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MICHELE RIBEIRO DA SILVA
O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de
dietas acrescidas de própolis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Departamento: Nutrição e Produção Animal
Área de Concentração: Nutrição Animal
Orientador: Profa. Dra. Maria de Fátima Martins
Pirassununga
2009
Autorizo a reproduç ã o parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de Sã o Paulo)
T.2219 Silva, Michele Ribeiro da FMVZ O Achatina fulica e sua utilizaç ã o zooterápica atravé s de dietas
acrescidas de própolis / Michele Ribeiro da Silva. --2009. 64 f. : il. Dissertaç ã o (Mestrado) - Universidade de Sã o Paulo. Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Nutriç ã o e Produç ã o Animal, Pirassununga, 2009.
Programa de Pós-Graduaç ã o: Nutriç ã o e Produç ã o Animal. Área de concentraç ã o: Nutriç ã o e Produç ã o Animal. Orientador: Profa. Dra. Maria de Fátima Martins. 1. Escargots. 2. Achatina fulica. 3. Muco. 4. Própolis. 5. Cicatrizaç ã o.
I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: SILVA, Michele Ribeiro
Título: O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de dietas acrescidas de própolis
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências.
Data: ___/___/___
Banca Examinadora
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: ____________________
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: ____________________
Prof. Dr. ___________________________ Instituição: _____________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: ____________________
Dedico este trabalho ao meu amor, mmeeuuss ppaaiiss e meus
avós, em especial ao meu avô
José Liberali Sobrinho (in memorian).
AGRADECIMENTOS
• À Deus por ter me dado proteção e forças para prosseguir e principalmente por
ter me concedido a graça de ter os pais maravilhosos que tenho;
• A todos os animais participantes desta pesquisa;
• Aos meus pais por todo apoio, incentivo, paciência e tentativas de compreensão;
• À professora e orientadora Dra. Maria de Fátima Martins pelas oportunidades, e
principalmente por todo amadurecimento proporcionado ;
• Ao Diego, por todo companheirismo, dedicação, auxílio e principalmente por todo
carinho e apoio recebido;
• A Juliana, por cada momento compartilhado, e acima de tudo pela amizade
verdadeira;
• Ao Vanerson e família por todo carinho, apoio e incentivo;
• À Profa. Dra. Mamie Misuzaki Iyomasa da Faculdade de Odontologia da USP de
Ribeirão Preto pela colaboração e orientações;
• À Yamba Carla Lara Pereira pelo precioso auxílio durante as análises;
• À Dimitrius Leonardo Pitol pela grata contribuição;
• Ao Prof. Auro Nomizo da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade
de São Paulo pelo auxílio com os testes de citotoxicidade;
• Aos colegas de pós graduação, em especial Eugênio pela importante participação
em minha vida, durante esses anos;
• Aos professores e funcionários do Departamento de Nutrição e Produção Animal
da FMVZ/USP;
RESUMO
SILVA, M. R. O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de dietas acrescidas de própolis. [The Achatina fulica, and utilization use of propolis]. 2009. 64 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2009. Os escargots da espécie Achatina fulica são caracóis africanos comestíveis e para essa finalidade foram introduzidos no Brasil em 1988 para substituir o escargot europeu Helix sp. Contudo, o hábito alimentar conservador da população brasileira ocasionou prejuízos aos criadores de escargots no Brasil, desencadeando uma soltura irresponsável e anti-ética desses moluscos no meio ambiente, o que proporcionou uma associação direta dos caracóis à impactos ambientais, sendo objeto de estudos e pesquisas correlatas. Todavia, estudos anteriores descreveram efeitos benéficos, antimicrobianos e cicatrizantes do muco extraído de caracóis Achatina sp, e ainda a potencialização destes efeitos a partir do acréscimo de plantas medicinais à dieta base consumida pelos escargots, constatando a capacidade de retenção em seu organismo das propriedades dos alimentos por eles ingeridos. As atividades antimicrobiana e cicatrizante também são conhecidas na utilização da própolis produzida por abelhas da espécie Apis mellifera. Partindo dessas premissas, neste estudo, foi adicionada própolis à ração base dos escargots, objetivando avaliar o efeito cicatrizante desses zooterápicos e suas aplicações. Os resultados obtidos demonstraram que a utilização de muco nas lesões cirurgicamente induzidas em camundongos acelerou o processo de cicatrização, comparativamente ao grupo controle que recebeu apenas tratamento com soro fisiológico. As análises parasitológica e citotóxica realizadas demonstraram que o muco é apto para a utilização proposta. A dieta acrescida de própolis interferiu nas características do muco. Foi possível observar, a partir das avaliações histológicas e macroscópicas uma discreta vantagem no processo de cicatrização para o grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base acrescida de própolis em sua dieta. Estes resultados demonstram a potencialidade desta pesquisa em resultar em um biofármaco com propriedades cicatrizantes à base de muco de escargots e ainda uma possível patente deste muco, através do indicativo de sua importância terapêutica para o reparo tecidual de lesões veterinárias e humanas. Palavras-chave: Escargots. Achatina fulica. Muco. Própolis. Cicatrização.
ABSTRACT SILVA, M. R. The Achatina fulica, and its´s Zootherapics utilization through the use of a propolis diet. [O Achatina fulica e sua utilização zooterápica através de dietas acrescidas de própolis] 2009. 64 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, 2009.
The snail species Achatina fulica, is an edible African giant land snail species that was introduced into Brazil in 1988 as a substitute for the european escargot Helix sp. However, the conservative eating habits of the brazilian population have caused losses to breeders of escargot in Brazil due to the irresponsible, unethical release of the species into the environment. This species is known for it’s invasive nature and most of the literature focuses on the species disruption to the environment. Thus, the first objective of the study and related research focuses on these environmental impacts. Others studies have described beneficial attributes, antimicrobial and healing properties, of the mucous extracted from the small Achatina species. They have also described the potential benefits of feeding the snails a base diet enriched with medicinal plants to prove the capacity of the organisms to retain the aforementioned properties after ingestion. Lastly, our research will also examine the addition of propolis, to the base ration diet of snails. Propolis is a resinous material, obtained from local plant sources, used as a sealant in bee hives. For the purpose of these studies, the focus will be propolis specifically associated with the bees of the species Apis mellifera. The antimicrobial and healing properties of propolis have been well recognized and described. The objective of this work is thus, to evaluate the healing effects of this zootherapics, and it’s application in veterinary medicine as a biopharmaceutical. The results showed that the use of mucous in the lesions surgically induced in mice accelerated the healing process, compared to a control group that received treatment only with saline. Parasitological and cytotoxic analysis performed demonstrated that the mucous is suitable for the proposed use. The diet added with propolis influenced the parameters of mucous. It was observed from the macroscopic and histological findings a slight advantage in the healing process for the group treated with mucus extracted from snails fed diets basis with propolis in their diet. This results achieved were encouraging, showing the potenciality of this research results in a medication with scaring properties based on snail mucus and further a possible patent of this mucus, through its expressive therapeutics importance to veterinary and human lesions tissue repair. Key words: Snails. Achatina fulica. Mucous. Propolis. Helling.
12 1. INTRODUÇÃO
Os caracóis terrestres são animais invertebrados, pertencentes ao Filo
Mollusca, da Classe dos Gastrópodes e mais especificamente da Ordem dos
Pulmonados. Caracóis terrestres comestíveis são denominados “escargots” e os
mais comumente utilizados pertencem às Famílias Achatinidae (África) e Helicidae
(Europa).
Os escargots da espécie Achatina fulica foram introduzidos no Brasil em
1988, (SOUZA, et al., 2007) para criação e comercialização com finalidade
comestível, visando substituir os escargots europeus Helix sp. nas mais diversas
iguarias. Contudo, no Brasil a criação de escargots, denominada “helicicultura”, não
obteve êxito, devido aos hábitos alimentares conservadores da população brasileira
e ainda em decorrência do alto custo de mercado da carne de escargots e de seus
subprodutos. ( Martins, 2009) A conseqüência dos prejuízos obtidos pelos criadores
através da helicicultura, principalmente devido ao molusco africano foi a soltura
irresponsável e anti-ética desses animais no meio ambiente, praticamente em todas
as regiões brasileiras, com maior expressividade na região Sudeste.
A família Achatinidae, de origem centro africana, ocorre em regiões de
florestas tropicais úmidas e apresenta ampla distribuição tanto na África como na
Ásia, sendo extremamente adequada à regiões tropicais, principalmente em
temperaturas superiores a 23ºC. (MARTINS et al., 2002; PACHECO, 1998). São
herbívoros generalistas, altamente prolíferos, encontrando no meio ambiente do
Brasil condições ideais para reprodução e sobrevivência, inclusive competindo com
espécies nativas por alimento e espaço, quase não possuindo predadores naturais.
