nueva serie de uhplc baños de disolución. 1200 infinity · ¿qué se requiere para trabajar a ......
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1220
Infinity LC
1260
Infinity LC
1290
Infinity LC
Nueva serie de UHPLC
1200 infinity:
- Mejore 10 veces la sensibilidad y
productividad de sus HPLC.
- Amplie su rango de aplicación con
los nuevos:
- SFC (cromatógrafo de fluidos supercríticos)
- RRLC-Bioinerte
Isidre Masana
Agilent Technologies
Especialista Productos UHPLC/MS
Seminario: Últimas
Novedades en UHPLC,
Cromatografía Flash y
Baños de Disolución.
Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.
2. Posibilidades de la Nueva Serie 1200
Infinity RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.
•Ejemplos de rendimiento.
3. Conversión de Métodos de HPLC a
UHPLC/RRLC:
•Estrategias de Traspaso de Métodos.
•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s
convencionales.
4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.
5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.
6. Conclusiones.
Página: 2
Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.
2. Posibilidades de la Serie 1200 Infinity
RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.
•Ejemplos de rendimiento.
3. Conversión de Métodos de HPLC a
UHPLC/RRLC:
•Estrategias de Traspaso de Métodos.
•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s
convencionales.
4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.
5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.
6. Conclusiones.
Página: 3
¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC /
RRLC?El poder de separación de elevadas velocidades lineales
Cromatogramas con escala de tiempo alineada a primer y último picoI.D. & I.M - Waldbronn 5/2009
Columna: ZORBAX RRHD SB-C18 2.1 x 100mm 1.8 µm
Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 a 40ºC Cromatogr. A: 0.5mL/min en 3.0min // B: 0.833mL/min en 1.8min
Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens).
P máx. grad. A= 590bars. B= 905 bars
A 0.5mL/m gr.. 3.0min
K„ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
FxTg = 0.5x3 = 0.833x1.8 = 1.5
B 0.833mL/m
gr. 1.8min
3min Si el producto de Flujo x Tgrad se mantiene
constante el poder de separación no variará (utlizando la misma columna y sin variar los %
solvente orgánico)
1.8min
↑Flujo: Reduce tiempo análisis y mejora
capacidad de separación en gradientes
A 0.5mL/m gr.. 3.0min
B 0.833mL/m
gr. 1.8min
Columnas RRHD & RRHT permiten subir el
flujo SIN reducir resolución para:
- Reducir tiempos (subiendo flujo)
- Aumentar resolución (sin sacrificar tiempo)
Página: 4
¿Qué se Requiere para Trabajar a
Velocidades Lineales Elevadas?• No perder eficacia al aumentar el flujo.
+
EFI
CA
CIA
-
S.T.M.: Sub Two Microns
UHPLC / RRLC
HEPT = A+ B/u + C u
4.6mm d.i.
UHPLC/RRLC permite velocidades elevadas sin pérdida de información
• Poder trabajar a flujos y presiones elevadas.
∆P = f (η .u .L / dp2)
Página: 5
0
200
400
600
800
1000
1200
0 1 2 3 4 5
1290 Infinity
1200 Infinity Series: Aumentado los Estándares
y Compatibilidad en HPLC y UHPLC
bar
ml/min
Standard LC
Vendor A1.7µm columns
Agilent RRLC: 1220 & 1260
Infinity Series Columnas 1.8µm
Vendor B1.9µm columns
Vendor C
Vendor D
1290 Infinity le permitirá la máxima reducción de sus tiempos de
análisis y/o aumento de la resolución de sus aplicaciones
52
1200
HPLC Estándar
RRLC
Agilent 1100 y 1200
600
Página: 6
Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.
2. Posibilidades de la Serie 1200 Infinity
RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.
•Ejemplos de rendimiento.
3. Conversión de Métodos de HPLC a
UHPLC/RRLC:
•Estrategias de Traspaso de Métodos.
•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s
convencionales.
4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.
5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.
6. Conclusiones.
Página: 7
Página: 8
1260
Infinity LC
Modular
600bar
80Hz
2-10x Sensibilidad UV
Precio HPLC–Prestaciones RRLC
100% Compatible con HPLC
1220
Infinity LC
Integrado
600bar
80Hz
2-10x* Sensibilidad UV
Most affordable
HPLC and RRLC
1290
Infinity LC
Modular
1200bar
160Hz
Las Mejores Prestaciones
Máxima FlexibilidadCostes Mantenimiento de HPLC
*2x for build-in VWD, 10x via add-on 1260/1290 DAD
Nueva Serie LC Agilent 1200 Infinity: Mejorando los
Estándares en HPLC – Mayor Valor para Cualquier Presupuesto
NUEVAS LINEAS 1200 Infinity
1260
Infinity LC
Modular
Flexibilidad
en configuración
Analytical
SFCGPC
SEC
Preparative LC & LC/MS
Bio-inert
HPLC
Isocratic
LC
Nano & Cap LC
Nuevo Nuevo
Multi-method and
Method Development
Nuevo
RRLC al precio de HPLC
Página: 9
Hasta 8 columnas y 15 disolventes Desde 100 nL/min hasta 100mL/min
1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario Prestaciones RRLC para TODOS LOS LABORATORIOS
Resolución optimizada
3x100mm, 1.8µm
Resolución pico 5 = 7.16
Tiempo análisis: 7 min
Velocidad y Resolución optimizadas
3x50mm, 1.8µm
Resolución pico 5 = 4.79
Tiempo análisis: 1.1min
Convencional
4.6x150, 5µm
Resolución pico 5 = 4.20
Tiempo análisis: 11 min
min0 2 4 6 8 10
min0 2 4 6 8 10
min0 2 4 6 8 10
10 x PRODUCTIVIDAD mayor nº de datos y de mejor calidad!
