micro propagare
Post on 20-Jan-2016
398 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
-
UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN
VETERINAR CLUJ-NAPOCA Facultatea de Horticultur
Str. Mntur Nr.3-5 ,400372, Cluj-Napoca, Romnia Tel: 0264-596384; Fax:0264-593792
Conf.dr.ing. Corina Ctan
MICROBIOLOGIE I MICROPROPAGARE
Note de curs
Cluj-Napoca
Editura AcademicPres
2010
-
C1. Biotehnologia clasic i modern
n prezent, umanitatea se confrunt cu o problem serioas i anume "hrana". Din
pcate, pentru o parte a populaiei (mai evident n rile lumii a 3-a), producia agricol
este incapabil s satisfac chiar i cele mai elementare nevoi, problema devenind i mai
acut prin creterea numrului populaiei planetei (5,8 miliarde n prezent fa de 1,6
miliarde n 1914 i, probabil, cam 8,3 miliarde pn n 2025), fapt care va face insuficient
volumul produciei agricole actual. Pentru a asigura necesarul de hran preconizat pentru
2025, nivelul mediu al produciei trebuie s creasc semnificativ (de exemplu, cel al
cerealelor cu pn la 80%). Sofisticatele sisteme agricole de nalt tehnologie ale rilor
dezvoltate (mrirea suprafeelor cultivate, dezvoltarea sistemelor de irigare i creterea
numrului lucrrilor agricole) ncearc, dar cu rezultate limitate, s rezolve dorina de a
crete masiv producia alimentar. n plus, la nivel mondial, sunt nregistrate i pierderi
ale produciei agricole, estimate ntre 20-40%, cauzate de diferii factori: insectele- care
produc pierderi de 14%, plantele duntoare- 10% sau bolile care produc pierderi de
12%, acestea fiind doar pierderi de ordin primar.
Natura a dezvoltat o diversitate vegetal enorm, fiind descrise pn n prezent un
numr de aproximativ 250.000 de specii vegetale dintr-un total estimat la cel puin
500.000 specii diferite. Plantele triesc n ecosisteme n care interacioneaz cu alte
organisme, prin mecanismele de aprare, simbioze sau polenizare. Aceste interaciuni
specifice implic o gam larg de compui chimici. La un anumit nivel, exist o
biochimie similar necesar supravieuirii unei celule vii dar, pe lng aceste procese
primare, organismele vegetale produc i o serie de metabolii secundari cu rol esenial n
interaciunea cu alte organisme. Datorit numrului mare de organisme i a numrului
practic infinit de interaciuni, n cursul evoluiei a aprut un numr enorm de metabolii,
pn n prezent fiind nregistrai peste 100.000, numrul lor sporind anual, n medie, cu
ali peste 4.000 (Verpoorte et al., 1998). Pe lng rolul lor n asigurarea calitii
alimentare a plantelor (gust i culoare), aceti compui prezint i importan economic,
fiind resursa de substane active pentru obinerea de medicamente, substane aromatice,
esene i parfumuri, insecticide i colorani. Mai mult chiar, n ultimi ani a devenit tot mai
-
evident importana lor preventiv i terapeutic cnd sunt utilizai ca ingredieni i
aditivi alimentari, aspect care fundamenteaz un domeniu complet nou i anume, cel al
nutriceuticalelor.
Progresul n tiina plantelor este cea mai bun speran pentru realizarea unei
agriculturi profitabile, susinute economic i stabil din punct de vedere ecologic i, astfel
cercul se nchide - Natura, om i tehnologie.
Strategia iniial de selecie i meninere a unor forme vegetale valoroase a pornit
de la o alegere simpl, adeseori ntmpltoare imediat ce observaia empiric c
seminele unor plante czute pe pmntul rscolit ncolesc, cresc i fructific a
fundamentat ideea de cultur, respectiv de agricultur. ncetul cu ncetul plantele au fost
mai nti domesticite iar cultivarea lor a nlocuit treptat vntoarea i culesul. Profesorul
Indra Vasil spunea odat c: alegerea fcut de omul neolitic s-a dovedit a fi neleapt
i remarcabil de durabil i, de asemenea, a ajutat la susinerea dezvoltrii civilizaiei
umane prin asigurarea unei bogate i dependente surse de nutriie pentru populaia aflat
mereu n cretere numeric i deci, n nevoi.
Dei ne-am dori o armonie continu ntre om i natur, nc din acele vremuri a
existat o permanent lupt ntre forele naturale ale biodiversitii i nevoia omului de a
produce alimente, ntr-un sistem de producie intensiv, din ce n ce mai progresiv. La
nceput, ameliorarea plantelor n scopul mbuntirii lor, s-a bazat pe ncercare i eroare.
Descoperirile fcute de Darwin i Mendel au demonstrat c: 1) combinaiile caracterelor
genetice sunt favorizate ntre indivizi, n cadrul populaiilor, printr-un proces de selecie
natural i 2) c aceste caractere individuale (genele) manifest un proces de segregare n
descenden, n conformitate cu un program predictibil.
n zilele noastre, din punct de vedere tehnic, n activitatea de creare de soiuri i
hibrizi comerciali, amelioratorul trebuie s rezolve, trei grupe de probleme eseniale,
reprezentate de:
- utilizarea unei variabiliti genetice ct mai largi, n limitele resurselor sale
materiale i umane,
- gsirea posibilitilor de selecie a recombinaniilor care prezint
caracteristicile dorite de el i,
-
- utilizarea unor metode rapide de obinere a unei descendene numeroase ale
seleciilor valoroase, cu caracteristici previzibile i stabile.
Biotehnologia vine s ntmpine aceste deziderate ale amelioratorului pe dou ci:
- prin creterea randamentului i a eficienei de selecie propriu zis i,
- prin lrgirea i completarea bazei genetice prin mecanisme directe sau
indirecte de modificare genetic, baz din care amelioratorul poate selecta o
form ct mai potrivit scopurilor sale.
Ulterior cultivrii plantelor, n demersul uman de cunoatere n sine a lucrurilor i
proceselor pn la aciune i aplicaie practic (i invers) omul a descoperit prepararea
vinului (vinificaia) dup ce a observat c sucul stors din struguri i pstrat mai mult
vreme, fermenteaz i se transform ntr-o butur cu noi caliti. Tot aa, omul a ajuns s
tie cum s-i prepare pinea, brnzeturile, s-i pstreze un timp mai ndelungat
alimentele. Azi considerm tehnicile de panificaie, vinificaie, fabricare a berii, de
preparare a brnzeturilor ca reprezentnd biotehnologiile tradiionale. Dup ce celebrul
chimist francez Louis Pasteur (1822-1895) a descoperit rolul esenial al
microorganismelor n procesele de fermentaie sau dup ce autori ca Takamine (1914) n
SUA i Boidin i Effront (1917) n Frana i Belgia au reuit producerea biotehnologic a
enzimelor, amilaza (folosind specii ca Asp. oryzea i Baccilus mesentericus) putem vorbi
cu adevrat de o biotehnologie, clasificat azi ca fiind veche .
Lucrrile lui Fleming (1929), Chain i Abraham (1940) asupra penicilinei,
Waksman, (1943), asupra streptomicinei, Smith i Worrel, (1949-53), asupra
cloranfenicolului, reprezint precursori ai biotehnologiei moderne deoarece ele
reprezint primele realizri n acest domeniu. Prima producie industrial prin fermentaie
a penicilinei a fost realizat de ctre o echip format din Florey i Chain i cea condus
de Perlman n perioada 1940-48. Au urmat apoi, fabricarea prin fermentaie a acidului
glutamic (n Japonia, 1957), a lizinei (Japonia, SUA, 1957-58), a treoninei (1960), a
fenilalaninei, 1961 (USA). Brevetul de invenie pentru fabricarea vitaminei B12 este
datat n 1960 .
Descoperirea succesiv a antibioticelor (> 4000 ntre 1939-59), folosirea lor n
timpul celui de al doilea rzboi mondial, au fost favorizate i de realizarea primelor
bioreactoare (ceea ce a marcat apariia bioingineriei), a punerii la punct a procedeelor (de
-
exemplu: folosirea aa numitelor culturi pure, noiune fundamental n microbiologie,
larg utilizat acum n biotehnologie.
Dezvoltarea industriilor cosmetice, chimice, agro-industrial, i agro-alimentar
(fermentative i de bioconversie), au contribuit la formarea, dezvoltarea i diversificarea
biotehnologiilor moderne.
Datorit valorii unor astfel de cercetri i realizri, n prezent au luat fiin
Societi (1983 Socits de Biotechnologie dans le Monde). Exist aproximativ 700
societi specializate (n Biotechnologie nouvelles (SSB), n SUA, aprox. 300 n Europa.
ncepnd cu anii 80, guvernele lumii ntregi se intereseaz asupra perspectivelor
bio-industriilor, de maniera orientrii politicii lor economice pentru stimularea i
susinerea financiar a cercetrii i industrializrii n acest domeniu. Desigur, exist
Programe naionale de Biotehnologii elaborate i coordonate de diverse ministere.
S-au nfiinat firme specializate (Imunotech anticorpi monoclonali, 1981;
Coletica (cosmetice), CLOMATEC (imunologie), Genset (sinteze ADN i ARN),
BIOEUROPE (Contracte de cercetare) care supervizeaz i direcioneaz dezvoltarea
biotehnologiei.
Materia de baz o constituie de obicei experiena etno-farmacologic,
etnomedical sau/i etnobotanic sau cunotine/informaii specifice de utilizare a unui
anumit compus pentru un anumit scop. Sursa cea mai important i masiv o constituie
speciile vegetale slbatice. Din cele peste 400 specii etnobotanice, doar 1/3 au fost
analizate fitochimic n mod corespunztor. Se estimeaz c, n prezent, doar 5-15% din
totalul de 25.000 pn la 75.000 de specii vegetale au fost studiate ca potenial surs de
substane utile (Simon, 1986), iar n ri mai puin evoluate, n domeniul tiinei doar 1%
din specii au fost analizate. Pentru un proces complet de analiz fitochimic sunt necesare
aproximativ 100 kg de material original (rdcini, tulpini, frunze, flori, fructe, semine).
Acest procedeu este destul de greu de realizat datorit numrului mare de indivizi ce
trebuie colectai, situaie care poate perturba compoziia floristic a unui areal dat sau
poate duce chiar la distrugerea-dispariia unor specii rare sau endemice.
n domeniul biologiei celulare i moleculare ultimii ani au avut i continu s aib
un impact considerabil asupra lucrrilor de ameliorare vegetal concretizndu-se,
-
conform unor reputai amelioratori precum Gallais, Jacobse, Elliot n trei direcii
importante:
-elemente de biologie celular utilizabile n ameliorare,
-elemente de biologie molecular utilizabile n ameliorare,
-manipularea genetic la plante n scop de ameliorare.
