modelos animales de enfermedad en investigaciÓn translacional virginia hernández gea laboratori de...
Post on 11-Apr-2015
103 Views
Preview:
TRANSCRIPT
MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD EN INVESTIGACIÓN
TRANSLACIONAL
Virginia Hernández Gea
Laboratori de Recerca Translacional d’Oncologia Hepàtica
BCLC group. IDIBAPS. Hospital Clínic
MODELOS ANIMALES
Desarrollo de tratamiento de muchas enfermedades humanas
• Desarrollo tratamientos (tratamiento de DM con insulina en perros)• Validación mecanismos de acción (tratamiento de asma con anti-
IL5 en roedores y primates )• Estudios de seguridad /Eficacia (toxicidad de penicilina Ginea pigs)
Avances en investigación del genoma y biología molecular
ELEGIR EL MODELO ADECUADO
No hay modelos disponibles para todas las enfermedades
Determinadas condiciones etiología-especifica no son patogénicas en animales
• Virus de la Hepatits C virus no afecta roedores
La respuesta a un determinado agente inductor puede cambiar entre animales y humanos
CARACTERÍSTICAS DEL MODELO ANIMAL IDEAL
•Reproducibilidad % animales que alcanzan el estadio de interés
•Especificidad alteración deseada sin otras complicaciones
•Coste directo e indirecto mantenimiento colonia
•Seguridad riesgo para el personal
•Tamaño volumen de sangre requerido, accesos vasculares, cantidad fármaco
•Ética aceptabilidad del modelo
•Viabilidad del modeloexperiencia en el laboratorio, mano de obra
SIMILITUD CON LA ENFERMEDAD HUMANA OTRAS CONSIDERACIONES
• Patogénesis y fenotipo similar a la enfermedad en humanos
• Reflejo de interacciones celulares y moleculares (microambiente)
• Similares biomarcadores de enfermedad
• Predicción fiable de toxicidad y respuesta a terapias aprobadas en humanos
DESARROLLO HEPÁTICO
Chu & Sadler. Hepatology 2009
La formación del hígado empieza 60-72 horas post-fertilizaciónEl hígado esta completamente desarrollado a los 5 díasEl desarrollo hepático es independiente de la vasculogenesis
VentajasCamadas de gran númeroCreación de transgénicos es fácil, rápida y barataManipulación genética unida a fluorescencia permite visualización en tiempo real de todo el proceso de desarrollo
HEPATITIS AGUDA POR VHC
No modelos en animales pequeños que reproduzca todo el ciclo infección
La inoculación virus en roedores (incluso inmunodeprimidos) no produce infección detectable
Chimpancé• Permite el estudio de todos los pasos del ciclo vital de la infección
Replicación/Infección/Producción virus• Modelo immunocompetente
Estudio de la respuesta inmune huésped (innata & adaptativa)• Permite analizar cambios precoces en la expresión génica
Obtención muestras tras infección aguda• Probar de forma directa agentes antivirales• Único modelo para el estudio y desarrollo de vacunas• Limitaciones
• Éticas• Escasa disponibilidad• Coste prohibitivo
Bukh J. Gastroenteroogy 2012
USO DE RATONES
• Genética/bioquímica y fisiológicamente similares
• Habilidad para manipular su genoma
• Rápida reproducción • Mínima variabilidad biológica
• Disponibilidad de histología postmortem
VENTAJAS
USO DE RATONES
• Genética/bioquímica y fisiológicamente similares
• Habilidad para manipular su genoma
• Rápida reproducción • Mínima variabilidad biológica
• Disponibilidad de histología postmortem
• Diferencias propias de la especie
• Diferente talla/ ciclo vital/morfología de los órganos
• Actividad de la telomerasa
• Escaso desarrollo de metástasis o en localizaciones distintas
• Diferencias en vías de señalización y metabolismo
• Distinto microambiente y sistema inmune
VENTAJAS LIMITACIONES
Ligadura parcial de la Vena Porta • Fácil, reproducible y de bajo coste• Desarrollo de HTP muy rápido (máx 24h) • Una semana tras la LPVP , desarrollo
completo del sme HTP (circulación híperdinámica, shunts porto-sistémicos)
Sección rama de la Vena Ileocólica• Caracterizado en LPVP y BDL • La severidad de la hemorragia depende del
grado de hipertensión portal y del tamaño de la rama seccionada
• Buen modelo para testar drogas vasoactivas en condiciones hipovolémicas
Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006
HIPERTENSIÓN PORTAL HEMORRAGIA POR HIPERTENSIÓN PORTAL
COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS
COMPLICACIONES DE LA CIRROSIS / FIBROSIS
Shunt Portocava en ratas
• Bypass portosistémico sin fallo hepático• Cambios comportamiento • Reversible con tratamiento anti-EH• Buen modelo para estudio EH y
desarrollo de nuevos fármacos
Díaz-Gómez et al. Rev Esp Enferm Dig. 2011
ENCEFALOPATIA HEPÁTICA FIBROSIS POR ALCOHOL
Modelo Lieber–DeCarli • Reproduce la mayoría de los rasgos
patológicos de la enfermedad
hepática por alcohol
• Dieta semilíquida que aporta etanol
como el 36% de las calorías totales
• Ad libitum como única fuete de
alimento y líquido
• Fibrosis pericelular y perivenular
progresiva
• Aparición de cirrosis en 1/3 de los
animales después de una exposición
tras 1-3 años.