Página: 10
1260 Cuaternario y 1220 Gradiente Binario 100% Compatibilidad con Métodos HPLC
Reemplazo Sin Riesgo
1260/1220 Infinity LC
Sistema Cuaternario
1100/1200 Series
Sistema Cuaternario
Columna: 4.6 x 150mm, 5µm
Gradiente: 0 min 20 % B
10min 95 %
Flujo: 1 mL/min
min0 2 4 6 8 10
Ejecute sus actuales métodos de HPLC y obtenga los mismos resultados
Página: 11
Serie 1200 Infinity: Compatibilidad de
Columnas
Sistema
1200 Infinity
STM-cortas1.8µm 30-50 mm long.
STM-largas1.8µm >100 mm long
Convencionales
(3.0-4.6mmID,
150-300mm)Partículas 3 - 5µm
Superficialmente
porosaPartículas 2.7µm 2.1 3.0 4.6 2.1 3.0 4.6
1290 Binario
1260 Binario 2)
1220 Bin/1260 Cuat 1) 2)
1220 /1260 Isocrático 1) 2)
Cualquier columna convencional de HPLC, RRLC o UHPLC
se puede utilizar en un sistema 1220/1260/1290 Infinity,
independientemente de su dimensión, tipo o tamaño
de partículas o mecanismo de separación.
STM-cortas: partículas sub-2µm , 30 – 50mm long.
STM-largas: partículasub-2µm, >100 – 150mm long.
Convencionales: partícula 3-5 µm
1) Por volumen de retardo del gradiente
2) Por volumen de retardo del gradiente y presión (para ≥150mm).
Página: 12
Preparación Muestra en Inyector Automático. Ejemplo Derivatización precolumna: Aminoácidos (OPA + FMOC)
Dosificador de Muestra
Unidad de
Muestreo
deshecho
Bomba
a columna
Muestra Reactivo
VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\095-0101.D)VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\003-0201.D)VWD1 A, Wavelength=338 nm, TT (AASM0531\007-0401.D)
min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0
50
100
150
200
250
300
350
ASP
GLU
SER
THR
TYRCYS-CYS
VAL
METPHE
ILE
ASN
TRP
ORN
ROJO: muestra AAS libres
GLY
HIS
ARG
ALA
LEULYS
PRO
DERIVATIZACION AMINOACIDOS
1.-Toma 5 µl tampón Borato (vial 2)
2.-Toma 1 µl reactivo OPA (vial 3)
3.-Toma O µl agua (vial 1) - lavado exterior aguja
4.-Toma 1 µl muestra AAS (vial X)
5.-Toma O µl agua (vial 1) – lavado aguja
6.-Mezclar 7 µl 6 veces – Derivatiza AAS PRIMARIOS
7.-Toma O µl agua (vial 1) - lavado exterior aguja
8.-Toma 1 µl reactivo FMOC (vial 3)
9.-Mezclar 8 µl 3 veces – Derivatiza AAS SECUNDARIOS
10.-INYECTAR
También es útil para mezclar patrones durante la puesta a punto de métodos o p.e. para automatizar la
derivatización con FMOC en el análisis de Glifosato y AMPA por LC/MS
Página: 13
Agilent 1290 Infinity
El más Versátil
UHPLC:
• Cualquier tipo de columnas:
UHPLC, LC, Solid Core, Monolitics,…
• Columnas de 1 a 8 mm d.i..
• Longitudes hasta 25cm x1.8µm.
• UHPLC & UFLC con CH3OH.
• ….
• ..
•.
Infinitas Posibilidades !!
1290 Infinity – ¿Qué aporta al mundo del UHPLC?
1290 Infinity NO sólo es un equipo capaz de proporcionar unos
rangos mayores de Flujo y de Presión…
1290 Infinity es un equipo INNOVADOR
1290 Infinity incorpora grandes avances en todos sus módulos,
que una vez más, marca la diferencia tecnológica.