Dezvoltarea biologiei celulare i moleculare, genetica molecular i ingineria
genetic au permis punerea la punct a unor tehnici (de exemplu: tehnica amplificrii in
vitro a ADN = PCR (Polymerase Chain Reaction), chromosome walking, chromosome
painting, RFLP (Restriction Fragments Length Polimorphism), identificarea i cartarea
genelor), care sunt n prezent mijloace aproape obligatoriu folosite n procesul
biotehnologic.
Dintre obiectivele noi realizate prin intermediul ingineriei genetice menionm:
posibilitatea de cretere a randamentului fotosintetic, sporirea randamentului de cretere a
utilizri ngrmintelor minerale, modificarea genelor care particip la activizarea cilor
metabolice exprimate prin spor de producie. Prin utilizarea unor ageni, vectori de tipul
plasmidei Ti de la Agrobacterium este posibil realizarea transferului unei heterogene de
la o form donoare la plantele cultivate. Transferul de gene este, fr ndoial, o surs de
variabilitate genetic. n momentul de fa, la plantele de cultur, este posibil transferul a
unor gene care determin:
-depozitarea unei mari cantiti de proteine n semine;
-sinteza unor enzime specifice care s permit acumularea, n organe specializate, a unor
cantiti dorite de amidon sau alte zaharuri;
-sinteza unor compui toxici pentru anumite insecte duntoare;
-sinteza unor proteine virale de tip capsidic care s asigure protecia impotriva infeciilor
virotice;
-sinteza unor produi ce induc androsterilitatea.
Pentru a se ilustra ctigurile ce se ateapt de la manipulrile genetice utillizate
n ameliorarea plantelor nu este lipsit de interes s se prezinte i principalele gene ce se
-
doresc a fi transferate plantelor de cultur, de la alte organisme. Dintre acestea,
deocamdat, au fost realizate:
-rezistena la boli virotice, prin transferul la plantele de cultur, a unor gene virale
ce determin sinteza proteinelor capsidice sau a ARN-ului viral antisens ;
-rezistena la atacul insectelor, bazat pe transferul la plante, al genelor pentru
sinteza proteinelor cristale i a inhibitorilor proteinazei ;
-rezistena la erbicide, obinut prin realizarea unei mutaii n gena ce determin
sinteza proteinei int sau prin introducerea n plante a unor gene ce determin
supraproducia de protein int sau detoxifierea substanei active a erbicidului ;
-rezistena la bolile bacteriene realizat prin transferul la plantele de cultur a
genelor ce codific sinteza unor peptide cu efect bactericid ;
-reglarea coninutului n amidon al tuberculilor de cartof prin transferul de gene ce
influeneaz sinteza enzimei GBSS, responsabil pentru producia de amidon ;
-obinerea unei fermiti ridicate a pulpei fructelor de tomate prin includerea, n
genotipul soiurilor valoroase, a unor gene ce regleaz sinteza enzimei poligalacturonaza,
responsabil cu nmuierea pieliei i pulpei fructelor.
La acest nivel vorbim deja de o altfel de strategie a dezvoltrii biotehnologiei
adic de o strategie caracteristic tiinelor aplicative, care pornete de la idee spre
aplicaiile practice. Aceasta presupune obligativitatea ca naintea oricrui demers practic
s se efectueze mai multe investigaii teoretice (aa numita cercetare fundamental).
Tehnologia se distinge de tiin prin obiectul su, prin realitatea tehnic, dar este totui
tiin datorit coninutului su. n zilele noastre, tehnologia se hrnete din tiin i
hrnete tiina prin executarea tehnic a acesteia, ceea ce presupune (dup Soran et al.,
1993):
- manier metodic (deci se pun probleme care trebuiesc rezolvate n tiin un
rspuns negativ este acceptat; n tehnologie nu are valoare, pentru c nu poate fi
aplicat. Exemple de probleme puse i rezolvate de biotehnologie: prepararea laptelui
lipsit de lactoz, medicamente pe baz de enzime, modelarea artificial a fotosintezei,
obinerea de semine artificiale)
-
- rigoare n demersuri datorit preurilor de cost ridicate, programele aprobate
pentru finanare n biotehnologie trebuie s fie temeinic fundamentate
- precizie n observaii i msurtori, chiar dac conceptele rezultate sunt de manier
general.
- necesitatea susinerii matematice (asigurarea statistic a rezultatelor) (spre
deosebire de cercetarea n tiin unde simpla observaie i descriere a unui
fenomen sau proces este suficient, n biotehnologie, rezultatele se finalizeaz sub
forma tehnologiilor de producie ceea ce presupune elaborarea unui program care
poate i trebuie s fie reproductibil i funcionabil, oricnd i de ctre oricine, n
condiiile respectrii condiiilor indicate n aa numitele protocoale de lucru.
Definirea biotehnologiei
Termenul de Biotehnologie este rezultatul asocierii a dou cuvinte de origine
greac BIOS-via i TECHNE-art, artefact, lucru fcut de mna omului; adic, n sens
modern, tehnic. Pn la apariia i intrarea n vigoare a noilor legiferri internaionale,
biotehnologia se putea defini ca fiind o ramur a biologiei care se ocup de elaborarea
unor procedee tehnice pentru obinerea diverselor bunuri necesare omului, folosindu-se
de particularitile metabolice ale diverselor sisteme vii, n particular ale celulelor de
diverse proveniene (Soran, 1993). Totui, aa cum atrgea atenia Topal (1986), nu
tot ceea ce are tangen cu biologia i cu tehnica este biotehnologie, dup cum nu orice
tehnic biologic sau tehnologie bazat pe o materie prim biologic este biotehnologie.
Aspect foarte bine demonstrat de limitarea precis a noiunii de biotehnologie, n
accepiunea sa modern, legiferat prin Protocolul de la Cartagena, n Articolul 3, ca
fiind aplicaia :
(a). tehnicilor in vitro asupra acidului nucleic, incluznd tehnica ADN-ului
recombinant i injectarea direct de acid dezoxiribonucleic (ADN) n celule sau
organite celulare, sau
(b). fuziunea celulelor dincolo de limita taxonomic a familiei, care depesc
barierele fiziologice reproductive naturale sau cele de recombinare i care nu
sunt tehnici folosite n ameliorarea i selecia clasic
Aplicaiile practice se pot ntrevedea i realiza dup elucidarea aspectelor
teoretice. Principala diferen ntre ceea ce ar putea nsemna termenul de tradiional
-
i nou (cu sensul de noutate) n biotehnologia vegetal este aceea c primul se
bazeaz esenial pe organismul ca ntreg, n timp ce cel de-al doilea se refer la
nivelul celular al organismului.
Micropropagarea Biotehnologia Material: celule organizate, esuturi, fragmente de esuturi, plant ntreag
Obiectiv: multiplicarea nelimitat a aceluiai tip de material biologic valoros
Procese biologice implicate: creterea i dezvoltarea
Stabilitate genetic: obligatorie
Metode i tehnici : simple i ieftine
Aplicaii imediate: comerciale
Material: celule neorganizate: calus, suspensii
celulare, celule imobilizate, celule individuale
Obiectiv: obinere de material genetic modificat, obinere de metabolii secundari Procese biologioce implicate: metabolismul celular
Stabilitate genetic: variabilitate genetic i somaclonal
Metode i tehnici: complexe i sofisticate, destul de costisitoare
Aplicaii imediate: tiinifice, comerciale i industriale
Cultura in vitro a unor specii agricole i horticole este, probabil, primul exemplu
de implicare a cuceririlor biologiei celulare n ameliorarea plantelor. Concret, cultivarea
in vitro a materialului vegetal (esuturi meristematice, celule, embrioni) permite obinerea
rapid a unui numr impresionant de indivizi identici din punct de vedere genetic.
Potenialul culturii in vitro este imens, ns incomplet exploatat.
Noiunea de cultur de esuturi vegetale este sinonim cu cultura in vitro (n sticl) i se refer la:
cultura n condiii aseptice a unor:
Organisme vegetale
Organe vegetale
esuturi vegetale
Celule, suspensii celulare vegetale
Protoplati
Organite celulare, vegetale, etc.
Ce nseamn cultura n condiii controlate?
Cultura aseptic (axenic)
Lips de contaminare (bacterii, ciuperci, virusuri, drojdii)
-
Mediu sterilizat
Lipsit de microorganisme
Condiii controlate de cultur
Suport nutritiv artificial (mediu lichid sau solid)
Fizice (temperatur, lumin, umiditate)
Cursul nr 2
Ce este micropropagarea?
Micropropagarea poate fi definit ca un sistem de cultur pe un suport
nutritiv n condiii de asepsie total a oricarei pri, organ, esut sau
celul vegetal.
Aplicaiile micropropagrii sunt:
Principale -multiplicarea clonal rapid a formelor de interes agronomic -stabilirea, meninerea i desfacerea pe pia a clonelor libere de viroze
Secundare -n cazul speciilor recalcitrante -ca metod suport n procesele de ameliorare
Paralele (alternative) - metod folosit pentru conservarea materialului genetic, -metod de transport a materialului vegetal (se realizeaz n containere mici)
De ce este important micropropagarea ? Pentru c asigur producie prin:
cantitate- obinerea ntr-un timp scurt, pe tot parcursul anului a unor cantiti de material extrem de uniform i ntr-un numr practic nelimitat
calitate- fiind o metod de multiplicare vegetativ asigur uniformitatea genetic a materialului biologic, ntr-o stare fitosanitar excelent
i pentru activitatea de cercetare i studiu asupra unor aspecte precum:
organogeneza
elemente consumate
reglare hormonala vegetal
metoda suport pentru programele de ameliorare genetic
Caracteristicile obligatorii ale micropropagrii:
Se realizeaz pe medii nutritive
Asigur controlul total al influenei factorilor fizici i chimici
Principiile de baz ale micropropagrii
1. Totipotena celular 1902 Haberland 2. Asepsia 1922 Robbins 3. Mediul de cultur 1934 White 4. Reglarea hormonal 1957 Skoog i Miller 5. Etapizarea culturii 1964 Murashige.
Avantajele micropropagrii
-
n principal, alturi de celelalte ramuri ale economiei, agricultura cunoate i ea profunde
transformri. n contextul acestor prefaceri intervenite n agricultur, biotehnologiile moderne devin o
alternativ viabil.
Una din aceste noi bio-tehnologii este cultura de esuturi la plante.
Importana utilizrii tehnicii de nmulire a plantelor prin culturi de esuturi rezult din
numeroasele avantaje pe care le prezint aceast metod n comparaie cu metodele de nmulire vegetativ
tradiionale (clasice). Potenialul acestei metode este prezentat de unii autori ca fiind nelimitat. Exist ns
si reineri cu privire la folosirea pe scar larg a micropropagrii, reineri ce se refer la posibilitatea
meninerii valorii biologice a materialului produs, ntruct nu poate fi exclus riscul apariiei unor mutaii
accidentale. Folosit ns corect, cultura in vitro, poate deveni din acest punct de vedere competitiv
culturii in vivo.