13 (Vasconcellos e Pile, 2001)
A associação desses fatores possibilitou uma ampla dispersão do Achatina
fulica. De acordo com SOUZA, et al. (2007), há dessa espécie em 23 estados
brasileiros, perpassando diferentes ecossistemas. Esta ocorrência foi fator
desencadeante de estudos e pesquisas correlatas, porém ainda há muito a ser
pesquisado e trabalhado sobre a Família Achatinidae, desde seu controle ambiental,
até à respeito de seus efeitos zooterápicos, e ainda sobre as propriedades
terapêuticas do muco desses escargots, que para finalidade de pesquisas científicas
são reproduzidos em laboratório, mantidos exclusivamente para fins didáticos e de
pesquisa.
Segundo a instrução normativa do IBAMA, Instituto Brasileiro do Meio
Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis, de número 73, de 18 de Agosto de
2005, encontra-se proibida, em todo território brasileiro, a criação e comercialização
de moluscos terrestres da espécie Achatina fulica, porém a mesma autoriza órgãos
competentes federais, estaduais e municipais, bem como organizações não
governamentais capacitadas na área, pesquisar e implementar medidas de controle
destes moluscos nos ambientes urbanos, rurais e naturais.
A secreção ou muco liberado pelos escargots protege o corpo do animal
contra desidratação e sua viscosidade auxilia na locomoção, captura de alimentos,
reprodução e proporciona resistência a infecções por microorganismos, devido à
presença de um fator antimicrobiano (IGUCHI, et al., 1982). Este fator antimicrobiano
pode auxiliar nos processos de reparação de feridas, pois a infecção constitui a
causa mais importante de retardo da cicatrização. (COTRAN, et al., 2000).
Autores como Martins, et al. (1996; 2003); Sírio (2005) verificaram a
capacidade antimicrobiana e cicatrizante do muco extraído de escargots Achatina
14 sp. utilizado em lesões induzidas cirurgicamente em camundongos e coelhos. Um
estudo realizado por Iyomasa et. al (2002) constatou histologicamente uma
diferença na maturação do epitélio, em favor da aplicação da secreção mucosa de
caracóis sobre a área lesada quando comparada a um grupo controle.
Pesquisas anteriores realizadas pelo Heliciário Experimental Profa. Dra. Lor
Cury da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São
Paulo demonstraram que os escargots possuem a capacidade de absorver
propriedades dos alimentos que ingerem e eliminá-las através de seus ovos e muco.
Sírio, et al. (2005) e Lorenzi et al. (2006) fizeram uso de dietas acrescidas de plantas
medicinais com finalidades cicatrizantes, apresentando resultados potencializadores
e que nos motivaram a avaliar o efeito do muco acrescido de própolis no processo
de cicatrização. Pois, assim como o muco de escargots, a própolis também pode ser
considerada um zooterápico, sendo uma resina de coloração e consistência variada,
coletada por abelhas da espécie Apis mellifera de diversas partes das plantas, como
brotos, botões florais e exsudatos resinosos (PARK, et al., 1998), possuindo
atividade antimicrobiana, propriedades anti-inflamatória, cicatrizantes, anestésicas e
anti-carcinogênicas, o que possibilita sua aplicação nas indústrias farmacêuticas e
alimentícias.
Em trabalhos fazendo uso tópico a base de própolis, Berreta (2003 e 2007)
desenvolveu um gel com potencial de aplicação dermatológica, particularmente no
tratamento de queimaduras. Pesquisadores como SUTTA et al. (1974),
DAMYANLIEV et al. já relatavam o efeito epitelizante da própolis, considerando-a
adequada para o tratamento de feridas e infecções microbianas. RAHAL, et al.
(2003) revelaram histologicamente a indução de uma melhor cicatrização pela
redução da resposta inflamatória e uma reepitelização mais rápida após tratamentos
15 com própolis. Face aos resultados apresentados, não foram encontrados trabalhos
em literaturas nacional e internacional fazendo uso de própolis na dieta do molusco
Achatina fulica com a finalidade de implementar o processo de cicatrização.
Partindo dessas premissas, esta pesquisa teve como objetivo adicionar
extrato de própolis na composição da dieta base oferecida para escargots da
espécie Achatina fulica e avaliar um possível efeito sinérgico desses dois
zooterápicos (muco + própolis), nas atividades antimicrobianas e cicatrizantes
através de lesões cirurgicamente induzidas em camundongos “hairless”, Mus
musculus, Linhagem HRS/J.
O enfoque farmacológico associado às propriedades cicatrizantes do
muco destes moluscos amplia o campo de atuação da Zooterapia, pois se traduz na
capacidade de exploração da diversidade biológica dos escargots Achatina fulica
que foram descartados de forma desordenada no meio ambiente e que em
condições de controle em laboratório, podem vir a contribuir para o desenvolvimento
de um biofármaco com capacidade cicatrizante.
16 2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Zooterapia/Zooterápicos
Zooterapia é uma palavra de origem grega, onde zoo significa animal e
therapia trás a idéia de tratamento. Etimologicamente este termo relaciona-se a
terapia através dos animais, incluindo aqui seus produtos ou subprodutos. Sendo
assim, são considerados zooterápicos todos os produtos oriundos de animais com
finalidade terapêutica, como é o caso da própolis obtida de abelhas e do muco
extraído de caracóis.
Compartilhando o pensamento de Costa Neto (1999), Zooterapia refere-se,
stricto sensu, ao registro do uso de remédios elaborados a partir de partes do corpo
de animais, de produtos de seu metabolismo, como secreções corporais e
excrementos, ou de materiais por eles constituídos.
Segundo Costa Neto (2005), a utilização medicinal através de animais é um
fenômeno transcultural historicamente antigo e geograficamente disseminado.
Agentes antimicrobianos seguros tem sido buscados no ambiente natural,
pois há uma preocupação com o crescente uso de antibióticos que podem induzir
resistências bacterianas. (OGAWAA, 1999).
17
2.2. Caracóis terrestres (escargots) da espécie Achatina fulica
Os caracóis da espécie Achatina fulica são moluscos africanos, introduzidos
no Brasil na década de 80 com finalidade comestível visando a substituição do
escargot europeu Helix sp. (SOUZA, 2006) Sendo comparativamente, a criação de
Achatina fulica comercialmente mais lucrativa e menos onerosa, uma vez que estes
moluscos possuem maior tamanho e rusticidade que os Helix aspersa e Helix
pomatia.
A carne do escargot Achatina fulica é constituída de 32% de proteína e
apenas 0,5% de gordura, além de possuir cálcio, ferro, zinco e um pH alcalino, o que
segundo Iguchi, Aikawa e Matsumoto (1982), pode ser adequado ao tratamento de
úlceras, caracterizando propriedades terapêuticas a sua carne.
Segundo Iguchi, et al. (1982), os invertebrados não possuem organismos
imunoespecíficos como os encontrados nos vertebrados. Esses invertebrados,
possuem fatores de defesa que impedem a entrada de materiais estranhos. Para tal,
o muco do molusco possui fatores antibacterianos que exibem atividades contra
organismos gram-positivos e gram-negativos.
Os moluscos produzem de 60 a 400 µg de muco seco/hora/grama de peso
corporal, que produz 24J/MG de peso. O muco expressa informações sobre o estado
sexual dos animais e direção para locomoção (SKINGSLEY; WHITE; WESTON,
2000). A habilidade de secretar muco através da epiderme consiste numa
propriedade particular dos caracóis. O muco é produzido em algumas regiões do
corpo e é freqüentemente misturado a materiais advindos de glândulas juntamente
com o exsudato geral das células epiteliais. Considera-se, primeiramente, que a
superfície ciliada é caracteristicamente coberta pelo muco que atua como um veículo
para o movimento das partículas através do epitélio, e está relacionado com a
18 função de locomoção propriamente dita do molusco. Sugere-se também que, a alta
viscosidade do muco é produzida pelas glândulas suprapodais enquanto que a baixa
viscosidade viria do enchimento das cavidades inferiores dos “pés”, causadas pela
oscilação dos músculos (SIMKISS; WILBUR, 1977).
O muco consiste em 90 a 99,7% de seu peso em água. O principal
constituinte do muco gastrópoda é um complexo de proteínas e polissacarídeos.