FIBROSIS
• Necrosis centro-lobulillar aguda• Respuesta reparadora inmediata
• Reclutamiento de células inflamatorias• Incremento de matriz extracelular
• Fibrosis significativa tras 2-4 semanas• Cirrosis micronodular en 12 semanas• Administración ip / inhalación • DEN (Diethylnitrosamine) + CCl4 reproduce la
secuencia daño hepático / fibrosis / transformación maligna
• Fibrosis periportal • Cirrosis macronodular en 12
semanas• Administration: i.p. / agua
TETRACLORURO DE CARBONO TIOACETAMIDA (TAA)
Abraldes et al. World J Gastroenterol 2006
FIBROSIS
• Cirrosis biliar primaria.• Especialmente apropiado en ratas
(no tienen vesícula biliar)• Desarrollo de fibrosis-cirrosis biliar
en 4-6 s • Proliferación colangiocitos y fibrosis
portal• Demuestra la importancia a de los
miofibroblastos periportales
Concanavalin A
• Injección iv durante 20 semanas
• Fibrosis centrilobular y perisinusoidal
Schistosoma mansoni
• Exposición percutanea produce granulomas y fibrosis periportal
Arias M et al. BMC Gastroenterology 2003
LIGADURA COLÉDOCO INMUNOLOGICAMENTE MEDIADA
MANIPULACIÓN GENÉTICA
Gen de interés
Pérdida de función Ganancia de función
Knock-down Knock-out Transgénico Knock-in
RNAi
Control Espacial & Temporal?
No Sí
Conventional knockout
Reversible?
Cambio esporádico?
Inducible system
Knock-out condicional
Virus-mediated delivery
No
No
No Sí NoSí
No Sí
Control Espacial & Temporal?
Control Espacial & Temporal?
Expresión Tejido específica?
• Condicional(Cre-Lox)
• Inducible(Tet)
Transgénico con
promotor ubicuo
Transgenico con
promotor Tejido-
específico
Knockin Convencional
Sí
Sí
FIBROSIS
RATONES KNOCK OUT ATP-binding cassette (ABC) B4 (ABCB4-/-)
Defecto en el transporte de fosfolípidos desde los hepatocitos al luz canalicular
Desarrollo espontáneo de fibrosis
LIM homeobox gene (Lhx) 2 (LHX2-/-)
Ratones deficientes en LHX2 desarrollan fibrosis hepática espontánea y progresiva durante el desarrollo embrionario (día 14) semanas del nacimiento
El gen de interés se reemplaza (knock out) mediante selección antibiótica (Neomicina)
Inyección embrión y Reproducción
COMBINACIONES
Hepatotoxinas: CCl4/TAA con Modificación genética tejido específica (sistema Cre LoxP)
La deleción del gen Atg7 específicamente en HSC aminora el desarrollo de fibrosis tras provocación daño hepático con hepatotoxinas.
PROMOTOR LOX
GFAP
Atg7
CRE
Deleción gen interés en celulas estrelladas
GFAP-cre Atg7F/F
Homocigotos Atg7flox/flox GFAP-Cre(Knockout Atg7 específicamente en
células estrelladas)
FIBROSIS
Hernandez-Gea et al. Gastroenterology 2012
LOX
PROMOTOR
FIBROSISRATONES TRANSGÉNICOSSobreexpresión de Tgf-β1 en hepatocitos (ALBUMIN-Promoter)
Sobreexpresión de PDGF-C en hepatocitos
Cambios morfológicos a las 2 semanas de edad con fibrosis prominente a las 6 semanas
HCC entre 6 meses-1 año. Reproduce los pasos de desarrollo de HCC que ocurren en humanos (esteatosis, fibrosis, displasia, neoangiogenesis y malignización)
Doyle A et al.Transgenic Res (2012)
HEPATOCARCINOMA
DOBLE TRANSGÉNICOMyc/TGFα
TGFa bajo el promotor metalotionina. Myc bajo el promotor albúmina
20% de los ratones transgénicos para ambos genes desarrollan HCC a los 4 meses y el 100% a los 8-10 meses.