Página: 15
1220/1260 “versus” 1290 Infinity Binary Pumps- Los más bajos volumen muerto y ruido de mezcla
1220/60 Series
Channel A
Passive Damper
0 - 300 µl
Passive Mixer
400 µl (opcional 200)
1220/60 Series
Channel B
1290 Inifinity
Chanel A
1290 Inifinity
Chanel B
Very Low Noise
~ 800 µl
+ =Active Damping
10µl
Jet Weaver Mixer
35µl
Lowest Noise
• min. 50% lower
Delay Volume
• 10µl / 45µl
• 80x / 20x lower
1290 Infinity
Página: 16
Precision Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 3 Peak 5 Peak 6 Peak 7 Peak 8 Peak 9
% RSD RT 0.016 0.0077 0.0052 0.0058 0.0058 0.0054 0.0059 0.0057 0.0080
% RSD Area
0.5 µl 0.40 0.39 0.43 0.47 0.40 0.46 0.44 0.52 0.56
RT RSD = 0.005% !!!
Phenone Standard, 10 Consecutive Runs
2.1 x 50mm RRHD SB C18, 1.8µm
1.2ml/min, 0.5ul, 40C
80Hz, 245/10nm, REF 360/80nm
5 - 95% ACN in 0.5min
1290 Infinity UHPLC: Precisión del Tiempo
de Retención en modalidad UFLC
Página: 17
Muestra de tranquilizantes
Columna: Porosa superficial
Poroshell-120 50 x 2.1mm, 2.7um
Flujo 3.5ml/min, ~ 700 barGradiente 2-92% ACN en 0.4min
T= 80 °C
0.095sec PW 0.140secPW
Agilent 1290 Infinity UHPLC: Poder de
separación con todo tipo y marcas de columnas
Columnas Superficialmente Porosas: permiten
muy elevadas velocidades lineales con elevada
resolución y menor presión (↓40-50%)
0.5 s
Núcleo
Sólido
1.7um
} 0.5µm
2.7µm
Página: 18
10 s
eg
un
do
s!!
2 s
egu
nd
os!!
Nuevas Celdas Diode Array “Max-Light Cartridge“- Guía de ondas Optofluídica
Beneficios: La más alta sensibilidad (S/N) con pequeños volúmenes de celda (mínima dispersión).
Fácil selección de celdas: una para todas las aplicaciones principales.
Más fiable y robusta integración automática de picos, debido a la “quasi”
NO influencia de cambios de IR y de temperatura del disolvente.
Diseño en cartucho para un muy fácil intercambio y manejo de la celda.
Sílice fundida libre de recubrimiento (sin efectos sobre línea de base) y sin mantenimiento.
La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida)
V
VmD
LFr
24
42
~100% eficiencia transmisión de luz debido a principio de reflexión interna total (TIR).
2 Versiones: -10 mm x Vol.σ: 1 µL (x2.5 sensib.) -60 mm x Vol. σ: 4 µL (x10 sensibilidad)
Página: 19
1 ó 6 cm
1290 Infinity DAD: Mejora hasta x10 Sensibilidad-1290 Infinity DAD: 11.4 x 1200 Series DAD SL
1290 DAD
60 mm
1200 DAD SL
10mm
Height [mAU] 28.87579 4.93845
Noise [mAU] 0.009806 0.01908
Signal/ noise 2944 259
Sensitivity
increase
+11.4
min0 1 2 3 4 5
mAU
0
5
10
15
20
25
30
Columns: 150 x 4.6mm Zorbax SB C18, 5µm
Sample: Anthracene: 835 pg/µL
Mobile phase: A: Water, B: Acetonitrile
Elution: isocratic 80 % B
Injection volume: 5 µL
Flow: 1.5 mL/min
DAD: 251/4nm, Ref= 450/80nm,
2.5Hz, slit width 4nm
1290 Infinity DAD
1200 Series DAD SL
1290 DAD
60 mm
1200 VWD
10mm
Height [mAU] 28.87579 4.79998
Noise [mAU] 0.009806 0.01894
Signal/ noise 2944 253
Sensitivity
increase
+11.6
1290 Infinity DAD
el detector UV/VIS más sensible del mercado
Página: 20
1290 Infinity UHPLC + 6460 QQQ Jet StreamProductividad: Análisis 250 Pesticidas en 8 min - Dynamic MRM.
Columna 100x2,1mm x 1.8µm Zorbax Eclipse Plus C18
500ppt, dynamic MRMVentana tiempo de retención = 12 seg.
Ancho de los picos ~ 1 segundo
Zorbax Eclipse Plus C18
2.1 x 100mm (1.8μm)
1290 Infinity
el UHPLC ideal para LC/MS
Página: 21
x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1
Cycle time
Rt
QqQ-dMRM “Dynamic Multiple Reaction Monitoring”:
Mayor Sensibilidad en “Screenings”
= nº Concurrent dMRM
dMRM: • MRM Dinámico con ventanas de
monitorización individuales creadas
automáticamente a partir del tiempo
de cada compuesto.
• Permite mejorar la sensibilidad(↑ dwell time) o la frecuencia de
adquisición de datos.
dMRM
RSD%
requeridoPtos./pico
necesarios
<1% 15
1-3% 12
10-12% 8
QqQ
Video Quality
Página: 22
200 zeptomoles90 atogramos
VerapamilInjectados en-columna
Acquisition Time (min)
+ MRM (455.3 -> 164.9)
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
1x10
4.2
4.3
4.4
4.5
Página 23
¿Límites Actuales UHPLC-QqQ?: UHPLC-
1290/QqQ-6490 con Tecnología i-FunnelLimites Detección Zeptomolares
¿Qué es un Zeptomol?
