mikrobiologi 6
Post on 30-Dec-2014
112 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Tujuan Praktikum
Praktikum ini bertujuan untuk mengenalkan mahasiswa dengan
beberapa pengujian biokimia yang digunakan untuk karakterisasi dan
identifikasi mikrobia.
1.2 Dasar Teori
Banyaknya oksigen di lingkungan menyebabkan kebanyakan bakteri
akan memproduksi hidrogen peroksida yang bersifat toksik terhadap bakteri
yang masih hidup, untuk menjaga kelangsungan hidupnya sejumlah bakteri
mampu menghasilkan enzim katalase yang memecah H2O2 menjadi air dan
oksigen sehingga sifat toksiknya hilang. Produk toksik H2O2 yang dipecah
menjadi H2O dan O2 dipecah menggunakan enzim katalase yang terdapat
secara luas dalam jaringan khususnya hati. Reaksi oksidase asam amino
bersifat reversibel, jika katalase tidak ada maka produk α asam keto akan
mengalami dekarboksilasi non enzimatik oleh H2O2 hingga terbentuk asam
karboksilat dengan kurang satu karbon (Murray, 1995).
E.coli yang tidak mengandung enzim katalase sangat rentan terhadap
kerusakan oksidatif. Superoksida dismutase merupakan adaptasi molekuler
yang penting terhadap paparan lingkungan oksigen. Kepentingan enzim ini
diperkuat oleh penemuan terakhir bahwa mutasi superoksida dismutase
menyebabkan sklerosis amiotrofik lateral (Strayer, 2000).
Hidrogen peroksidase yang terbentuk oleh superoksida dismutase
dan reaksi katalitik dari radikal hidroperoksil dimusnahkan oleh katalase,
suatu protein yang terdapat melimpah dan mengkatalisasi dismutasi
hidrogen peroksida menjadi air dan molekul oksigen. Katalase mempunyai
daya katalitik yang besar. Menempatkannya dalam golongan enzim elit
yang memperoleh kinetik sempurna. Peroksidase yang juga enzim hem.
Mengkatalisis reaksi analog yaitu reduksi alkil peroksida menjadi air dan
alkohol oleh suatu reduktan (AH2) dapat berupa sitokrom c atau askorbat
(Strayer, 2000).
Uji katalase akan positif ditandai dengan terbentuknya gelembung-
gelembung oksigen yang menunjukkan bahwa organisme tersebut
menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang menghasilkan hidrogen
peroksida tersebut adalah bakteri aerobik dan anaerobik. Bakteri tersebut
dapat tetap hidup karena adanya antimetabolit yang dihasilkan oleh katalase
(Hadioetomo, 1993).
Asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, pepton
dan peptida. Triptofan merupakan asam amino yang penting untuk
mengetahui jenis bakteri tertentu karena beberapa bakteri mampu
menghidrolisa asam amino ini. Hasil hidrolisis triftofan adalah senyawa
indol yang dapat diamati dengan tes kalorimeter. Disamping terbentuknya
indol pada medium ini juga dapat diamati sulfat dan gerakan bakteri
(motilitas bakteri) (Murray, 1995).
Hidrogen sulfida (H2S) merupakan gas yang timbul sebagai hasil
penguraian protein dan senyawa-senyawa lain yang mengandung belerang.
Biasanya hasil itu tidak banyak, namun hal ini dapat diuji dengan indikator.
Pembusukan bangkai serta penguraian sulfat ditempat-tempat yang becek
menimbulkan banyak H2S. Bakteri yang banyak menghasilkan hidrogen
sulfida ialah Desulfovibrio desulfuricans (Dwidjoseputro, 2003).
H2S diproduksi oleh beberapa bakteri melalui pemecahan asam
amino yang mengandung unsur belerang seperti sistin dan metionin. H2S
juga dapat diproduksi melalui reduksi senyawa-senyawa belerang anorganik
misalnya tiosulfat, sulfit atau sulfat. H2S yang terjadi dapat diamati dengan
menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium. H2S akan
bereaksi dengan senyawa-senyawa ini membentuk logam sulfida yang
berwarna hitam (Schlegel, 1993).
