mοριακήδιαγνωστική στα Νευρολογικά Νοσήματα...Από τα,...
Post on 01-Aug-2020
4 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Mοριακή διαγνωστική στα Νευρολογικά Νοσήματα
Ιωαννίδης Αναστάσιος BSc, MD, PhDΕπίκουρος Καθηγητής Μικροβιολογίας
Πανεπιστήμιο ΠελοποννήσουΕπιστημονικός Υπεύθυνος Εργαστηρίου Medisyn
ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ
Νευρολογική διαταραχή ή νευρολογικό νόσημα θεωρείται κάθε
Δομική
Βιοχημική
Ηλεκτρική
διαταραχή στο νευρικό σύστημα (εγκέφαλος, νωτιαίος μυελός, περιφερικοί νευρώνες)
ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ
ΚΑΤΑ ICD-10G00-G09 Φλεγμονώδεις παθήσεις του κεντρικού νευρικού συστήματος
G10-G13 Συστηματικές ατροφίες που προσβάλλουν πρωτοπαθώς το ΚΝΣ
G20-G26 Εξωπυραμιδικές και κινητικές διαταραχές
G30-G32 Άλλα εκφυλιστικα νοσήματα του νευρικού συστήματος
G35-G37 Απομυελινωτικά νοσήματα του ΚΝΣ
G40-G47 Επεισοδιακές και παροξυσμικές διαταραχές
G50-G59 Διαταραχές των νεύρων, των νευρικών ριζών και πλεγμάτων
G60-G64 Πολυνευροπάθειες και άλλες διαταραχές του περιφερικού νευρικού συστήματος
G70-G73 Παθήσεις της νευρομυϊκής σύναψης και των μυών
G80-G83 Εγκεφαλική παράλυση και άλλα παραλυτικά σύνδρομα
G90-G99 Άλλες διαταραχές του νευρικού συστήματος
ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ
Μοριακή Διαγνωστική: είναι μια συλλογή από τεχνικές που
χρησιμοποιούνται στη διερεύνηση της δομής και της
λειτουργίας του γενετικού υλικού, τόσο του ίδιου του ατόμου
όσο και των μικροοργανισμών που τον προσβάλλουν
Είναι ένα εργαλείο που συμβάλλει στην πρόγνωση, διάγνωση
και θεραπευτική αντιμετώπιση του ατόμου
Λοιμώξεις Κεντρικού Νευρικού
Συστήματος
Μηνιγγίτιδα
Εγκεφαλίτιδα
Μηνιγγοεγκεφαλιτιδα
Εγκεφαλικό απόστημα
Λοιμώξεις που δρουν στο ΚΝΣ μέσω τοξινών:
τέτανος, αλλαντίαση, διφθερίτιδα
Λοιμώξεις ΚΝΣ που οφείλονται σε:
Νευροχειρουργικές επεμβάσεις
Τραύμα του ΚΝΣ
Νευροτρόπους ιούς (πολιομυελίτιδας, έρπητα
ζωστήρα, HTLV-1)
Η εισαγωγή των μοριακών μεθόδων έγινε με κύριο σκοπό να επιλυθούν οι
αδυναμίες των κλασικών μεθόδων, έτσι ώστε ο αιτιολογικός παράγοντας της
λοίμωξης να ταυτοποιείται αξιόπιστα και γρήγορα με στόχο την εφαρμογή
αιτιολογικής θεραπείας
Μοριακή διαγνωστική και λοιμώξεις
❖ Μη καλλιεργήσιμα παθογόνα
❖ Δύσχρηστα ή αργά αναπτυσσόμενα
παθογόνα
❖ Mycobacterium tuberculosis
❖ Legionella pneumophila
❖ Πολύ μολυσματικοί παράγοντες που είναι
επικίνδυνοι
❖ Francisella tularensis
❖ Brucella species
❖ Ebola virus
❖ Παθογόνα σε χαμηλή συγκέντρωση
❖ Ανίχνευση και ποσοτικοποίηση σε δείγματα
μικρού/πολύ μικρού όγκου