¿¿¿¿ Zepto ???FACTOR POR EL QUE HAY QUE MULTIPLICAR
LA UNIDADMULTIPLO PREFIJO
ABREVIATU
RA
0,1 mol 10-1 mol decimol dM
0,01 mol 10-2 mol centimol cM
0,0001 mol 10-3 mol milimol mM
0,0000001 mol 10-6 mol micromol μM
0,0000000001 mol 10-9 mol nanomol nM
0,0000000000001 mol 10-12 mol picomol pM
0,0000000000000001 mol 10-15 mol femtomol fM
0,0000000000000000001 mol 10-18 mol attomol aM
0,0000000000000000000001 mol 10-21 mol zeptomol zM
0,0000000000000000000000001 mol 10-24 mol yoctomol yMPage
24
602 moleculas
< 1molécula
Página: 24
6 Órdenes de magnitud de rango dinámico
lineal
Y = 65283 x – 0.390412
R2 = 0.9976
Femtograms
Are
a R
esp
on
se
1
10
100
1000
10000
100000
1000000
10000000
0.1 1 10 100 1000 10000 100000
100 Attogram to 100 Picogram verapamil on column
Página 25
1290 Infinity/6540-UHD-QTOF: Fast UHPLC
“Screening” 250 Pesticidas en 90 segundos.
Fenpyroximate EMass [M+H]+ = 422.20806Resolution = 38636-0.25ppm
1290/6540 90seg análisis250 pesticidas (125pg on-column)MS con masa exacta
1-naphthol Mass [M+H]+ = 145.06489Resolution = 249090.06 ppm
Spinosad AMass [M+H]+ = 732.4687
Resolution = 47094-0.77ppm
90s
LC/MS-TOF(/QTOF): “Screening” de
cualquier compuesto ionizado
6540-QTOF
Resolución
espectral: 25-47K
2.1 x 50 mm x 1.8µm Eclipse Plus C18
1.2 mL/min, 60 ºC
Página: 26
Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.
2. Posibilidades de la Serie 1200 Infinity
RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.
•Ejemplos de rendimiento.
3. Conversión de Métodos de HPLC a
UHPLC/RRLC:
•Estrategias de Traspaso de Métodos.
•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s
convencionales.
4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.
5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.
6. Conclusiones.
Página: 27
Conversión Métodos de HPLC a UHPLC/RRLC:
1.- Estrategias en el Traspaso de Métodos
Reducción de Tiempo:
• Reducir la longitud y tamaño de partícula de la columna: cambio .a columnas de 1.8 μm (o 3.5 μm).
• Aumentar el flujo.
• Aumentar la temperatura.
Mejora de Resolución :
• Reducir el tamaño de partícula manteniendo longitud columna: Cambio a columnas de 1.8 μm (o 3.5 μm)..
• Aumentar el flujo con gradientes de concentración.
• Acoplar varias columnas en serie de 5μm.
32-28
1.8 µm Máxima eficacia / min. ó cm columna.
5 µm Máxima eficacia / bar presión (pero ↑ tiempo)
Página: 28
Transferencia de métodos de HPLC a UHPLC/RRLC
www.agilent.com/chemInstruments
Liquid Chromatography
Buscar: Method translator
Para 1290: http://www.chem.agilent.com/en-US/Products/Instruments/lc/Pages/1290infinity_method_translator_cost_calculator.aspx
Página: 29
Traspaso de Métodos Isocráticos a UFLC.
Columna referente: 5µm x 150mm (12.500 platos)
Reducción del Tiempo de Análisis*
Flujo Constante Flujo x 2 Flujo x 3
1.8µm x 50mm
(12.000 platos)
1/3
30min10min
1/6
30min5min
1/9
30min3.3 min
3.5µm x 75mm
(10.500 platos)
1/2
30min15min
1/4
30min7.5min
1/6
30min5 min
3.5µm x 100mm
(14.000 platos)
2/3
30min20min
1/3
30min10min
2/9
30min6.7 min
La resolución será semejante a la original. La misma proporción aplica a D.I. 2.1 y 3mm*Nota: Reducción del tiempo de análisis calculada con respecto a columna de 150x4.6mm 5µm
**Nota: Incremento presión: +35% para 10cm x 3.5µm +150% para 5cm y 1.8µm (∆P = f (η . u . L / dp2))
• Mantener: composición y nº puntos muestreo pico (↑ Hz).
• Subir Flujo (hasta p.e. 80% presión máxima instrumento).
• Reducir volumen inyección (proporcionalmente a. reducción volumen columna).
Página: 30
Traspaso de Métodos con Gradientes
•S: definirá la “sensibilidad” del analito a variaciones en la proporción de modificador orgánico.