Co-expresión de Myc y TGFa induce tumores con alto grado de inestabilidad genética, aneuplodia y alta proliferación similar a los HCC de mal pronóstico
Sobreexpressión hepática de linfotoxinas α y β
Selectivamente en hepatocitos Hepatitis crónica a los 9 mesesHCC a los 12 meses
Johannes Haybaeck et al. Cell 2009
Control LTαβ LTαβ
Factor VM et al. J Biol Chem 1998
TRANSGÉNICOS CONSTITUTIONALES LIMITACIONES
Letalidad embrionaria / infertilidad
El gen alterado puede ser vital para el desarrollo normal
Variabilidad en el patrón de expresión
Poco control sobre el sitio de integración y el nº copias del DNA insertado
Puede que la proteína truncada todavía retenga actividad biológica
No mimetiza la secuencia de eventos presentes en la tumorogenesis espontánea
Mutación esta presente en todas las células alteradas y desde el principio
El transgen se integra en los dos alelos del genoma del animal
Tanto las células tumorales como estromales expresan el transgen
Disponibilidad limitada de promotores tejido-específico
HEPATOCARCINOMATRANSGÉNICOS INDUCIBLESRaton transgénico con delección del oncogen Myc específica en hígado e inducible
Proteína tTA bajo el control del promotor LAP (Liver activator promotor) capaz de unirse en hígado a celulas que expresan secuencia específica TetO
Myc bajo el control de protor TetO-CMV
El tratamiento con Doxicilina en estos animales previene la expressión de Myc.
Discontinuación de doxiclinia a las 3 semanas de edad activa la expressión de Myc (Tet-Off) y los ratones que expresan Myc desarrollan HCC a las 12 semanas
TetR VP16
TetO CMV Myc Expresión gen interés
TetR VP16No expresiónLAP
Doxi
LAP
Shachaf CM et al. Nature 2004
Firma genética generada en hepatocitos primarios de ratón basada en la expresión temporal del gen TGFβ es capaz de identificar distintos subgrupos de HCC en humanos
INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN)
Coulouarn C et al. Hepatology 2008
INTEGRATIVE ONCOGENOMIC (MICE TO HUMAN) En humanos los dos subgrupos generados presentan diferencias en supervivencia, origen de células tumorales (hepatoblastos vs hepatocitos), expresión c-Met/HGF, HBV status.
Coulouarn C et al. Hepatology 2008
IDENTIFICACIÓN DE NUEVOS ONCOGENES
Análisis de expresión para comparar anomalías genómicas (amplicones) entre ratón y humano. Los eventos recurrentes sirven como filtro para identificar los genes candidatos. Una vez identificados se evalúa su funcionalidad en cuanto actividad tumoral o metastásica
p53−/− con sobreexpresión de Myc (marcage GPP)Identificación de oncogenes cIAP1 y Yap Zender L et al. Cell. 2006
XENOGRAFTS
Inyección de células tumorales humanas o fragmentos de tumor de forma subcutánea u ortotópica en ratones inmunodeficientes
Crecimiento tumoral con el soporte del estroma y vasculatura murina
Formación de nódulo tumoral en 2–6 semanas tras implantación
Pilar principal de los estudios preclínicos para el desarrollo in vivo de nuevos medicamentos
Células tumorales en cultivo
Inyección subcutánea de células
DESARROLLO NUEVOS TRATAMIENTOS
Sharpless & DePinho. Nature Reviews Drug Discovery 2006
Tras inyectar células tumorales, los ratones se tratan con el compuesto de interés durante 2-6 semanas tiempo durante el cual se desarrolla el tumor. Es estudio es positivo si el compuesto de interés reduce le crecimiento tumoral
Cultivo de células tumorales
Inyección ≈ 106 células en ratón inmunodeprimido
Tratamiento durante 2-6 semanas
XENOGRAFTS
• Fácil uso y bajo coste• Células tumorales
representativas de tumores reales (complejidad genética)
• Evaluación del volumen tumoral y crecimiento tras tratamiento
• Nuevas terapias: • diferentes dosis • esquemas de tratamiento en
el mismo set de células• Gran ayuda para priorizar los
compuestos que pasaran a Fase I
• Inmunosupresión huésped • SCID mice (severe combined
Immunodeficience) tienen defectos en los mecanismos de reparación del DNA
• Nude mice ( alteración timica ): fragilidad general que limita su tolerancia y resistencia a fármacos
• No sirve para evaluar tratamientos inmunomoduladores
• No recapitulan completamente la heterogeneidad intratumoral ni el microambiente
• Eficacia quimioterapéutica es sensible pero poco específica
• Hasta 89% de fármacos que superan los estudios preclínicos nunca llegan a ser aprobados
VENTAJAS DESVENTAJAS
QUIMERAS / TRASPLANTE HUMAN-IN-MOUSE
Células cancerígenas humanas se implantan en un tejido adyacente normalFácil/ Rápido/ Coste efectivoValoración interacciones tumor-estroma (quimeras)Desarrollo y validación de nuevos fármacos Heyer J et al. Nature Reviews Cancer. 2010
MODELO ANIMAL IDEAL
GEMM
Biología MolecularFisiopatología
Desarrollo FármacosQuimioresistencia
Análisis genomaPerfil molecular
Histopatología
Estudios Imagen in vivo
Carcinogénesis
Screening Identificación Biomarcadores
Determinantes de progresión metastásica
Influencia factores
ambientales
CONCLUSIONES
• El perfecto modelo animal todavía esta por generar
• En cáncer, no existe el modelo que recapitule todos los estadios del desarrollo del tumor
• Diferencias interespecies obligan a seguir utilizando material humano
• Entender las ventajas y limitaciones de cada modelo es necesario para maximizar la rentabilidad de los modelos disponibles
top related