❖ Αντιική ευαισθησία φαρμάκων
❖ HIV μόλυνση
❖ Μη βιώσιμοι παθογόνοι μικροοργανισμοί
Πλεονεκτήματα
❖ Μεγαλή ευαισθησία (High sensitivity)
❖ Θεωρητικά μπορεί να ανιχνευθεί η
παρουσία ενός και μόνο παθογόνου
μικροοργανισμού (single
cell/molecule)
❖ Υψηλή ειδικότητα (High specificity)
❖ ανίχνευση συγκεκριμένων γονότυπων
❖ ανίχνευση φαρμακευτικής αντοχής
❖ πρόβλεψη μολυσματικότητας
❖ Ταχύτητα (Speed)
❖ Πιο γρήγορα από τις συμβατικές
μεθόδους καλλιέργειας για
συγκεκριμένα παθογόνα
❖ Ευκολία (Simplicity)
❖ Αυτοματοποιημένες μέθοδοι/δοκιμασίες
❖ Δεν επηρεάζονται από τα αντιμικροβιακά
Μειονεκτήματα
❖ Κόστος
❖ Η μεγάλη ειδικότητα απαιτεί την ύπαρξη
κλινικών δεδομένων πριν τη μοριακή
διερεύνηση
❖ Υψηλή εξειδίκευση άρα και
ανάγκη εξειδικευμένου
προσωπικού
❖ Νέοι λοιμογόνοι/παθογόνοι παράγοντες
❖ Υψηλή ειδικότητα? Συχνά προκαλεί
ερωτήματα για την κλινική σημασία
του αποτελέσματος
Διαχείριση κλινικών δειγμάτων & μοριακή ανάλυση
Κλινικό Δείγμα
Λύση-Καθαρισμός
Απομόνωση Νουκλεϊκού Οξέος
mRNA
Ιϊκό RNA
rRNA
ΗλεκτροφόρησηΠροϊόντα
Κλωνοποίηση
RT-PCR
Αλληλούχηση
DNA
cDNA
PCR
Υβριδισμός
Μικροσυστοιχίες
Αλληλούχιση επόμενης γενιάς
ΑΛΛΗΛΟΥΧΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ 16s ή 23s ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΟΥ RNA
Muzzi A, Mora M, Pizza M, Rappuoli R, Donati C. Conservation of meningococcal antigens in the genus Neisseria. MBio. 2013 Jun 11;4(3)
ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΗ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΥΒΡΙΔΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ (Microarray Comparative Genomic
Hybridization –MCGH)
ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΣΗ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΙΑΣ(Next Generation Sequencing - NGS)
ΦΑΣΜΑΤΟΜΕΤΡΙΑ ΜΑΖΑΣ ΤΥΠΟΥ MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry - MALDI-TOF MS)
hybriSpot 24TM
hybriSpot 24TM
ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ
ΚΑΤΑ ICD-10G00-G09 Φλεγμονώδεις παθήσεις του κεντρικού νευρικού συστήματος
G10-G13 Συστηματικές ατροφίες που προσβάλλουν πρωτοπαθώς το ΚΝΣ
G20-G26 Εξωπυραμιδικές και κινητικές διαταραχές
G30-G32 Άλλα εκφυλιστικά νοσήματα του νευρικού συστήματος
G35-G37 Απομυελινωτικά νοσήματα του ΚΝΣ
G40-G47 Επεισοδιακές και παροξυσμικές διαταραχές
G50-G59 Διαταραχές των νεύρων, των νευρικών ριζών και πλεγμάτων
G60-G64 Πολυνευροπάθειες και άλλες διαταραχές του περιφερικού νευρικού συστήματος
G70-G73 Παθήσεις της νευρομυϊκής σύναψης και των μυών
G80-G83 Εγκεφαλική παράλυση και άλλα παραλυτικά σύνδρομα