Pentru a scoate mai bine n eviden importana acestei metode, n cele ce urmeaz enumerm
cteva din principalele avantaje oferite de ctre utilizarea n practic a tehnicilor in vitro de
micropropagare:
tehnica de multiplicare in vitro se poate aplica la toate speciile de plante, atunci cnd sunt cunoscute i
ndeplinite condiiile i cerinele la nivel optim;
se pot iniia i practica culturi pe tot parcursul anului, n laboratoare special amenajate, cu explante
provenite de la culturi din cmp, din ser sau din alte culturi controlate putndu-se obine material de
plantat independent de sezon;
n comparaie cu metodele tradiionale de nmulire, cultura in vitro permite multiplicarea rapid, ntr-
un ritm accelerat;
favorizeaz crearea de noi genotipuri, prin inducerea variabilitii genetice (mutaii, hibrizi somatici
prin fuzionare de protoplati, transfer de informaie genetic, etc.);
n majoritatea cazurilor se transmit fidel, la toi descendenii, caracteristicile prinilor din care provin
explantele ( sunt i unele excepii, exemplu la culturile de calus poate apare fenomenul de
poliploidizare);
creaz o economie important de for de munc i de spaii de producie n comparaie cu nmulirea
clasic;
se poate realiza rentinerirea plantelor foarte mbtrnite, respectiv juvenilizarea materialului de plantat
obinndu-se plante de valoarea celor generate din embrionul seminei;
scurteaz perioada de ameliorare a soiurilor la toate speciile de plante dar, n mod deosebit, la speciile
lemnoase ( dela 10 15 ani la numai 2-3 ani);
permite obinerea de material de plantat cu valoare biologic ridicat fiind, prin definiie, liber de
viroze;
exist posibilitatea nmulirii plantelor pentru producerea de samn hibrid
atunci cnd genotipul parental este inapt de autopolenizare.
-
uureaz schimburile de material biologic ntre laboratoare de acelai tip att la nivel naional ct i la
nivel internaional
faciliteaz conservarea fondului genetic n "bnci de gene", ntruct prin pstrarea genotipurilor
valoroase existente se mpiedic eroziunea (degradarea genetic) a speciilor;
nlesnete crearea de plante cu caliti speciale privind coninutul n glucide, aminoacizi, vitamine etc.
micropropagarea constitue o metod mbunattit de munca, activitatea desfsurndu-se n condiii de
igien maxim.
Numeroasele avantaje enumerate au determinat pe muli specialiti din cercetare i producie s
treac la introducerea i aplicarea acestei tehnici, pe scar din ce n ce mai larg, iar la expoziii
internaionale de horticultur i-au fcut apariia incinte aspetice, posibil de a fi instalate n condiii mai
puin proprii nfiinrii unor laboratoare pretenioase. In acest mod chiar i micii productori i amatorii pot
beneficia de utilizarea acestor tehnici moderne de nmulire a plantelor.
Dezavantajele i riscurile micropropagrii Cnd vorbim despre avantajele multiplicrii in vitro a plantelor trebuie s lum n considerare i
anumite riscuri pe care le implic aceast tehnic n condiiile unei producii lrgite, de tip industrial, de
generare a materialului de plantat, prin operarea de subculturi, respectiv prin micropropagare, i anume:
exist pericolul introducerii "explozive" n cultur ntr-un anumit sezon sau an, a speciilor sau soiurilor
atunci la mod, ceea ce poate cauza saturarea pieei cu acelai tip de produs, conducnd la o scdere a
cererii;
rspndirea n cultur a unui numr redus de clone sau chiar nfiinarea de culturi monoclonale, ce va
conduce la o "srcire genetic" a speciilor sau a varieilor aflate n cultur, apare pericolul selectrii
naturale de duntori care pot decima ntr-un timp scurt exemplarele unei anumite clone ;
n condiiile micropropagrii in vitro se remarc prezena unor fenomene fiziologice nedorite, cum este
cazul vitrificrilor sau necrozelor;
pierderi pot fi cauzate i din lipsa de profesionalism i contiinciozitate a persoanelor angajate n
operaiunile implicate n lanul tehnologic de micropropagare in vitro.
trebuie avute n vedere posibile accidente i ntoxicrii personalului muncitor cu diferite substane
toxice folosite n decursul fluxului tehnologic, precum i procentul de pierderi de plante datorat fazelor
de aclimatizare.
Tehnicile i metodele de cultur in vitro permit obinerea a dou tipuri de cretere: creterea
materialului vegetal n form organizat (celule, esuturi specializate i organe) i respectiv, creterea
materialului vegetal n form neorganizat (calus, suspensii celulare).
Creterea organizat
-
Creterea organizat const n crearea sau/i meninerea unei structuri vegetale definite. Aceasta
se realizeaz cnd diferite organe vegetale, cum sunt vrfurile de cretere ale lstarilor sau rdcinilor
(zonele meristemelor apicale), primordiile foliare, muguri floriferi sau flori aflate ntr-o faz iniial de
dezvoltare, fructe mici n faz incipient de dezvoltare, transferate pe medii de cultur i continu
creterea. Creterea organizat se realizeaz i cnd sunt create organe rezultate direct dintr-un fragment de
esut plasat n cultur (deci dintr-un explant) sau dintr-o mas de celule iniial neorganizat (creterea din
timpul proceselor de regenerare). Acest din urm proces, care duce la formarea unor organe de novo, se
numete organogenez (formarea organului vegetal) sau morfogenez (adic dezvoltarea formei).
Cultura esuturilor organizate
Cultura de organe: se folosete ca termen general pentru acele tipuri de culturi n care formele
organizate ale creterii (adic structuri definite cum sunt primordiile foliare, flori, fructe imature) pot fi
meninute in mod continuu.
Cele mai importante tipuri de culturi de organe sunt:
cultura de meristeme, n care pri extrem de mici ale vrfului de cretere (0,5-1 mm) ,
respectiv domul meristematic cu una-dou primordii foliare sunt izolate aseptic din planta
mam i crescute pe mediu. Acest tip de cultur duce la formarea unei singure plante
cultura de noduri, izolai aseptic din mugurii laterali, fiecare fiind purttorul unui
fragment mic de tulpin (1 cm) care poart 1-2 muguri laterali. Acest tip de cultur duce
la formarea a 1-2 lstari
cultura de lstari, este iniiat aseptic din mugurii laterali sau din vrfurilor ramificaiilor
laterale, vrfuri de dimensiuni mai mari dect cele ale meristemelor (1-2 cm), i care
conin i cteva primordii foliare. Acest tip de cultur duce la formarea lstarilor multipli
cultura de embrioni zigotici, const n disecia aseptic a seminelor fertilizate sau
nefertilizate provenind din fructe mature sau imature i creterea lor pe mediu pn n
faza de plantul. Acest tip de cultur duce la formarea unui numr mai mare de plantule.
Cultura embrionilor zigotici este total diferit de ceea ce nseamn cultura embrionilor
somatici!
Cultura de rdcini izolate, presupune cultura pe mediu nutritiv, n condiii aseptice i
controlate a rdcinilor plantelor separat de restul plantei. Acest tip de cultur duce la
formarea unui sistem radicular ramificat. Cultura de rdcini izolate este total diferit de
ceea ce nseamn cultura de rdcinue lnoase (hairy roots), care sunt esuturi tumorale
foliare sau caulinare!
Creterea neorganizat
-
Existena plantelor superioare depinde de alocarea organizat a unor funcii specifice pentru
fiecare parte a organismului. Aceste pri devin difereniate, adic pentru ndeplinirea unor activiti
specifice sunt modificate i funcioneaz diferit.
Creterea neorganizat nu se gsete frecvent n natur dar poate fi realizat cu succes n condiii
de cultur in vitro prin plasarea unor fragmente vegetale pe un mediu special. esutul care rezult n urma
creterii pe acest tip de mediu nu conine nici o structur vegetal care s poat fi identificat, coninnd
doar un numr limitat de celule specializate sau difereniate tipice plantei ntregi. O celul difereniat este
o celul care a dezvoltat o form (o morfologie specific) sau/i funcie (fiziologie specializat). Un esut
difereniat (de exemplu epiderma) este agregarea mai multor celule difereniate. Obinerea separat doar a
unui tip de celule difereniate este greu de realizat deoarece formarea lor n cultur poate fi controlat
numai pe o durat limitat de timp, adic nu putem menine i multiplica, pe o durat nedeterminat n
timp, o cultur alctuit strict numai din celule epidermale (de exemplu). esuturile neorganizate ns
permit meninerea lor, prin transfer repetat pe un mediu nutritiv, pe o durat foarte lung de timp.
Procesele de difereniere care sunt induse in vitro pot fi studiate pentru descrierea botanic a
formrii organelor distincte n timpul morfogenezei.
Cele mai importante tipuri de culturi neorganizate sunt:
cultura de calus (esut), reprezint creterea i meninerea unei mase mari de celulare
neorganizate care rezult din creterea coordonat sau dezorganizat a unor organe
vegetale mici, pri de esut vegetal sau culturi de celule iniiate anterior
cultura de suspensii celulare (celule), reprezint creterea unor populaii de celule i
agregate celulare mici, 20-100 celule, dispersate ntr-un mediu lichid i n condiii de
agitare continu pe platform rotativ orizontal
cultura de protoplati (cte o singur celul) reprezint cultura unor celule vegetale
izolate ca urmare a ndeprtrii temporare a peretelui celular
cultura de antere (grunciori imaturi de polen), reprezint cultura anterelor ntregi care
conin microspori imaturi de polen n scopul obinerii de plante haploide prin formarea
embrionilor somatici direct din polen. Cultura de polen este cea obinut prin creterea
polenului scos din antere.
-
C3 Compoziia mediului de cultur i rolul componentelor sale
n corpul plantei s-au dezvoltat funcii specializate ale diferitelor tipuri de esuturi, care
interacioneaz pentru a asigura creterea i dezvoltarea organismului ca ntreg. n culturile de pri,
organe, esuturi sau celule vegetale separate de corpul ntreg al plantei mam creterea autotrofic nu mai
poate fi realizat astfel nct funciile prilor lips trebuie asigurate de mediul nutritiv. Sruri, vitamine,
aminoacizi, fitoregulatori de cretere , zaharuri sunt componentele mediului de cultur care asigur una
sau mai multe funcii pentru creterea plantelor in vitro. Fiecare specie vegetal, esut sau tip particular
de cultur are o alt formul de optim pentru alctuirea sa. Gsirea formulei de mediu optime pentru
cultur reprezint parte din arta i tiina culivrii materialului vegetal in vitro.
n reuita cultivrii explantelor vegetale pe medii aseptice, un rol important revine compoziiei
chimice a mediilor de cultur (a naturii elementelor prezente n substrat, proporia lor i compuii sub care
ele sunt administrate), epuizrii prefereniale a unor compui din mediu sau a concentrrii acestora,
fenomene ce duc la instalarea unor manifestri de caren, de toxicitate, soldate uneori, chiar cu
necrozarea inoculilor.
nc din momentul efecturii primelor ncercri de cultivare pe medii aseptice a explantelor
vegetale pe baza cercetrilor de nutriie s-au fcut tatonri pentru elucidarea rolului jucat de ctre diferite
elemente chimice, compui i concentraiile optime n care trebuie s fie prezente acestea n mediile de
cultur. Mediile de cultur sunt concepute astfel nct s asigure creterea explantului ntr-un spaiu total
artificial. Fa de mineralele obinuite gsite i n sol, pentru cultura in vitro substratul nutritiv trebuie s
conin i compui organici cum sunt vitaminele, regulatori de cretere i o surs de carbon.