Esse complexo é usualmente classificado numa ampla categoria de
mucopolissacarídeos e glicoproteínas (LINCOLN et al., 2004).
O fator antibacteriano dos caracóis demonstrou grande atividade inibitória de
crescimento para bactérias , ainda que a estrutura da parede celular seja diferente.
Isso sugere que cada célula bacteriana é atacada por um fator antibacteriano que
pode não estar localizado na parede celular, mas em algum outro local. (KUBOTA,
et al., 1985).
2.3. Utilização do muco de caracóis terrestres como zooterápico
A utilização do muco, uma secreção glicoproteica produzida através de glândulas
localizadas em toda superfície corpórea dos escargots, e o conhecimento de suas
aplicações terapêuticas e cosméticas remontam aos primórdios da humanidade. Em
países europeus, por exemplo, são produzidos xaropes expectorantes e diversos
cosméticos produzidos com o muco dos caracóis, baseados em receituário milenar.
(CHERNOVIZ, 1890). E, de acordo com Bonnemain (2004) o muco de caracóis é
utilizado na medicina em diferentes formulações desde a antiguidade, e que
19 Hipócrates fazia emprego desta substância para tratar dor em queimaduras,
abcessos e demais feridas.
Uma outra espécie citada por sua utilização zooterápica é o caracol Aruá,
Pomacea sp., que quando aplicados como emplastro, auxiliam na cicatrização de
feridas. (Nomura, 1996)
De acordo com Obara et al., (1992) existem nos moluscos dois tipos de
grupos de reação de defesa: uma celular e outra mediada por fatores de defesa
humoral. A primeira envolve a fagocitose de partículas estranhas e o
encapsulamento de materiais estranhos; a segunda envolve lisozimas, como
proteínas, lectinas, fatores antibacterianos ou antivirais e opsonização.
Iguchi, et al. (1982) descreveram a atividade antibacteriana observada em
frações do muco obtido a partir da superfície corpórea do caracol africano Achatina
fulica. Estas frações exibiram atividade antibacteriana, tanto para as bactérias Gram
positivas quanto para bactérias Gram negativas.
Kubota, et al. (1985) descreveram a presença de uma proteína ou um
polipeptídeo, sendo mais provavelmente a mucina, com poder antimicrobiano para
bactérias gram-positivas (Bacilos subtilis e Staphylococus aureus) e gram-negativas
(Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa), que ocorre no muco dos escargots e
inibe os crescimentos bacterianos quando em presença desta.
Ehara, et al. (2002) purificaram a glicoproteína antibacteriana a partir do muco
do Achatina fulica e a denominaram de “Achacin”. De acordo com Fuchino, et al.
(1991) a ação do “Achacin” assemelha-se àquela de antibióticos pertencentes ao
grupo dos beta-lactâmicos, que inibem a síntese de peptideoglicano na superfície
celular, assim como ocorre na utilização das Penicilinas. Estudos morfológicos
20 revelaram que Achacin “ataca” as membranas citoplasmáticas destas bactérias.
(OGAWAA, 1999)
GONZALES, et. al. (2004) em um estudo realizado sobre os efeitos da
aplicação de um creme industrializado a partir do muco extraído de caracóis da
espécie Helix sp., em pacientes com cicatrizes de queimaduras e enxertos de pele
nas regiões de cabeça, pescoço e mãos, tratados na Unidade de Terapia
Ocupacional do Centro de Reabilitação e Auxílio a Crianças Queimadas,
“Coaniquem Corporation”, descreveram que o creme atuou favorecendo a
despigmentação destas cicatrizes, e na melhora referente a textura da pele com
queimaduras. Estes mesmos autores verificaram a presença de alantoína,
colágeno, elastina, ácido glicólico e de um fator antibacteriano natural eficaz contra
bactérias comumente encontradas em infecções da pele humana (Staphyloccocos
aureus, Pseudomonas aeruginosa e Escherichia coli).
2.4. Utilização da própolis como um zooterápico
O nome própolis é derivado do grego pro, em defesa de, e polis a cidade, o
que significa em defesa da cidade ou neste caso, em defesa da colméia. As abelhas
utilizam esta substância para protegê-las contra outros insetos e microorganismos.
(DEBUYSER, E., 1983)
A própolis vem se destacando, nas últimas décadas, por suas propriedades
terapêuticas e biológicas relatadas em vários trabalhos científicos. Estudos
21 atribuem à própolis a melhora no tratamento de queimaduras, cicatrização e
ulcerações (MUJALLI, 1999).
Registros mais antigos citados por Zimmerman (1961) falam sobre
manuscritos egípcios que datam de 3000 - 2500 antes de Cristo, e neles são
mencionados curativos à base de mel e outros produtos oriundos de animais.
Hausen (1987) e Goetz (1990) descreveram os benefícios da sua utilização
em dermatologia na cicatrização de ferimentos, regeneração de tecidos, tratamento
de queimaduras, neurodermites, eczemas, dermatite de contato, úlceras externas,
psoríase, lepra, herpes, pruridos e dermatófitos.
Uma observação importante sobre a utilização da própolis, é que, assim,
como outros produtos oriundos das abelhas (mel, cera e geléia real), sua
composição varia de acordo com a flora, condições sazonais de uma determinada
área, o tempo de coleta e contaminantes. (MARCUCCI, 1996)
GREGORI, et al., (2002) avaliaram satisfatoriamente a utilização de um creme
a base de própolis em tratamentos de pacientes que apresentavam queimaduras de
primeiro e segundo graus,
GEBARA et. al., (2002) estudaram a atividade antimicrobiana do extrato de
própolis em diferentes doenças periodontais, OZTURK, et al., (1999) demonstraram
o efeito cicatrizante do extrato aquoso de própolis a 1% em córnea lesada de ratos.
2.5. Cicatrização
Segundo Gillitzer & Goebeler (2007) a cicatrização é um processo interativo que
envolve mediadores solúveis, componentes da matriz extracelular, e células como
queratinócitos, fibroblastos, células endoteliais e nervosas, e ainda infiltrado de
22 diferentes subtipos de leucócitos, que participam diferentemente na classificação de
cada uma das três fases da cicatrização: inflamatória, proliferativa e remodelação.
Martins (1997) destaca que a migração de neutrófilos ao local da lesão inicia-
se minutos após a injúria como uma primeira linha de defesa para a eliminação de
corpos estranhos e bactérias, além de produzir citocinas importantes para ativar os
fibroblastos e queratinócitos. (Hubner, et al., 1996).
De acordo com Yukami et al. (2007), a cicatrização da pele se inicia
imediatamente após uma injúria e consiste em três fases gerais: inflamatória, que
consiste em agregar e recrutar células inflamatórias; proliferativa, que envolve
migração e proliferação de queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais,
formação do tecido de granulação; e remodelação, com migração de células
inflamatórias, inicialmente, neutrófilos no local da lesão, sendo estes a primeira linha
de defesa, realizam limpeza de partículas e bactérias. Os neutrófilos são o primeiro
sinal para ativação dos fibroblastos e queratinócitos. Macrófagos são responsáveis
por debridamento através da fagocitose de microorganismos e fragmentos da matriz
extracelular, ainda são importantes mediadores do fatores de crescimento como por
exemplo o fator básico de crescimento de fibroblasto (bFGF).
A cicatrização tecidual pode sofrer diversas influencias como por exemplo,
produtos secretados de células inflamatórias como o fator de crescimento endotelial
vascular (VEGF) e fator de crescimento de fibroblastos, induzindo a angiogênese.
Angiogênese é um processo de crescimento de novas células sanguíneas, é
o elemento chave da fase proliferativa da cicatrização. Muitos estudos sugerem que
a neovascularização é importante para a cicatrização, como suplemento de oxigênio
e de nutrientes para o crescimento das células mediadoras de reparo. Resultados
demonstraram que os níveis de VEGF influenciam na textura da cicatriz resultante
23 do processo de cicatrização, são responsáveis pela estimulação direta das células
endoteliais e fibroblastos. (Wilgus, 2008)
VEGF inicia a formação vascular, e consequentemente, remodelamento,
maturação e estabilização. VEGF atua na remodelação pela proliferação de
queratinócitos. (Wilgus, 2008)
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Animais
3.1.1. Escargots
Para a realização desta pesquisa foram utilizados em sua totalidade um
número de 12 escargots adultos da espécie Achatina fulica, com aproximadamente 8
meses de idade e peso médio de 100 gramas provenientes do Heliciário
Experimental Profa. Dra. Lor Cury da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
da Universidade de São Paulo. Destes, 6 animais receberam ração base e 6
receberam ração base acrescida de própolis.
