modulação do estado redox em ilhotas pancreáticas e sua
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Eduardo Rebelato Lopes de Oliveira
MODULAÇÃO DO ESTADO REDOX EM ILHOTAS
PANCREÁTICAS E SUA IMPLICAÇÃO NA SECREÇÃO
DE INSULINA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Humana do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de Concentração: Fisiologia Humana Orientador: Prof. Dr. Angelo Rafael Carpinelli
São Paulo
2010
2
RESUMO Rebelato E. Modulação do Estado Redox em Ilhotas Pancreáticas e sua Implicação na
Secreção de Insulina 2010. 178 f. [tese (Doutorado em Fisiologia Humana)]. São Paulo:
Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010.
Alterações no estado de óxido-redução (redox) aparecem como importante via de controle da
funcionalidade de diferentes tipos celulares. Em ilhotas pancreáticas, níveis elevados de
peróxido de hidrogênio (H2O2) foram reportados por diminuir o conteúdo de ATP e
hiperpolarizar o potencial de membrana plasmática, suprimindo a secreção de insulina
estimulada pela glicose (GSIS). Esses achados sugerem a influência de alterações no ambiente
oxidativo sobre a função de células β pancreáticas, bem como indicam a importância de um
ajuste do estado redox para a GSIS. Neste estudo, pudemos observar que o favorecimento do
estado oxidativo, devido à adição de H2O2 tanto em concentrações elevadas, quanto em
concentrações próximas ao máximo obtido fisiologicamente, promoveram a inibição da
secreção de insulina, por inibição do metabolismo da glicose e das oscilações intracelulares de
cálcio ([Ca2+]i). De modo contrário, alterações no estado redox pela adição de antioxidantes,
como a catalase-peguilada (CAT-PEG) e a N-acetil-L-cisteína (NAC), promoveram efeitos
positivos sobre a secreção de insulina, associados ao aumento do metabolismo da glicose e
das oscilações de [Ca2+]i. Porém, os efeitos positivos dos antioxidantes sobre as ilhotas
pancreáticas foram concomitantes a pequenas diminuições no conteúdo das espécies reativas
de oxigênio (EROs). Por outro lado, diminuições mais acentuadas no conteúdo de EROs,
promovidas por maiores concentrações dos antioxidantes, suprimiram o efeito positivo
previamente observado sobre a secreção de insulina. Ademais, um efeito negativo sobre a
funcionalidade das ilhotas pancreáticas ocorreu em resposta a uma diminuição drástica no
conteúdo intracelular de EROs devido à inibição da enzima NAD(P)H oxidase. Dessa forma,
a modulação no estado redox celular, favorecendo o estado oxidativo, inibiu a funcionalidade
da célula β pancreática. Entretanto, a diminuição do estado oxidativo, exerceu efeito dual
sobre a funcionalidade da célula β pancreática, onde pequenas alterações se mostraram
estimulatórias sobre a secreção de insulina, enquanto alterações maiores suprimiram este
efeito positivo. Adicionalmente, o conteúdo de EROs foi modulado pela glicose em ilhotas
pancreáticas. O aumento na concentração de glicose diminuiu o conteúdo de EROs, sendo
este efeito correlacionado com o aumento na atividade da via das pentoses-fosfato (PPP) pela
glicose. A atividade da PPP contribui para a funcionalidade das defesas antioxidantes através
da produção de NADPH. A inibição da PPP resultou na perda do controle de EROs pela
3
glicose em paralelo à perda da GSIS. Sob estes aspectos, a ativação das células β pela glicose
parece também requerer um ajuste no conteúdo intracelular de EROs para sua funcionalidade,
sendo essa regulação redox dependente do metabolismo de glicose.
Palavras-chave: Ilhota pancreática. Metabolismo da glicose. Estado redox. Secreção de
insulina.
4
ABSTRACT
Rebelato E. Redox Modulation in Pancreatic Islets and its Implication for Insulin Secretion
2010. 178 f. [thesis (PhD in Human Physiology)]. São Paulo: Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2010.
Changes in the intracellular oxidation/reduction (redox) state have been considered an
important pathway to control cell function. Shifts toward an oxidative environment due to
addition of high concentrations of hydrogen peroxide (H2O2) to pancreatic islets was reported
to decrease the ATP content, to hyperpolarize the plasma membrane potential and suppress
glucose-stimulated insulin secretion (GSIS). These findings suggest an implication of the
redox state in pancreatic β cell function, where possible adjustments of the redox state are
required for GSIS. This work shows that increases in the oxidative state by H2O2 addition, to
high or close to maximal physiological levels, decreased insulin secretion through inhibition
of glucose metabolism and of intracellular calcium oscillations ([Ca2+]i). In an opposite way,
changing the redox state by antioxidant treatment with PEG-catalase (PEG-CAT) and N-
acetyl-L-cysteine (NAC) resulted in a positive effect on insulin secretion, in association with
an increase in glucose metabolism and [Ca2+]i. This positive effect by the antioxidants was
paralleled to small changes in the reactive oxygen species (ROS) levels. However, a more
drastic decrease in ROS content, due to higher concentrations of the antioxidants, suppressed
the positive effect previously observed on insulin secretion. Moreover, a negative effect on
pancreatic β cell function was also observed during the drastic suppression of intracellular
ROS content by inhibition of the enzyme NAD(P)H oxidase. Thus, the redox modulation
favoring the oxidative state inhibits pancreatic β cell function. However, the suppression of an
oxidative state exerts a dual effect on pancreatic β cell function, where small changes in the
ROS content was positively correlated with an increase in insulin secretion, while higher
changes suppressed this GSIS. Additionally, ROS content was decreased by increasing
glucose concentrations in pancreatic islets, and such effect was correlated with the activation
of the pentose-phosphate pathway (PPP) by glucose. The PPP is a metabolic shunt which is
important for antioxidant defense due to NADPH production. PPP inhibition resulted in the
impairment of ROS control by glucose and GSIS. Thus, the mechanism of insulin secretion in
response to glucose might also request an adjustment of intracellular ROS content, which is
dependent on glucose metabolism.
Key-words: Pancreatic islets. Glucose metabolism. Redox state. Insulin secretion.
5
1- INTRODUÇÃO
6
1 INTRODUÇÃO
1.1 Secreção de Insulina Induzida pela Glicose
O pâncreas endócrino é formado por grupamentos celulares denominados ilhotas
pancreáticas, as quais são compostas por pelo menos quatro diferentes tipos de células,
classificadas morfofuncionalmente em células alfa (α), beta (β), delta (δ) e PP. Essas células
são, sobretudo, responsáveis pela secreção de hormônios peptídicos, respectivamente:
glucagon, insulina, somatostatina e polipeptídio pancreático 1.
As ilhotas pancreáticas são constituídas em maior parte por células β, secretoras de
insulina, que é um hormônio polipeptídico constituído por duas cadeias de aminoácidos alfa e
beta, interligadas por duas pontes dissulfeto em resíduos de cisteína. Sua síntese ocorre a
partir da transcrição e tradução do gene da insulina, com a formação da pré-pró-insulina no
retículo endoplasmático. Posteriormente, pela remoção da sequência contendo 24 resíduos de
aminoácidos, forma-se a pré-insulina. No complexo de Golgi, esta é armazenada nos grânulos
de secreção, onde por clivagem forma o peptídio C e a insulina, sendo esta última a forma
com maior potencial biológico 2.
Na célula β a insulina é armazenada em grânulos que, através de exocitose deflagrada
por estímulos, liberam seu conteúdo para o meio extracelular. Devido a característica
hidrofílica e a ausência de transportadores de membrana para esse hormônio, a fusão desses
grânulos com a membrana e abertura do poro de extrusão é o único mecanismo para
transposição da membrana plasmática e consequente liberação da insulina. Cada célula β
contém aproximadamente entre 10.000 a 13.000 grânulos insulínicos, cada qual com um
diâmetro e conteúdo de moléculas de insulina de aproximadamente, 350 nm e 106 moléculas,
além de 50 outros polipeptídeos 2. O controle da extrusão dos grânulos de insulina é um
processo complexo determinado pela resultante entre diversos estímulos que atuam sobre as
ilhotas pancreáticas. Porém, apesar de ser modulada por diversos fatores, tais como outros
nutrientes, neurotransmissores e hormônios, a secreção da insulina pelas células β das ilhotas
pancreáticas tem como principal estímulo o aumento na concentração de glicose 3.
A elevação na concentração de glicose consequentemente aumenta o fluxo dessa
hexose para o interior das células β pancreáticas. A glicose permeia a membrana da célula β
através dos transportadores de glicose do tipo 1 e do tipo 2 (GLUT 1 e 2), os quais possuem
baixo e elevado Km, respectivamente 4, 5. No citosol, a glicose é inicialmente fosforilada
formando glicose-6-fosfato, principalmente pela atividade da enzima glicoquinase, a qual
também possui elevado Km. A presença de enzimas com elavado Km na metabolização da
7
glicose permite que o fluxo de glicose para o interior da célula β pancreática e sua velocidade
de metabolização não se saturem, podendo assim, acompanhar as elevações na concentração
da glicose plasmática. A consequente metabolização da glicose-6-fosfato resulta no aumento
da produção de adenosina trifosfato (ATP), aumentando a razão entre ATP e adenosina
bifosfato (ADP). Carpinelli et al. (1980) 6 verificaram que a estimulação da secreção de
insulina está diretamente relacionada ao aumento desta razão, a qual é induzida pela
metabolização da D-glicose como inicialmente havia sido proposto por Malaisse et. al. (1979) 7 como a Hipótese de Regulação pelo Nutriente - The Fuel Hypothesis.