Substane anorganice
Poate cea mai consacrat i utilizat formul de mediu de cultur este MS, formul realizat de
Murashige i Skoog n 1962. Acest mediu a fost realizat prin analiza compuilor anorganici din plantele de
tutun, compui care apoi au fost testai, prin adugarea experimental n compoziia substratului nutritiv n
doze asemntoare celor gsite n plante.
Macroelementele
-
Elementele chimice de baz care intr n structura materiei vii sunt: C, O, H, N, S, P, K, Mg, Na,
Cl, Al, Fe. Aceste elemente asigur cca 99,9 % din materia vie.
Cele mai ntlnite macroelemente n formulele de mediu sunt: calciu (Ca), magneziu (Mg), azotul (N),
fosforul (P), potasiu (K) i sulful (S). Prezena lor este indispensabil plantelor crescute pe medii de cultur
datorit rolului lor structural i funcional n sinteza proteinelor (N i S), sinteza nucleotidelor (P, N, i S),
sinteza peretelui celular (Ca), co-factor enzimatic (Mg) i integritatea membranei celulare (Mg). Srurile
utilizate pentru prepararea mediilor de cultur trebuie s prezinte un nalt grad de puritate.
Calciul. Calciul funcioneaz ca i co-factor pentru majoritatea enzimelor i are un rol de o
importan particular n procesele de sintez a peretelui celular. Carena n calciu n mediile de cultur
duce la necrozarea vrfurilor de cretere prin provocarea unor tulburri grave n esuturi, iar suprimarea din
mediu duce la moartea celuleor n cca dou luni. La prepararea mediilor de cultur, calciul se folosete n
cantiti de 1-3 mM, sub form de clorur de calciu sau nitrat de calciu.
Magneziul. Magneziul este un element critic pentru funcionarea enzimelor i totodat este un
compus integral al moleculei de clorofil. n corpul plantei cationul de magneziu echilibreaz ionii
negativi. n mediul de cultur se utilizeaz n concentraii asemntoare clor de calciu, sub form de sulfat
de magneziu.
Azotul. Prezena azotului este esenial pentru creterea i viaa plantelor. Majoritatea azotului
anorganic este convertit n aminoacizi i apoi n proteine. Azotul necesar culturilor in vitro se asigur pe
dou ci: sruri anorganice i/sau organice. Azotul anorganic este reprezentat de ionii de amoniu i nitrat.
Ionul de nitrat (NO3-), care are rol oxidant, se d n concentraii de 25-40 mM, iar cel de amoniu (NH4
+), cu
rol reductor, se d n concentraie de 2-20 mM, sub form de sruri anorganice. Plantele prezint o
cretere mult mai bun n prezena ambelor forme de ioni, dar mai ales n medii de cultur slab tamponate
este necesar utilizarea ambelor forme, fiind asigurat astfel meninerea valorii stabile a pH-ului. Cnd se
administreaz numai ioni de amoniu acesta are un efect toxic. n mediul de cultur valorile concentraiei de
azot anorganic sunt cuprinse ntre 25-60 mM
Azotul se poate asigura i sub form organic ca aminoacizi cum sunt: glicina (2mg/l), l-
glutamin, asparagin, tirozin (100mg/l), l-arginina sau cisteina (10 mg-l), hidrolizate (cazeina hidrolizat
0,02-0,1%) sau acizi organici. Formele organice sunt utilizate mai ales cnd nu se administreaz amoniu.
Avantajul utilizrii formulelor organice este dat de faptul c majoritatea formelor sunt deja reduse la forme
tipice din plante, astfel c pot fi asimilate la nivel celular cu mare uurin. Prezena aminoacizilor pot avea
i rol inhibitor astfel nct trebuie utilizai cu atenie, mai ales n mediile destinate stimulrii formrii de
calus. Formele organice nu pot nlocui total prezena formelor anorganice.
-
Fosforul. Fosforul este necesar datorit faptului c face parte integrant din acizii nucleici i ali
compui structurali. Obinuit este utilizat sub form de fosfai (PO4-) cu valori cuprinse ntre 1-3 mM. n
exces, fosforul are efect toxic.
Potasiul. Potasiul reprezint majoritatea ionilor pozitivi din plant avnd rol n schimburile de ioni
prin echilibrarea ionilor negativi. Valorile de potasiu cerute de plante difer foarte mult n funcie de specie.
n general prezena lui n mediul de cultur este corelat cu concentraia de nitrai fiind utilizat la valori de
10-30 mM. Carena potasiului duce la necrozarea esuturilor, iar excesul stimuleaz evoluia doar a unor
esuturi.
Sulful. Sulful este esenial n structura proteinelor, prezena lui fiind critic n sinteza
aminoacizilor pe baz de sulf. Sulful prezint valoare nutritiv difereniat, astfel c i sulfiii sunt mai
asimilabili dect sulfurile. Se d n concentraii de 1-3 mM, sub form de ion de SO4- n asociaie cu
magneziul i rar npreun cu ioni de amoniu.Carena de sulf induce o clorozare a esuturilor in vitro, iar
excesul de sulf exercit un efect toxic care produce necrozarea esuturilor.
Microelemente
Microelementele cele mai utilizate n mediile de cultur sunt: borul (Bo), manganul (Mn), cuprul
(Cu), iodul (I), fierul (Fe), molibdenul (Mo), zincul (Zn), nichelul (Ni), cobaltul (Co), aluminiul (Al), etc.
Microelementele sunt indispensabile, exercitnd un rol special asupra esuturilor vegetale,
constituind co-factori enzimatici eseniali plantelor (citocromoxidaza, peroxidaza). Se administreaz de
ordinul M. Suprimarea lor din mediu determin reducerea creterilor cu 40% la primul transfer,
determinnd la cel de-al treilea transfer moartea celulelor. ntre ionii din mediul de cultur se stabilesc
anumite interactiuni si chiar substituiri. Unele substante chimice pot imobiliza unii ionii sau pot provoca
precipitarea unor sruri.
Borul (Bo). Borul este un element esenial n activitatea enzimatic legat de biosinteza ligninei i
metabolismul acizilor fenolici.. Se d sub form de acid boric iar carena lui duce la moartea meristemelor
i a vrfurilor de cretere.
Manganul (Mn). Prezena lui este necesar n reaciile enzimatice, n mod special n procesele
respiratorii i de fotosintez dar i n cresterea rdcinilor, fiind implicat si n sinteza proteic. Se d sub
form de sulfat cu valori ntre 5-30 M.
Cuprul (Cu). Cuprul, administrat sub form de sulfat cupric, are rol n creterea rdcinilor. La
nivel celular, prezena lui, dei n cantiti extrem de mici (0,1M), este un factor critic n reacia multor
enzime, nclusiv n sistemul de oxidare al citocromului. Excesul de cupru este toxic.
-
Iodul (I). Efectul iodului difer n funcie de specie. Dei nu este un element esenial se adaug n
mediul de cultur deoarece stimuleaz creterea rdcinilor i a culturilor de calus.
Cobaltul (Co). Nici acest element nu este esenial n fiziologia plantei dar se regsete n
majoritatea mediilor de cultur destinate unei palete largi de aplicaii. Se d n concentraii asemntoare
celor ale cuprului (0,1 M) iar n concentraii mari poate fi toxic.
Fierul (Fe) Fierul este implicat n sinteza proteic si intr n compozitia unor metalo-enzime.
Prezena fierului, n concentraie de 1M, este necesar att pentru sinteza clorofilei ct i pentru majoritatea
reaciilor de oxidare i reducere. Aspectul cel mai important legat de prezena fierului l reprezint
meninerea valorii optime a pH-ului n mediul de cultur, astfel nct ionii de fier s fie uor asimilai de
celulele vegetale. Pentru stabilizarea ionilor de fier sunt utilizai agenii de chelatizare, compui care leag
ionii metalelor, ionii devenind astfel mult mai accesibili esuturilor vegetale la valori diferite ale pH-ului.
Marea problem n adugarea fierului este dat de formarea compuilor insolubili n mediile cu valori
alcaline, fenomen evident mai ales n mediile lichide. Dei exist mai multe tipuri de ageni de chelatizare,
la culturile in vitro cel mai folosit este forma potasic sau sodic a acidului etilen-diamino-tetra-acetic
(EDTA). Acesta prezint avantajul c, fa de ali chelani, nu este toxic i poate fi folosit la valori variabile
ale pH-ului (pn la pH 8,0). Fe-EDTA-ul poate fi cumprat ca atare sau poate fi preparat din sulfatul feric
(FeSO47 H2O) i Na2EDTA.
Molibdenul (Mo). Molibdenul este co-factor a dou enzime implicate n procesul de transformare
a nitrailor n amoniu i are aciune pozitiv asupta ritmului de cretere al celulelor. Se d sub form de
molibdat de sodiu n concentraii mici (1 M).
Zincul (Zn). Prezena zincului este necesar n activitatea multor enzime i joac un rol esenial n
dezvoltarea cloroplastelor. n mediul de cultur, concentraia de zinc difer destul de mult, avnd valori
cuprinse ntre 5-30 M i nu are efect toxic la concentraii mai mari. Cea mai folosit form de
administrare este cea de sulfat de zinc.
Nichelul (Ni), aluminiul (Al) i siliciul (Si) nu au rol esenial n creterea i dezvoltarea plantelor
in vitro i de aceea se gsesc mai rar n formulele de mediu de cultur.
Compui organici
Exist o diversitate de compui organici care sunt utilizai la preopararea mediilor de
cultur. Compuii organici au rol n cretere (zaharurile) i pentru stimularea evident a proceselor de
cretere celular (vitaminele, compuii organici nedeterminai i acizii organici).
-
Carbonul organic
Datorit faptului c celulele inoculilor nu sunt complet autotrofe meninerea lor n via depinde
de prezena unei surse de carbon, de tipul glucidelor, alcoolilor sau a acizilor organici.
Zaharurile servesc ca surs energetic pentru esuturile i plantele crescute in vitro.
Glucidele se adaug n concentratiile de 1,2-8% n anumite experimente se pot utiliza si fructoz
,glucoz, maltoz , arabinoz .
Dintre alcooli , eficient s-a dovedit glicerolul (polialcool) , n unele cazuri putndu-se aduga si
mezo inozitol (alcooli ciclici).
Acizii organici de tipul acizilor :fumaric , succinic ,si citric au un rol
favorabil n crestere desi au o valoare energetic mai mic dect cea a zaharozei.