3.1.1.1. Nutrição
A ração bbaassee oferecida aos escargots participantes desta pesquisa é a
mesma utilizada e desenvolvida no Heliciário Experimental Profa. Dra. Lor Cury da
24 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo,
sendo esta composta por 10% de farelo de soja, 56% de fubá de milho, 13% de
farelo de trigo, 1% de suplemento mineral e 20% de carbonato de cálcio.
(FLAUZINO, et al.,1997; MARTINS, et al., 1998 e PACHECO, et al., 1999)
Para o preparo da ração com pprróóppoolliiss, foi acrescida à ração base dos
escargots, 10% de extrato bruto seco de própolis (Fig. 01), sendo observado boa
aceitação na palatabilidade e consumo dos animais. Este extrato passou por
processo de secagem em estufa por 7 dias, com temperatura média de 45ºC. Após,
foi previamente triturado e levado junto com a ração base pronta ao misturador por
20 minutos, na proporção de 10 gramas de própolis para cada 100 gramas de ração
base.
Figura 01: Extrato Bruto de Própolis, posteriormente processado e acrescido na ração base dos escargots da espécie Achatina fulica.
Tabela 01. Nutrição dos escargots, onde grupo 1 recebeu ração base e grupo 2 recebeu ração base acrescida de própolis em sua dieta. Pirassununga, 2009.
Grupo 1 – Muco Puro Ração Base
Grupo 2 – Muco + Própolis Ração Base + Própolis
25
Figura 02: Comparação entre as duas dietas oferecidas (ração base e ração base + própolis).
3.1.1.2. Manejo dos Escargots em experimentação
Os escargots foram mantidos em caixas plásticas, com medidas de 75x40x30
cm, padronizadas pelo Heliciário Experimental e foram separados em número de 3
animais (n=3) por cada caixa, de acordo com o manejo alimentar, ou seja, duas
caixas para os escargots alimentados apenas com a ração base e duas caixas para
os alimentados com a ração base acrescida de própolis. (Figs. 03 e 04) Água e
ração foram fornecidas ad libitum diariamente, em comedouros e bebedouros
específicos, também padronizados.
Figuras 03 e 04: Manejo dos escargots, recebendo ração base e ração base acrescida de própolis, respectivamente.
26
3.1.1.3. Extração de muco dos Escargots
Para a extração de muco, os animais passaram por jejum alimentar,
recebendo apenas água pelo período de um (1) dia, com a finalidade de se evitar
uma possível contaminação do muco a ser extraído.
A coleta do muco foi realizada através de estimulação manual (fricção
contínua) das glândulas podais dos escargots. (Fig. 05) Esta metodologia utilizada
por Martins, et al. (1996) e Caetano, et al. (1998), não acarreta em sacrifício dos
animais, nem prejudica seu bem estar, como ocorreria em técnicas de eletro-
estimulação, utilizadas por autores como IGUCHI, et al. (1992).
Figura 05: Técnica de estimulação manual para a extração de muco de escargots da espécie Achatina fulica.
3.1.1.4. Avaliação citotóxica do muco de escargots Achatina fulica.
Esta análise foi realizada na Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo, em Ribeirão Preto, com o auxílio e orientação do Prof.
Dr. Auro Nomizo. Os mucos extraídos dos escargots que ingeriram ração base e dos
escargots que ingeriram ração base acrescida de própolis foram submetidos em
diferentes diluições ao bioensaio de citotoxicidade em células esplênicas extraídas
27 de camundongos.
Primeiramente, as amostras de mucos foram solubilizadas em DMSO/meio
RPMI, (1:100, 1:10, 1:100), sendo este diluente utilizado como controle negativo.
Para avaliar a atividade citotóxica foi utilizado o método colorimétrico de
citotoxicidade pelo 3-(4,5-dimetil tiazol 2-il) 2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT). A
avaliação da atividade citotóxica foi determinada por espectrofotometria.
3.1.1.5. Análise parasitológica do muco de escargots Achatina fulica
Autores como Alicata (1965) e Moreira (1973) descreveram que o escargot
Achatina fulica pode ser considerado na Ásia e Ilhas do Pacífico, um importante
hospedeiro intermediário do Angiostrongylus cantonensis, e que humanos podem
sofrer infecção acidental após a ingestão de L3 eliminadas através do muco destes
moluscos. Para verificação da possível presença de larvas no muco dos escargots
Achatina fulica utilizados nesta pesquisa, foram realizadas análises parasitológicas
destes mucos, com esta finalidade, adaptou-se a metodologia descrita por
Vasconcellos (2001). Folhas de papel celofane foram introduzidas nas caixas
plásticas onde estavam os escargots, forrando as mesmas por um período de vinte e
quatro horas. Após, as folhas de papel celofane foram levadas ao microscópio óptico
para observação da possível presença de larvas liberadas através do muco destes
moluscos. O muco também foi coletado através da estimulação das glândulas
podais dos escargots e levado em placas diretamente ao microscópio para
visualização e análise.
28
3.1.2. Camundongos
Foram utilizados 09 animais (n=9) machos do tipo camundongo “hairless”,
Mus musculus, Linhagem HRS/J, com peso corporal variando entre 30 e 35 gramas,
com idade aproximada de 40 dias, provenientes do Biotério da Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto, FORP/USP. Estes camundongos possuem um gene
recessivo autossômico situado no cromossomo 14 e são produzidos em laboratórios,
resultantes do acasalamento entre machos Hr e fêmeas (Hr+). A opção por estes
camundongos deu-se devido aos mesmos possuírem ausência de pelo como
característica fenotípica, sem apresentar deficiências imunológicas severas, o que
facilitou as avaliações macroscópicas, assim como os procedimentos que se fizeram
necessários nesta pesquisa.
Estes animais permaneceram acondicionados individualmente em caixas
específicas para roedores, porém, nesta pesquisa envolvemos ténicas inovadoras,
segundo Sgay (2007), um animal com mais opções comportamentais terá mais
chances de lidar com eventos estressantes, como a condição experimental, todas
com enriquecimento ambiental, visando melhoria das condições de experimentação,
bem estar psicológico dos animais cativos de experimentação, modificando seu
comportamento e mantendo-os distraídos.
Água potável e ração específica balanceada foram fornecidas ad libitum.
29
Figura 06: Demonstração de “toca” proporcionada pelo enriquecimento ambiental.
Figuras 07 e 08: Enriquecimento ambiental proporcionado aos camundongos, na tentativa de torná-los em melhor bem estar. .
3.2. Ensaio biológico
3.2.1. Indução de lesão epitelial realizada com “punch”
As lesões foram cirurgicamente induzidas, ou seja, em condições ideais de
assepsia, sedação e analgesia. O protocolo anestésico utilizado está de acordo com
o estabelecido pelos comitês de bioética, onde foi realizado a associação de agentes
30 anestésicos injetáveis, por via intramuscular, nas seguintes dosagens: Xilasina 10
mg/Kg e Cetamina 75 mg/Kg de peso corporal.
Após a anestesia dos camundongos e preparo da região com realização de
assepsia e anti-sepsia, foi induzida uma lesão circular padronizada de 5 mm. de
diâmetro no dorso de cada animal, com auxílio de “punch” para biópsia, tesoura e
pinça. (Fig. 09)
Figura 09: Demonstração da lesão circular induzida cirurgicamente no dorso dos camundongos “hairless” com auxílio de punch com diâmetro de 5 mm.
31
3.2.2. Grupos Experimentais
Os camundongos foram divididos em 3 diferentes grupos, de acordo com o
tratamento que receberam:
1. Grupo Controle
O grupo controle recebeu apenas aplicação de soro fisiológico;
2. Grupo Muco Puro
Recebeu tratamento com muco extraído de escargots Achatina fulica
que receberam ração base em sua dieta;
3. Grupo Muco + Própolis
Recebeu tratamento com muco extraído de escargots Achatina fulica
que receberam dieta base acrescida de própolis.
Todos os grupos receberam tratamento diário com auxílio de conta-gotas (Fig.
10), até o 5º dia após cirurgia.
Figura 10: Aplicação de muco após a cirurgia com auxílio de conta-gotas.
32
3.2.3. Avaliação Fenotípica da lesão
Análise Macroscópica:
Os camundongos foram avaliados individualmente e pesados a cada dois
dias. As observações macroscópicas referentes ao reparo cicatricial foram
comparadas entre os grupos experimentais, mensuradas com auxílio de paquímetro
digital - MARBERG e através de registros fotográficos.
