molekuler genetik_haftaviii
Post on 04-Apr-2018
227 Views
Preview:
TRANSCRIPT
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
1/18
31.10.2007
1
Hafta VIIIRekombinant DNA Teknolojileri
Do.Dr. Hill zda
GENETK
111-503
Rekombinant DNA TeknolojisiAma
Spesifik DNA dizilerinin yerlerinin belirlenmesi.
DNAnn belirli noktalardan kesilmesi
Belirli bir DNA parasnn milyarlarca kopyasnn
karlarlarak mteakip ilemlerin mmknklnmas.
DNA paralarnn mutasyona uratlp birarayagetirilmesi suretiyle istenen dizilimlerinoluturulmas.
Oluturulan DNA diziliminin transferi.
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
2/18
31.10.2007
2
Rekombinant DNA Teknolojisi
Aamalar Doku veya hcrelerden DNA izolasyonu.
DNAnn belirlenen restriksiyon endonkleazlarla kesilmesi.
Restriksiyon enzimleri ile oluturulan DNA paralarnn vektrlerlebirletirilmesi. Rekombinant DNA moleklnn oluturulmas.
Rekombinant DNAnn konak hcreye aktarlmas. Konak hcre iindeoalarak klonlarn oluturmas.
Konak hcrenin oalarak rekombinant DNA molekln oulhcrelere aktarmas.
Klonlanm DNAnn konak hcrelerden izole edilip incelenmesi. Klonlanm DNAnn gerekirse konak hcrede ifadelenmesi. lgili
proteinin tayin ve analizi.
Restriksiyon Endonkleazlar
HindIII
Yapkan U
PvuII
Kt U
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
3/18
31.10.2007
3
Restriksiyon Endonkleazlar
Palindrom
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Kes Yaptr
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Kt u oluturan enzimlerle yaplan kesimlersonras oluan fragmentleri birarayagetirebilmek iin nce terminildeoksinkleotidil transferaz enzimi ile polyTve/veya polyA kuyruu taklr sonrasnda DNAligaz ile fragmentler birletirilir.
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
4/18
31.10.2007
4
Vektrler (Tayclar) Kendisini ve tad DNA molekln bamsz olarak replike
edebilmelidir.
Vektr zerinde pekok restriksiyon enzimin sadece bir kesilme blgesiolmaldr. Bu blge restriksiyon enzimi ile kesilerek ayn enzimle kesilenbaka bir DNA parasnn bu blgeye sokulmas iin kullanlr.
zerinde seilebilir bir belirte (marker) tamaldr bir antibiyotik direngeni veya konak hcreden olmayan bir enzime ait gen). Bu belirte
vektr ieren konak hcreleri vektr iermeye konak hcrelerdenayrmak iin kullanlr.
Vektr konakdan kolayca izole edilebilir olmaldr.
Vektrler (Tayclar) Plazmid vektrler
Bakteriyofaj vektrler
Kozmit ve mekik vektrler
Bakteriyel yapay vektrler (BAC)
Maya yapay vektrler (YAC)
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
5/18
31.10.2007
5
Vektrler (Tayclar) Plazmid vektrler
Kktrler.
Mesela pUC19 konaksnda 500 kopya olacak ekildeoalabilir.
oklu klonlama blgesi barndrrlar.
Belirte olarak lacZ genini tar pUC19.
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Vektrler (Tayclar)
Bakteriyofaj vektrler Lambda faj genlerinin hepsi tanmlanm btn genomu
karlm bir bakteriyofajdr.
Genomunun 1/3lk ksm ok hayati olmad iin fajnhcreleri enfekte etmesini ve plak oluturmasn engellemedenyabanc bir DNA ile deitirilebilir.
M13 ise tek zincirli bir fajdr. Bakteri hcresini enfekte ettiindeift zincirli, replikatif formu (RF) alr.
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
6/18
31.10.2007
6
Vektrler (Tayclar) Bakteriyofaj vektrler
http://bioweb.wku.edu/courses/biol566/Images/LambdaGenome.jpg Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Vektrler (Tayclar)
Kozmit vektrler Kozmit vektrler lambda kromozomunun bir ksm ile
plazmit DNAnn birletirilmesiyle oluturulmutur.
Lambdann protein klfnn paketlenmesi iin gerekli
olan cos dizileri ile plazmitin replikasyonu iin gereklidizileri tar.
Belirte olarak antibiyotik diren geni tar.
Hemen btn faj genomu karld iin 50 kbbyklnde fragmentleri tar (fajlar 15 kb,plazmitler ise 5-10 kb tayabilir).