Vitamine
Vitaminele sunt indispensabile unei multiplicri i creterii optime
Tiamina (vitamina B1) - stimuleaz creterea biomasei celulare i tisulare.
Piridoxina (vitamina B6 ) - este precursorul unor enzime .
Vitamina C se recomand ca agent antioxidant
Ciancobalamina se folosete n cazuri foarte rare.
Biotina este stimulator n proliferarea celulelor.
Acidul nicotinic influeneaz dezvoltarea celular.
Se mai folosesc : riboflavina, acidul pantotenic.
Mezo-inizitolul
Apa
Apa este solvent pentru substanele hidrofile, asigurnd mediul de dispersie pentru coloizii
organitelor celulare. Calitatea apei utilizat la prepararea mediilor de cultur este un factor deosebit de
important. Apa utilizat trebuie s fie distilat sau bidistilat. n unele situaii este necesar utilizarea apei
pure (ap distilat, sterilizat prin autoclavare i apoi filtrat prin filtru Millipore. Apa distilat se pstreaz
n recipiente bine nchise pentru evitarea solvirii CO2 i scderea pH-ului.
Fitohormonii
-
Fitohormonii ocup poziii cheie in procesele de multiplicare celular i n creterea acestora, n
general i n sinteza plantelor cormofite in special.
Biogeneza fitohormonilor este localizat de regula n alte organe dect organele inta. Din locurile
de sintez ei sunt translocate spre esuturile apte de a recepiona semnale si de a reaciona la stimuli primii,
ei determin producerea unor rspunsuri: biochimice, fiziologice, morfologice.
Celulele responsabile de biogeneza fitohormonilor, trebuie sa dein un sistem enzimatic adecvat
sintezei sau deblocrii cilor metabolice, responsabile de asigurarea manifestrii integrale a activitaii
fiecrui compartiment biomolecular.
Tip de fitohormon Funciile de baz Locul sintezei
AUXINELE Stimuleaz alungirea celular; sunt implicate n fototropism, gravitropism, dominana apical, difereniere vascular; stimuleaz sinteza etilenei i induce formarea rdcinilor adventive la butai
n meristemele mugurilor apicali, embrion, frunze
tinere
CITOCHININELE Stimuleaz diviziunea celular, contracareaz dominana apical, implicate n creterea tulpinii, prelungete succesiunea frunzelor
n rdcini i transportate la alte
organe
ACIDUL
GIBERELINIC
Stimuleaz alungirea tulpinilor, stimuleaz nflorirea la speciile bienale, reglementeaz producia enzimelor hidrolitice la cereale
n meristemele mugurilor apicali i radiculari, frunzele tinere, n embrion
ACIDUL ABSCISIC Inhib creterea, stimuleaz nchiderea stomatelor, menine starea de repaus
n frunze, tulpini i fructele verzi
ETILENA Stimuleaz coacerea fructelor, determin senescena frunzelor i a florilor, precum i cderea lor
n esuturile fructelor coapte, nodurile
caulinare, frunze i flori senescente
Ali aditivi la mediul de cultur
Suplimeni organici complecsi
Partea voodoo a mediilor de cultur este asigurat de cantiti necunoscute a unor compui
complecsi, substane provenind din extracte naturale, care dei nu sunt de dorit a fi folosite neputnd fi
stabilite exact din punct de vedere cantitativ i calitativ, reprezint uneori singura cale pentru reuita unor
culture mai dificile. Aceti suplimeni organici sunt:
Laptele de nuc de cocos
Suc de portocale
Extract de drojdie
Extract de mal
Suc de tomate
Pudr de banane, etc.
-
Crbunele activ
La unele specii favorizeaz creterea esuturilor n culturi de apex i de antere, deoarece s-a
constatat c pulberea de crbune absoarbe compuii toxici rezultai n urma degradrii zaharozei n timpul
sterilizrii prin autoclavare, i totodat absooarbe fitohormonii prezeni n mediu. De asemenea, este folosit
ca substan antioxidant.
.
Clasificarea mediilor de cultur
In funcie de complexitatea formulei chimice: mediu de baz, mediu complex
n funcie de destinaia culturii: de iniiere, de multiplicarede regenerare, de induicere a calusogenezei, de
nrdcinare, culturi doic, medii cu val osmotic ridicat (pt. protoplati) de producie (elicitatori,
precursori) etc.
n funcie de tipul de suport asigurat: lichid, solid, n dublu strat, semisolid
Sisteme de suport
Ageni gelifiani
Agarul este cel mai comun agent solidificator, utilizat n prepararea mediilor de cultur,
preparndu-se din alge roii ale genului Gellidium i comercializat sub form de fibre, solzi sau pulbere.
Agarul fibre sau lamele se pretrateaz pentru ndeprtarea impuritilor. ncercrile de a nlocui agarul cu
gelatina nu au reuit deoarece aceasta nu permite aerarea mediului solidificat, schimburile ionice i
absorbia substanelor din mediu este frnat.
Ca ageni de solidificare a mediului se mai folosesc
Agaroza: o form pur de agar
Gelrite: un gelifiant sintetic
Phytagel: un substituent de agar sintetizat din gum gellan. Acest produs nu opacizeaz mediul de cultur i
datorit gradului ridicat de transparen este recomandat folosirea lui n cazul mediilor pentru studiul
creterii i dezvoltrii rdcinilor.
Biogeluri, silicageluri sau geluri de poliacrilamide.
Suporturi mecanice
-
C4 C4 Etapele micropropagrii
Cultura de esuturi reprezint o metod comercial rapid de multiplicare a
cultivarelor noi obinute, a speciilor rare i a plantelor cu probleme de multiplicare prin
metodele clasice. Datorit cererii tot mai ridicate pentru material vegetal
micromultiplicat, de la cele cteva laboratoare existente acum civa ani, n prezent
funcioneaz o adevrat industrie. Cu toate c nc funcioneaz uniti de producie care
se ocup exclusiv de multiplicarea plantulelor, care sunt apoi vndute mai departe
cultivartorilor, tendina general este ca marile uniti cultivatoare prin crearea propiului
laborator de micropropagare s-i includ i etapa de multiplicare in vitro a materialul
sditor.
-
In vivo=care crete n condiii naturale
In vitro= care crete n condiii perfect controlate; n vase de sticl
Ex vitro= aclimatizat pentru condiii naturale, provenind dintr-o cultur in vitro
T. MURASHIGE descrie n 1974 etapele succesive care trebuie parcurse
la producerea de plante in vitro, in regim industrial, distingnd 3 stadii :
- Stadiul I, de infiintarea culturilor aseptice.
- Stadiul II, de multiplicare si propagare in vitro a subiectului
- Stadiul III, de pregatire a plantelor generate in vitro, pentru transferarea lor ex-vitro
n 1982, din ratiunii de ordin economic, Debergh si Maene recomand extinderea numrului de
stadii, prin nfiinarea unui Stadiu 0, premergator explantrii, i subdivizarea Stadiului III, n dou
substadii.
Nu exist reguli inviolabile pentru propagarea unei anumite specii vegetale prin culturi de esuturi
i adesea este necesar ajustarea i reajustarea compoziiei mediului, a ambientului i chiar a habitatului
astfel nct culturile s poata fi determinate s porneasc n cretere i dezvoltere.
Pentru obiectivele micropropagrii poate fi descris o schem ce cuprinde cinci etape de baz:
Etapa 0 de pregtire a materialului biologic
Etapa 1 de iniiere a culturii in vitro
Etapa 2 de micropropagare
Etapa 3 de pregtire a plantulelor i de nrdcinare n vederea aclimatizrii
Etapa 4 de aclimatizare.
Etapa 0 se refer la pregatirea plantelor - mame donoare de explante; Ele trebuie crescute in conditii
speciale de cultura, in spatii protejate, la temperatura de 25C , in umiditatea atmosferica de 70%; plantele
vor fi udate numai la nivelul solului . Astfel, se obtine cresterea considerabila, a numrului de inoculi
necontaminati . De regula - procentul de inoculi necontaminati nu depasea 50% .
Etapa 1 de iniiere a culturii "in vitro"
nfiinarea culturii const n exploatarea sau dimensionarea fragmentelor din care vor fi nfiinate
culturile sau porionarea inoculilor (calus, culturi de celule ori a suspensiei de protoplati) i n introducerea
acestora n mediu, asigurnd pe tot parcursul operaiilor condiii de asepsie total.
n aceast etap se practic - selectarea cu responsabilitate a materialului vegetal i a explantului,
ales ca iniiator al culturii, a mediilor de cultur i a condiiilor de incubare a inoculilor cu meniunea c o
atenie cu totul special trebuie acordat momentului sterilizrii materialului biologic. De asemenea este
important splarea la jet de ap, timp ndelungat a materialului biologic donator de explante astfel
obinndu-se bune rezultate n ntemeierea culturii aseptice la materialele biologice dificile. Aceast etap
-
de iniiere a culturii are o durat mai lung de cca. 6 luni, n dependen cu materialul biologic cu care se
lucreaz.
Alegerea metodei de pretratament a plantei care urmeaz s fie propragat "in vitro", n cazul
multor specii reprezint o etap esenial de care depinde succesul sau insuccesul fazei de iniiere a culturii
"in vitro".
Se iau n considerare urmtorii factori:
Gradul de contaminare a materialului de pornire;
Cnd explantele necesare iniierii unei culturi sunt recoltate din pri mature ale plantei
sunt necesare procedee foarte complicate de sterilizare.
Etapa 2 de Micromultiplicare
Multiplicarea esuturilor cultivate "in vitro".
Multiplicarea explantelor este un stadiu crucial pentru propagarea speciilor, n scopuri comerciale
i, mai ales, cnd este cerut o rat rapid de multiplicare.
Cel mai adesea, mediul standard de cretere este suplimentat cu citochinine, de obicei BAP sau
chinetin. Exist cazuri cnd se nregistreaz un efect negativ la aplicarea citochininelor n concentraii
mari recomandate pentru sporirea ratei de multiplicare. n general, datorit habiturii esuturilor vegetale la
aplicarea citochininei, apar probleme serioase. n acest caz exist posibilitatea alternrii diferitelor tipuri de
citochinine, ce de exemplu, folosirea didiazuronului, cu efect superior fa de BAP la speciile de Malus,
dnd o rat mai mare de multiplicare i mai puine, probleme n stadiile urmtoare.
Ali factori care afecteaz rata de multiplicare includ intensitatea luminoas, tipul de agar i
cantitatea care se folosete, orientarea explantului pe mediu de inducie.
3. Etapa de inradacinare
Etapa de nrdcinare, se refer la unele modificri n compoziia mediului de cultur si la
schimbarea condiiilor de cultur. Dac n etapa II au predominant auxinele iar citochininele au fost
absente din substratul de cultur sau adgate n concentraii foarte mici, sau chiar au lipsit hormonii in
totalitate, in etapa III se recomand reinstalarea dominaiei apicale la nivelul tulpinilor generate "in vitro"
si inrdcinarea acestora. Exista 3 ci de abordare a etapei III.