Gelatin adalah protein yang diperoleh dari hidrolisis kolagen yaitu
zat pada jaringan penghubung dan tendon hewan. Gelatin akan terurai oleh
mikrobia yang mensintesis enzim proteolisis. Larutan gelatin bersifat cair
pada suhu ruangan atau suhu kamar dan padat apabila berada dalam
refrigerator, apabila gelatin sudah dihidrolisis oleh mikrobia akan bersifat
cair (Murray, 1995).
BAB II
METODE PRAKTIKUM
2.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Senin, 2 Maret 2012, pukul
10.00-12.10 WITA, bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lambung Mangkurat
Banjarbaru.
2.2 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah botol semprot, jarum inokulasi/ose,
bunsen, gelas objek, inkubator, tabung reaksi dan pipet tetes.
Bahan-bahan yang digunakan adalah biakan E. coli, biakan Bacillus
sp., biakan Staphylococcus aureus, medium Tryptone Broth (TB), medium
Triple Sugar Iron Agar (TSIA), medium Nutrient Gelatin (NG), larutan
H2O2 3%, reagent Ehrlich, alkohol 70%, kertas label, sil dan kapas.
2.3 Prosedur Kerja
2.3.1 Uji Katalase
1. Dibersihkan gelas objek dengan alkohol 70%.
2. Dinyalakan bunsen, dipanaskan jarum ose sampai panas memijar.
3. Dibiarkan jarum ose beberapa saat hingga sedikit dingin.
4. Diambil biakan bakteri (Eschericia coli dan Bacillus sp.) dengan jarum
ose sebanyak 1 ose.
5. Diratakan setipis mungkin di bagian tengah gelas benda dan dikering
anginkan.
6. Ditetesi larutan H2O2 3% sampai menutup seluruh suspensi bakteri.
7. Diamati adanya gelembung-gelembung O2 yang terbentuk dari hasil
kedua bakteri (Eschericia coli dan Bacillus sp.) tersebut pada gelas
objek.
2.3.2 Produksi Indol
1. Diinokulasikan biakan E. coli dan Bacillus sp. ke dalam media Tryptone
Broth.
2. Ditambahkan 0,5 ml reagen Ehrlich ke dalam setiap tabung.
3. Digunakan tabung yang berisi medium tanpa diinokulasikan sebagai
kontrol.
4. Diinkubasikan pada suhu 35 - 37C selama 24 jam.
5. Diamati perubahan yang terjadi dalam tabung, jika terbentuk cincin
berwarna merah keunguan maka ada senyawa indol yang terbentuk.
2.3.3 Produksi H2S
1. Diinokulasikan masing-masing bakteri (E. coli dan Bacillus sp.) ke dalam
medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dengan cara gores dan diakhiri
dengan tusuk tegak.
2. Digunakan tabung yang berisi medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA)
tanpa diinokulasikan sebagai kontrol.
3. Diinkubasikan pada suhu 30 - 35oC selama 24 - 48 jam.
4. Diamati terbentuknya H2S yang ditunjukkan oleh adanya warna hitam di
sepanjang tusukan.
5. Diamati pula perubahan warna pada medium tersebut akibat fermentasi
gula-gula dan adanya pembentukkan gas.
2.3.4 Hidrolisis Gelatin
1. Dipersiapkan tabung-tabung yang berisi Nutrient Gelatin.
2. Diinokulasikan biakan E. coli dan S. aureus ke dalam medium Nutrient
Gelatin.
3. Digunakan tabung-tabung Nutrient Gelatin tanpa diinokulasikan sebagai
kontrol.
4. Diinkubasikan pada suhu 37oC selama 1 - 7 hari atau sampai reaksi
positif muncul.
5. Diuji adanya hidrolisis dengan cara membenamkan tabung yang berisi
biakan ke dalam es yang sedang mencair/potongan es.
6. Diamati kontrol dan gelatin yang tidak terhidrolisis akan tetap cair.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
3.1 Hasil
Hasil yang diperoleh dari praktikum yang telah dilaksanakan, yaitu
sebagai berikut :
Tabel 1.1 Hasil Pengamatan Uji KatalaseNo.