•Valores típicos S: aumentan con el tamaño de la molécula
2-5 moléculas pequeñas / 10 moléculas grandes (péptidos) / 40 moléculas muy grandes (proteínas)
•Al aumentar el tamaño de la molécula aumenta su “sensibilidad” a cambios de composición del eluyente.
K„ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Parámetro dependiente de:
• Analito
• Modificador Orgánico
Volumen muerto de la columna
% de incremento de Modificador OrgánicoTiempo del gradiente (min)
Flujo (ml/min)
“Factor de Capacidad ó Retención” en Gradientes
Columna: ZORBAX Eclipse XDB-C8
4.6x50, 3.5µm
Gradiente 45 – 90% B en 3 y 2 min
Fase Móvil: A:25mM Na2HPO4 , pH 3
B: Metanol
Flujo: 2 y 3 mL/min
Temperatura: 35°CMuestra: Fármacos Cardiacos:1. Diltiazam
2. Dipyradamole 3. Nifedipina
4. Lidoflazina 5. Flunarizina
EJEMPLO 1 - REDUCCIÓN TIEMPO ANÁLISIS: Reducir Tg Aumentando F
Al mantener TG x F = constante el perfil de la separación NO varía
1
2 3
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Time (min)
F = 2.0 mL/min
Tg = 3 min
3min
1
23
4
5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Time (min)
F = 3.0 mL/min
Tg = 2 min
2min
Si K‟ se mantiene constante el poder de separación no variará
Página: 31
Comparación Estrategias Mejora de la Resolución
k = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
Columna: ZORBAX SB-C8
Gradiente: 20 – 60% B en 10 min o 60 min
Fase Móvil: A:H2O con 0.1%TFA, pH 2
B: Acetonitrilo
Flujo: 1.0 mL/minTemperatura: 35°C
Muestra Herbicidas: 1. Tebutiuron 2. Prometon 3. Prometryna 4. Atrazine
5. Bentazon 6. Propazina 7. Propanil 8. Metolaclor
Tg = 10 min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
15min
1,2
34 5
6
7
8
0 5 10 15Time (min)
• Aumentar Tg (el resto de parámetros no se modifican )1
Tg = 60 min a 1mL/min 4
2
0 25 50Time (min)
3
5
8
6
7 40min
4.6 x 150 mm, 5 µm
N = 12,000
V0=1.5ml
Tradicional
• Reducir V0 y Subir Flujo4.6 x 75 mm, 3.5 µm V0=0.75ml
N = 10,000
Tg = 15 min a 2mL/min
“Moderna”:
Si K‟ se aumenta (↑Tg, ↑F, ↓V0) el poder de separación mejorará.
Página: 32
Time (min)0 5 10
2
3
45
67
8
1
7min
1x10/1.5= 6,7
2x15/0.75= 40
1x60/1.5= 40
¡¡¡Se reduce Tiempo análisis
a 1/6 pero se mantiene la
Separación !!!
¿Cómo mejorar?
¿Partículas Superficial o Totalmente Porosas?
Superficial Totalmente Porosa
Poroshell-120 reduce 40-50% de presión con similar resolución
2.7µm (capa porosa: 0,5µm)
1.8µm
Ventajas Poroshell 120:
• Reducir la presión para aumentar el flujo.
Importante con HPLC de 400 bars
• Mejorar la resolución en Métodos USP
con 5µm (2.7µm <50% en disminución
del tamaño de partícula)
Ventajas 1.8µm Totalmete Porosas:
• Mayor surtido de fases.
• Zorbax 1.8-3.5-5µm con idéntica
selectividad.
• 10-20% más eficacia/cm.
Página: 33
48-12
Comparación Eficacia Partículas Superficial
“versus” Totalmente Porosas
Poroshell 120 proporciona:
• Eficacia muy similar* (>80-90%.) a partículas 1.8µm totalmente porosas.
• Curva de Van Deemter plana en un amplio rango de flujos.
• Su mayor permeabilidad le permite trabajar a flujos más elevados.
* También su capacidad de carga
Poroshell -120
Mínimo flujo recomendado (columna 4.6mm d.i.) ↓P↑F
Página: 34
Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.
2. Posibilidades de la Serie 1200 Infinity
RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.
•Ejemplos de rendimiento.
3. Conversión de Métodos de HPLC a
UHPLC/RRLC:
•Estrategias de Traspaso de Métodos.
•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s
convencionales.
4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.
5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.
6. Conclusiones.
Página: 35
Agilent 1260 Infinity
Bio-inert Quaternary LC: superior separation for more
confidence in large bio-molecule
analytics
Página: 36
HPLC-Based Characterization
of Therapeutic Biologics
• Witnessing a move from traditional pharma (NCE) to biopharma (NBE*).
• Now over 2,500 biotech drugs in the discovery phase.
• Predicted by 2014 that 50% of top 1000 products will be biotech.
They include:
• monoclonal antibodies (Mabs)
• recombinant proteins, insulin, erythropoeitin (EPO)
• peptide hormones
• peptide antibiotics
• cytokines
• oligonucleotides
• BioPharmaceuticals can be produced: in biological environments
or by synthetic routes.