As células β são eletricamente excitáveis e mudanças no potencial de membrana
acompanham variações na concentração plasmática de glicose, inibindo ou estimulando a
secreção de insulina 8, 9. Este processo envolve o metabolismo da glicose, produção de ATP,
fechamento de canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP), despolarização de membrana
plasmática e a ocorrência de potenciais de ação. Assim, o aumento da razão ATP/ADP
promove o fechamento de KATP, impedindo o efluxo de K+ e resultando na retenção de cargas
positivas no interior celular. Esse acúmulo de cargas eleva o potencial de repouso da
membrana, diminuindo a polaridade da membrana plasmática 6, 9, 10. Essa redução na
diferença de potencial de membrana dispara potencias de ação através da abertura dos canais
para Ca2+ sensíveis à voltagem (CCSV ou do tipo - L), resultando no aumento da
concentração intracelular deste íon, e consequentemente na ativação da maquinaria secretória
da célula β e liberação de insulina 9, 11.
O processo de exocitose nas células β pancreática é dependente da elevação na
concentração intracelular de cálcio ([Ca2+]i), porém, as proteínas pertencentes a familia
SNARE (fator solúvel sensível a N-etilmaleimida) são elementos críticos para esse processo.
Entre as SNAREs encontram-se as t-SNAREs (proteínas de membrana plasmática) das quais
fazem parte a sintaxina 1 e a SNAP-25, e também as v-SNAREs (proteínas vesiculares) como
a sinaptobrevina/VAMP-2 2.
Como reportado em células β de camundongos, as t-SNARES sintaxina 1 e SNAP-25
agregam-se na membrana plasmática em aproximadamente 400 complexos, refletindo o
número de grânulos atracados à membrana e correlacionando-se com o número de CCSV por
célula β 2. A distribuição dos CCSVs na membrana celular colocaliza-se com os pontos de
atracamento e fusão de grânulos insulínicos à membrana plasmática 12. Dessa forma, as
alterações na concentração de [Ca2+]i ocorrem em domínios específicos de Ca2+ na membrana
plasmática 13, possivelmente, direcionando os eventos intracelulares decorrentes da
despolarização para a atividade secretória.
8
Assim, alterações na concentração intracelular de Ca2+ distantes das regiões de
microdomínios de Ca2+ podem não refletir a ativação e sustentabilidade da secreção de
insulina.
Apesar da clássica predominância da glicose sobre o mecanismo de secreção de
insulina, as células β apresentam ainda enzimas associadas à membrana plasmática que
auxiliam no processo secretório. Dentre essas enzimas, encontram-se isoformas da fosfolipase
C (PLC), fosfolipase A2 (PLA2), fosfolipase D e adenilato ciclase. Essas enzimas podem ser
ativadas pela ligação de hormonios a seus receptores de membrana, sendo as proteínas Gs ou
Gq a via de interação entre os receptores e as enzimas efetoras. A atividade dessas enzimas
resulta na formação de mensageiros intracelulares que modulam o processo de secreção de
insulina 4.
Nas células β, o metabolismo da glicose também ativa isoformas da PLC, PLA2 4 e
adenilato ciclase 14. A PLC hidrolisa fosfolipídios de membrana, resultando na formação de
diacilglicerol (DAG) e 1,4,5 inositol-trifosfato (IP3). O DAG promove a ativação da proteína
quinase C (PKC), a qual é dependente de Ca2+ e atuante na regulação da secreção da insulina.
O IP3, por sua vez atua no retículo endoplasmático desencadeando o efluxo de Ca2+, desse
estoque para o citoplasma, o que reforça o aumento intracelular de Ca2+ decorrente da
abertura dos CCSVs em resposta ao metabolismo da glicose 4, 15, 16.
A ativação da adenilato ciclase resulta no aumento intracelular de adenosina
monofosfato cíclico (AMPc), segundo mensageiro ativador da proteína quinase A (PKA), a
qual também contribui para a exocitose dos grânulos de insulina 14, 15.
Adicionalmente, tanto a PKA quanto a PKC aumentam a atividade dos CCSVs,
intensificando a entrada de Ca2+ a partir do meio extracelular. Além disso, ambas quinases
promovem a fosforilação e ativação de proteínas componentes do citoesqueleto que
participam da exocitose dos grânulos de insulina 15, 16.
Receptores acoplados a proteínas G são, por exemplo, utilizados por hormônios como
o peptídio semelhante ao glucagon (GLP-1). Esse hormônio, dentre outros, são chamados
incretinas, sendo secretados pelas células intestinais em resposta à ingestão de glicose. Na
célula β pancreática, através de seus receptores, as incretinas potencializam a secreção de
insulina induzida pela glicose. Dessa forma, a secreção e a ação das incretinas está
relacionada com a maior resposta secretória de insulina observada frente a uma carga oral de
glicose se comparada à sua infusão intravenosa 17.
9
1.2 Espécies Reativas de Oxigênio
O processo de quebra enzimática da molécula de glicose, glicólise, ocorre em diversas
etapas pouco dispendiosas energeticamente, gerando uma forma primária de energia através
do fornecimento de elétrons, os quais são abstraídos dos subprodutos formados durante o
metabolismo da glicose. Os elétrons abstraídos são transportados por carreados em sua forma
reduzida, o dinucleotídeo de nicotinamida-adenina reduzido (NADH) e o dinucleotídeo de
nicotinamida-adenina fosfato reduzido (NADPH). Esses carreadores reduzidos são
fundamentais para a produção de energia pela célula. Além disso, esses carreadores servem
ainda como substratos para demais processos celulares, como o controle do conteúdo das
espécies reativas de oxigênio, as quais têm sido recentemente prospostas como possíveis
atuantes na regulação da fisiologia da ilhota pancreática, bem como, participantes na
patogênese do diabetes 18, 19.
O oxigênio na atmosfera encontra-se 99 % sob sua forma molecular diatômica (O2), o
qual possui dois elétrons desemparelhados em sua camada de valência, podendo assim ser
caracterizado como um radical livre. Seus dois elétrons desemparelhados, por apresentarem o
mesmo valor de spin, ou seja, spins paralelos, limitam a velocidade de suas reações de
oxidação, conferindo ao oxigênio pouca reatividade e, por consequência, o estado mais
estável dessa molécula. Dessa forma, a redução do O2 ocorre em etapas gerando os
intermediários da redução do oxigênio 20. Por definição, a denominação radical livre refere-se
a qualquer elemento capaz de existir de forma independente e que possua um ou mais elétrons
desemparelhados em sua camada de valência. Essas espécies são usualmente representadas
por um ponto sobrescrito seguido do elemento atômico no qual ela está centrada (i.e. O2•).
Dessa forma, radicais livres podem ser naturalmente encontrandos nos sistemas biológicos,
gerados a partir da perda ou do ganho de elétrons 21.
Os produtos intermediários da redução do oxigênio, por sua constituição e reatividade,
são denominados espécies reativas de oxigênio (EROs). Esses intermediários reagem
quimicamente com outras biomoléculas, doando ou recebendo elétrons visando estabilidade
molecular. Categorizados como EROs encontram-se elementos centrados no átomo de
oxigênio tanto sob a forma radicalar, como não-radicalar. Porém, apesar dos elementos não-
radicalares não possuírem elétrons desemparelhados em camada de valência, ainda assim
apresentam alguma reatividade.
A reatividade entre esses elementos pode ser termodinamicamente determinada,
definindo sua possibilidade ou impossibilidade de ocorrência. Uma reação é naturalmente
favorável quando a alteração em sua energia livre é negativa. Esse fenômeno pode ser
10
classicamente observado durante reações entre elementos de alto potencial redutor com
elementos de alto potencial oxidante.
As espécies reativas de oxigênio abrangem uma diversidade de espécies químicas,
incluindo o radical ânion superóxido (O2•-), o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical
hidroxila (OH•). A redução da molécula de oxigênio pela incorporação de um elétron em sua
camada de valência resulta na formação do O2•-, caracterizada como etapa inicial na seqüência
de reações responsáveis pela formação das demais espécies reativas 22 (Figura 1). Por possuir
um elétron a mais do que sua carga de prótons, o superóxido é ânionico, elétricamente
carregado, o que limita sua difusão por membranas celulares.
Figura 1. Representação da distribuição eletrônica na molécula de oxigênio, no radical ânion
superóxido e no íon peróxido Distribuição dos elétrons (representados por setas ↑) nos orbitais ligantes e anti-ligantes (*) nos azimutes “s” e “p”, nas camadas energéticas da eletrosfera do oxigênio (O2), superóxido (O2
●-) e do íon peróxido (O22-), forma desprotonada do peróxido de hidrogênio.