Bakteri Gambar Keterangan
1. E. coli 1
1. Positif () terbentuk
gelembung-gelembung
O2
2. Bacillus sp. 1
1. Positif () terbentuk
gelembung-gelembung
O2
Tabel 1.2 Hasil Pengamatan Produksi IndolNo.
Bakteri Gambar Keterangan
1. E. coli
1
2
Negatif (-) tidak
terjadi perubahan
Warna kuning keruh
1. Bakteri E. coli
2. Kontrol
2. Bacillus sp.
1 2
Negatif (-) tidak
terjadi perubahan
Warna kuning keruh
1. Bakteri Bacillus sp.
2. Kontrol
Tabel 1.3 Hasil Pengamatan Produksi H2SNo.
Bakteri Gambar Keterangan
1. E. coli 1 2
Negatif (-) tidak
terjadi perubahan
Warna coklat tua
1. Bakteri E. Coli
2. Kontrol
2. Bacillus sp.
1 2
Negatif (-) tidak
terjadi perubahan
Warna coklat tua
1. Bakteri Bacillus sp.
2. Kontrol
Tabel 1.4 Hasil Pengamatan Hidrolisis GelatinNo.
Bakteri Gambar Keterangan
1. E. coli 1 2
Positif () bakteri
terhidrolisis
1. Bakteri E. coli
2. Kontrol
2. S. aureus 1 2
Positif () bakteri
terhidrolisis
1. Bakteri S. aureus
2. Kontrol
3.2 Pembahasan
Praktikum kali ini membahas tentang pengujian sifat biokimia.
Melakukan identifikasi suatu mikrobia hasil isolasi, tidak cukup hanya
berdasarkan sifat morfologinya saja. Perlu pula diteliti sifat biokimianya.
Pengujian sifat biokimia adalah uji yang dilakukan untuk karakterisasi dan
identifikasi suatu mikrobia hasil isolasi dengan melihat sifat biokimianya
karena mikroba tertentu memiliki sifat khusus yang dapat memproduksi
maupun mereduksi senyawa-senyawa kimia. Pengujian sifat biokimia
merupakan suatu dasar yang digunakan untuk menentukan karakterisasi dan
klasifikasi sebagian besar mikrobia.
Praktikum kali ini menggunakan beberapa pengujian biokimia untuk
karakterisasi dan identifikasi mikrobia, yaitu uji katalase, produksi indol,
produksi H2S dan hidrolisis gelatin.
Uji katalase merupakan uji biokimia yang dilakukan untuk
membedakan mikroorganisme yang memiliki enzim katalase yang
digunakan untuk mendegredasi hidrogen peroksida yang bersifat toksik.
Katalase adalah enzim yang mengatalisis penguraian hidrogen peroksida
(H2O2) menjadi H2O dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel
karena bahan ini dapat menginaktivasikan beberapa jenis enzim dalam sel.
Uji katalase berguna dalam identifikasi kelompok bakteri aerobik,
bakteri anaerobik aerotoleran dan bakteri anaerobik fakultatif. Kebanyakan
bakteri aerobik dan anaerobik fakultatif yang menggunakan oksigen
menghasilkan hidrogen peroksida yang bersifat racun bagi sistemnya
sendiri, tetapi bakteri ini dapat bertahan dengan adanya antimetabolit yang
dihasilkan enzim katalase. Bakteri anaerob obligat akan mati jika ada
oksigen karena tidak adanya pembentukkan enzim katalase sehingga H2O2
meracuni bakteri tersebut.
Hasil pengamatan untuk uji katalase pada biakan E. coli dan Bacillus
sp. menunjukkan reaksi positif terhadap uji katalase. Hal tersebut dapat
dilihat dari adanya gelembung-gelembung O2 yang dihasilkan setelah kedua
bakteri tersebut ditetesi dengan larutan H2O2 3%. Gelembung-gelembung ini
terjadi sebagai hasil perombakan hidrogen peroksida (H2O2) dengan bantuan
enzim katalase. Adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai berikut:
H2O2 enzim katalase
→H2O + ½ O2 (g) (Lay, 1994).