• Higher order characterisation is needed for these complex molecules.
Light Chain
Fc
Fab
Antigen
binding
Hinge
Glycosylation
siteTruncation
(lysine)
Disulfide
shuffling
Pyroglutamat
e
Deamidation/
oxidation
Heavy Chain
EvaluatePharma (12May 2009) * NBE: New Biological Entity
Página: 37
Agilent‟s Solutions
for Biologic Characterization
• For size separations of dimers, aggregates and degradation products
Agilent Bio SEC-3 and Bio SEC-5
• For charge isoform separations
Agilent Bio IEX and Bio Mab
• For protein primary sequence* analysis
Poroshell 300 and Porosell 120
For use with the Agilent 1260 Infinity Bio-inert Quaternary LC
* Secuencia de aminoácidos
Página: 38
It is critical to confirm that the biologic
has the correct intact molecular weight
and identify variants and other potential
post translational modifications.
Degradation products must be identified
and monitored
Aggregation causes immunoresponse issues
which in turn cause death and injury during
patient treatment
Polymeric coated silica :
minimises non-specific binding
Optimized for use in low salt (150mM phosphate)
Particle
Size
3 m particle size 5 m particle size
Pore Sizes 100Å 100Å (0.1 – 100 kDa)
150Å 150Å (0.5 – 150 kDa)
300Å 300Å (5 – 1,250 kDa)
500Å (15 – 5,000 kDa)
1000Å (50 - 7,500 kDa)
2000Å (>10,000 kDa)
Feature Highest resolution High stability and long
column lifetime
Benefit Faster SEC Good reproducibility
SEC Separations: Size separations of
Dimers, Aggregates and Degradation products
Página: 39
Monitoring Dimers, Aggregation and ImpuritiesA
U
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
Minutes
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00
Column: Agilent Bio SEC-3 300Å, 7.8x300mm
Mobile phase: 150 mM Phosphate, pH 7
Flow rate: 1.0 mL/min
Temperature: Ambient
Sample: Monoclonal antibody (10 L, 5 mg/mL)
Buffer/Excipients
MAb
DimerMAb
Aggregates
Low Molecular
Weight Impurities
Página: 40
Ion Exchange Separations
Non-porous PS/DVB particles with a uniform
polymeric coating
Available in SCX, WCX, SAX, WAX phases,
Designed for protein and peptide separations
10 µm, 5 µm, 3 µm, 1.7 µm particle sizes
Multiple ion exchange functional groups for higher
surface area and capacity
Particle has a dense, weak cation exchange
(WCX) mono-layer with excellent selectivity for
basic monoclonal antibodies
• Separation based on differences in a charge state
• Changes in glycosylation and deamidation
• Application specific media
Página: 41
Charge Isoform Analysis of Monoclonal AntibodiesA
U
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
Minutes
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00
(Acidic
Isoforms)weakly bound
(Basic
Isoforms)Strongly bound
Isoforms are commonly deamidated
and glycosylated forms of the MAbColumn: Agilent Bio MAb, NP5, 4.6mm x 250mm
Buffer A: 10 mM Sodium Phosphate, pH 7.50
Buffer B: A + 100 mM NaCl, pH 7.50
Gradient: 15-95% B in 60 min
Flow rate: 0.8 mL/min.
Sample: 5 L, 5 mg/mL, mAb
Página: 42
Reverse Phase Separation
• Reverse phase HPLC is used for the analysis of both
intact proteins and also protein peptide maps for:
• Detailed information about the primary structure.
• Including disulphide shifting
• Most RP methods require (or cause) denaturing of the protein
•The pore size of the media must be matched to the size of the
molecule:
• Intact Protein Analysis 300Å (5µm)
• Peptide Mapping 120Å (2.7µm)
SOLID
CORE
Porous Shell
5 ó 2,7 µm
Página: 43
Protein separation - Effect of Increasing Flow
Aligned
min0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5
mAU
0
200
400
600
800
1000
min*0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5
mAU
0
200
400
600
800
1000
min*0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5
mAU
0
200
400
600
800
1000
min*0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5
mAU
0
200
400
600
800
1000
3 mL/min0-100%B0.67 min
1. Neurotensin
2. Rnase A
3. Lysozyme
4. Myoglobin
12 3
4
Mobile Phase: A= 95% H2O, 5% ACN with 0.1%TFA; B= 5% H2O, 95% ACN, with 0.07%TFA
2 mL/min0-100%B1 min
1 mL/min0-100%B2 min
0.5 mL/min0-100%B4 min
Sustained Efficiency and Resolution
Resolution is maintained when using superficially porous particles at high flow rates
3 min
Poroshell 300SB-C182.1x75mm, 5µm
0.5 min
Página: 44
Heavy and Light Chain Characterization
Light Chain
Fc
Fab
Antigen
binding
Hinge
Glycosylation
siteTruncation
(lysine)
Disulfide
shuffling
Pyroglutamate
Deamidation/
oxidation
Heavy Chain
Página: 45
Why a dedicated Bio-inert?