3.2.4. Perfusão dos animais
Após o período de tratamento (05 dias), os animais foram novamente
anestesiados com Xilasina 10 mg/ Kg e Cetamina 80 mg/ Kg de peso corporal, e
tiveram o diafragma rompido para perfusão com formol a 10%, em tampão fosfato,
por via intracardíaca utilizando o equipamentos de infusão SAMTRONIC.
3.2.5. Preparo histológico das amostras
Os tecidos de pele foram imersos em solução de formalina a 10% por 24
horas, e em seguida submetidos ao processo de desidratação em álcool 70, 80, 90,
95, absoluto (1,2,3). Uma vez desidratadas, as peças foram diafanizadas em xilol e
incluídas em parafina sob forma de blocos. Os blocos foram montados em
micrótomo e obtidos cortes de seis micra de espessura, de modo que a amostra
fosse seccionada longitudinalmente no sentido mésio-distal. A lâmina recebeu
33 coloração de hematoxilina e eosina (HE) para análise histopatológica (TANOMARU
et al, 2003)
3.2.6. Análise qualitativa ao microscópio de luz
Análise Histológica:
As biópsias foram realizadas após o 5º dia de tratamento nos três diferentes
grupos.
Foram avaliados os diferentes graus de reparo tecidual entre os três grupos.
A análise qualitativa das lâminas permite avaliar o grau de inflamação e
cicatrização, permitindo compará-los entre os diferentes grupos. Foi utilizado um
microscópio de luz Leica MZ125 acoplado a uma câmera digital. As imagens foram
analisadas através de objetivas, com aumento de 20 e 40x.
3.2.7. Análise quantitativa
Os cortes histológicos foram analisados em microscópio óptico, e as tomadas
fotográficas feitas em fotomicroscópio Leica MZ125, no aumento de 100 vezes,
partindo-se da periferia da lesão até o centro da mesma. Foram realizadas de 10 a
12 imagens de cada animal para a contagem de fibroblastos, neutrófilos e capilares
e, assim comparar os processos inflamatórios e cicatricial, entre os três grupos.
A quantificação foi realizada pelo Método de Contagem Diferencial de Pontos,
com auxílio do programa Image-J® (Versão 1,32 para Windows), de domínio público
(http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html), do Instituto Nacional de Saúde (NIH),
Bethesda, EUA. Foi utilizado o sistema-teste de 300 pontos sobre as imagens
34 capturadas para determinação da porcentagem relativa de fibroblastos, neutrófilos e
capilares. Esta relação foi determinada entre os pontos de intersecção encontrados
sobre as respectivas áreas.
Figura 11: Imagem do programa Image-J®, em utilização para contagem de fibroblastos ( seta branca), neutrófilos (seta verde) e capilares (seta azul).
Figura 12: Imagem do programa Image-J®, em utilização para contagem de fibras colágenas.
35
4. RESULTADOS
4.1. Dieta base + própolis ofertada aos escargots Achatina fulica
Inicialmente houve uma preocupação inicial a respeito de uma possível
rejeição dos escargots à nova dieta, devido ao odor e gosto acentuados da própolis.
Porém, foi verificada aceitação dessa nova dieta composta de ração base acrescida
de própolis, havendo uma pequena perda de peso, cerca de 4 a 6 gramas por
animal na primeira semana. Após a segunda semana, os animais começaram a
ganhar peso e não apresentaram mudanças em seu comportamento normal, o que
denotou uma adaptação a dieta testada.
Nesta mesma fase, foram extraídas pequenas porções de muco dos dois
grupos de escargots à fim de verificar fenotipicamente uma possível diferença entre
o muco dos escargots alimentados apenas com ração base em comparação ao
muco dos escargots alimentados com ração base acrescida de própolis.
Foi possível observar uma grande diferença quanto a consistência,
viscosidade, odor e principalmente na coloração dos mucos extraídos dos escargots
com diferentes dietas, constatou-se que, a dieta acrescida de própolis interferiu nas
características da secreção (mucoglicoproteíca) natural dos escargots. (Fig. 13)
36
Figura 13: Muco de escargot da espécie Achatina fulica alimentado com ração base acrescida de própolis e muco de escargot Achatina fulica alimentado apenas com ração base, respectivamente.
4.2. Análise citotóxica do muco de escargot Achatina fulica
Foram avaliados o muco extraído de escargots Achatina fulica que receberam
ração base em sua dieta e o muco extraído de escargots Achatina fulica que
receberam ração base adicionada de própolis.
Nenhuma das concentrações analisadas “in natura”, tanto do muco puro
quanto do muco+própolis, apresentou toxidade, o que permitiu e confirmou a
potencialidade de uso do muco acrescido de própolis com finalidades terapêuticas.
4.3. Análise parasitológica do muco de escargot Achatina fulica
Em nenhum dos mucos analisados foi observada eliminação ou presença de
larvas. Os moluscos avaliados não encontraram-se infectados por Angiostrongylus
cantonensis.
37
4.4. Resultados Macroscópicos aos 5 dias de experimento
Os camundongos não apresentaram alteração comportamental.
Não houve óbitos no período de avaliação.
Os grupos experimentais tratados com muco apresentaram o diâmetro da
lesão menor ao 5º dia de tratamento comparativamente ao grupo controle, tratado
apenas com soro fisiológico. (Tab. 02)
Os aspectos macroscópicos foram praticamente semelhantes entre os grupos
tratados com os mucos, com discreta vantagem para o grupo tratado com muco
extraído de escargots que receberam ração base acrescida de própolis em sua
dieta. Comparativamente ao grupo controle, as bordas das lesões encontraram-se
mais regulares nos grupos tratados com muco, e novamente com discreta vantagem
para o grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base
acrescida de própolis em sua dieta. Não foram observados edemas, nem sinais de
infecção em nenhuma das lesões induzidas, durante todo o período de avaliação.
Tabela 02: Diâmetro da lesão, em milímetros (mm), nos diferentes grupos experimentais ao 5º dia de tratamento. Peso dos camundongos, em gramas (g), no dia da cirurgia (dia 0); ao segundo dia de tratamento (dia 2) e ao 5º dia de tratamento (dia 5). Pirassununga, 2009. Grupos Experimentais Diâmetro da Lesão Dia 0 Dia 2 Dia 5
Muco + Própolis
(Ração Base + Própolis)
11..99mmmm 35 g 37g 38g
Muco Puro
(Ração Base)
22..1188 mmmm 38g 33g 37g
Soro Fisiológico
(Grupo Controle)
33..6644 mmmm
36g 28g 35g
38
4.5. Resultados Histológicos aos 5 dias de experimento
4.5.1. Grupo Experimental Controle - Soro Fisiológico
4.5.1.1. Epitélio
O corte histológico observado, caracterizou-se por ser espesso contendo as
camadas basal, espinhosa, granulosa e a córnea em diferenciação (Fig. 14). A
porção central da lesão ainda sem o epitélio contem muitos neutrófilos e hemáceas
em contato com a camada profunda da crosta, haja visto que o epitélio regenera-se
da borda da lesão para o centro, sob a crosta.
A descrição das células acima é bem característica das fases iniciais do
processo de cicatrização, pois neutrófilos são as primeiras células inflamatórias a
aparecerem e na ausência de infecção diminuem rapidamente do local da lesão.
Figura 14: Fotomicrografia do grupo controle, lesões tratadas com soro fisiológico. Nota-se o epitélio neoformado espesso (seta curva) apresentando a camada córnea em diferenciação, apoiado sobre o tecido conjuntivo (*) neoformado. Coloração H.E. Aumento de 20x.
39
4.5.1.2. Tecido Conjuntivo
O tecido conjuntivo da borda da lesão e sob o epitélio neoformado revelou a
presença de fibroblastos em desenvolvimento, neutrófilos isolados, linfócitos e
numerosos capilares em desenvolvimento com e sem hemáceas (Fig. 15).
Na região central da lesão numerosas células adiposas entremeadas por
neutrófilos e alguns fibroblastos caracterizaram o tecido conjuntivo.
Figura 15: Fotomicrografia do grupo controle com soro fisiológico. O tecido conjuntivo em processo de cicatrização mostrando os capilares (seta) e as células adiposas entre as células variadas. Coloração H.E. Aumento de 40x.
4.5.1.3. Fibras Colágenas
Notou-se por meio da técnica de coloração “Sirius Red” (Fig. 16) que a
periferia da lesão revelou a presença de fibras colágenas agrupadas em feixes além
de fibrilas delgadas.