1. cultura poate fi transferat pe medii care s permit alungirea lstarilor: dup care vor fi
recoltai si vor fi subcultivai pe un mediu proaspt, pregtit pentru facilitarea rizogenezei la nivelul
minibutailor .
2. inoculii vor fi divizai prin fragmentarea culturii in uniti care s dein o capacitate
regenerativ rapid -n propagule care apoi vor fi subcultivate, pentru a determina formarea de rdcini, in
vederea transferrii culturii "ex-vitro".
3. tulpiniele derivate din Stadiul II, vor fi nrdcinate "in vitro", pe medii agarizate, avnd o
balant hormonal adecvat acestui scop.
Regenerarea de plante ntregi din esuturi propagate "in vitro", n mod obinuit, nseamn
producerea de rdcini, proliferarea ramurilor axilare.
-
Obinerea nrdcinrii la unele specii se realizeaz prin reducerea concentraiei de citochinine, n
prezena sau absena auxinelor, n special AIB (0,02 0,5 mg/l). Acest tratament poate fi folosit cu succes
n combinaie cu reducerea componenei ionice a mediului MS, cu jumtate din concentraia nitrailor. La
unele specii pentru stimularea nrdcinrii mediile pot fi suplimentate cu crbune activ sau ascorbat,
tratament care nu este ns de rutin.
Etapa 4 de aclimatizare i transferul la condiiile ex vitro.
Plantele crescute n condiii "in vitro" se adapteaz la mediul artificial n diferite moduri. Forma
cea mai extrem o reprezint vitrificarea esuturilor vegetale, ceea ce face ca materialul respectiv s nu fie
potrivit pentru transferul direct la condiiile ex vitro. n acest caz, o perioad de pregtire postregenerativ
este necesar pentru asigurarea supravieuirii ex vitro a esuturilor cultivate "in vitro".
Cerinele sunt, n general, asemntoare pentru majoritatea speciilor. n condiii
"in vitro" plantele cresc ntr-un mediu cu un nalt grad de umidiate, ca urmare
pentru aclimatizare a devenit o rutin folosirea camerelor izolate sau a sistemului
de cea artificial. Umiditatea relativ este meninut la un nivel relativ ridicat,
80%, att n timpul zilei ct i n timpul nopii.
Este esenial o splare a rdcinilor plantelor cultivate "in vitro" pentru ndeprtarea oricrui
reziduu de mediu, care reprezint o excelent surs nutriional pentru bacterii. Este indicat o fertilizare
cu un coninut ridicat de fosfor, n special n primele stadii ale aclimatizrii. Cnd umiditatea este foarte
mare, este necesar folosirea fungicidelor.
Cel mai critic factor n momentul ocului de adaptare l constituie n opinia lui De Fosard,
funcionarea maxim a rdcinilor.Este necesar de asemenea protejarea tulpinielor impotriva uscciunii
atmosferice. Acest stadiu poate fi prelungit, uneori, pn la 4 luni . n consecina o deosebit importan
trebuie acordat momentului transferarii plantulelor din condiiile in vitro, n condiii naturale de viat,
precum i modului n care se realizeaz aceast trecere, respectiv realizrii unei acomodri treptate a
neoplantulelor, la condiiile mediului septic.
ansele de supravieuire sunt determinate de pierderile prin transpiraie, datorit lipsei stratului de
cear i a activitii aproape inexistente a stomatelor. Anterior transferarii, plantulele trebuie calite la un
regim de viata mai sarac in umiditate. S-a observat c reducerea umiditii relative la 80% fa de
maximum ct este recomandat la unele specii este suficient pentru a asigura formarea stomatelor
funcionale i acoperirea cu un strat de cear suficient pentru asigurarea reducerilor, pierderilor de ap.
Aceast reducere a umiditii relative se realizeaz prin deschiderea parial a vasului sau prin rcirea bazei
vasului cu 2-3C sub temperatura aerului.
Pentru a mri ansele de supravieuire se recomand supunerea plantelor - prealabil deschiderii
recipientelor de cultur - la un regim special de lumin sau de temperatur prin ridicarea de cca.3-10 ori a
intensitaii luminoase, in raport cu lumina din camera de cretere, din perioada dezvoltrii inoculilor.
-
Intensitatea luminoas, in funcie de specie, va creste la 8-10 mii luci . Uneori, se recomand aplicarea
unor ocuri termice, ori schimbarea fotoperioadei; n unele cazuri, se impune transferarea plantulelor de pe
medii lichide, pe medii solide, respectiv schimbarea calitailor fizice ale substratului de cultur, ori ale
compoziiei chimice - hormonale - a mediului de cultur.
Procentul de supravieuire in momentul trecerii plantulelor din condiiile "in vitro", in mediul
septic, depinde de realizarea acomodrii plantelor la noile condiii i n special de protejarea de stres
hidric, insolatie, extreme termice si curenii de aer. Plantele vor putea fi cultivate dup metodele
agrotehnice normale abia dup acomodarea acestora la condiiile septice.
C5 Embriogeneza somatic. Semine artificiale
Obinerea de semine artificiale Embriogeneza: reprezint procesul iniierii i dezvoltrii unui organism. Se
distinge fa de organogenez prin faptul c rezult o structur autonom care nu mai
are legtur prin intermediul sistemului vascular, cu nici o alt structur iniial. n
practic, termenul include toate procesele (mai mult sau mai puin sincrone) de
dezvoltare a celor doi poli: apical i radicular.
Embriogeneza somatic: reprezint procesul prin care, pornind de la celule somatice,
fr legtur vascular cu esutul de origine, se formeaz o structur bipolar
asemntoare embrionului zigotic. Embrionii somatici se pot diferenia dintr-un
explant vegetal att direct, din celule somatice organizate ct i indirect, prin trecerea
printr-o faz de calus.
Organele plantelor se caracterizeaz prin anumite trsturi comune i anume: structura
celular i tisular (substratul material i sediul proceselor biochimice), caracterul
sistemic al organelor, polaritatea, simetria, orientarea n spaiu i regenerarea. Caracterul
sistemic este dat de alctuirea acestora din ansambluri de esuturi specifice, subordonate
activitii biologice proprii organismului i subordonarea fiziologic a organelor n cadrul
organismului n ansamblul su, ceea ce asigur realizarea funciilor sale biologice.
Polaritatea este dat de deosebirea morfologic i fiziologic ntre baza plantei i vrful
ei. Aceast trstur prezint o importan deosebit n procesele de microbutire
deoarece indiferent de poziionarea unui buta, rdcinile adventive se vor forma numai
-
la baz, crescnd n jos, iar lstririle numai n partea superioar, crescnd n sus.
Simetria, necesar pentru meninerea echilibrului plantei n asigurarea verticalitii se
realizeaz de la baz (cazul rozetelor de frunze) sau pe tulpina plantei.
Precondiiile morfogenezei vegetale Totipotenialitatea celular
Competena de regenerare
potenialul pentru diviziune
efectul de poziie
predispoziia
Totipotenialitatea celular
La nceputul secolului XX, Gottlieb Haberland (1902) a experimentat cultura
celulelor de tip mezofilian pe un mediu de cultur. Dei celulele cultivate nu au intrat n
diviziune, acest experiment este important pentru fundamentarea teoriei totipotenialitii
celulei vegetale. Totipotenialitatea celular se definete ca fiind capacitatea genetic a
celulelor vegetale individuale, nucleate, de a regenera un organism vegetal ntreg,
structural i funcional, n mod direct sau prin intermediul unei faze de calus.
Teoretic, toate celulele somatice sunt totipotente (Steward et al., 1958; Steward,
1968), dar practic exist diferene mari ntre diversele tipuri de celule, speciile vegetale,
gradul de dezvoltare a celulelor de acelai tip, etc. n stadiul difereniat al celulei,
expresia capacitii totipoenei se numete competen morfogenetic. Incapacitatea unor
specii/grenotipuri de a manifesta totipotena celular este confundat adesea cu lipsa
capacitii de regenerare. Expresia variabil a acestei competene este doar rezultatul
gradului de specializare i a statutului fiziologic al celulei respective sau a incapacitii
cercettorului de a identifica condiiile de cultur optime cerute de acest proces.
Competena de regenerare
ntr-un organism vegetal intact, la nivelul celulelor nalt specializate, nu mai apar
niciodat schimbri, ntruct prin ultraspecializarea lor acestea i pierd capacitatea de a
forma plante noi i deci, aceste celule nu pot deveni morfogenice. Unele celule i
pstreaz capacitatea pentru diferenieri particulare sau pentru morfogenez, sau pot
-
dobndi aceast capacitate ca rspuns la un stimul adecvat; acest tip de celule se numesc
celule competente.
Competena reprezint prima condiie a unei celule spre morfogenez, adic de a
urma o cale de dezvoltare definit.
In vitro competena de regenerare este influenat direct de genotip (genele
nucleare, genele citoplasmatice i genele de interaciune), faza ontogenetic a explantului
iniial precum i de condiiile de cultur (mediul i factorii fizici) alei. Toi aceti facori
sunt folosii n stabilirea unui rspuns morfogenic, relativ comun, n cadrul unei specii
vegetale.
potenialul pentru diviziune- reprezint precondiia esenial n
alegerea explantului iniial, fiind definit de prezena unei capaciti de
diviziune ridicat i o plasticitate morfogenetic pronunat
efectul de poziie n 1878 Vchting sublinia importana poziiei unei
celule n organism demonstrnd c destinul ei este n funcie de poziia
sa (teoria proximitii celulare). Dei toate celulele specializate sunt
derivate dintr-o celul iniial (celula ou) nedifereniat, dar care se
divide, forma i polarizarea celulelor, a esuturilor i respectiv, a
organelor vegetale ale unui organism, este stabilit nc din faza
embrionar. Stadiul de difereniere odat fixat, are un rol determinant
n evoluia ulterioar a explantului prelevat. Astfel, explantele
prelevate din partea inferioar formeaz muguri vegetativi (lstari) n
proporie de 100 %, explantele din zona median formeaz muguri n
procent de aproximativ 25 % care evolueaz spre lstari floriferi iar
explantele prelevate din zona florifer, sunt capabile s regenereze, pe
substratul de cultur, direct structuri florale.
predispoziia- este realizat prin utilizarea esuturilor tinere, aflate n
cretere (de exemplu agregate celulare friabile periclinale, celule mari
nedifereniate din coleoriz, mezocotil, apex radicular, etc.).