HPLC1260 Infinity Bio-inert HPLC
What´s new ?
No corrosion due to high salt
Sample management completely metal-free
No usage of MP35N capillaries with cobalt,
nickel, chromium…
pH-range 1-13, shortterm pH 14
low and high pressure possible
large volume injections
• Widest pH range
• High salt tolerance
• Lowest surface activity
no passivation needed !!
Página: 46
1260 Infinity Bio-inert HPLC
600 bar (UHPLC) for fast or high
resolution bio-separations without
any compromises!
What is similar to standard 1260
Infinity?
Based on proven technology
System performance specification
System Robustness
Página: 47
Capillary design to ensure Bio-inertness
Capillaries
Metal cladded PEEK capillary
Newest fitting design: Hybrid technique
New capillary technolgy
enabeling 600 bar but
completely metal free !!
Página: 48
G1315 DAD or MWD
with bio-inert Detector
Flow-cell
Bio-inert
Quaternary Pump
Components of the 1260 Infinity bio-inert HPLC
base configuration
Bio-inert High Performance
Autosampler
G1316 C Column
Compartment with Bio-inert
Solvent Heater
Bio-inert materials
used:
PEEK, PEKK,
ceramic, titanium
(only in solvent
delivery), gold,
saphire, PTFE
Página: 49
Bio-inert
Fraction Collector
For small-scale prep and semi-prep
Purification (up to 10 ml/min)
Bio-inert
Manual Injector
For large volume injection
Bio-inert flow cell for
fluorescence detector
Modular Flexibility - More bio-inert choices
For bio-inert fluorescence detection
Página: 50
Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.
2. Posibilidades de la Serie 1200 Infinity
RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.
•Ejemplos de rendimiento.
3. Conversión de Métodos de HPLC a
UHPLC/RRLC:
•Estrategias de Traspaso de Métodos.
•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s
convencionales.
4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.
5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.
6. Conclusiones.
Página: 51
The New Agilent
1200 Infinity Series
Analytical SFC System
Aurora Fusion A5 SFC Module
Página: 52
What is Supercritical Fluid Chromatography?
Supercritical Fluid Chromatography
• Form of normal phase chromatography used for the analysis of low to
moderate molecular weight molecules
• Frequently used for the separation of chiral compounds
• Separation principles are similar to HPLC
• SFC utilizes carbon dioxide as the mobile phase; therefore the entire
chromatographic flow path must be pressurized
• Modifiers such as methanol, ethanol, isopropanol are added to the
mobile phase as modifiers
Definition
Página: 53
The Supercritical state of a solvent
Página: 54
The Agilent 1200 Series Analytical SFC SystemThe New Standard in Performance, Cost-efficiency, Reliability and Ease-of-Use
Highest Analytical SFC Performance.... Ever HPLC-like Sensitivity, Precision and Dynamic Range
>10,000 for accurate quantitation of 0.01% level impurities
Lowest Operating Cost, Green Chemistry 10-15x lower operating costs by compatibility with standard
grade CO2 instead of liquid SFC grade CO2
Lowest solvent consumption and waste generation
Ease of use, Flexibility and Reliability Highest investment protection by modular, reversible
design. Customers can reconfigure their SFC system for
HPLC.
Upgrade option* for pre-exisiting Agilent 1100 and 1200 LC
systems (*incluye bomba binaria SFC).
ChemStation control, data analysis and reporting
Agilent warranty and service quality
Single Vendor Solution – Single Vendor Support
Makes routine analytical SFC a reality!
Página: 55
The Agilent 1200 Analytical SFC System –
Modular Design
Page 56
• Aurora SFC Fusion A5 Module
for delivering preconditioned supercritical CO2
for maintaining the correct backpressure & recycle it
for washing the autosampler loop
• Modified RRLC pump especially adapted for SFC performance.
• Modified Standard Autosampler to perform fixed loop injection.
• Diode Array Detector SL or Multi-Wavelength Detector SL
• Thermostatted Column Compartment
• High-pressure flow cell
• ChemStation control for all the HPLCcomponents and SFC Fusion A5
SFC Fusion does not replace any part of the HPLC !!!
Vapor Phase CO2 is delivered to the Fusion A5
Fusion A5 delivers preconditioned CO2 to the Agilent pump
Fusion A5 delivers wash solvent
Effluent is returned to Fusion A5 for back-pressure regulation
and waste collection
Aurora A5 Fusion
A5 Fusion eliminates compression requirements from the HPLC
pumps resulting in pulseless pump metering and low baseline noise !!!
Output
“Tee”
BPR
Input
“Tee”Wash
pumpFrom Detector
To Agilent Pump
From wash
solvent bottle
To ALS
To waste
Página: 57
Typical Applications for SFC
• Chiral Analysis:
> Chiral purity analysis
> Chiral column screening
• Quantitation of enantiomeric purity of starting materials, intermediates, and bulk drugs Impurity analysis (EE)
• High throughput HPLC-SFC(MS) library QC and pre-preparative analysis
• Natural product separations
• A-chiral separations in Environmental, Food and Industrial
• Typical Normal Phase or RP phase small molecule applications
• UHPLC like separations with standard columns
Página: 58
Rango Aplicabilidad SFC
Separaciones quirales, no quirales y productos naturales en todo tipo de industrias:
farmacéuticas, químicas, medioambientales, alimentación,….