Fonte: modificada de Halliwell e Gutteridge, 2007 21.
Essa etapa inicial, de formação de O2•-, pode ser resultante de diferentes sistemas
celulares, como a fosforilação oxidativa na cadeia respiratória mitocondrial, a auto-oxidação
da glicose, a oxidação das catecolaminas, a ativação da cascata do ácido araquidônico, ou
ainda por sistemas enzimáticos como xantina oxidase após isquemia e reperfusão,
monoxigenases citocromo P450, desacoplamento de lipoxigenases 23, 24 e uma importante
fonte descrita especialmente em fagócitos, a ativação da enzima NAD(P)H oxidase 25.
11
O ânion superóxido apresenta baixa reatividade e pode seguir diversos caminhos
metabólicos, sendo estes determinados pelo tipo e pelo estado celular. Dentre esses caminhos,
o O2•- pode reagir com óxido nítrico (NO•) resultando em peróxido nitrito (ONOO•), o qual é
muito mais reativo que seus precursores. Através da ação das enzimas superóxido-dismutase
mitocondrial (MnSOD), citoplasmática (CuZnSOD) e extracelular (EcSOD), o O2•- é
convertido em H2O2 25. Essa conversão pode ocorrer também por dismutação espontânea 23, 26.
A espécie reativa de nitrogênio, NO•, também é um radical livre formado pela conversão da
L-arginina em L-citrulina e NO•, através da ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Essa
espécie reativa atravessa a membrana plasmática e difunde-se com facilidade entre as células,
além de reagir rapidamente com demais radicais livres, em especial e de grande importância
fisiológica com o O2•- 27. Este fenômeno é classicamente descrito em células endoteliais, onde
o aumento na produção de O2•- está relacionado com a diminuição na concentração de NO•
livre e, consequentemente, na supressão do seu potencial vasodilatador 28.
Sistemas antioxidantes enzimáticos como catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) 29, tiorredoxina peroxidase (TPx), Glutarredoxina (GRx) e/ou pequenas moléculas, como
antioxidantes tióis, são responsáveis pela eliminação do H2O2, evitando assim sua conversão
em radical hidroxila, o qual é altamente reativo (Figura 2). A formação do OH• a partir do
H2O2 pode ocorrer pela oxidação de metais de transição em seu estado reduzido, como o
Fe(II), denominada reação de Fenton, resultando na fissão heterolítica do peróxido de
hidrogênio 23.
Inicialmente, os estudos sobre as espécies reativas de oxigênio focaram-se
principalmente sobre sua importante função antibactericida em células fagocitárias, como
macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e monócitos, visando a destruição de micro-organismos
invasores 30, bem como na promoção de ações deletérias em episódios fisiopatológicos 31.
Porém, essa visão tem sido modificada com a descoberta do papel de EROs em outras funções
celulares 31.
Alguns processos celulares estão submetidos à regulação por reações de óxido-redução
(redox) 32, além da ação direta de EROs como segundo mensageiros, contrapondo-se a um
papel deletério 26. Em ilhotas pancreáticas, apesar de possuirem sistemas específicos de
formação de EROs, foi reportado uma menor produção dessas espécies reativas em relação às
células do sistema imune 33, o que parece indicar um papel regulatório dessas espécies no
tecido em questão.
12
O H2O2 pode atuar como agente oxidante ou redutor de baixa reatividade, o que
suscita uma ação sinalizadora por essa espécie. Entretanto, o H2O2 é capaz de inativar
diretamente algumas enzimas por oxição de sítios tióis hiper-reativos, essenciais para a
atividade catalítica, como no caso da enzima gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase 34, 35.
A descrição da participação do H2O2 como segundo mensageiro intracelular, ocorreu
inicialmente na via de sinalização do fator de crescimento derivado de plaquetas, pelo
aumento da fosforilação em resíduos de tirosina de importantes proteínas, p42 e p44 MAP
quinase 36. Posteriormente, a participação do H2O2 foi reportada na via de sinalização do fator
de crescimento epidérmico (EGF), aumentando a fosforilação em tirosina do receptor de EGF
e fosfolipase Cγ1 36, 37. A regulação de funções protéicas por elementos redutores ou
oxidantes é semelhante e pode ter caminhos análogos à regulação por fosforilação. Contudo,
os elementos suceptíveis a essa regulação redox são aqueles que possuem aminoácidos alvo
sensíveis ao estado redox celular, como cisteína e histidina, ao invés de aminoácidos alvo
suceptíveis à fosforilação 31.
Devido às diferenças químicas entre essas espécies reativas, cada uma possue alvos
redox específicos para a tansmissão do sinal de óxido-redução. O NO• liga-se, sobretudo a
grupamentos heme para modulação da atividade de uma grande classe de enzimas. O O2•-
reage com grupamentos ferro-enxofre alterando a atividade de proteínas chave nos processos
celulares, enquanto o H2O2 modifica proteínas principalmente através da oxidação de
grupamentos tióis, favoráveis em sua forma desprotonada, tiolato 38.
Tióis, sítios sulfidrila (SH), são importantes alvos biológicos para oxidação, sendo
parte essencial de sistemas antioxidantes, de elementos críticos para a atividade de enzimas,
de fatores de transcrição e de proteínas regulatórias 39. Assim, a oxidação de proteínas pode
constituir uma via de sinalização celular, onde a alteração para um ambiente oxidativo leva a
rápida modificação de grupamentos sulfidrila para ácido sulfênico ou radical centrado no
átomo de enxofre, tiíl. Proteínas parcialmente oxidadas podem se conjugar com a glutationa,
formando proteínas S-glutationiladas. Embora a S-glutationilação iniba a atividade de
algumas proteínas contendo tióis, ela garante a reversibilidade da oxidação, impedindo a
oxidação e inativação irreversível. Pois, oxidação do ácido sulfênico e formação de ácido
sulfínico e sulfônico pode inativar irreversívelmente e levar à degradação protéica 39.
Sob esses aspectos, o direcionamento das ações dos intermediários reativos do
oxigênio é determinado pelo estado redox celular, montante das reações de óxido-redução, o
qual, sob a óptica das espécies reativas de oxigênio, é mantido pela resultante entre a
produção e eliminação de EROs 29. Dessa forma, a manutenção do equilíbrio redox pode
13
atribuir a esses intermediários um papel regulatório dos processos celulares 31, contrário às
ações patológicas desencadeadas pelo desequilíbrio crônico e descontrolado entre produção e
remoção, com predominância na produção, denominado estresse oxidativo 23.
Figura 2. Representação dos possíveis direcionamentos das espécies reativas de oxigênio
Esquematização hipotética das possibilidades de eliminação, reação e conversão das espécies reativas de oxigênio. Sistemas geradores: NAD(P)H oxidase; ETC - cadeia de transporte de elétrons; NOS - óxido nítrico sintase. Elementos reativos: O2
•- - radical ânion superóxido; H2O2 - peróxido de hidrogênio; OH• - radical hidroxila; NO• - óxido nítrico; ONOO• - peróxido nitrito; HO2
• - hidroperoxil (forma protonada do superóxido). Eliminadores: SOD - superóxido dismutase; GPx - glutationa peroxidase; GSH - glutationa reduzida; GR - glutationa redutase; TPx - tiorredoxina peroxidase; Trx - tiorredoxina; TR - tiorredoxina redutase; GRx - glutaredoxina; CAT - catalase; NADPH - dinucleotídeo de nicotinamida-adenina fosfato reduzida.
1.3 Sistemas Antioxidantes
A produção de espécies reativas de oxigênio apresenta características distintas de
acordo com o estado celular e a funcionalidade dessas espécies nas células em questão.
Apesar da possibilidade de ações deletérias por parte dos elementos reativos gerados no
interior celular como produtos das reações biológicas, organismos aeróbios desenvolveram
mecanismos sofisticados de detecção e eliminação de EROs, assegurando assim a manutenção
NAD(P)H oxidase
O2•- H2O2 OH•
EXTRACELULAR
NO•
ONOO-
- GPx - GSH - GR - TPx - Trx - TR - GRx - CAT - NADPH
H2O
ETC
NOS
HO2•
SOD
14
de um estado de controle sobre os níveis desses elementos 21, denominado Homeostase
Redox.
Para garantir a Homeostase Redox e proteger contra a citotoxicidade promovida por
EROs, há inúmeras proteínas antioxidantes que atuam no controle dos níveis de EROs e no
reparo de componentes celulares oxidados 40.
Esses sistemas protetores podem ser enzimáticos como, superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), tiorredoxina peroxidase (TRx), glutarredoxina
(GRx) e não enzimáticos, como vitamina C e E, glutationa reduzida (GSH), tioredoxina
reduzida (Trx) 41 (Figura 2), e quelantes de metais 42, atuando na manutenção do equilíbrio
redox.
