novecošanās un ģenētika

Novecošanās un ģenētika

LU 66. konference

Autori: Andis Brakmanis; Astrīda Krūmiņa; Liāna Pliss; Inese Pelnēna;Viesturs Baumanis

Pētījums veikts LU zinātniskā projekta nr.: 2007/ZP-5 ietvaros

Novecošanās

• Bioloģisks process, kas raksturojas ar progresējošu un neatgriezenisku fizioloģisko funkciju zudumu, kā arī mirstības palielināšanos līdz ar vecumu (Schal a. Weindruch, 1996);

• Izpratne par novecošanās molekulārajiem mehānismiem ir svarīga, lai mēģinātu izveidot terapiju, kas pagarinātu cilvēku mūžu un samazinātu mirstību vecāku cilvēku populācijā.

Novecošanās veidi

• “Normāla” – to raksturo virkne vecu cilvēku slimību (ateroskleroze, osteoporoze un neirodeģeneratīvas slimības);

• “Sekmīga” jeb “veselīga” – nozīmē, ka cilvēks spēj izvairīties no iepriekš minētajām slimībām;

• “Patoloģiskā” – ar vecumu saistītās slimības sākas agrīnāk un ir samazināts dzīves ilgums (Rowe and Kahn; Science 1987).

Novecošanās molekulārās teorijas

Mitohondriālā teorijaTelomēru teorijaIzmaiņas gēnu ekspresijāDNS bojājumu uzkrāšanās

MitohondrijiGalvenās mitohondriju funkcijas:• ATP sintēze;• Lipīdu, ogļhidrātu un proteīnu

oksidācija līdz CO2 un H2O;• Intracelulāro jonu homeostāzes

uzturēšana (Ca++,H+ u.c.);• Apoptozes regulācija;• Daļēji autonoma mitohondriālo

proteīnu sintēze.

Mitohondriālā teorija

Pirmo reizi apspriesta 1950. gadā, kā brīvo radikāļu teorija.

Dzīves laikā progresīva somatisko mutāciju uzkrāšanās mtDNS noved pie neatgriezeniskas mitohondriju funkciju izsīkšanas postmitotiskajos audos (Harman, 1992).

Izmaiņas mitohondriju funkcijā un morfoloģijā novecojot (Loeb et al., 2005).

“Mitohondriālais novecošanās pulkstenis”

Mitohondriju bojājums

mtDNS punktveida mutācijas

Mutantās mtDNS

amplifikācija

mtPTP aktivācija

Šūnas nāve

Šūn

u da

udzu

ms

Bērnība Jaunība VecumsPusmūžs

funkcionālais

slieksnis

mtDNS Katrā šūnā ir apmēram 1000 -

10 000, bet mitohondrijā 1 – 15 mtDNS kopijas;

Cirkulāra, divpavedienu DNS; Sastāv no 16 569 bp; Nav pierādīta rekombinācijas; Ir nedaudz atšķirīgs

ģenētiskais kods nekā kodola DNS;

Ir 37 gēni, kas kodē 13 proteīnus, 22 tRNS un 2 rRNS;

Nav intronu.

mtDNS mutācijas

Adaptīvās mutācijas bieži notiek mtDNS kodona trešajā nukleotīdā (AGA), neizraisot aminoskābju nomaiņu;

Adaptīvās mutācijas ir populāciju specifiskas un nostabilizējas mtDNS evolūcijas laikā, populācijai pielāgojoties apkārtējas vides apstākļiem.

Iedzimtais mtDNS genotips:Haplotips – konkrēts mtDNS sekvences tips, kas var

būt unikāls vai arī atrasts vairākos indivīdos;Haplogrupa – līdzīgu haplotipu kopums, kuriem ir

viena vai vairākas kopīgas alēles.

Mērķis

1) Noskaidrot mtDNS polimorfismu iespējamo saistību ar novecošanos Latvijas populācijā;

2) Noteikt heteroplazmijas biežumu dažādās vecuma grupās.

Materiāls

mtDNS polimorfismu analīzei izmantoti latviešu DNS paraugi: 351 paraugs vecumā no 18 līdz 40 gadiem (1.grupa);98 paraugi vecumā no 74 līdz 89 gadiem (2.grupa);74 paraugi vecumā virs 90 gadiem (3.grupa).

Heteroplazmijas analīzē iekļauti 100 paraugi:40 paraugi vecumā no 18 - 40 gadiem;30 paraugi vecumā no 74 - 89 gadiem;30 paraugi virs 90 gadiem.

Metodes

1) Iedzimto haplotipu un haplogrupu noteikšana:• HVSI (620bp) un HVSII (450bp) segmentu tiešā

nukleotīdu sekvenēšana;• mtDNS kodējošā rajona PCR-RFLP analīze;• Datu statistiskā apstrāde ar ARLEQUIN 3.0

programmu (Excoffier, 2005).

2) Heteroplazmijas noteikšana:• “mismatch” specifiskā DNS endonukleāze;• Denaturējošā gradienta gēla elektroforēze;• HVSI (620bp) segmenta tiešā nukleotīdu

sekvenēšana;• Datu statistiskā apstrāde ARLEQUIN 3.0

programmu (Excoffier, 2005).

RezultātimtDNS ģenētiskā daudzveidība

Vecuma grupas 1.grupa 2.grupa 3.grupa

Paraugu skaits 351 70 68

Saliktie haplotipi 123 56 44

A. Haplogrupas un HVSI

Vecuma grupas 1.grupa 2.grupa 3.grupa

Paraugu skaits 351 70 68

Saliktie haplotipi 192 64 36

B. Haplogrupas, HVSI un HVS II

RezultātimtDNS ģenētiskā daudzveidība

RezultātiHaplogrupu izplatība

Rezultāti

Latvieši; Somi

Franči; Īri

Latvieši

Japāņi

RezultātimtDNS heteroplazmija HVSI segmentā

Telomēri

• Telomēri ir fizikālie lineāro hromosomu nobeigumi eikariotu hromosomās;

• Vairumā izpētīto organismu telomēri satur garus posmus ar tandēmi atkārtotām, vienkāršām DNS sekvencēm [(TTAGGG)n], kas veidotas no G – un C- bagātiem posmiem (tā saucamie terminālie atkārtojumi).

Telomēru teorija

• “Replikācijas beigu problēma” – notiekot replikācijai saīsinās telomēri un sasniedzot noteiktu kritisko garumu apstājas šūnas cikls (Alsopp et al., 1992);

• “Uncapping” – telomēru struktūras bojājums, kas izraisa genoma nestabilitāti (Shay et al., 2004);

Secinājumi

Mūsu rezultāti apstiprina hipotēzi, ka noteikti iedzimtie mtDNS polimorfismi ir saistīti ar novecošanos.

Heteroplazmijas līmenis pakāpeniski palielinās līdz ar vecumu, kā arī vecākiem indivīdiem ir vairāk heteroplazmiskās pozīcijas.

Lai saprastu novecošanās molekulāri ģenētisko mehānismu, nepieciešams veikt cilvēka genoma stabilitātes pētījumus (telomēru “cap” struktūra).