G90-G99 Άλλες διαταραχές του νευρικού συστήματος
G00-G09 Φλεγμονώδεις παθήσεις του κεντρικού νευρικού συστήματος
G10-G13 Συστηματικές ατροφίες που προσβάλλουν πρωτοπαθώς το ΚΝΣ
G20-G26 Εξωπυραμιδικές και κινητικές διαταραχές
G30-G32 Άλλα εκφυλιστικα νοσήματα του νευρικού συστήματος
G35-G37 Απομυελινωτικά νοσήματα του ΚΝΣ
G40-G47 Επεισοδιακές και παροξυσμικές διαταραχές
G50-G59 Διαταραχές των νεύρων, των νευρικών ριζών και πλεγμάτων
G60-G64 Πολυνευροπάθειες και άλλες διαταραχές του περιφερικού νευρικού συστήματος
G70-G73 Παθήσεις της νευρομυϊκής σύναψης και των μυών
G80-G83 Εγκεφαλική παράλυση και άλλα παραλυτικά σύνδρομα
G90-G99 Άλλες διαταραχές του νευρικού συστήματος
Από τα, περίπου 6000 γενετικά νοσήματα που αναφέρονται στον κατάλογο των κληρονομικών νοσημάτων McKusick, το 1/3 προσβάλλει, με κάποιον τρόπο, το νευρικό σύστημα. Ο κύριος λόγος για τον οποίο το νευρικό σύστημα εμφανίζει τον μεγαλύτερο αριθμό γενετικών νοσημάτων από κάθε άλλο σύστημα του ανθρώπινου οργανισμού, φαίνεται να σχετίζεται
με το γεγονός ότι, το 1/3, περίπου, των γονιδίων του ανθρώπινου γονιδιώματος εμπλέκεται στη διαδικασία ανάπτυξης του νευρικού συστήματος.
Τα γενετικά νοσήματα νευρικού συστήματος δεν είναι
ίσως πολύ συχνά, αλλά το βάρος που επιφέρουν για το
άτομο και την κοινωνία είναι δυσβάσταχτο αφού συχνά
οδηγούν σε σημαντική αναπηρία ήδη από τα πρώτα
χρόνια της ζωής και έχουν μία αναπόφευκτη προοδευτική
επιδείνωση.
Κληρονομικά
Νόσος των Charcot-Marie-
Tooth
Νόσος του Huntington
Κληρονομικές Αταξίες
Μυοτονική Δυστροφία
Μυϊκές Δυστροφίες
Μιτοχονδριακά Νοσήματα
Σποραδικά
Νόσος του Alzheimer
Σκλήρυνση κατά πλάκας
Πλάγια Μυατροφική
Σκλήρυνση
Νόσος του Parkinson
Μέχρι και τη δεκαετία του 80 τα
γενετικά νοσήματα του
νευρικού συστήματος ήταν
συνδεδεμένα με αισθήματα
«θεραπευτικής απαισιοδοξίας»
Η επανάσταση στη Μοριακή Βιολογία
στη δεκαετία του 90 (ανάλυση
σύνδεσης, ανάλυση μεταλλάξεων)
οδήγησε στη μοριακή προσπέλαση
της αιτιοπαθογένειας των
Νευρογενετικών Νοσημάτων
Η Νόσος του Huntington είναι το
πρώτο νόσημα που χαρτογραφήθηκε
στις αρχές της δεκαετίας του 90 με
τη χρήση γενετικών δεικτών (RFLPS
markers)
Σήμερα ένας αξιόλογος αριθμός
νευρολογικών νοσημάτων ταυτοποιείται
μέσω γενετικού test και παρέχεται η
δυνατότητα στον ασθενή για :
•Προσυμτωματικό έλεγχο
•Γενετική συμβουλή
•Προγεννητικό έλεγχο
ΝΟΣΗΜΑ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΤΕΣΤ
Νόσος του Huntington (HD) repeat test
Αταξία του Friedreich (FRDA) repeat test
Πολυνευροπάθειες (CMT1A,CMT1B, CMT1X,
CMT2, CMT1F, CMT1E. CMT2D)