Na porção central da lesão, foram evidenciadas delgadas fibras colágenas na
camada subjacente ao epitélio, o que vai ao encontro do relatado por Mackay, Miller
(2003) que constataram que os níveis de colágenos aumentaram continuamente por
40 aproximadamente três semanas e essa quantidade determinará a resistência e
tensão da lesão.
4.5.2. Grupo Experimental – Muco com Própolis
4.5.2.1. Epitélio
Na periferia da lesão o epitélio apresentou-se bem diferenciado revelando as
camadas basal, espinhosa, granulosa e espessa camada córnea. Esse epitélio
recoberto pela crosta apresentou muitas hemáceas nos espaços intercelulares (Fig.
17). A porção central da lesão não mostrou ainda o epitélio, mas apresentou a crosta
protegendo a área contendo grande quantidade de hemáceas entremeadas por
numerosos neutrófilos.
Figura 17: Fotomicrografia do grupo tratado com muco+própolis na borda da lesão. Nota-se o epitélio bem diferenciado (seta curva) apresentando a camada córnea espessa, apoiado sobre o tecido de granulação (*) com numerosas células mononucleares e capilares. Coloração H.E. Aumento de 20x.
41
4.5.2.2. Tecido Conjuntivo
Sob o epitélio neoformado, o tecido conjuntivo da periferia da lesão
apresentou-se bastante celular com fibroblastos em desenvolvimento, escassos
neutrófilos, alguns linfócitos, numerosos capilares e vasos sanguíneos de tamanhos
variados preenchidos por hemáceas, (Fig. 18) diferentemente do tratamento com
soro fisiológico que representava nosso controle. As características descritas,
sugeriram que o muco possui a capacidade de acelerar o processo de cicatrização,
pois é observado um início de angiogênese. Isso ocorre porque todos os estágios
da cicatrização são interligados, e havendo alteração em algum destes estágios,
consequentemente a capacidade de reparo se alterará, acelerando ou retardando o
processo de cicatrização, e somado a isso a ausência de contaminação microbiana.
Figura 18: Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco+própolis. O tecido conjuntivo revela numerosos capilares (seta) e vasos sanguíneos bem desenvolvidos (seta grossa) entre as células mononucleares e os fibroblastos em desenvolvimento. Coloração H.E. Aumento de 40x.
42
4.5.2.3. Fibras Colágenas
A coloração por “Sirius Red” revelou na periferia da lesão que os feixes de
fibras estavam bem constituídas, corando-se fortemente. Esta característica esta
associada ao alto número de fibroblastos observados, pois uma das principais
funções destes é a síntese de colágeno, sendo a cicatriz determinada pela
velocidade, quantidade e qualidade da deposição das fibras colágenas. Na porção
central a camada profunda revela feixes de fibras colágenas semelhantes as da
região periférica da lesão. Nota-se uma delgada camada superficial com poucos
feixes de fibras formadas e organizadas (Fig. 19).
4.5.3. Grupo Experimental – Muco Puro
4.5.3.1. Epitélio
A figura muco puro 20x (Fig. 20) mostra que o epitélio da margem da lesão
apresentou-se bem diferenciado distinguindo-se as camadas basal, espinhosa,
granulosa e córnea.
A porção central revelou uma crosta com a porção profunda rica em
neutrófilos ainda com a morfologia preservada e o epitélio ainda ausente.
43
Figura 20: Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco puro. O epitélio estratificado mostra as camadas bem diferenciadas (seta curva) distinguindo-se a camada córnea bem definida, apoiado sobre o tecido de granulação (*) com numerosas células mononucleares e capilares e as células adiposas (seta). Coloração H.E. Aumento de 20x.
4.5.3.2. Tecido Conjuntivo
O tecido conjuntivo na margem da lesão caracterizou-se por ser bastante
celular com a presença de fibroblastos em desenvolvimento neutrófilos e alguns
linfócitos. Notou-se ainda, muitos capilares e vasos sanguíneos com diâmetros
variados (Fig. 21).
44
Figura 21: Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco puro. O tecido conjuntivo na porção profunda apresenta-se mais celular (*) enquanto na porção superficial menos celular (seta curva). Nota-se numerosos capilares com hemáceas (seta) e sem hemáceas (seta grossa) entre as células mononucleares e os fibroblastos em desenvolvimento. Coloração H.E. Aumento de 40x.
No centro da lesão, sob a crosta, notou-se um tecido conjuntivo celular e
avascular sobre a camada de células adiposas e em alguns locais a presença de um
material amorfo entremeado por neutrófilos com a morfologia preservada e alguns
núcleos em degeneração.
4.5.3.3. Fibras Colágenas
A coloração por “Sirius Red” revelou na periferia da lesão que os feixes de
fibras bem constituídas corando-se fortemente. Na porção central a camada
profunda revela feixes de fibras colágenas semelhantes as da região periférica da
lesão. Nota-se uma delgada camada superficial com poucos feixes de fibras
formadas e organizadas. (Figura 22)
45
Fig. 16 Fotomicrografia do grupo controle com soro fisiológico. A coloração específica revela fibrilas colágenas delgadas (seta) e escassos feixes de fibras colágenas (seta grossa). Coloração de Picro-sirius, Aumento de 40x.
Fig. 19 Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco+própolis. A coloração específica revela feixes de fibras colágenas (seta grossa) bem constituídos entre as fibrilas colágenas delgadas (seta). Coloração de Picro-sirius, Aumento de 40x
46
Fig. 22 Fotomicrografia da borda da lesão do grupo tratado com muco puro. A coloração específica revela na porção profunda feixes de fibras colágenas com indícios de agrupamento (seta grossa) e na porção superficial as fibrilas colágenas delgadas (seta). Coloração de Picro-sirius, 40x.
47
4.5.3.4 Enriquecimento Ambiental
As tocas colocadas como enriquecimento ambiental, foram utilizadas pelos
camundongos na maior parte do tempo, utilizando-as para brincar, (Figs. 23 e 24)
rodar, utilizar como ponto de “fuga”, expressar seu comportamento normal, como por
exemplo o ato de “higienizar-se”, e principalmente para dormir.
Não buscou-se avaliar se o enriquecimento ambiental poderia interferir na
cicatrização, e este foi colocado para todos os animais, indistintamente, pensando
somente em dar melhores condições de bem estar aos animais de experimentação.
As pedras higiênicas, utilizadas para forrar as caixas foram importantes para
preservar o ambiente livre umidade, diminuindo os odores normalmente liberados.
As serragens, sobre as pedras higiênicas, além de proporcionar maior conforto,
inclusive térmico, tendo em vista que o experimento foi realizado durante o inverno,
também possibilitou sua utilização como abrigo e “esconderijo”.
Segundo Newberry (1995) o enriquecimento ambiental ou comportamental é
tido como um método efetivo de melhoraria do bem-estar psicológico.
Figuras 23 e 24: Camundongos explorando o enriquecimento ambiental.
48 5. DISCUSSÃO
5.1 Análise do desempenho das rações nos escargots em experimentação
Os animais não mostraram rejeição ao novo alimento ofertado, porém, não se
pode afirmar se houve preferência alimentar por uma ou outra ração, no entanto, a
perda média de peso (aproximadamente 4 a 6 gramas por animal na primeira
semana) não pode ser considerada significativa, pois não houve alteração no
comportamento ingestivo dos animais em experimentação, não ocorreu mortalidade
dos mesmos, o que repercutiu em bem estar adequado durante todo o período
experimental.
A alteração da consistência, viscosidade, odor e coloração dos mucos pode
ser considerada um indicativo da absorção de nutrientes através da dieta e expressa
no muco, como já descrito em literatura.
5.2 Extração do muco
Neste trabalho preconizou-se a ética e o bem estar animal. Sendo assim,
para a extração de muco foi realizada a estimulação manual das glândulas podais
dos escargots, como realizada nos demais experimentos desenvolvidos no Heliciário
Experimental Profa. Dra. Lor Cury.
Esta metodologia se difere das utilizadas por outros pesquisadores como
Iguchi, et al. (1982), Kubota, et al. (1985) e Otsuka-Fuchino, et al. (1992) que fazem
uso de estímulos elétricos de 5 a 10 volts na superfície podal do animal para a
retirada do muco, o que causa estresse e até mesmo a sua morte, não preservando
o bem estar dos mesmos, assim como o uso do método de “afogamento” realizado
por Craze e Barr (2002) no preparo dos animais para dissecação, onde os caracóis
49 terrestres permaneciam em um recipiente com água durante todo o período noturno.