As enzimas CAT, GPx, TPx e GRx atuam na decomposição de H2O2. A catalase
possui elevado KM e catalisa diretamente a decomposição de duas moléculas de peróxido de
hidrogênio em duas moléculas de água e uma de oxigênio, em duas reações. A atividade da
catalase é dificilmente saturada, devido à elevada velocidade máxima de destruição do H2O2,
apresentando constantes de reações de 1,7 x 107 M-1 s-1 e 2,6 x 107 M-1 s-1, para k1 e k2
respectivamente (reação abaixo representada). Durante a reação com o H2O2, forma-se o
componente I, no qual o Fe(III) da catalase é convertido em Fe(IV)O. A equação abaixo
mostra que a remoção completa do H2O2 requer a reação de duas moléculas de H2O2 com uma
única molécula de catalase, o que se torna menos provável com a queda nos nível de H2O2,
refletindo assim uma diminuição de sua atividade em paralelo à queda nos níveis do seu
substrato 21.
Reação da catalase: k1
Catalase-Fe(III) + H2O2 Componente I + H2O k2
Componente I + H2O2 Catalase Fe(III) + H2O + O2 ____________________________________________________
2 H2O2 2 H2O + O2
Nos animais, a catalase é formada por quatro subunidades protéicas, cada qual
contendo um grupamento heme, e a forma ativa da catalase é mantida em um processo
dependente de NADPH 43.
Diferente da catalase, peroxidases removem H2O2 através da oxidação de outros
substratos. A glutationa peroxidase acopla a redução do H2O2 à custa da oxidação de GSH,
um tripeptídio que contém um grupamento tiól. Essa reação resulta na formação de água e na
15
oxidação de duas moléculas de glutationa, que se conjugam entre si por uma ponte dissulfeto,
formando GS-SG (GSSG)44.
O conteúdo intracelular de GSH é determinado pela taxa de influxo e síntese menos a
taxa de efluxo e conjugação. A formação de GSH ocorre intracelularmente em sequências
dependentes de ATP, catalisadas pela enzima γ-glutamilcisteína sintetase e GSH sintetase, ou
redução de glutationa oxidada pela glutationa redutase 45, processo dependente de NADPH 46.
A enzima γ-glutamilcisteína sintetase é responsável pela formação do dipeptídio glutamato-
cisteína, o qual, posteriomente, sofre ação da enzima GSH sintetase concluindo a síntese do
tripeptídio GSH pela inserção do aminoácido glicina. O aminoácido cisteína, portador do sítio
tiól, pode normalmente ser obtido a partir do fluido extracelular pelo transporte da própria
cisteína e/ou transporte e redução da cistina, forma oxidada da cisteína 45.
A glutationa reduzida é uma importante molécula antioxidante que pode ser
rapidamente sintetizada em duas etapas enzimáticas, podendo ainda apresentar um turnover
elevado em alguns tecidos. Esse tripeptídio participa na sinalização intracelular, eliminando
pontes dissulfeto em receptores de membrana, fatores de transcrição e proteínas regulatórias 45.
Outra importante molécula antioxidante é a tiorredoxina (Trx), uma proteína redox-
ativa com baixo peso molecular (12kD) e um sítio ativo conservado contendo dois resíduos de
cisteína adjacentes. Após oxidação, os resíduos de cisteína ligam-se entre si por uma ponte
dissulfeto. A restauração do estado reduzido da Trx se dá pela seleno-flavoproteína
dependente de NADPH, tiorredoxina redutase (TR) 45, 47.
Trx é uma das proteínas essenciais para síntese e reparo do DNA, sendo sua síntese
induzida por vários tipos de estresse, como infecção, insultos isquêmicos e H2O2. A Trx atua
como scavenger de intermediários reativos de oxigênio e repara proteínas oxidadas por esses
intermediários 47, além de regular fatores de transcrição envolvidos na sinalização intracelular
de combate ao estresse oxidativo e apoptose 48.
In vivo, o efeito positivo da TRx foi reportado em animais transgênicos super-
expressando Trx, a qual previniu a incidência do diabetes, induzido tanto geneticamente,
quanto por estreptozotocina 47.
Semelhante à TRx, glutarredoxina também atua como um redutor ditiól, envolvida na
sinalização e no direcionamento de funções celulares, bem como, na defesa contra danos
oxidativos. A manutenção do estado reduzido da GRx se dá por um sistema, no qual os
elétrons são provenientes do NADPH, transferidos pela GR para a GSH e posteriormente para
a GRx. A glutarredoxina cataliza tanto a redução ditiól, quanto monotiól em cisteínas
16
oxidadas. Na redução ditiól o processo ocorre em etapas, onde a císteina N-terminal do sítio
ativo da GRx inicia uma reação sobre um dos átomos exofre da ponte dissulfeto da proteína
oxidada. Isso resulta na formação de uma ponte dissulfeto entre a GRx e a proteína alvo,
estabilizando esses elementos. A cisteína C-terminal do sítio ativo da GRx reduz a outra
cisteína da proteína alvo, e se desprotona, reagindo em seguida com a cisteína N-terminal da
GRx formando uma ponte dissulfeto entre as duas cisteínas da GRx e restaurando o estado
reduzido das duas cisteínas na proteína alvo 49. Em reduções monotióis, GRx utiliza apenas a
císteína N-terminal do seu sítio ativo, a qual apresenta baixo pKa. O mesmo ocorre durante a
redução de pontes dissufeto de proteínas glutationiladas, nesse processo a GRx
especificamente interage com o domínio GSH da ligação dissulfeto alvo, devido a afinidade
da GRx pelo GSH. O que resulta na formação da GRx-SG e restauração do estado reduzido da
cisteína na proteína alvo. A glutarredoxina é posteriormente reduzida pelo GSH, fomando
GSSG, que é restaurado pela GR 49.
A glutationilação de tióis de proteínas, incluindo chaperonas, proteínas de
citoesqueleto e enzimas metabólicas, tem sido proposta como um importante mecansimo de
regulação dos processos biológicos pela modificação reversível dessas proteínas em resposta
às alterações no estado redox intracelular 49.
Os aminoácidos cisteína e metionina são facilmente oxidados sob situações de
aumento no estado oxidativo, porém cisteínas podem ser regeneradas por vias enzimáticas
(NADPH-dependentes) e não enzimáticas (GSH), enquanto para redução de metionina
oxidada (MetO) é necessária a atuação da enzima metionina sulfóxido redutase (Msr) 50. A
redução de resíduos MetO para metionina em proteínas oxidadas, por ação da Msr, é uma
reação dependente de tiorredoxina 51. Esses sistemas podem ser analisados como um
processo de eliminação de EROs, por tamponamento, determinado pela oxidação inicial de
aminoácidos cisteína e metionina e posterior restauro de seu estado reduzido 50.
1.4 Produção e Controle de EROs pela Mitocôndria
Na mitocôndria a cadeia respiratória direciona a energia proveniente de substratos
reduzidos (NADH e FADH2), para o processo de fosforilação oxidativa (FosfOx) do ADP em
ATP. Os substratos reduzidos doam energia na forma de elétrons aos complexos I e II, que os
transferem para o complexo III através da coenzima Q, e subsequentemente ao complexo IV,
o qual, por fim, é responsável pela transferência dos elétrons para o oxigênio formando
moléculas de água 52, 53.
17
Na cadeia de transporte de elétrons o NADH é oxidado à NAD+ pela NADH coenzima
Q redutase ou complexo I, onde dois elétrons são liberados e transferidos para a coenzima Q
(ubiquinona). O complexo II, após a oxidação de FADH2 em FAD, também transfere seus
elétrons para a coenzima Q. A redução parcial por um elétron da ubiquinona resulta na
formação da ubisemiquinona a qual, após ser reduzida por mais um elétron, resulta no
ubiquinol, forma completamente reduzida da coenzima Q 21, 52. Posteriormente, os elétrons
são transferidos para o complexo coezima Q-citocromo c redutase, ou complexo III. Este
complexo por sua vez reduz o citocromo c, proteína pequena móvel associada ao lado
citoplasmático da membrana mitocondrial interna. Finalmente, o citocromo c é re-oxidado
pelo complexo multienzimático citocromo c oxidase ou complexo IV. Esse complexo remove
um elétron do Fe2+ de cada um dos quatro citocromo c reduzidos pelo complexo III,
oxidando-os para citocromo c férrico (Fe3+). Posteriormente, os quatro elétrons são
transferidos para o O2 formando H2O, como representado 21.
O2+4H++4e- → 2H2O
Devido à impossibilidade de transferir quatro elétrons de uma única vez para o
oxigênio, esse processo de redução tem que ser realizado em etapas. Considerando a
reatividade das espécies de oxigênio parcialmente reduzidas, no complexo IV deve haver uma
ligação suficientemente forte com o oxigênio e seus intermediários reduzidos até sua
completa conversão à água, o que se torna possível devido à elevada afinidade do complexo
IV pelo oxigênio 21.
Utilizando a energia proveniente do carreamento eletrônico, os complexos da cadeia
de transporte de elétrons transportam prótons da matriz para o espaço intermembrana
mitocondrial, criando um gradiente eletroquímico de prótons e consequentemente um
aumento na diferença de potencial na membrana mitocondrial interna (∆ψ).