sequencing test, MLPA evaluation, Long PCR
Μυοτονική Δυστροφία (DM1, DM2) southern blot test
TP-PCR
Νωτιαιοπαρεγκεφαλιδικές αταξίες
(SCA1, SCA2, SCA3. SCA6, SCA7, SCA8,
SCA10, SCA12, SCA17)
repeat test
Οδοντοτοερυθροωχρολουιζιανή ατροφία
(DRPLA)
repeat test
Πλάγια Μυατροφική σκλήρυνση ( ALS) sequencing test
RP-PCR
Νόσος του Parkinson (PARK) sequencing test, MLPA evaluation
Οικογενής σπαστική παραπληγία (HSP) sequencing test, MLPA evaluation
Μιτοχονδριακά Νοσήματα sequencing test
southern blot
RFLPS
Μυϊκή Δυστροφία (DMD) southern blot
Η μοριακή
μελέτη των
νευρολογικών
νοσημάτων
αποκάλυψε :
Την κλινική και
γενετική
ετερογένεια των
νευρολογικών
νοσημάτων
Την ύπαρξη των
δυναμικών
μεταλλαγών
Πως η βλάβη
ενός γονιδίου έχει
πολυγονιδιακές
επιπτώσεις
Κλινικός τύπος CMT Γενετική ταξινόμηση CMT Συνήθης φαινότυπος Γονίδια
CMT1 (MCV <38m/s) Γενετική ταξινόμηση CMT Κλασσική CMT με ετερογένεια ως
προς τη βαρύτηταΔιπλασιασμός PMP22
CMT1A Κλασική CMT, βαριά CMT MPZ
CMT1B Κλασική CMT LITAF
CMT1C Κλασική CMT, βαριά CMT EGR2
CMT1D Κλασική CMT, βαριά CMT Σημειακές μεταλλαγές PMP22
CMT1E Κλασική CMT NEFL
CMT1F Κλασική CMT, βαρύτερη στους
άνδρεςGJB1
CMTX Συνήθως βαριά CMT GDAP1, MTMR2/MTMR13, SH3TC2, NDRG1,
EGR2, PRX, HK1, FGD4, FIG4
CMT4A, CMT4B, CMT4C, CMT4D,
CMT4E, CMT4F, CMT4G, CMT4H, CMT4J
Κλασική CMT MFN2
CMT2 (MCV >38m/s) CMT2A Κλασική CMT NEFL, MPZ, GDAP1
CMT2E,CMT2I, CMT2K Κυρίως αισθητική συμμετοχή
(παρόμοια εικόνα με HSN1)RAB7
CMT2B Κυρίως κινητική συμμετοχή
(παρόμοια εικόνα με dHMN)TRPV4, GARS, HSPB1, HSPB8
CMT2C, CMT2D, CMT2F, CMT2L Κλασική CMT, ήπια στις γυναίκες με
μορφή CMT2GJB1
CMTX Συνήθως κλασική ή βαριά CMT LMNA, MED25, GDAP1
CMT2B1, CMT2B2, CMT2H Κλασική HNPP Έλλειψη PMP22
HNPP HNPP Κλασική HNPP ενίοτε και με στοιχεία
κλασικής CMTΣημειακές μεταλλαγές PMP22
Πολυνευροπάθειες
Νευρολογικά νοσήματα
που προκαλούνται από
επανάληψη
τρινουκλεοτιδίων
20ς αιώνας, νέες μοριακές
τεχνικές καινούργιες
δυνατότητες
microarrays
Next generation sequencing -
Exome sequencing
ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ(MICROARRAYS)
Η βασική αρχή των
DNA τσιπς είναι ότι
ένα μόριο mRNA θα
προσκολληθεί ειδικά,
μέσω δημιουργίας
ζευγών βάσεων, με
ένα μόριο DNA που
έχει
συμπληρωματική
αλληλουχία
ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ
ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΕΠΟΜΕΝΗΣ ΓΕΝΙΑΣ(NEXT GENERATION SEQUENCING)
ΑΝΑΓΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΟΤΙΔΙΚΗΣ
ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΑΣ ΕΞΟΝΙΩΝ(EXOME SEQUENCING)
top related