Berdasarkan literatur uji katalase akan positif ditandai dengan
terbentuknya gelembung-gelembung oksigen yang menunjukkan bahwa
organisme tersebut menghasilkan enzim katalase. Bakteri yang
menghasilkan hidrogen peroksida tersebut adalah bakteri aerobik dan
anaerobik. Bakteri tersebut dapat tetap hidup karena adanya antimetabolit
yang dihasilkan oleh katalase (Hadioetomo, 1993).
Uji produksi indol merupakan uji biokimia yang dilakukan untuk
mengetahui apakah dalam proses pertumbuhan bakteri dapat memproduksi
indol dari asam amino esensial triptofan. Senyawa indol adalah hasil
hidrolisis triftofan. Asam amino triptofan merupakan komponen asam
amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan
mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme dari penguraian protein.
Bakteri menguraikan triptofan membentuk asam piruvat yang kemudian
dapat digunakan sebagai sumber energinya.
Hasil pengamatan untuk uji produksi indol pada biakan E. coli dan
Bacillus sp. menggunakan media Trytone Broth (TB) menunjukkan reaksi
negatif. Hal tersebut diketahui setelah kedua bakteri tersebut diinkubasi
pada suhu 35-370C selama 24 jam dan setelah ditetesi 0,5 ml reagen Ehrlich
tidak terjadi perubahan, tidak ada timbul cincin berwarna merah keunguan,
warnanya tetap kuning keruh.
Bakteri tertentu seperti Escherichia coli mampu menggunakan
triptofan sebagai sumber karbon. Adapun reaksi yang terjadi adalah sebagai
berikut:
(Lay, 1994).
Berdasarkan literatur uji produksi indol yaitu isolat bakteri
diinokulasi ke dalam medium Tryptone Broth (TB) pada tabung reaksi
secara aseptik, diinkubasi pada suhu 37oC selama 24-48 jam, setelah
diinkubasi ditetesi dengan 10 tetes reagen Kovac’s dan uji akan positif
merupakan indikasi bahwa bakteri mampu memecah asam amoni triptofan
dengan pembentukan warna merah pada permukaan medium (Hadioetomo,
1993).
Uji produksi H2S (hidrogen sulfida) merupakan uji biokimia yang
dilakukan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhan bakteri
dapat memproduksi H2S. H2S diproduksi oleh bakteri melalui pemecahan
asam amino yang mengandung belerang atau melalui reduksi senyawa-
senyawa belerang anorganik. H2S yang terjadi dapat diamati dengan
menambahkan garam-garam logam berat ke dalam medium. H2S akan
bereaksi dengan senyawa-senyawa tersebut membentuk logam sulfida yang
berwarna hitam.
Hasil pengamatan untuk uji produksi H2S pada biakan E. coli dan
Bacillus sp. menggunakan media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dengan
cara gores dan diakhiri dengan tusuk tegak menunjukkan reaksi negatif. Hal
tersebut diketahui setelah kedua bakteri tersebut diinkubasi pada suhu 30-
350C selama 24 jam tidak terjadi perubahan dan tidak ada warna hitam di
sepanjang tusukan, warnanya tetap coklat tua.
Pembentukan H2S oleh mikroorganisme menunjukan adanya
penguraian asam amino yang mengandung sulfur. Produksi H2S merupakan
langkah awal di dalam proses deaminasi sistein dari protein yang
mengandung gugus sulfur seperti pada reaksi berikut:
CH2SH CH2 CH3 CH3
H—C—NH2 H2S + C—NH2 C = NH C = O + NH2
COOH COOH COOH COOH
Sisitein Asam Asam Asam
α-amino amino piruvat
akrilat
(Cappuccino & Sherman, 1992).
Berdasarkan literatur untuk uji produksi H2S yaitu isolat bakteri
diinokulasi ke dalam medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA) dalam tabung
reaksi secara vertikal pada bagian buut dan secara streak pada bagian slant.
Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 - 48 jam dan diamati perubahan yang
terjadi pada medium. Indikator terbentuknya H2S dengan adanya warna
H2O
hitam pada medium dan terbentuknya gas ditandai dengan pecahnya
medium di bagian ujung bawah tabung reaksi (Hadioetomo, 1993).