O gradiente de prótons é a força necessária para a FosfOx pela ATP sintase (complexo
V). O complexo V acopla a energia eletroquímica à ligação do ADP com fosfato inorgânico
(Pi), formando ATP. A baixa condutância da membrana mitocondrial interna ao influxo de
próton é condição fundamental para garantir o importante influxo de próton através do
complexo V e consequentemente, o acoplamento entre o processo de respiração mitocondrial
e a síntese do ATP. Entretanto, a condutância da membrana interna mitocondrial ao influxo de
prótons pode variar, em resposta ao aumento do ∆ψ. Da mesma forma que, o aumento na
condutância devido a expressão de proteínas desacopladoras (UCPs), que permitem a
passagem de prótons do espaço intermembrana para a matriz mitocondrial, alteraram o ∆ψ 19.
18
UCPs são proteínas de aproximadamente 32 kDa, membros de uma família de carreadores
mitocondriais de ânions 53. A familia das proteínas desacopladoras é caracterizada por 5 UCPs
homólogas (UCP1 - UCP5), sendo a UCP2 tecidualmente mais distribuída, porém, suas
funções fisiológicas ainda não estão totalmente esclarecidas 52.
Em condições com diminuida FosfOx e sustentado consumo de oxigênio, a força
próton motriz é elevada devido a uma sobrecarga no gradiente eletroquímico. O elevado
potencial de membrana aumenta a permanência da coenzima Q em seu estado reduzido,
aumentando a probabilidade de redução por um elétron da molécula de oxigênio e formação
de superóxido 53.
Dessa forma, o elevado gradiente eletroquímico parece aumentar a resistência ao
bombeamento de prótons, prejudicando a cadeia de transporte de elétrons e favorecendo a
formação de superóxido. Por outro lado, a atividade das UCPs diminuem a formação de EROs
devido a diminuição no ∆ψ. Porém, diminuem também a síntese de ATP por desviar o influxo
de prótons da ATP sintase 52. Assim, a UCP2 tem um papel importante na célula β
pancreática, refletindo-se em aterações na funcionalidade e na sobrevivência dessas células,
por controlar a produção de ATP e de EROs pela mitocôndria. Ademais, esta proteína tem
sido proposta como um mecanismo de proteção contra o estresse oxidativo causado pela
mitocôndria 52, 54.
Estudos recentes confirmaram a regulação da atividade da UCP por EROs, embora o
caminho exato pelo qual essas espécies ativem a UCP2 permaneça desconhecido. Entretanto,
esta ativação poderia ser mediada diretamente pelo radical ânion superóxido ou, como
recentemente proposto, pelo 4-hidroxinonenal (HNE), um produto de peroxidação lipídica 55.
Assim, a hiperglicemia crônica poderia prejudica a funcionalidade de célula β pancreática
através da indução na atividade da UCP2 pelo superóxido, reduzindo o potencial de
membrana, a produção de ATP e, consequentemente, a secreção de insulina estimulada pela
glicose (GSIS).
Ilhotas pancreáticas de camundongos knockout para a UCP2 mantêm a GSIS após
hiperglicemia crônica. Do mesmo modo, a remoção do superóxido endógeno previne a perda
da GSIS induzida pela hiperglicemia em camundongos controle, mas não tem efeito sobre
ilhotas pancreáticas com deficiência para UCP2 52. Esses aspectos indicam que a relação
superóxido-UCP2 resulta em prejuízo na secreção de insulina pelas células β pancreáticas.
Em contra-partida, o real efeito da relação superóxido-UCP2 sobre a proteção da célula B
contra espécies reativas ainda é incerto. Porém, a redução na secreção de insulina pela
ativação da UCP2 pode refletir a ativação de um mecanismo protetor que, através da
19
diminuição do ∆ψ, reduz a produção de superóxido para garantir a proteção contra danos
oxidativos. Dessa forma, parece haver uma inter-relação entre o controle na produção
mitocondrial de EROs pela UCP, e o controle na atividade da UCP por EROs.
Outra importante proteína localizada na membrana interna mitocondrial que contribui
para a redução no conteúdo de EROs é a nicotinamida nucleotídeo transidrogenase (NNT),
uma proteína mitocondrial transcrita no núcleo, envolvida na detoxificação de espécies
reativas de oxigênio.
Camundongos knockout para o gene da NNT apresentam intolerância à glicose e
redução na estimulação da secreção de insulina pela glicose. Esse defeito fenotípico foi
revertido através da expressão do gene selvagem da NNT nesses animais. A nicotinamida
nucleotídeo transhidrogenase atua como uma transferidora de elétrons que catalisa a redução
do NADP+ atavés do NADH, formando NADPH e NAD+. Em condições fisiológicas a NNT é
um eficiente gerador intramitocondrial de NADPH. Dessa forma, a NNT participa no controle
do conteúdo mitocondrial de EROs, o que impediria o aumento na atividade da UCP2 por
EROs e consequente redução na secreção de insulina estimulada pela glicose 56.
A mitocôndria apresenta ainda outros mecanismos antioxidantes, como a isoforma da
enzima superóxido dismutase (MnSOD), isoforma da GPx 57, 58 e outras enzimas dependentes
de tióis para detoxificação de H2O2, como glutarredoxina 59. Dessa forma, parece haver um
controle local de conteúdo de EROs na mitocôndria o que sugere esta organela como um
microambiente redox finamente regulado.
Fisiológicamente, alterações na produção de EROs pela mitocôndria, em resposta as
alterações glicêmicas parecem não interferir sobre os mecanismos extramitocondriais de
controle da secreção de insulina. Pois, considerando que, a ausência de UCP2 esteja associada
à perda da via de controle UCP2-EROs, mesmo assim, ilhotas isoladas de camundongos
knockout para a UCP2 apresentaram um aumento da secreção de insulina frente a qualquer
concentração de glicose 54. Assim, esse fenômeno parece indicar que a formação de EROs
pela mitocôndria pode estar implicada com a própria função mitocondrial, regulando a
atividade de componentes como UCPs, e assim o acoplamento do metabolismo energético e a
produção de ATP. Enquanto fontes extramitocondriais de EROs como a NAD(P)H oxidase,
poderiam estar associadas às alterações na sinalização intracelular e modular a secreção de
insulina por atuar em vias distais à mitocôndria 19.
20
1.5 Produção de EROs pela Enzima NAD(P)H oxidase
A descrição clássica da enzima NAD(P)H oxidase, de sua estrutura e funcionamento,
ocorreu primeiramente para a isoforma NOX2. Como descrito por Babior et. al. (2002),60a
NAD(P)H oxidase é uma enzima heteromultimérica formada por quatro componentes
essenciais para sua ativação. Um deles, uma proteína flavocitocromo b558, constituída pelos
componentes gp91PHOX (isoforma NOX2) e p22PHOX, está ligado à membrana plasmática. Os
demais componentes são citosólicos (p47PHOX, p67PHOX, p40PHOX e uma proteína de baixo
peso molecular Rho GTPase: Rac1 ou Rac2) e translocam-se para a membrana após ativação,
a qual ocorre pela fosforilação da p47PHOX em diversos resíduos de serina, sendo os resíduos
S303, S304, S358 e S370 essenciais para o recrutamento. A interação dos componetes
citosólicos com o citocromo b558 é mediada pela subunidade p22PHOX, a qual ancora esses
componentes e possibilita a ativação da NOX2 pela p67PHOX 61. Após ser ativada, a enzima
catalisa a produção do ânion superóxido a partir da redução do oxigênio, tendo o NAD(P)H
como doador de elétrons (Figura 3).
Figura 3. Representação da isoforma NOX2 da enzima NAD(P)H oxidase Esquematização da transferência de elétron (e-), formação de superóxido (O2
●-) e das subunidades protéicas que compõem a isoforma NOX2 da enzima NAD(P)H oxidase. Fonte: modificada de Newsholme et al., 2009 62.
A enzima NAD(P)H oxidase apresenta ainda outras isoformas, como os homólogos 1
e 4, denominados NOX1 e NOX4, respectivamente. Todos os membros NOX da família da
21
NAD(P)H oxidase são proteínas transmembranas que transportam elétrons através de
membranas biológicas, formando superóxido pela redução do oxigênio 63.
Semelhante à NOX2, a isoforma NOX1 gera superóxido dependente de sua ativação
por componentes citosólicos que, no caso dessa isoforma, são as subunidades citosólicas
NOXO1 (NOX Organizador, correspondente ao p47PHOX) e NOXA1 (NOX Ativador,
correspondente ao p67PHOX). Embora a ativação da NOX1 pelos componentes citosólicos
requeira a proteína p22PHOX 64, sua dependência é menor do que a observada para NOX2 63.