Página: 59
0.025-0.03 mAU
Noise Detail
0.08 %
1a
2a
3a
4a
HPLC-like Sensitivity!: Impurities and Enantiomeric Excess
Determination now Below 0.1% of your Main Peak
Página: 60
Excellent Repeatability of analyses
N=10 runsFlurbiprofen,
Theophyllin, Caffeine,
Cortisone,
Hydrocortisone,
Prednisolone
The analysis was
performed at 2
ml/min, isocratic
CO2/methanol
(85/15, v/v).
Data courtesey
RIC
Página: 61
Enantiomeric Excess (Impurities)Racemic mixture of each R- 1,1‟-bi-2-naphthol and S– 1,1‟-bi-2-naphthol
OH
OH
Column
ChiralCel OD-H, 4.6 ID x 250
mm, 5 µm (Chiral
Technologies)
Supercritical
Fluid
CO2
ModifierMeOH w. 0.1% TFA + 0.1%
DEA
Outlet Pressure 150 bar
Flow Rate 2.0 mL/min
Isocratic% modifier
25%
Temperature 30°C
Injection Volume 5 µL
Detection DAD, 220 nm
Example 1:
Impuritiy analysis below 0.05% possible !!!
Página: 62
2
34
51
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
1718
19
20 21
22
Non Quiral Example:
High resolution separation “22 Component Mix”
30°C
Fusion A5 &1200 SL
22 peaks
3.5ml/min, 150bar, gradient separation, Princetons HA dipyridyl, 5μm 4.6x250mm
Caffeine•Theophyline•Theobromine•Ibuprofen•Flurbiprofen•Adenine•Thymine •Uracil•Hypoxanthine •Cytosine •Cortisone
•Prednisone•Hydrocortisone•Prednisilone•Estriol•Suflamethoxazole •Sulfamerazine
•Sulfamethoxine•Sulfanilamide•Sulfaquinoxaline•Sulfaguanidine•Sulfamethazole
Página: 63
Agenda1. Introducción: ¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?.
2. Posibilidades de la Serie 1200 Infinity
RRLC, UHPLC & UHPLC/MS.
•Ejemplos de rendimiento.
3. Conversión de Métodos de HPLC a
UHPLC/RRLC:
•Estrategias de Traspaso de Métodos.
•Columnas Poroshell-120: UHPLC con HPLC‟s
convencionales.
4. NUEVO 1260 Infinity Bio-inert.
5. NUEVO 1200 Infinity SFC System.
6. Conclusiones.
Página: 64
Resumen Traspaso de Métodos a UHPLC/RRLC
• Reducir Tiempo Análisis sin perder Resolución:
– Reducir tamaño de partícula y longitud de la columna pero manteniendo constante nº
platos columna (15cm x 5µm = 10cm x 3.5µm = 5cm x 1.8µm).
– Las columnas TP de 1.8µm o SP de 2.7µm permiten trabajar a flujos elevados para reducir
tiempo de análisis sin perder resolución.
• Maximizar la Resolución:
– Sin aumentar tiempo de análisis: Reducir tamaño de partícula y mantener la longitud de la
columna (p.e. 150mm x 1.8µm).
– Aumentado tiempo de análisis: acoplar varias columnas en serie de 5µm requieren un equipo
de alta presión como el Agilent 1200-RRLC (SL).
• Columnas Poroshell 120 (superficialmente porosas):
– Le permiten trabajar en RRLC con HPLC‟s convencionales.
– Poder trabajar a mayores flujos para:
• reducir sus tiempos de análisis
• incrementar la capacidad de separación en gradiente
Página: 65
Prestaciones UHPLC/ RRLC:
Hasta +60% más de resolución que un HPLC convencional.
Hasta 20 veces más rápido que un HPLC convencional
(hasta 2000 muestras / día).
Hasta 10 veces más sensible.
Cromatógrafo Líquido Universal:
Flujo de 0,05 a 5 ml./min.
Hasta 3 columnas de 1,5 a 30 cm. de longitud de todo
tipo de tamaños de partícula (1.8 a 10µm) y diámetros
internos (1-8 mm).
Columnas Zorbax de 1.8, 3.5 y 5µm con igual selectividad
para una fácil, rápida y segura transferencia de métodos de
HPLC a UHPLC/RRLC y viceversa.
Serie 1200 Infinity: un HPLC Convencional y UHPLC ó RRLC en 1 sólo sistema.
Página: 66
Muchas
Gracias
por su
Atención
Estamos a su disposición en
tel.: 901.11.6890
customercare_spain@agilent.com www.agilent.com/chem
Agilent 1290 Infinity UHPLC
Estamos a su disposición en
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