Organogeneza ca proces de dezvoltare
-
La modul general, dezvoltarea este procesul care rezult ntr-un organism normal,
matur i funcional. Dezvoltarea cuprinde toate evenimentele din timpul vieii unui
organism care au ca scop realizarea corpului organismului n forma sa capabil de a
exercita funciile vitale de nutriie i reproducere, de a folosi oportunitile pentru a face
fa evenimentelor de hazard din timpul vieii (Fosket, 1994). Organogeneza este un
proces de dezvoltare unic n lumea vegetal. Celulele animale urmeaz calea de
dezvoltare ntr-un mod ireversibil al diferenierii spre un esut sau celule specifice
deoarece, n lumea animal mitoza duce la formarea a dou celule fiice identice ca
urmare a separrii celulelor prin formarea unei cute a membranei. (Rappaport, 1986). Cu
alte cuvinte, celulele animale i esuturile rmn din punct de vedere structural i
funcional la forma la care au fost programate din momentul iniierii dezvoltrii. Spre
deosebire de celulele animale, celulele vegetale pe tot parcursul vieii i pstreaz
capacitatea de a se dediferenia din structura i funcionarea lor curent i s nceap o
nou cale de dezvoltare care s sfreasc n structuri morfogenetice complet diferite.
Mitoza n celulele vegetale este un proces al diferenierii interne a citoplasmei (Peters et
al., 2000); aceasta se poate datora i faptului c formarea plcii mediane n nucleu, n
timpul separrii nucleelor fiice, se face ntr-o manier centrifugal; materialul necesar
noului perete este furnizat de aparatul Golgi. Aceast manier de separare, specific
celulelor vegetale, permite meninerea unor pori (deschideri) la nivelul plasmodesmatei
(Krager i Monzer, 1998), deschideri prin care are loc micarea unor macromolecule
(McLean et al., 1997) i chiar nuclei i plastide (Zhang et al., 1990), celulele fiice
meninnd astfel o legtur informaional cu celula mam, continuitate simplastic
indispensabil dezvoltrii i specializrii celulelor (Lucas et al., 1993).
Fragmentele de esuturi vegetale cultivate in vitro pot produce, pornind de la una sau
mai multe celule, numeroase tipuri de primordii de novo, inclusiv de tipul acelora care se
vor diferenia n embrioni, flori, frunze, lstari i rdcini. Celulele din care se vor forma
plantule de novo sunt stimulate pentru a iniia o serie de diviziuni celulare rapide care
au ca scop formarea unor agregate celulare de tip meristematic , denumite
meristemoizi. Termenul de meristemoid a fost introdus n anul 1966 de ctre Torrey i
definete o mas sferic de 6-24 celule nespecializate mici, izodiametrice, cu perete
celular subire, fr vacuole, cu nuclei mari i citoplasm foarte dens (Thorpe, 1982). n
-
primele faze de dezvoltare, meristemoizii sunt structuri morfogenice plastice, fiind
capabile s se dezvolte n diferite tipuri de celule primordiale. Aceast caracteristic de
dezvoltare flexibil st la baza folosirii culturilor de celule n sistemele de propagare.
Exist dou evenimente organogenice care sunt folosite n mod curent pentru propagarea
in vitro. Primul l constituie regenerarea unui numr mare de meristeme caulinare, etap
care este urmat de creterea i dezvoltarea lor n microbutai pn la o mrime suficient
pentru trecerea la al doilea eveniment care const n inducerea produciei de meristeme
radiculare de novo. Meristemele morfogenice pot lua natere pe dou ci distincte:
Direct din celulele difereniate ale esutului proaspt transferat pe un mediu, fr
proliferarea unor celule nedifereniate
Din celulele nespecializate, neorganizate i dedifereniate ale unei culturi de calus
sau suspensie.
Hicks (1980) a denumit aceste dou ci ale morfogenezei ca organogenez direct
i, respectiv, indirect. Cele dou metode difer prin prezena sau absena unui stadiu de
calus n secvenierea organogenetic. Metoda care conine ca faz intermediar
producerea de calus se numete organogenez indirect.
Organogeneza direct
Explant primar
Explant primar Calus Meristemoid
Meristemoid
Primordii de organe
Primordii de organe
Organogeneza indirect
-
Formarea organelor de novo prin intermediul organogenezei indirecte poate duce
la creterea posibilitii de introducere a variaiei n constituia cromozomial. De
exemplu, schimburi poliploidice la nivelul celulelor aflate n faza de calus i astfel, poate
determina apariia unor organe care s prezinte att variaii fiziologice ct i morfogenice.
Pentru cercetrile care sunt dirijate n scopul determinrii cilor fizio-chimice a
procesului de organogenez exist un alt motiv care necesit reducerea sau mcar
minimalizarea acestui tip de dezvoltare organogenetic. Prezena unui stadiu de calus
aflat n diviziune determin o complicare a analizelor evenimentelor moleculare care
nsoesc i care pot determina producia organelor de novo. Grupurile de celule care n
mod particular sunt destinate pentru a deveni organogenice se gsesc ntr-un numr
relativ redus ntr-o mas mare de celule de calus aflate n diviziune, ceea ce limiteaz
foarte mult capacitatea de analiz a fiziologiei i chimiei specifice acestor celule
(Schwartz i Beaty, 1996).
Organogeneza direct se realizeaz fr o faz intermediar de calus, secvena
evenimentelor sintezei organelor de novo fiind urmtoarea:
- explantul de iniiere
- meristemoidul
- primordiul organului.
Cea mai mare diferen dintre cele dou ci de sintez de novo o reprezint
prezena sau absena unui stadiu intermediar detectabil de calus. esutul de calus
coninnd celule care au fost difereniate n forme mai puin specializate din punct de
vedere morfologic i care sunt foarte flexibile schimbrilor, pot servi ca material de
pornire pentru organogeneza de novo. n absena unui stadiu intermediar de calus,
celulele prezente n interiorul explantului au capacitatea de a aciona ca precursori direci
ai noului primordiu. (pentru exemple de organogenez direct sau indirect pornind att
de la explante de tip meristematic ct i nemeristematic, n sisteme diferite de cultur,
vezi Hicks, 1980).
Culturile n care se induce organogeneza sunt folosite ca modele sistem pentru a
determina evenimentele cauzale prin care sunt produse rdcinile i tulpinile n mod
direct, iar prin generalizare, de a da rspunsuri proceselor morfogenice. ntr-un astfel de
-
model, procesul de organogenez este mprit n cteva faze, conform schemei adaptate
dup Christianson i Warnick, (1985).
competen determinare
EXPLANT ORGAN (regenerare)
dedifereniere inducere difereniere (redifereniere)
Punctul de interes n reprezint cele dou faze iniiale care preced faza de
difereniere, adic de pierderea caracterului de specializat. Aceste faze cuprind
evenimente care ncep cu dediferenierea, ceea ce duce la obinerea competenei, urmat
de iniiere care culmineaz cu stadiul complet de determinare. Diferenierile morfologice
i de dezvoltare ale organului nou format pot duce la realizarea structurii funcionale
dorit. Primele dou faze ale modelului presupun evenimente care se desfoar naintea
morfogenezei (Hicks, 1980). Embrionii, meristemele apicale, organele primordiale i
straturile de celule ale organelor mature sau fragmente complexe ale organelor mature,
chiar organe intacte i protoplati, pot fi folosii ca explantele de iniiere.
Dediferenierea (dup Schwartz i Beaty, 1996)
Procesul de dedifereniere presupune reversia spre un stadiu mai flexibil, plastic,
care poate s dea sau nu natere unui esut de tip calus. n cazul organogenezei directe,
celulele competente care nu au produs calus pot fi considerate ca singurele implicate n
formarea organelor progenitoare, ceea ce presupune c aceste celule previn procesele de
dedifereniere, fie n mod individual, fie n grupuri mici destinate de a produce noi
primordii. Explantele foliare de Convolvulus arvensis L. produc rdcini i lstari prin
intermediul unei ci organogenice indirecte care implic procese de dedifereniere ce duc
la formarea unei cantiti limitate de calus din care sunt generate organe noi (Christianson
i Warnick, 1983). Rezultatul completrii acestei prime etape const n obinerea
statutului de competen a explantului iniial, statul care se caracterizeaz prin capacitatea
de a rspunde la stimulii organogenetici. Atingerea nivelului de competen de ctre
esutul implicat nu reprezint totdeauna un proces realizat ntr-o singur etap, uneori
fiind necesar o etap intermediar n care se folosesc fitoregulatorii de cretere. De
-
exemplu, n cazul calusului de Medicago sativa care a fost cultivat timp de 4 zile pe un
mediu cu o concentraie relativ ridicat de chinetin i o concentraie sczut de 2,4-D au
fost obinute rdcini. Lstarii sunt produi cnd calusul este tratat n acelai regim de
cultur, cu excepia faptului c raportul regulatorilor de cretere este schimbat
(concentraii mari de 2,4-D i sczute de chinetin). Tratamentul cu fitoregulatori de
cretere urmat de transferul pe un mediu lipsit de regulatori de cretere nu este suficient
ca s aduc esuturile n faza a doua de iniiere, faz cerut pentru producerea rdcinilor
sau a tulpinilor (Walker et al., 1979). Este necesar o anumit mrime cu o limit minim
de 105 m, precum i o mrime minim a diametrului agregatelor celulare de calus
pentru a fi competente pentru iniierea morfogenezei.
Iniierea
Etape de iniiere apare n perioada dintre momentul n care esutul devine
competent i momentul n care devine complet determinat pentru a produce primordiile.
Aceast faz se caracterizeaz printr-un numr de timpi fenocritici, momente care
rezult din funcionarea unei ci genice integrate care dirijeaz procesele de dezvoltare i
precede diferenierea morfologic. n 1958 a fost sugerat ideea (Landauer) c anumii
stimuli chimici i fizici pot s ntrerup o cale de dezvoltare determinat genetic, ceea ce
duce la modificarea rezultatului morfogenic care produc apariia fenotipurilor de tip
mutant. Christianson i Warnick, n 1984, au identificat civa ageni chimici care
intervin n timpul fazei de iniiere la Convolvulus arvensis. Agenii care induc producerea
acestor tipuri de fenotipuri sunt efectivi numai n anumite momente specifice n timpul
etapei de iniiere, fiind denumii elemente-cheie n calea genetic a proceselor de
dezvoltare. Agenii inductori sau inhibitori specifici de etap se pare c blocheaz
anumite ci directe de aciune a genei sau a produsului genei prin activarea unei gene
control. n sistemul prezentat la Convolvulus arvensis a fost blocat gena de determinare
a iniierii lstarului aprnd un fenotip modificat de tip calus.
Sfritul procesului de iniiere este definit ca punctul n care o celul sau un grup
de celule devin complet determinate pentru producerea lstarilor sau a rdcinilor.
Practic, acest punct este atins cnd explantele vegetale pot fi transferate de pe mediul de
inducere al lstarilor sau rdcinilor i transferate pe un mediu de baz fr regulatori de
-
cretere coninnd doar sruri minerale, vitamine i o surs de carbon, cultura avnd ca
scop producerea organului dorit. n acest moment, esutul a ncheiat complet procesul de
iniiere i poate fi considerat complet determinat pentru organogenez (Schwartz i
Beaty, 1996).
Gradul de competen celular pentru organogenez variaz n funcie de specie i
uneori chiar n cadrul speciei. Tipul de esut recoltat din planta mam influeneaz radical
organogeneza (la mr, obinerea de embrioni somatici din frunz este dependent de
genotip, Welander, 1988). Aceasta sugereaz efectul primar i secundar al unor gene.