A isoforma NOX4 apresenta a mais distante similaridade com a NOX2, apenas 39%
de homologia, bem como uma localização primariamente observada no retículo
endoplasmático. Essa baixa homologia confere a independência dos componentes citosólicos,
porém dependência da p22PHOX, para a atividade da NOX4, que poderia estar
constituivamente ativa mesmo na ausência de estímulo 63, 64. Interessantemente, durante a
indução da expressão da NOX4, um aumento na produção de peróxido de hidrogênio, e não
de superóxido, foi detectado no meio extracelular 64. Porém, esse fenômeno não pode ser
assumido como uma prova da produção direta de H2O2 pelo NOX4 pois, devido a sua
localização em organela, o superóxido liberado pelo NOX4 no lúmen da organela poderia
rapidamente ser dismutado a peróxido de hidrogênio, o qual é capaz de se difundir por entre
membranas e alcançar o espaço extracelular 63.
A forma aniônica do superóxido limita sua difusão por membranas plasmáticas. O
superóxido em solução dismuta espontâneamente para H2O2 com uma taxa de 105 M-1s-1 em
pH 7, podendo esta constante ser aumentada em até 4 vezes pela ação de enzimas superóxido
dismutases. Assim, como sua meia vida, a distância de difusão do superóxido não é longa 38.
Considerando o tempo de vida das espécies reativas de oxigênio, suas ações e participação
como moléculas sinalizadoras são provavelmente dependentes do local de sua produção, o
que poderia indicar a NAD(P)H oxidase como uma fonte de EROs com uma área de atuação
no citoplasma e na membrana plasmática. Em células não fagocíticas a enzima NAD(P)H
oxidase libera superóxido para o meio extracelular, assim a ação intracelular dessas espécies é
dependente da difusão do superóxido através de canais de Cl- (ClC-3) ou pela dismutação do
superóxido, pela SOD extracelular, a H2O2 e difusão deste para o interior celular mediado por
aquaporinas 38.
O complexo enzimático NAD(P)H oxidase, similar ao encontrado em fagócitos, foi
descrito por Oliveira et al. (2003) 33 em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos. Os autores
mostraram que a enzima é responsável pelo aumento na produção de O2•- quando as ilhotas
são estimuladas pela glicose, tendo a PKC como reguladora através da fosforilação da p47phox
22
19, 33. O RNAm dos homólogos NOX1, NOX4, NOXO1 e NOXA1 também foram
identificados em ilhotas pancreáticas de ratos 65. Apesar da incerteza do papel dessa enzima
em células não fagocíticas, a atividade da NAD(P)H oxidase em situações fisiológicas pode
contribuir para a funcionalidade celular 19, por sua participação no controle de pH intracelular,
na facilitação do metabolismo da glicose devido à liberação de NAD+ e também pelo
suprimento de EROs 63.
Entretanto, a NAD(P)H oxidase pode também estar implicada ou ser modificada
durante a gênese de algumas patologias. Níveis aumentados de mRNA para o componente
p22PHOX foi reportado em ilhotas pancreáticas isoladas de pacientes diabéticos do tipo 2.
Porém, os níveis de p22PHOX foram revertidos paralelamente à melhora na sobrevivência e
funcionalidade das ilhotas pancreáticas devido ao tratamento com metformina 66. Esse
resultado foi o primeiro a relacionar experimentalmente, uma possível implicação da
NAD(P)H oxidase com o processo de disfunção da célula β pancreática humana, o qual
poderia estar relacionado com alterações na atividade desta enzima.
1.6 NAD(P)H oxidase, Espécies Reativas de Oxigênio e Sinalização: uma primeira
hipótese em ilhotas pancreáticas
A primeira hipótese por nós formulada sobre a possível ação de sinalização de EROs
em ilhotas pancreáticas foi estabelecida a partir dos dados da literatura discutidos abaixo, os
quais conjecturam a possibilidade de controle da funcionalidade da célula β pancreática por
EROs, através da ativação da enzima NAD(P)H oxidase.
O receptor de insulina (IR) e seus principais substratos (IRS-1 e IRS-2) os quais, após
serem fosforilados, associam-se ao fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-K), estão presentes nas
células β das ilhotas pancreáticas, possibilitando um mecanismo autócrino e parácrino de ação
da insulina. Porém, há ainda controvérsias sobre o real efeito desse mecanismo autócrino e
parácrino. No entanto, foi sugerido que a inibição da atividade tirosina quinase do IR, nas
ilhotas pancreáticas, esteja relacionada com um considerável aumento na secreção da insulina 67. Posteriormente, foi observado um efeito inibitório da insulina sobre sua própria secreção
através da fosforilação de seu receptor, sendo este efeito mediado pela PI3-K, a qual promove
a abertura dos canais para K+ sensíveis ao ATP e subsequente hiperpolarização da membrana
celular 68. Esse sistema de feedback negativo foi evidenciado em ilhotas pancreáticas de
camundongos, pela amplificação da secreção de insulina frente à inibição da PI3-K em meio
contendo alta concentração de glicose 69. A ativação desse fenômeno pode ocorrer através da
23
fosforilação do IRS-2 pois, como demonstrado por Kubota et. al. (2000) 70, ilhotas de
camundongo com knockout do gene codificador do IRS-2 apresentaram aumento na resposta
secretória da insulina induzida pela glicose.
Paralelo a essas evidências, Mahadev et. al. (2001) 71, demonstraram que em
adipócitos 3T3-L1 e células hepáticas, a insulina estimula a formação de peróxido de
hidrogênio, promovendo inibição de proteínas fosfatases de tirosina (PTPs), especificamente a
PTP-1B, a qual apresenta grande afinidade pelo IR e seus substratos. Dessa forma, nessas
células, o aumento da formação de H2O2 facilitaria a propagação do sinal insulínico.
Posteriormente, os mesmos autores mostraram que o aumento na produção de H2O2 induzido
pela insulina em adipócitos foi devido à ativação da enzima NAD(P)H oxidase 72.
Respectivamente, Nakazaki et al. (1995) 73 verificaram inibição transiente da secreção
de insulina resultante da exposição de ilhotas pancreáticas de ratos ao H2O2. Semelhante ao
efeito descrito para a insulina, a inibição provocada pelo H2O2 foi também mediada pelo
aumento na probabilidade de abertura dos canais para K+ sensíveis ao ATP. Para este
fenômeno, foi sugerida uma ação indireta por via da inibição da glicólise e ou da fosforilação
oxidativa, resultando na redução da concentração intracelular de ATP.
Sob esses aspectos, criou-se a hipotese na qual a ação autócrina do hormônio, poderia
promover a hiperpolarização da membrana plasmática em células β pancreáticas, devido ao
aumento na concentração intracelular de H2O2 gerado pela ativação da enzima NAD(P)H
oxidase. Considerando o efeito bloqueador do H2O2 sobre o metabolismo celular, a
hiperpolarização causada pela insulina poderia ser um reflexo de uma relação entre insulina-
NAD(P)H oxidase-EROs-metabolismo.
A conexão entre esses dados da literatura foi a nossa primeira hipótese e indício acerca
da modulação endógena de EROs sobre a função de célula β e o envolvimento da enzima
NAD(P)H oxidase nesse processo.
1.7 Metabolismo, Estresse Oxidativo e Diabetes
Apesar do metabolismo de nutrientes ser um mecanismo essencial para a secreção de
insulina, a exposição crônica a elevados níveis glicêmicos, hiperglicemia, resulta na disfunção
e morte de células β pancreáticas. Embora ainda não se conheça o mecanismo exato da
toxicidade pela glicose, alguns aspectos têm sido apontados como importantes colaboradores.
Os efeitos deletérios da toxicidade pela glicose, glicotoxicidade, foram inicialmente
atribuídos à excessiva atividade da célula β, causando sua exaustão, perda de sua função e
24
consequentemente sua morte. Atualmente, os danos pela glicotoxicidade têm sido atribuídos a
um desvio no direcionamento metabólico da glicose associado à formação excessiva de
espécies reativas de oxigênio. Durante esses quadro de toxicidade, a formação excessiva de
EROs resulta em estresse causado pela alta taxa de oxidação, denominado estresse oxidativo,
o qual está relacionado com a perda de funcionalidade das células β pancreáticas 19.
A elevação sustentada na concentração de glicose aumenta o fluxo de glicose para a
via do poliol. Essa via é iniciada pela conversão enzimática da glicose às custas do consumo
dos antioxidantes NADPH ao poliálcool sorbitol, o qual, após ser metabolizado a frutose pela
sorbitol desidrogenase, aumentando a razão NADH/NAD+, é convertido a frutose-6-fosfato 74.
A via da hexosamina é um dos caminhos adicionais no metabolismo da glicose que pode
mediar efeitos tóxicos, iniciada pela conversão da frutose-6-fosfato a glicosamina-6-fosfato,
resulta na formação da UDP-N-acetilglicosamina, substrato de glicosilação de importantes
fatores de transcrição 53.
Os produtos finais de glicação avançada (AGEs) também caracterizam um importante
mecanismo envolvido na complicação microvascular no Diabetes 53. A formação intracelular
dos precursores da glicação reduz a integridade da célula alvo por modificação em funções
protéicas ou pela ativação dos receptores de AGE, que estimulam a produção de EROs 75.