Uji hidrolisis gelatin merupakan uji biokimia yang dilakukan untuk
mengetahui kemampuan bakteri dalam membentuk enzim semacam
proteolitik (gelatinase) yang dapat menghidrolisis gelatin. Gelatin adalah
protein yang diperoleh ketika proses merebus tulang rawan atau jaringan
ikat hewan lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk gel.
Hasil pengamatan untuk uji hidrolisis gelatin pada biakan E. coli dan
Staphylococcus aureus menggunakan media Nutrient Gelatin (NG)
menunjukkan reaksi positif. Hal tersebut diketahui setelah kedua bakteri
tersebut diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam dan tabung yang berisi
biakan bakteri tersebut dibenamkan dalam potongan es batu, hasilnya kedua
bakteri tersebut mampu mencairkan gelatin.
Hidrolisis gelatin oleh mikroorganisme dikatalisasikan oleh enzim
gelatinase. Gelatin yang telah dicerna oleh mikroba tidak dapat membentuk
gel dan akan berwujud cair.
Gelatingelatinase→
peptida-peptida kecil (Lay, 1994).
Berdasarkan literatur untuk uji hidrolisis gelatin yaitu biakan
diinokulasi pada media Nutrient Gelatin (NG) dengan cara menusukkan
mikroba yang akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan
media, kemudian diinkubasi pada suhu 350C selama 24 jam. Media gelatin
yang mencair menunjukkan uji positif. Namun jika tidak mencair maka di
inkubasi kembali selama 1 minggu pada suhu 350C. Hasil uji negatif, jika
setelah 1 minggu gelatin tidak mencair sedikitpun (Lay, 1994).
Larutan H2O2 3% digunakan dalam uji katalase. Larutan H2O2 3%
berfungsi sebagai pereaksi penentu (reagen uji) adanya enzim katalase pada
suatu bakteri dengan adanya reaksi gelembung-gelembung gas O2.
Sedangkan reagen Ehrlich digunakan dalam uji produksi indol. Reagen
Ehrlich berfungsi sebagai pereaksi (reagen uji) adanya produksi indol hasil
hidrolisis dari triptofan oleh bakteri. Penambahan reagen Ehrlich dalam
media biakan dapat mengetahui adanya penumpukan senyawa indol,
ditandai dengan terbentuknya warna merah keunguan di lapisan bawah
media.
BAB IV
PENUTUP
4.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum ini adalah sebagai berikut:
1. Pengujian sifat biokimia merupakan suatu dasar yang digunakan untuk
menentukan karakterisasi dan klasifikasi sebagian besar mikrobia.
2. Uji katalase pada biakan E. coli dan Bacillus sp. menunjukkan reaksi
positif dengan adanya gelembung-gelembung O2.
3. Uji produksi indol pada biakan E. coli dan Bacillus sp. menggunakan
media Trytone Broth (TB) menunjukkan reaksi negatif, tidak ada timbul
cincin berwarna merah keunguan dan warnanya tetap kuning keruh.
4. Uji produksi H2S pada biakan E. coli dan Bacillus sp. menggunakan
media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) menunjukkan reaksi negatif, tidak
ada warna hitam di sepanjang tusukan, warnanya tetap coklat tua.
5. Uji hidrolisis gelatin pada biakan E. coli dan Staphylococcus aureus
menggunakan media Nutrient Gelatin (NG) menunjukkan reaksi positif,
kedua bakteri tersebut mampu mencairkan gelatin.
4.2 Saran
Sebaiknya praktikan dapat berhadir pada saat pengamatan, sehingga
dapat mengetahui secara jelas perubahan yang terjadi pada setiap perlakuan.
DAFTAR PUSTAKA
Capuccino, J.G & Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Mannual. The Benjamin/Cummings Publish. USA.
Dwidjoseputro. 1990. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan. Jakarta.
Hadioetomo, R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. PT Gramedia. Jakarta.
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.
Murray, R.K. 1995. Biokimia Harper Edisi 22. Buku Kedokteran ECG. Jakarta.
Schlegel. 1993. General Microbiology. Cambrige University Press. Australia.
Strayer, L. 2000. Biokimia Vol 2. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
top related