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
7/18
31.10.2007
7
Vektrler (Tayclar)
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Vektrler (Tayclar)
Mekik vektrler
Deiik kaynaklardan tretilen ve kendi replikasyonbalama blgelerini ieren dier hibrit vektrlerbirden fazla konak hcrede replike olabilirler.
ki konak sistemde de seilebilen belirteler tarlar.
Genellikle gen ifadesi almalarnda kullanlrlar.
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
8/18
31.10.2007
8
Vektrler (Tayclar) Bakteriyel yapay vektrler (BAC)
karyotik genomlarn analiz ve haritalanmasndaihtiya duyulan byk DNA paralarnnklonlanabilmesi iin gelitirilmi vektrlerdir.
Bakterilerdeki reme plazmitleri (F plazmit) kendikendine eleyebilme zelliine sahiptir.
BAClar yaklak 300 kb DNA tayabilir.
Replikasyon iin F faktr genlerini, belirte olarakantibiyotik diren genlerini ve oklu klonlamablgesini tarlar.
Vektrler (Tayclar)
Maya yapay kromozomlar (YAC)
Bir YAC her iki uta telomer yaps, bir replikasyonoda (otonom olarak replike olan diziler, ARS) ve
mayaya ait bir sentromer ierir. ki adet belirte (TRP1 ve URA3) bulunur.
oklu klonlama blgesi mevcuttur.
2 megabaz (2 milyon b) uzunluunda DNA paralarYAClarn iine girebilir.
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
9/18
31.10.2007
9
Vektrler (Tayclar) Maya yapay kromozomlar (YAC)
Hartl Jones, Genetics
Konak Hcreler
Prokaryotlar
Bakteriler
karyotlar: zellikle YAC gibi vektrler karyotik hcrelere DNAaktarmnda kullanlr. Vektr plazmit ise hcre iine DNA girii transformasyonolarak eer vektr virus ise transfeksiyon olarak adlandrlr.
Bitki hcreleri
Memeli hcreleri
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
10/18
31.10.2007
10
Konak Hcreler
Bitki Hcreleri
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Konak HcrelerMemeli Hcreleri
Hartl Jones, Genetics
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
11/18
31.10.2007
11
Mutajenez
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Genomik Ktphaneler
Bir genomik ktphane genomdaki tmdizilerden en az bir kopya ierir.
DNA izolasyonu
Restriksiyon endonkleazlarla muamele
Uygun vektrn seilmesi
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
12/18
31.10.2007
12
Genomik Ktphaneler
f)(
P)(N
=
1ln
1ln
N: Gerekli klonlarn saysP: Verilen DNA parasn alma olaslf: Her bir klondaki genom fraksiyonu
Genomik Ktphaneler
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
13/18
31.10.2007
13
Kromozoma zgl Ktphaneler Flow cytometry
www.chrombios.com/Service/FlowKar.jpg
Pulsed Field Gel Electrophoresis
cDNA Ktphaneleri
mRNA zerinden reverse transcriptase ile cDNAsentezi
Sentezlenen cDNAnn her iki ucuna bir
restriksiyon enziminin tanma dizisini ieren ksaift zincirli DNA taklp klonlanmas
cDNA ktphaneleri hcre/doku spesifik olarakhazrlanr
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
14/18
31.10.2007
14
cDNA Ktphaneleri
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Genom ve Transkriptom Ktphanelerinden
Yararlanmak
DNA problar
Ktphanenin taranmas: plak hibridizasyonu
Komu genlerin tanmlanmas: Kromozomdayrme
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
15/18
31.10.2007
15
Genom ve Transkriptom Ktphanelerinden
Yararlanmak
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
DNA problar
Genom ve Transkriptom Ktphanelerinden
Yararlanmak
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Plak hibridizasyonu
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
16/18
31.10.2007
16
Genom ve Transkriptom Ktphanelerinden
Yararlanmak
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Kromozomda Yrme
Balant analizi sonras belirlenenbalantl blgelerden balayp hedefgene ulamay hedefleyen bir yaklamdr.
Her aamada DNA dizi analizini ve akokuma erevesini bulmay hedefler.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PCR)
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
17/18
31.10.2007
17
Southern Blot
Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
Restriksiyon Haritalama
faculty.plattsburgh.edu/.../restmap/Figure6.GIF Pierce B., Genetics: A conceptual Approach,
-
7/30/2019 Molekuler Genetik_HaftaVIII
18/18
31.10.2007
DNA Dizi Analizi
Hartl Jones, Genetics
top related