modifide direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay for aflatoxin b1 in rice

Modifide Direct Competitive Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay for Aflatoxin B1 in rice

การพฒนาวธหา 1AflatoxinB ในขาวดวยการใช D DDDDD DDDDDDDDDDD DDDDDD-DDDDDD

DDDDDDDDDDDDD DDDDD

ผรวมจดทำ

น.ส. นดตย ประกอบแสงD4810056

น.ส. รตน เกยรตทรงชยm4810131

วตถประสงค

เพอตรวจสอบและห ปรม ณของ alflatoxin B 1 ในข ว

ก รนำ ไปใชประโยชน

เพอตรวจห ระดบของ 1alflatoxin B ทปนเปอนอยในข ว นอกจ กนนยงเชอมโยงไปถงก รปนเปอนในน ข วและพนทใกลเคยง

หลกก ร

ประยกตจ กวธทดสอบของ Chu 1989( ) ในก รทดลองของเร จะ coat แตละ well ของ microtiter plate ดวย aflatoxin B -1 oxime-BSA และ incubate ไว หลงจ กล งกจะเตม ตวอย งข วทตองก รทดสอบหรอ aflatoxin B 1 ม ตรฐ น กบ anti-aflatoxin B -1 BSA- HRP conjugate ลงไปพรอมๆ กน แลว iiiiiiii ตอ ส รพษทอยในส รละล ยข วหรอใน ii 1 ม ตรฐ น จะแยงจบกบ iiiiiii ทตดอยกบผวของ iiiiiiiiii iiiii

และจะจบตรงบรเวณท antibody จะม จบ หลงจ กล งอกรอบ กจะตรวจสอบปรม ณของ antibody ทจบอยบนผวของ microtiter plate ไดโดย incubate กบส รละล ย iiiiiiiii ผลของสจ กก รทำ ปฏกรย จะวดโดยใชเครอง spectrophotometer ปรม ณของ iiiiiiiii 1 ในตวอย งข วจะห ไดโดยก รเทยบกบกร ฟของ iiiiiiiii 1 ม ตรฐ น

บทนำ

Aflatoxin : ส รพษสร งจ กเชอร พวก Aspergillus flavus ส รพษตวนจะทำ ล ยเซลลตบอย งรนแรง และยงเปนส รกอมะเรงทรนแรงม กอกดวย

• เชอร พวก Aspergillus flavus มกจะเจรญไดในททมคว มชนตำ เชน ในเมลดธญพชทงถว ข ว เปนตน

วธการเตรยมสารเคม ใชส รเคมระดบ AR grade

ส รละล ยสกดตวอย ง (Sample extraction solvent )

Carbonate coating buffer

Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 เขมขน 10เท

-PBS Tween

Conjugate buffer

Substrate buffer

Enzyme Substrate

- 1Af latoxin B BSA เขมขน 500 เท

- 1Anti Af latoxin (B ) Peroxidase conjugate

Blocking 1%

iiiiii iiii iiiiiii 0.5 N

รปแสดง ขาวกะเทาะเปลอก ขดขาว

บดละเอยด

วธทำาการทดลอง coat plate ดวย - 1Aflatoxin B BSA (sigma

6655100A ) ไมโครลตร ตอ i iii จะมปรม ณ 2ไมโครกรมตอมลลลตร

iiiiiiii ใน moist chamber ท 4°C ข มคน

ล งดวย -i i 3 ครง

block ดวย 1 2 00 ไมโครลตรตอ well ท 37 เปนเวล 1 ชวโมง

ล งดวย - 3PBST ครง

เตมส รละล ยตวอย ง 50 ไมโครลตรตอ well แลวต มดวย - - 1 50Anti AFB peroxidase conjugateไมโครลตรตอ well

iiiiiiii ใน i iiii iiii iii ท 37 45น ท

ล งดวย -i i 3 ครง

เตม 100Enzyme Substrate ไมโครลตรตอ well

Incubate ในทมด - 1015 น ท

หยดปฏกรย ดวย Colour stop reagent 25ไมโครลตรตอ well

อ นค ก รดดกลนแสงท 492น โนเมตร

ผลการทดลอง

ตารางท 1 แสดงคาการดดกลนแสงของ standard aflatoxin B1

ความเขมขน(ug/kg) คาการดดกลนแสงท 492 nm7.5 0.21515 0.21830 0.22060 0.212

120 0.213240 0.215480 0.196960 0.2071920 0.1893840 0.1377610 0.103

ตารางท 2 แสดงคาการดดแสงของตวอยางขาวทง 17 ตวอยาง

ตวอยางขาว คาการดดกลนแสงท 492

nm1 ทองมา   0.3872 นางเอยด   0.4063 สมยศ   0.3764 นางบญเรอน 0.3825 ประเสรฐ เคม 0.4025 ประเสรฐ อนทรย 0.3806 รำาพก   0.3597 กญญา   0.4158 นายเรยบ   0.3849 นายทอง   0.36810 นางทอน 0.37411 นายสนอง 0.370

12 ฮวด   0.34813 ชวน   0.36114 คำาม   0.36915 นายน   0.34716 นายมะล 0.361

รปท 2 แสดงสจากการทดสอบ standard aflatoxin ใน microtiter 96well plate

สรปผลการทดลอง ไมพบ aflatoxin ในปรม ณทเกนกำ หนด จ กตวอย ง

ข วทง 17 ชนด

เอกสารอางอง Anonymous. 1991. Aflatoxin analysis in groundnuts an

d groundnut products. Pages 195-278 in. The groundnut Aflatoxin problem: review and database (Mehan, V.K., Mcdonald, D., Haravu, L.J., and Jayanthi, S. eds.). Patancheru, AP. 502324, India :International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics.

Fan, T.S.L., and Chu, F.S. 1984. An indirect ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) for detection of aflatoxin B1 in corn and penut butter. Journal of Food Protection 47: 263-266

Chu, F.S. 1989. Current immunochemical methods for analysis of Aflatoxin in groundnuts and groundnut products. Pages 101-172. In Aflatoxin contamination of groundnuts : proceedings of the International workshop, 6-9 October 1987, ICRISAT Center, India. Patancheru, AP. 502324, India :International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics.

Wilson, D.M. 1989. Aflatoxin analytical methods for groundnut. Pages 191-199. Ibid

Anajaiah, V., Mehan, V.K., Jayanthi, S., Reddy, D.V.R. and Mcdonald, D. 1989. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for alflatoxin B1 estimation in groundnuts. Pages 1983-189. Ibid