AGEs podem ser formados pela reação da glicose com grupamentos amino, formando um
aducto referido como base de Schiff. Essa reação ocorre na terminação aldeído do açúcar,
pela substituição da dupla ligação com o oxigênio pelo nitrogênio da amina. O rearranjo da
base de Schiff resulta na formação do produto de Amadori, o qual se acumula em proteínas,
iniciando o processo de glicação avançada 76.
Os AGEs podem ainda ser formados pela autoxidação da glicose a glioxal,
decomposição do produto de Amadori a 3-deoxiglucosona e significativamente pela
fragmentação do gliceraldeído-3-fosfato e diidroxiacetona-fosfato a metilglioxal. Glioxal, 3-
deoxiglucosona e metilglioxal são compostos dicarbonílicos reativos que interagem com os
grupamentos amino de proteínas intracelulares e extracelulares, formando os AGEs 53. Além
desses fatores, a formação excessiva de diidroxiacetona-fosfato e sua oxidação promovem o
aumento na síntese de novo de diacilglicerol (DAG), e consequente elevação na atividade da
PKC 74.
Em ilhotas pancreáticas, o aumento na atividade da PKC contribui para a elevação na
produção de superóxido pelo aumento na atividade da enzima NAD(P)H oxidase (15). Esse
mecanismo pode gerar um desbalanço no equilibrio redox intracelular e consequente inibição
de processos celulares. Dentre esses, há o bloqueio do metabolismo da glicose pela oxidação
25
do grupamento tiól da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (G3PD), sítio
responsável pela ligação ao gliceraldeído-3-fosfato 77.
O bloqueio no metabolismo da glicose aumenta o acúmulo dos componentes
anteriores ao gliceraldeído-3-fosfato, o que é agravado pela não inibição da glicoquinase 78
com contínua entrada e fosforilação da glicose na célula. Esse acúmulo acentua o
direcionamento das cadeias carbônicas para as vias do poliol, da hexosamina, AGEs e DAG,
que consequentemente induzem a formação de EROs, caracterizando um ciclo deletério.
Apesar de a disfunção metabólica ser apontada como possível responsável pela
glicotoxicidade, fisiologicamente as células β pancreáticas saudáveis respondem de modo
apropriado às variações glicêmicas, com uma taxa adequada de secreção de insulina. O
piruvato derivado da glicose é eficientemente transportado para a mitocôndria, onde os
carbonos provenientes da glicose são prioritariamente oxidados a CO2. Sob estes aspectos, o
bloqueio no metabolismo e a excessiva formação de radicais de oxigênio, fatores
estabelecidos como mediadores dos danos hiperglicêmicos no diabetes, podem ser resultados
de defeitos genéticos e ou de condições metabólicas adversas como a dislipidemia. Pois, como
demonstrado, em ratos com pancreatectomia de 90%, não houve alteração na incidência de
apoptose, apesar da elevada glicemia 79.
Dessa maneira, o bloqueio na formação de piruvato e o direcionamento do
metabolismo para a via do poliol, hexosamina, AGEs e DAG não está unicamente associado
ao aumento na concentração de glicose, mas sim a disfunções genéticas ou ambientais
combinadas à hiperglicemia. Assim, a morte de célula β por hiperglicemia parece resultar de
uma taxa inadequada de metabolismo da glicose, ao invés de uma taxa elevada 80.
Apesar dos danos gerados na hiperglicemia crônica, agudamente o efeito do aumento
na concentração de glicose sobre o conteúdo intracelular das espécies reativas de oxigênio, e
em particular do peróxido de hidrogênio, em ilhotas pancreáticas permanece contraditório.
Considerando os aspectos supressores do H2O2 sobre a fisiologia da ilhota pancreática, o
aumento na atividade da célula β pela glicose pode requerer ajustes metabólicos e
consequentemente no conteúdo intracelular de H2O2 para a manutenção da homeostase redox.
1.8 Estado Redox e Funcionalidade de Ilhotas Pancreáticas
Células β pancreáticas estão continuamente expostas às variações glicemicas,
respondendo às mesmas com uma taxa adequada de secreção de insulina. Desse modo, apesar
26
da ocorrência de episódios hiperglicêmicos, a homeostase redox é mantida em condições
fisiológicas.
O mecanismo de secreção de insulina dependente de KATP, ou triggering pathway,
constitui o mecanismo principal de sinalização para GSIS. Esta via é ativada por nutrientes
mitocondrialmente oxidados que permitem a fosforilação oxidativa, resultam no aumento da
razão ATP/ADP e fechamento dos KATPs 81. Nas células β, essa estreita relação entre o nível
de glicose plasmático e a produção de ATP é garantida pela extraordinária taxa de oxidação
de glicose 80.
A glicose é transportada rapidamente para o interior celular por difusão facilitada,
através dos transportadores de glicose, e direcionada para a glicólise através da fosforilação
pela glicoquinase, a qual não é inibida pelo seu próprio produto, glicose-6-fosfato. Essa
característica da glicoquinase garante um sistema de baixa afinidade e de alta capacidade que
não se satura mesmo em condições de elevado fluxo glicolítico, sendo a glicoquinase, assim
denominada, como sensor de glicose da célula β 78, 80. A alta atividade metabólica nas células
β é garantida pelo eficiente consumo de piruvato pela mitocôndria com formação de CO2, de
FADH2 e NAD(P)H. Ademais, a elevada atividade das lançadeiras de hidrogênio
mitocondriais (glicerolfosfato e malato/aspartato) sustenta a reoxidação do NADH para NAD+
citosólico 82, cofator necessário para a manutenção da atividade da gliceraldeido-3-fosfato
desidrogenase 80.
A GSIS pode ainda ser potencializada por mecanismos independentes dos KATPs,
quando os mesmos já se encontram funcionalmente bloqueados, sendo estes mecanismos
caracterizados como via de amplificação da secreção de insulina, denominado amplifying
pathway. A sinalização para a via de amplificação parece apresentar-se dependente do
metabolismo da célula β e, embora muitos estudos evidenciem o envolvimento do amplifying
pathway em condições fisiológicas, não há uma explicação mecanística clara. Diversas
técnicas têm apontado o envolvimento do ATP nos passos de secreção distal ao aumento do
cálcio citosólico 81, onde os nucleotídeos de adenina poderiam atuar como segundo
mensageiro em ambas as vias, triggering e amplifying.
Estudos recentes propõem outros possíveis mensageiros para a amplifying pathway,
como o AMPc, a exportação mitocondrial de citrato para o citosol, a proteina quinase ativada
por AMP e o cofator reduzido NADPH 59, 81.
O equivalente reduzido NADPH é o principal responsável pela manutenção da
funcionalidade dos sistemas antioxidantes 83. A geração do NADPH através do metabolismo
da glicose possui importante participação da via das pentoses-fosfato (PPP). Essa via se inicia
27
com a degradação da glicose-6-fosfato, pela ação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase
(G6PD), passo enzimático limitante do processo 83, resultando na formação de 6-fosfoglucona
δ-lactona e a liberação de uma molécula de NADPH e CO2. Sobre o 6-fosfogluconato,
terceiro componente desta via, a ação da enzima 6-fosfogluconato desidrogenase resulta na
formação de D-ribulose 5-fosfato e outra molécula de NADPH.
Assim, o metabolismo da glicose desencadeia a exocitose dos grânulos insulínicos
fundamentalmente devido ao triggering pathway 81. Porém, gera sinalizadores intracelulares,
como o NADPH 59, 84, 85, o qual poderia atuar através da modulação do estado redox 59 como
um mecanismo de amplificação da secreção de insulina.
Reações de óxido-redução podem controlar vias de sinalização celular e
consequentemente processos fisiológicos. Este fenômeno foi primeiramente demonstrado por
Sundaresan et al. (1995), que reportaram a dependência do H2O2 para a sinalização mediada
pelo fator de crescimento derivado de plaquetas em células da musculatura vascular lisa 36.
Recentemente, foi demonstrado que a alteração no estado redox celular é uma
importante variável para a exocitose. A presença de NADPH e GSH durante medidas de
capacitância de membrana plasmática resultou no aumento do registro, observado frente a
trens de despolarizações em célula β pancreática. Para esse fenômeno, foi reportando a
dependência da atividade específica da glutarredoxina (GRx) como mediadora do efeito
positivo do NADPH sobre a maquinaria exocitótica 59. Pois, o efeito do NADPH sobre a
exocitose foi pontecializado por microinjeções de GRx, inibido por microinjeções de TRx 59 e
abolido pela redução na expressão de GRx 86.
Esses resultados indicam que NADPH/GRx/TRx parecem mediar uma regulação
redox sobre o mecanismo de secreção de insulina mediado por nutrientes 59. Em ilhotas
pancreáticas, a elevação na concentração de glicose resulta no aumento da atividade da PPP 84,
85 com consequente aumento na formação de NADPH 87 e de GSH 84. Associado a alta
expressão e distinta distribuição de GRx no citoplasma, especialmente em grânulos
secretórios, levanta a interessante possibilidade de que o controle redox sobre a exocitose
pode ocorrer de modo dependente do metabolsimo e em domínios específicos, como nas
regiões próximos aos grânulos insulínicos.