A quantidade de muco extraída através da estimulação manual, nesta pesquisa, foi
aproximadamente 1ml/por animal, podendo esta ser considerada baixa quando
comparada a outras metodologias de extração como a eletroestimulação podal,
porém que colocam o animal em sofrimento experimental.
Os métodos invasivos que podem levar animais a sofrimento foram abolidos
desta metodologia experimental nessa dissertação de mestrado, priorizando sempre
o bem estar animal.
5.3 Análise citotóxica do muco de escargot Achatina fulica
Muito se questiona a respeito da toxidade dos materiais biológicos oriundos
de animais, sendo imprescindível o desenvolvimento de tais testes in vitro, antes de
sua utilização in vivo, esse procedimento vem de encontro a ética e respeito a todos
os animais de experimentação.
Nenhuma das concentrações analisadas in natura, tanto do muco puro quanto
do muco+própolis, apresentou toxidade. Estes resultados estão em consonância
com a fisiologia do muco de caracóis terrestres, que consiste em 90 a 99,7% de seu
peso em água (Lincoln, et al., 2004) e é isento de crescimento bacteriano ou fúngico.
Fisher (1948) já sugeriu que o muco é ativamente anti séptico e inócuo e para
avaliar como substâncias antimicrobianas podem auxiliar no tratamento de feridas
de origem diversas, Martins, et al. (1996) realizaram experimentos em ratos fazendo
uso dessa secreção mucosa em diferentes concentrações.
Corossi e Chabu (2007) constataram que o muco de escargots possuem uma
substância denominada Acharan que possui ação anti angiogênica em tumores,
50 sendo responsáveis pela supressão tumoral e que exerce esta ação inibitória não
devido a ttooxxiicciiddaaddee cceelluullaarr, mas pela ação inibitória nos fatores de crescimento ou
ou por interferir nos mecanismos intracelulares ao se ligarem as proteínas das
membranas.
5.4 Análise parasitológica do muco de escargot Achatina fulica
Além dos escargots que fizeram parte da pesquisa com ração base e ração
base acrescida de própolis em sua dieta com finalidades cicatrizantes, foram
analisados mais 15 escargots provenientes do Heliciário Experimental Profa. Dra.
Lor Cury e 15 escargots asselvajados coletados na região de Pirassununga. Não foi
encontrada a presença de larvas nos mucos analisados.
Uma pesquisa divulgada através da Fundação Oswaldo Cruz e realizada por
NEUHAUSS, et al. (2006) relataram que, após a infecção experimental de
Angiostrongylus costaricensis e Angiostrongylus cantonensis e relatório
parasitológico de 6 lotes de Achatina fulica asselvajados da região de Florianópolis,
Santa Catarina, estes moluscos não apresentam um risco significativo para a
transmissão destes parasitas e que a carga parasitária e taxa de recuperação dos
inócuos foram extremamente baixas. Carvalho, et al., (2003) anteriormente, já havia
relatado que em seus estudos a maioria dos animais também não se infectaram.
Estudos realizados por Vasconcellos e Pile (2001), onde um total de 402
exemplares vivos de Achatina fulica foram coletados no município de Resende,
Estado do Rio de Janeiro e transportados em recipientes plásticos para o
Departamento de Biologia do Instituto Oswaldo Cruz (IOC), após análise
51 constataram que em nenhum dos moluscos testados foi observada eliminação ou
presença de larvas de Angiostrongylus cantonensis.
Apesar destes dados, os escargots Achatina fulica ainda são vistos como
vetores destes parasitas. SOUZA, et al. (2006) destaca que este aspecto pode estar
influenciado pelo conhecimento obtido sobre a helmintíase causada por
Schistosoma mansoni, onde há a participação de moluscos gastrópodes do gênero
Biomphalaria nos processos desta infecção aos seres humanos.
Um fator que deve ser ressaltado e também descrito por Paiva (2004), é que
as conchas de escargots Achatina fulica mortos, deixadas expostas ao meio
ambiente podem servir como reservatório para água da chuva e consequentemente
para proliferação de mosquitos do gênero Aedes, vetores de dengue no Brasil.
5.5 Enriquecimento Ambiental
Não foi avaliado se o enriquecimento ambiental pode interferir na cicatrização,
sendo colocado de igual forma (pedra higiênica, serragem e tocas) para todos os
animais, indistintamente. Buscou-se melhores condições para os animais de
experimentação. De acordo com Uez (2005), o enriquecimento ambiental reduz o
estresse pós-cirúrgico, relatando que o nível de corticosterona foi significativamente
menor na primeira semana de pós operatório nos animais submetidos a
enriquecimento ambiental. A autora também descreveu que os camundongos com
enriquecimento ambiental em suas caixas apresentaram níveis de corticosterona
similares a de animais que não haviam sofrido lesão cirúrgica.
52
O enriquecimento ambiental em nosso trabalho, não interferiu nos resultados,
porém foi gratificante proporcionar uma melhor qualidade de vida para estes animais
criados em laboratório.
5.6 Cicatrização da lesão induzida em camundongos
5.6.1 Avaliação macroscópica
No decorrer do experimento, observou-se que nos camundongos submetidos
a feridas provocadas com auxílio de punch, o tratamento com mucos de escargots
Achatina fulica extraídos de animais que receberam ração base e ração base +
própolis, proporcionaram uma redução maior da área da lesão induzida
comparativamente ao grupo controle, tratado com soro fisiológico.
No 3º dia após a indução das lesões, os aspectos macroscópicos eram
semelhantes entre os grupos tratados com os mucos, com discreta vantagem para o
grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base acrescida
de própolis em sua dieta.
A redução do diâmetro da lesão foi avaliada através de medidas obtidas com
paquímetro digital ao 5º dia de tratamento, a média das áreas lesionadas para o
grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam ração base foi de
22..1188 mmmm.; para o grupo tratado com muco extraído de escargots que receberam
ração base acrescida de própolis em sua dieta foi de 11..9944 mmmm..; e para o grupo
controle, tratado com soro fisiológico foi de 33..6644 mmmm..
53
Os resultados obtidos evidenciam portanto, que o muco de escargots pode
ser usado como agente protetor de células da superfícies expostas ao ambiente
externo. (DAVIES & KHINS, 1998)
Como já relatado anteriormente em pesquisas realizadas por Lorenzi, et.al.
(2006); Sírio, et al. (2005); Caetano, et al. (2005) há muitos indícios demonstrando
que o muco de escargots contem propriedades relacionadas ao processo de
cicatrização o que confirma a possibilidade de utilizá-lo como agente zooterápico.
Estudos realizados nas últimas décadas atribuíram a própolis diversas
propriedades biológicas, entre elas: antimicrobianas, anti-inflamatórias,
cicatrizantes, anestésicas e anti-carcinogênicas, descrevendo após sua utilização
uma melhoria em queimaduras, cicatrização e ulcerações. (PARK, et al., 1998 ;
MUJALLI, 1999; HAVSTEEN, 2002; BERRETA, 2007).
Em função de todas estas características relacionadas a própolis, esta
substância, como parâmetro potencializador da cicatrização através de sua
utilização em dieta oferecidas aos escargots, em nossa hipótese foi confirmada,
embora de maneira ainda prematura, sendo necessário outras repetições.
No que diz respeito a redução da área de lesão cirurgicamente induzida, as
médias mensuradas ao 5º dia de tratamento representam um resultado sinalizador
quanto aos benefícios zooterápicos propostos por esta associação (muco + própolis)
no processo de cicatrização.
5.6.2 Avaliação histológica
Nas ultimas décadas houve um interesse crescente por terapias naturais e
neste campo destaca-se a Zooterapia que faz uso de produtos oriundos dos
54 animais. Tendo por base esta proposição, o muco de escargots destaca-se por suas
propriedades cicatrizantes e antimicrobianas.
A utilização do muco de escargots como um zooterápico tanto em medicina
veterinária quanto humana ainda é uma perspectiva, porém, aliado a esta linha de
pesquisa denominada Zooterapia, a própolis é bem mais estudada e sua
composição química melhor elucidada comparativamente ao muco. Apesar de
ambos possuírem propriedades farmacológicas, a própolis é amplamente descrita
como medicamento em cicatrização de ferimentos, regeneração de tecidos,
eczemas, dermatite de contato, úlceras externas, psoríase, herpes, dermatófitos
(Marcucci, 1996) e queimaduras. (Berreta, 2007).
É conhecido que o reparo de feridas na pele é um processo complexo que
inclui uma reação inflamatória aguda, regeneração das células do parênquima,
migração e proliferação de queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais, síntese
de matriz extracelular, e longo período de remodelação (Singer e Clark, 1999 ; Chen
e Kirsner, 2007).
