neurofibromatóza typu 1 (nf1)
Post on 04-Jan-2016
65 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
RNA diagnostika neurofibromatózy typu 1
Kratochvílová A., Kadlecová J., Ravčuková B.,Valášková I. a Gaillyová R.
laboratoř molekulární diagnostiky, OLG, FN Brno, Černopolní 9
Neurofibromatóza typu 1 (NF1)
Neurofibromatóza typu 1 patří do skupiny
neurokožních syndromů primárně
postihujících tkáně odvozené od nervových
kmenových buněk.
Je to autozomálně dominantní choroba
s četností 1:3500, je způsobena mutacemi
v genu NF1, kódujícím protein neurofibromin.
Klinické projevy:
1. Lish noduly v oční duhovce
2. skvrny „bílé kávy“ na kůži
3. kožní a podkožní neurofibromy
4. abnormality skeletu
5. malignity centrálního a periferního
nervového systému
6. vzácně mentální retardace atd.
Diagnostická kritéria neurofibromatózy typu 1
Struktura NF1 genu
- lokalizován na chromozomu 17q11.2
- 350 kb
- 60 exonů
- 11 - 13 kb mRNA
- alternativní sestřih: exon 9br
23a
48a
Neurofibromin
Translačním produktem genu NF1 je protein
neurofibromin, skládající se z 2818 aminokyselin
s odhadovanou molekulární hmotností 327 kDa. Jedinou
oblastí na molekule neurofibrominu s jasně popsanou
biologickou funkcí je centrální doména o 360
aminokyselinách (exony 21 - 27), (s vysokým stupněm
homologie k Ras - specifickým GTPázy aktivujícím
proteinům) - “GAP-related domain” (NF1-GRD). Touto
doménou neurofibromin urychluje konverzi Ras z aktivní
(GTP-vázané) do inaktivní (GDP-vázané) formy.
Inaktivace Ras vede k regulaci buněčného růstu, při ztrátě této funkce neurofibrominu v tumorech (na obou alelách) dochází ke zvýšenému buněčnému růstu, neurofibromin ve své funkční podobě tedy působí jako tumor supresor.
Exprese neurofibrominu v lidských tkáních
NF1 expression in normal human tissues based on proprietary W.I.S DNA array results
Mutace v genu NF1
- jedna z nejvyšších mutačních
rychlostí u lidské choroby
(1x10-4/gametu/generaci)
- 50% případů de novo
- široké spektrum mutací:
od bodových mutací až
po komplexní přestavby
- žádné významnější
“hot spot” oblasti
(ex. 10 a ex. 37?),
mutace rozloženy
po celém genu.
Komplikace při molekulární diagnostice NF1
- nesnadné stanovení klinické diagnózy NF1
- až 50 % případů de novo - vysoká mutační rychlost genu NF1 - velikost genu (350 kb, 60 exonů)
- absence hot spot oblastí - nutnost vyhledávání mutací v celém genu
- nejasná korelace mezi typem mutace a formou postižení
- neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény
- různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci
Strategie molekulárně - genetického testování NF1 pacientů
DNA / RNA pacienta
Prenatální diagnostika
intragenový DNA polymorfismusIVS27AAAT2.1, IVS27AC28.4
IVS38GT53.0 - i 38
Vazebná DNA analýza
DNA/RNA vyhledávací metodyDGGE, SSCPcDNA / SSCP
Mutační analýza Přímé sekvenování
RNA diagnostika genu NF1
- dříve používána pouze DNA diagnostika: u pacientů skrínováno 8 exonů ze 60
- pomocí RNA diagnostiky prohledávána celá kódující oblast genu (využití přepisu RNA do bezintronové cDNA ): rozdělení cDNA do deseti úseků o délce okolo 1000bp.
- možnost zachycení mutací ovlivňujících sestřih (u NF1 časté)
RNA diagnostika genu NF1
- založena na detekci mutací v cDNA,
umožňuje vyhledávat mutace v celé kódující
oblasti genu NF1.:
1. Izolace RNA z krve nebo tkáně.
2. Přepis RNA zpětnou transkriptázou (RT)
do cDNA.
3. Amplifikace vnitřní kódující oblasti cDNA
s deseti páry specifických primerů - vznik
deseti částečně se překrývajících
segmentů P1 - P10 pokrývajících celou kódující oblast genu NF1.
4. Mutační analýza segmentů P1 - P10 pomocí cDNA-SSCP.
5. Sekvenace vzorků s odlišnou
elektroforetickou mobilitou.
6. Určení typu a polohy mutace.
cDNA
NF1 cDNA ( 60 exonů)
P1 P3 P5 P7 P9
RT
PCR
P2 P4 P6 P8 P10
cDNA-SSCP (~ 1000 - 1200bp)
Sekvenační analýza
celková RNA
Metoda jednořetězcového konformačního polymorfismu (SSCP)
- technika založená na elektroforetické mobilitě
jednořetězců DNA.
Cílový produkt amplifikace DNA je tepelně
denaturován na jednořetězce a je podroben
elektroforetické separaci. Za nedenaturujících
podmínek zaujímá ssDNA sekundární strukturu
podmíněnou sekvencí nukleotidů. Přítomnost mutace
tuto strukturu mění, tím je ovlivněna i rychlost
migrace DNA a na gelu můžeme detekovat nadbytečný proužek.
podmínky elektroforetické separace : 12% PAGE (60:1) / 150V / 16 hod. / r.t.
P7
mt C5242T
wt C62
cDNA/SSCP analýza genu NF1
Úspěšné zavedení SSCP analýzy (používané
většinou pro úseky DNA do 300bp) pro úseky genu
NF1 o délce okolo 1 kbp.
- PCR produkt ředit ve formamidu
- 10 % PAG (40:1)
- elektroforéza: 600 V
15°C
4,5 h
Sekvenace úseku P7 genu NF1 ( exony 28 - 33)
standardní DNA
mutantní DNA C 5242 T ( R 1748 X) Arg > Stop
5’ 3’
5’ 3’
C > T
Další kroky v diagnostice neurofibromatóz
- zavedení funkční analýzy proteinového produktu genu NF1,
(rozlišení neutrálního polymorfismu od mutaci způsobující změny)
- objasnění souvislosti konkrétní mutace a formy postižení
- genová terapie, cílená terapie(viz obr.):
a) blokování enzymů zapojených do farnesylace ras
b - d) blokování dalších cílů aktivovaných proteinem ras
pro amplifikaci mitogenního signálu
- zavedení diagnostiky neurofibromatózy typu 2 na našem pracovišti
a
b c d
V souboru 30 pacientů vyšetřovaných RNA diagnostikou (cDNA/SSCP) byla nalezena změna v mobilitě některého z fragmentů P1 - P10 cDNA u 17 pacientů. U 6 z nich byla mutace na úrovni cDNA přesně charakterizována (jedná se o tři delece celých exonů, jednu deleci čtyř nukleotidů a dvě nukleotidové substituce). U ostatních je třeba sekvenací dořešit, zda je změna v mobilitě úseku cDNA způsobena skutečně mutací a tuto případnou mutaci přesně charakterizovat.
Pro potvrzení patologického vlivu nalezených mutací na funkci proteinu by bylo vhodné zavést funkční analýzu neurofibrominu v kvasinkách (FASAY).
Závěr
top related