A importância do estado redox na fisiologia da ilhota pancreática há muito foi
demonstrada pela supressão da secreção de insulina, devido a redução no conteúdo de GSH
através da inibição da enzima glutationa redutase 88. Inversamente, a presença de GSH em alta
concentração de glicose, de forma dose-dependente aumentou a GSIS 89, bem como reduziu o
28
estresse oxidativo, melhorando a secreção de insulina, e a expressão de mRNA da insulina em
ilhotas isoladas de pacientes diabéticos tipo 2 90.
A cisteína, amino ácido portador de sítio tiól, também pode participar da modulação
redox como substrato para a síntese de glutationa ou ainda como agente redutor direto.
Agudamente, a presença da cisteína ou do seu análogo permeável à membrana plasmática a
N-acetil-L-cisteína (NAC), potente antioxidante, foram reportados por aumentar a secreção de
insulina em resposta à alta concentração de glicose 91. Efeito positivo foi ainda observado em
ilhotas de camundongos, pela presença do doador de cisteína (L-2-oxotiazolidina-4-ácido
carboxilico), o qual aumentou a liberação de insulina em paralelo ao aumento no inflxo de
cálcio 92.
O tratamento de células secretoras de insulina com cisteína promoveu proteção contra
danos induzidos por H2O2 93, 94 e pelo produto de peroxidação lipídica, 4-hidroxi-2-nonenal
(4-HNE) 93. Essa proteção foi correlacionada com um aumento no conteúdo de glutationa
nessas células 93-95, sendo ainda acompanhado pela supressão da translocação do fator de
transcrição pancreatic duodenal homeobox 1 (PDX-1) do núcleo para o citoplasma induzido
pelo 4-HNE 93.
Entretanto, concentrações elevadas de cisteína foram reportadas por inibir a GSIS,
devido à formação de sulfeto de hidrogênio (H2S), produto do metabolismo da cisteína 96. H2S
é endogenamente produzido pela cistatinonia β-sintase (CBS) e cistatinonia γ-liase (CSE)
enzimas-chave no processo de transulfuração a partir da cisteína. Ambas CBS e CSE são
expressas em ilhotas pancreáticas de camundongos e em células secretoras de insulina, onde o
efeito inibitório de altas concentrações de cisteína (3 mM) sobre a secreção de insulina,
correlaciona-se com a formação de H2S 96, o qual prejudica o fechamento dos KATPs 97 e a
oscilação intracelular de cálcio induzido pela glicose 96.
Diversos estudos mostraram o efeito negative do H2O2 sobre a função de células β
pacreáticas 73, 98-100. Em ilhotas pancreáticas tanto a exposição aguda ao H2O2, quanto a
exposição crônica a alta concentração de glicose suprimiram a atividade da G3PD 101, porém
sem aumentar o conteúdo dos metabolitos precedentes ao gliceraldeído 3-fosfato, sugerindo o
desvio desses matabólitos para a via das hexosaminas, poliol e para a formação dos produtos
finais de glicação avançada 101.
A inibição da maquinaria metabólica por EROs pode ocorrer pelo bloqueio da
atividade da enzima mitocondrial aconitase 102 e da enzima citosólica gliceraldeído 3-fosfato
desidrogenase (G3PD) as quais são suceptíveis à modificação oxidativa 34, 35, 103. G3PD possui
um papel crítico na catálise do glicareldeído 3-fosfato para 1,3-bisfosfoglicerato e para a
29
geração de NADH na via glicolítica. Um dos quatro monômeros de cisteína da G3PD é
especialmente reativo (Cis 149) e está localizado no sítio catalítico da enzima, próximo à
coenzima NAD 104. Como alguns tióis são essenciais para a atividade ezimática, a oxidação
destes implica na inativação de enzimas.
De modo semelhante, a atividade da aconitase é também suceptível a mecanismos
oxidativos. A aconitase mitocondrial pertence a uma família de desidratases contendo ferro-
enxofre, nas quais a atividade é dependente do estado redox dos grupamentos [4Fe-4S]2+.
Assim, tem sido demonstrado que a exposição de mitocondria isolada à oxidantes, em
particular O2•- e H2O2, inativa a enzima de forma reversível, impedindo a conversão de citrato
para isocitrato. Entretanto, é sugerido que o H2O2 não iniba diretamente a aconitase, sedo esta
inibição mediada pela interação da aconitase com componentes responsivos ao H2O2 102.
A inibição do metabolismo pelas espécies reativas de oxigênio em ilhotas pancreáticas
foi primeiramente sugerido por Nakazaki et al. (1995) 73. Através da técnica de patch-clamp,
os autores observaram uma ativação rápida de KATPs e inibição da excitabilidade elétrica
estimulada pela glicose. Este fenômeno foi proposto devido à inibição do metabolismo da
glicose pelo H2O2 73. Poteriormente, experimentos semelhantes realizados em células β
primárias e células secretoras de insulina, mostraram a inibição rápida no metabolismo e na
secreção de insulina pelo H2O2 99, 100. Recentemente, foi ainda demonstrado que a adição de
H2O2 (10-100 µM) suprime a frequência de disparo de potencias de ação, as oscilações
intracelulares de cálcio e a secreção de insulina, estimulados pela alta concentração de glicose
em ilhotas pancreáticas de camundongos 98.
Entretanto, uma ação estimulatória do H2O2 sobre a GSIS foi recentemente sugerida,
onde a adição de doses baixas (1-4 µM) de H2O2 estimulou a secreção de insulina na presença
de baixa concentração, mas sem efeito demonstrado em alta concentração de glicose.
Ademais, a diminuição drástica nos níveis de EROs pelo tratamento de ilhotas pancreáticas de
camundongos com antioxidantes, aboliu a secreção de insulina estimulada pela glicose 105, 106
e por alta concentração de K+ 106. Esses achados parecem sugerir as EROs, como elementos
fundamentais de sinalização para a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas.
Entretanto, apesar dessas observações, Martens et al. (2005) 107 mostraram que o
aumento na concentração de glicose associado à sua elevada taxa metabólica preveniu o
acúmulo de EROs em células β primárias. Onde o efeito supressor foi mais pronunciado em
células com maior responsividade metabólica à glicose 107. O metabolismo da glicose,
intimamente relacionado com a secreção de insulina, está também relacionado com a
supressão dos níveis de EROs em ilhotas pancreáticas, suscitando uma reavaliação do
30
conceito no qual a exposição à altos níveis de glicose invariavelmente aumenta os níveis de
EROs induzindo a disfunção e morte de célula β. Dessa forma, o efeito da elevada
concentração de glicose sobre os níveis de EROs e a funcionalidade da célula β pancreática
pode variar em relação ao tempo de exposição. Pois, cronicamente, estimula a formação
dessas espécies, enquanto que agudamente, diminui seu conteúdo intracelular em paralelo ao
efeito positivo sobre a secreção de insulina.
Sob estes aspectos, há a possibilidade de que o desequilíbrio no estado redox
intracelular decorrente do aumento no estado oxidativo, promova a oxidação de elementos
importantes para o funcionamento celular. Dentre esses, enzimas metabólicas como a
glicoquinase 32, a gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase 34, 35, 103 e a aconitase 102 possuem
sítios tióis susceptíveis à regulação redox. O aumento no estado de oxidação celular, promove
bloqueio metabólico e redução na razão ATP/ADP, resultando na redução da probabilidade de
fechamento dos KATPs e na hiperpolarização da membrana plasmática, com consequente
redução da secreção da insulina 73, 98-100.
Entretanto, apesar dessas observações, o efeito das alterações no estado redox sobre os
mecanismos de secreção de insulina permanece incerto, havendo ainda uma contradição na
literatura em questão.
31
2- CONCLUSÃO
32
6 CONCLUSÃO
O presente estudo mostrou que mudanças no estado de óxido-redução celular alteram a
resposta de secreção de insulina pela glicose em ilhotas pancreáticas. O aumento no estado
oxidativo devido à adição de H2O2 suprimiu a GSIS. Inversamente, efeitos positivos sobre a
GSIS foram observados pela adição de antioxidantes. Entretanto, a modulação no estado
redox celular em favor da capacidade redutora, exerceu um efeito dual na funcionalidade da
célula β pancreática, onde pequenas alterações no conteúdo de EROs foram estimulatórias
sobre a secreção de insulina, enquanto alterações maiores suprimiram esse efeito positivo.
Dessa forma, apesar dos efeitos positivos observados pela diminuição nos níveis de
EROs, uma diminuição acentuada prejudicou a função das ilhotas pancreáticas, mostrando a
existência e a importância de um estado redox para a secreção de insulina.
Adicionalmente, o conteúdo de EROs foi modulado pela glicose em ilhotas
pancreáticas. O aumento na concentração de glicose diminuiu o conteúdo de EROs, sendo
este efeito correlacionado com a atividação da via das pentoses-fosfato.
Assim, dentre os mecanismos de ativação das células β pela glicose, a modulação no
estado redox parece ser parte do mecanismo de secreção de insulina.
33
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