Nos três grupos analisados a reepitelização ainda encontrava-se incompleta
ao 5º dia de tratamento após a lesão induzida. Como Hattori, et al. (2009) obtiveram
a reepitelização completa aos 10 dias em uma lesão de pele com 8mm de diâmetro
em camundongos, o processo de reparo observado em nosso estudo está dentro da
normalidade. No entanto, o epitélio neoformado da periferia da lesão revelou as
camadas bem diferenciadas nos grupos tratados com os dois tipos de muco (dieta
base e dieta base + própolis). No grupo controle, a camada córnea apresentou-se
menos diferenciada.
Estudos revelam que a quimiocina IL-8 estimula a migração e proliferação dos
queratinócitos (Michel et al., 1992 e Gyulai, 1994). Além disso, Brown et al. (1992) e
55 Deodato, et al. (2002) relataram que os queratinócitos produzem o fator de
crescimento das células do endotélio vascular (VGEF), durante o reparo de lesões, o
qual atua de modo parácrino estimulando tanto a angiogênese (Detmar, et al., 1995)
quanto o reparo através dos queratinócitos (Egozi, et al., 2003).
A análise das células do tecido conjuntivo revelou que o número de neutrófilos
já havia reduzido consideravelmente no quinto dia após a lesão, entretanto este
número apresentou-se significativamente menor nos grupos tratados, quando
comparado ao grupo controle.
Observou-se ainda, que o tecido de granulação estava mais denso no grupo
tratado.
A migração de neutrófilos ao local da lesão inicia-se minutos após a injúria
(Martins, 1997) como uma primeira linha de defesa para a eliminação de corpos
estranhos e bactérias, além de produzir citocinas importantes para ativar os
fibroblastos e queratinócitos. (Hubner, et al., 1996).
Esses neutrófilos recém chegados liberam leucotrienos que apresentam
propriedades quimiotáxicas para todos os leucócitos (Gillitzer e Goebeler, 2001).
Após dois dias, com o fechamento da lesão e epitelização diminui muito o número
de neutrófilos junto a crosta. Monócitos e macrófagos representam a população mais
freqüente de células sanguíneas. (Engelhardt, et al., 1998).
Nossos dados estão de acordo com estas características, principalmente na
região periférica da lesão, no entanto, a região central, ainda sem epitélio revelou
uma freqüência maior de neutrófilos.
Com relação aos fibroblastos, foi observado um maior número nos grupos
tratados em relação ao controle.
56
Está bem estabelecido que os macrófagos são essenciais para o processo de
reparo normal, pois exibem a função imunológica como células apresentadoras de
antígeno, fagocitam e são importantes fontes de fatores de crescimento (Dipietro,
1995), além de produzir quimiocinas como a proteina-1 quimiotáxica de monócito
(MCP-1). (Engelhardt, et al., 1998). Essa quimiocina atrai também os mastócitos que
produzem interleucina-4 (IL-4), a qual estimula a proliferação de fibroblastos
(Trautmann et al., 1998). Desta forma, é possível que os componentes presentes no
muco de alguma forma participam estimulando a proliferação de fibroblastos, uma
vez que o grupo tratado revelou consideravelmente um maior número de
fibroblastos.
Houve também um desenvolvimento maior de fibras colágenas nesses grupos
comparativamente ao grupo controle. Os dados referentes as fibras colágenas foram
revelados por meio de uma técnica de coloração específica, denominada “Sirius
Red”.
A presença marcante de capilares e vasos sanguíneos de calibre variados,
nos grupos tratados, revelados em nossos estudos, sugere a participação do muco
de escargot puro ou com adição de própolis na angiogênese.
Tornossen, et al., (2000) revelaram que durante o reparo da ferida,
brotamentos capilares invadem o coágulo rico em fibrinas e fibronectina e em
poucos dias organiza uma rede microvascular no tecido de granulação. Lindenblatt,
et al. (2008) descreveram que em caso de enxerto de pele a microcirculação está
quase totalmente restaurada ao 5º dia. As características da microvascularização
aumentada quando comparada com a do grupo controle revela a efetividade do
muco puro ou com própolis sobre a angiogenêse, aspecto que favorece a
57 distribuição de oxigênio e nutrientes para as células em rápida proliferação no local
da lesão.
O endotélio dos capilares participam do complexo evento de reparo de lesões,
mediando e regulando o recrutamento dos leucócitos do compartimento intraluminal
para os tecidos e, formando novos vasos durante o reparo da lesão. (Gillitzer &
Goebeler, 2001). O processo da angiogênese está intimamente relacionado à
formação do tecido de granulação, o qual depende da ação relativa dos múltiplos
fatores produzidos por uma variedade de células. Dentre esses fatores encontra-se
o fator de crescimento das células do endotélio vascular (VEGF) produzido pelos
macrófagos e queratinócitos (Dvorak, et al., 1995) e fibroblastos. (Nissen, et al.,
1998) Gillitzer & Goebeler (2002) identificaram forte expressão da quimiocina IL-8
do primeiro ao quarto dia de lesão e a correlacionou com o número aumentado de
vasos neste período.
Estudos têm revelado que o VEGF é um potente estimulador de mitose para
as células do endotélio vascular. (Leug, et al.,1989). O VEGF liga aos receptores
VEGFR-1 e VEGFR-2 regulando a proliferação, migração e distribuição de células
endoteliais requeridas para o brotamento de novos vasos.
Foi possível observar uma diferença na maturação das células cicatriciais nas
lesões dos camundongos tratados com o muco extraído de escargots que
receberam ração acrescida de própolis, porém não se pode afirmar que houve uma
diferença significativa quando comparado ao grupo tratado com muco extraído de
escargots que receberam apenas ração base em sua dieta.
Muito ainda se questiona a respeito da manutenção das atividades biológicas
do muco de escargots, seja quanto a eficácia de suas propriedades anti
inflamatórias, regeneração tissular. A relação do muco de escargots ou alguns dos
58 seus constituintes, bem como as reações de defesa envolvendo fagocitose de
partículas estranhas (Ottaviani, 1983) e encapsulamento de material estranho (Tripp,
1970), fatores de defesa humoral envolvendo lizoenzimas (Cheng, 1975 e Miller, et
al., 1982) e opsonificação. ( Obara, et al., 1992)
Esses fatores de defesa humoral apresentam importante papel na proteção
de infecções microbianas, em especial no primeiro estágio da infecção, isto se deve
a presença da Achacin que é uma glicoproteina de alto peso molecular e composta
de subunidades que parecem estar relacionadas ao “ataque” da membrana
citoplasmática da célula. (Otsuka – Fuchino, et al., 1992).
Os resultados obtidos no presente estudo, podem vir a contribuir para melhor
entendimento do efeito do muco de escargots e consequentemente proporcionar sua
utilização efetiva, segura e de baixo custo em aplicações clínicas do processo de
cicatrização de animais e humanos. A utilização do muco de escargots ou sua
associação a produtos naturais como a própolis, confrei, barbatimão, papaína, entre
outros que promovem e contribuem no processo de cicatrização e todos seus
envolvimentos, é ainda restrito e carente de pesquisas “in vitro” e “in vivo”, mas para
nós representa um início, principalmente para nosso grupo de pesquisa do Heliciário
Experimental Profa. Dra. Lor Cury associado à Faculdade de Odontologia da
Universidade de Sâo Paulo, na pessoa da Dra. Mamie, que contribuiu com toda a
avaliação histológica dos trabalhos desenvolvidos até o presente momento.
Em função dos modestos resultados obtidos, investigações científicas
disponíveis, e de ter a adição de própolis como um sinalizador, este trabalho abre
caminho para outras possibilidades, com um número maior de repetições e adição
de própolis em diferentes concentrações.
59 5. CONCLUSÕES
Com base na metodologia utilizada e nos resultados obtidos conclui-se que:
O muco extraído de escargots Achatina fulica com diferentes dietas
apresentaram diferenciações fenotípicas quanto a consistência, viscosidade, odor e
coloração, demonstrando que as propriedades dos alimentos por eles ingeridos são
eliminados através desta secreção mucoglicoproteica.
Os mucos “in natura” de ambos os tratamentos não apresentaram toxidade,
estando aptos para a utilização proposta.
A utilização de ambos os mucos possibilitou acelerar o processo de
cicatrização.
A cicatrização tecidual foi praticamente semelhante entre os grupos tratados
com os mucos, com discreta vantagem para o grupo tratado com muco extraído de
escargots que receberam ração base acrescida de própolis em sua dieta.
60
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