Caracteristicile genetice ale esuturilor cultivate in vitro sunt direct legate de
comportamentul esutului respectiv manifestat ca parte a plantei ntregi, (in vivo), dar
rspunsurile morfogenice ale fragmentului separat i cultivat pe mediu sunt rezultatul
efectului secundar i a altor gene, activate datorit noilor condiii de via. Existena
acestor mecanisme genetice de control a competenei celulare poate fi:
- rezultatul unei expresii pleiotropice a genelor care sunt activate numai n
anumite tipuri de esuturi, sau
- controlat de secvene genice specifice care au un efect comun n toate tipurile
de celule, dar care :
sau sunt exprimate chiar n momentul recoltrii explantului
sau nivelul lor de expresie depinde de prezena unui anumit grad de dezvoltare a
celulei.
Msura n care explantul vegetal devine competent i, eventual determinant, este
n funcie de condiii fizice i chimice la care a fost expus. n cazul culturilor in vitro,
proprietile mediului nutritiv sunt asociate cu condiiile fizice care, amndou, joac un
rol esenial n determinarea semnalelor organogenice. Faptul c mediul de cultur este
elementul-cheie n controlul chimic al organogenezei in vitro ca raport dintre auxinele i
citochininele prezente n mediu a fost demonstrat de Skoog i Miller, nc din 1957.
Concluzia lor este c: interaciunile cantitative dintre factorii de cretere n special dintre
AIA i chinetin (auxine i citochinine) i ntre acestea i ali factori asigur un mecanism
comun de control al tuturor tipurilor de cretere analizate, de la creterea n mrime a
celulelor pn la formarea organelor. Pe lng acestea, variabile precum: lungimea zilei,
calitatea i cantitatea luminii, vrsta i mrimea explantului vegetal, genotipul i nutriia
-
mineral sunt civa dintre factorii care influeneaz capacitatea de regenerare. n absena
unor markeri genetici sau biochimici care s indice n mod clar calea de dezvoltare exact
a explantului primar i pn cnd vor fi puse la punct metode de dirijare i programare
genetic a esuturilor recalcitrante, singura modalitate de a determina iniierea
organogenezei ntr-un esut vegetal, rmne ghicitul prin tatonare (Schwarz i Beaty,
1996).
Diferenierea
Cea de-a treia etap n organogenez o reprezint faza de difereniere, etap n
care noul organ devine vizibil.
Faza de difereniere final a organogenezei asigur primul moment n care poate
fi observat geneza structural a noului organ ca rezultat al programului de dezvoltare
nceput n faza de iniiere. Prin observaia microscopic a schimbrilor arhitecturii
histologice interme i de suprafa, care apar n timpul fazei de difereniere, pot fi
identificate etapele morfologice ale evenimentelor care apar n timpul procesului de
organogenez : schimbri morfologice la nivelul suprafeei explantului, apariia
meristemoizilor, expansiunea verical i orizontal a noii regiuni formate, ieirea noului
meristem de sub epiderm, primordiile foliare i, n final, mugurele adventiv nou format.
C. Regenerare prin embriogenez somatic (nezigotic)
Embriogeneza somatic a fost observat pentru prima dat de Reinert (1958) i
apoi de Steward i Mearks (1958). Regenerarea prin embriogenez somatic se distinge
evident de regenerarea prin meristeme datorit unor caracteristici specifice de dezvoltare
i anume:
Formarea unui embrion (somatic dar i zigotic) ncepe de la o singur celul i
trece obligatoriu prin fazele globular, cordiform, torpedou i de maturare (faza
cotiledonal); rezultatul este o structur bipolar, deinnd dou tipuri de
meristeme: radicular, la un capt i, caulinar, la cellalt capt, n timp ce
organogeneza d natere numai la un singur tip din cele dou meristeme.
Embrionii somatici trebuie s ndeplineasc obligatoriu criteriul de baz al unei
structuri bipolare, adic formarea unei structuri vasculare proprii i izolate; n
-
cazul organogenezei, vasele conductoare asigur continuitatea legturii cu
esutul original (calusul).
Proteinele specifice care apar n cotiledoanele embrionilor somatici nu au fost
identificate n frunzele regenerate din lstarii adventivi (Crouch, 1982).
Embriogeneza in vitro, pornind de la celule somatice, trebuie vzut ca o
proprietate general specific plantelor superioare. Cnd embrionii somatici sunt obinui
pornind de la o singur celul procesele decurg de la omogen i general spre heterogen i
particular, fenomenul demonstrnd indiscutabil totipotenialitatea celular; prezena unui
program de dezvoltare foarte bine conservat este nnscut ntr-un numr mare de tipuri de
celule. Culturile de celule embriogenice permit ca ntreg genomul vegetal s poat fi
manipulat genetic prin tehnicile biologice. Odat ce celulele prolifereaz, pot fi
modificate genetic, iar plantele regenerate din astfel de celule modificate pot fi
reconstituite plante modificate.
Embriogeneza somatic
Un embrion, zigotic, somatic, (direct sau indus), este definit ca un individ nou,
rezultat dintr-o singur celul, care nu are legtur vascular cu esutul mam (Haccius,
1978) i este stadiul primar multicelular al unui individ, stadiu care are loc nainte de
dezvoltarea structurilor i a organelor caracteristice a unei specii date. n majoritatea
organismelor, embrionul este o entitate distinct morfologic care funcioneaz ca un
stadiu intermediar n procesul de tranziie de la viaa gametofitic la cea sporofitic
(Gray, 1996). La speciile superioare, tipic este embrionul zigotic, care se dezvolt n
interiorul seminei. Acest tip de embrion se formeaz ca produs al fuziunii gametice, n
urma reproducerii sexuale, fiind denumit embrion zigotic.
Caracteristic speciilor vegetale este faptul c din esuturi nedifereniate pot s
formeze embrioni nezigotici, perfect formai morfologic i funcional. Deoarece acest tip
de embrioni se formeaz apomictic (pe cale asexuat), plantulele care se dezvolt din ei
sunt identice genetic cu planta mam. Tipurile de celule din care pot s apar astfel de
formaiuni aparin diferitelor esuturi somatice i sunt ntr-un numr diferit att n faza
gametofitic ct i sporofitic a ciclului vegetal. Iniial, embrionii somatici au fost
-
denumii embrioizi, pentru a sublinia diferena fa de embrionii zigotici i din pcate
acest termen mai este meninut n anumite lucrri. Diferena dintre embrionul zigotic i
cel somatic nu este foarte bine neleas i descris n literatur.
Tabel.6. Clasificarea embrinilor (dup Bhojwani i Razdan, 1983)
1. Embrioni zigotici
2. Embrioni nezigotici:
- embrioni somatici
- embrioni adventivi
- embrioni partenogenetici
- embrioni androgenetici
Formai prin fertilizarea celulelor ou sau a zigotului
Formai din alte celule dect cele zigotice
- formai de celulele sporofitice, cu excepia
zigotului
- embrioni somatici formai direct din ali
embrioni sau organe
- formai din celule ou nefertilizate
formai de gametofilul mascul (microspori,
grunciori de polen)
Datorit faptului c majoritatea acestor tipuri de embrioni pot fi manipulai n
culturile in vitro, sistemele de cultur embriogenice sunt folosite ca baz n metodologiile
destinate mbuntirii calitative a plantelor, deoarece permit nu numai clonarea prin
propagarea vegetativ, dar i schimbri specifice i direcionate care pot fi introduse n
indivizi de elit selecionai. Celulele individuale modificate sau embrionii pot fi dup
aceea multiplicai eficient in vitro, ntr-un numr foarte mare de exemplare nainte de
dezvoltarea plantei. Aceas modalitate de manipulare genetic elimin consecinele
nedorite ale reproducerii sexuale (recombinarea genetic n mas i ciclurile de selecie
cerute), astfel nct tehnologia de ameliorare este net superioar prin reducerea timpului
i a efortului de execuie.
Condiiile de cretere a embrionilor somatici versus embrioni zigotici
-
n smn, n esutul nucelar, embrionul se formeaz ca rezultat al fertilizrii unei
celule ou. Unele specii au tendina de a forma mai mult de un embrion, ca urmare a
diviziunii celulei embrionice primare, rezultnd poliembrioni (la unele varieti de
Citrus).
Embrionii somatici pot aprea uneori i n natur, din esut ovular fr fuziunea
unor celule sau nuclee, proces denumit apomixie. Originea lor este unicelular (dintr-o
celul somatic diploid a sacului embrionar, fiind denumii apospori- sau dintr-o celul
nucelar, fiind denumii embrioni nucelari). Mai rar, embrionii somatici se formeaz
direct pe frunzele unor specii ca de exemplu Kalanchoe, Ranunculus Asplenium, etc.
n smn, esutul nutritiv, endospermul, mbrac embrionul zigotic aflat n
dezvoltare. n primele faze ale embriogenezei, substanele nutritive ajung la embrionul
zigotic att prin celulele suspensoare ct i prin suprafaa embrionului propriu-zis. n
funcie de specie pot s apar diferene n modul de nutriie prin suspensor sau embrionul
propriu-zis, de la o specie la alta. Spre deosebire de aceasta, n cazul embrionilor somatici
faptul c se dezvolt fr esut protector (ei nu sunt mbrcai de un esut precum
endospermul), face ca ei s nu fie subordonai unui regim nalt controlat i specializat
(Gray i Purohit, 1991). Cel mai adesea, suspensorul este singura legtur ntre embrion
i mediul de cultur. Aceasta demonstreaz c suspensorul poate servi ca mod de
asigurare a nutriiei necesare i c endospermul nu este absolut necesar n timpul
embriogenezei i a germinaiei (Gray, 1996).
Ce este o smn ?
O smn vegetal este o structur generativ, alctuit din embrion, endosperm
i un nveli de protecie denumit testa. La dicotiledonate embrionul este alctuit din dou
cotiledoane ataate unei axe centrale. Partea apical, plumula, crete sub form de lstar
iar partea bazal este alctuit din hipocotil i radicel, viitorul sistem radicular.
Endospermul asigur suportul nutritiv pe durata germinaiei, pn cnd plantula este
capabil de fotosintez. Testa, asigu protecia embrionului pe durata germinaiei fiind
ndeprtat pentru eliberarea rdcinuei i apoi a tulpiniei.
Ce este o smn artificial?
-
Seminele arificiale au fost introduce njurul anilor 1970 ca analog seminelor
obinuite. Acest produs se adreseaz speciilor care nu produc semine viabile,
reprezentnd metoda de multiplicare a acestora. Datorit dimensiunilor lor mici,
seminele artificiale prezint i avantaje n ceea ce privete manipularea, depozitarea,
transportul i plantarea lor.
Cum se obine o smn artificial?
Seminele artificiale se obin prin ncapsularea unui propagul vegetal
(embrionul) ntr-u
top related