o efeito in vitro dos compostos Ácido alfa-lipoico e … · antioxidant activity in installed...
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAacute
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
O EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E
RESVERATROL EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO
DURANTE O USO DA POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASE
MARIELY CRISTINE AMADOR PESSOcircA
BELEacuteM - PA
2014
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAacute
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
O EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E
RESVERATROL EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO
DURANTE O USO DA POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASE
Aluno Mariely Cristine Amador Pessocirca
Orientador Profordf Drordf Marta Chagas Monteiro
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas
aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e Medicamentos do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede
da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre
em Ciecircncias Farmacecircuticas
BELEacuteM - PA
2014
3
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)
Biblioteca do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede ndash UFPA
Pessocirca Mariely Cristine Amador 1989-
O efeito in vitro dos compostos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do estresse
oxidativo durante o uso da poliquimioterapia para hanseniacutease Mariely Cristine Amador Pessocirca
orientador Marta Chagas Monteiro mdash 2014
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) - Universidade Federal do Paraacute Instituto de Ciecircncias da Sauacutede (ICS)
Programa de Poacutes- Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas Beleacutem 2014
Inclui bibliografias
1 Hanseniacutease 2 Poliquimioterapia 3 Dapsona 4 Estresse oxidativo 5 Antioxidantes I
Tiacutetulo
CDD 22 ed 616998
4
FOLHA DE APROVACcedilAtildeO
MARIELY CRISTINE AMADOR PESSOcircA
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Farmacecircuticas do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade
Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em
Ciecircncias Farmacecircuticas
Aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e Medicamentos
Aprovado em ____________
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________
Profordf Drordf Marta Chagas Monteiro PPGCFUFPA
(Orientadora)
_________________________________________________________
Profordf Drordf Lilian Lund Amado
PPGEAPUFPA
_________________________________________________________
Profordf Drordf Maacutercia Cristina Furtado Nascimento
PPGNMTUFPA
5
AGRADECIMENTOS
Ao Onipotente
Agrave Universidade Federal do Paraacute e ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
FarmacecircuticasPPGCF-UFPA por fornecerem as ferramentas necessaacuterias para a conclusatildeo
dessa etapa
Agrave Profordf Dra Marta Chagas Monteiro pela confianccedila pelo conhecimento repassado e pelos
conselhos em boa hora
Agraves instituiccedilotildees de sauacutede que me permitiram realizar essa pesquisa UBS Pedreira e URE Dr
Marcello Candia assim como aos enfermeiros e teacutecnicos de enfermagem responsaacuteveis pelo
setor da PQT
Agrave equipe do Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem pelo auxiacutelio na
leitura dos exames hematoloacutegicos
Ao laboratoacuterio de Controle de Qualidade na pessoa da Profordf Dra Roseane Ribeiro Costa por
contribuir para a realizaccedilatildeo dos experimentos
Agrave famiacutelia pelo incentivo para seguir adiante e por cada vitoacuteria conquistada
Aos inuacutemeros amigos por compreenderem as ausecircncias pelas palavras amigas e risadas
compartilhadas
Aos integrantes do Laboratoacuterio de Microbiologia e Imunologia em nome dos momentos de
descontraccedilatildeo em meio aos experimentos de todo santo dia
Ao meu amor pela paciecircncia infindaacutevel companheirismo e mensagens de apoio
E natildeo menos importante a todos os que contribuiacuteram para a realizaccedilatildeo desse estudo
6
ldquoHaacute uma forccedila motriz mais poderosa que o vapor a eletricidade e a energia atocircmica a
vontaderdquo
(Albert Einstein)
7
RESUMO
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa que ainda representa uma preocupaccedilatildeo na sauacutede
puacuteblica mundial no seacuteculo XXI A poliquimioterapia preconizada pela Organizaccedilatildeo Mundial
de Sauacutede (OMS) apesar de ser a barreira mais eficaz no combate ao Mycobacterium leprae eacute
um dos responsaacuteveis pela produccedilatildeo de EROs e desenvolvimento de metemoglobinemia e
anemia hemoliacutetica nos pacientes em tratamento Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi
verificar os possiacuteveis danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de poliquimioterapia
(PQT) ao avaliar paracircmetros hematoloacutegicos e o perfil oxidativo em eritroacutecitos e detectar os
efeitos do tratamento in vitro com os antioxidantes resveratrol (RSV) e aacutecido alfa-lipoico
(ALA) na prevenccedilatildeo da metemoglobinemia e na atividade de enzimas antioxidantes Os
resultados obtidos demonstraram diminuiccedilatildeo dos valores de hemaacutecias e reticulocitose nos
pacientes entre o quarto e o seacutetimo mecircs de tratamento com PQT comparados aos valores
encontrados no grupo controle A formaccedilatildeo de metemoglobina (MetHb) aumentou a partir do
5ordm mecircs de tratamento com PQT e a utilizaccedilatildeo de RSV e ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM
manteve o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes que estavam entre o 4ordm e
6ordm mecircs de uso de PQT Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar
ao controle e uma decrescida atividade de CAT o que possivelmente implica maior produccedilatildeo
de H2O2 O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM elevou em duas
vezes a atividade de SOD em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT no entanto natildeo
alterou a atividade enzimaacutetica de CAT e SOD observada nos pacientes com hanseniacutease Dessa
forma os resultados descritos sugerem que os antioxidantes RSV e ALA nas concentraccedilotildees
testadas in vitro natildeo mostram atividade antioxidante quando utilizados em situaccedilotildees de
estresse oxidativo previamente estabelecidas poreacutem estudos posteriores satildeo necessaacuterios para
verificar os efeitos dose e tempo-dependentes de RSV e ALA como prevenccedilatildeo de danos
oxidativos nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
PALAVRAS-CHAVE hanseniacutease poliquimioterapia dapsona estresse oxidativo
antioxidantes aacutecido α-lipoico resveratrol suplementaccedilatildeo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
liver Life Sciences v 83 pp 155-163 2008
VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAacute
INSTITUTO DE CIEcircNCIAS DA SAUacuteDE
PROGRAMA DE POacuteS-GRADUACcedilAtildeO EM CIEcircNCIAS FARMACEcircUTICAS
O EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E
RESVERATROL EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO
DURANTE O USO DA POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASE
Aluno Mariely Cristine Amador Pessocirca
Orientador Profordf Drordf Marta Chagas Monteiro
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas
aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e Medicamentos do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede
da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre
em Ciecircncias Farmacecircuticas
BELEacuteM - PA
2014
3
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)
Biblioteca do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede ndash UFPA
Pessocirca Mariely Cristine Amador 1989-
O efeito in vitro dos compostos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do estresse
oxidativo durante o uso da poliquimioterapia para hanseniacutease Mariely Cristine Amador Pessocirca
orientador Marta Chagas Monteiro mdash 2014
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) - Universidade Federal do Paraacute Instituto de Ciecircncias da Sauacutede (ICS)
Programa de Poacutes- Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas Beleacutem 2014
Inclui bibliografias
1 Hanseniacutease 2 Poliquimioterapia 3 Dapsona 4 Estresse oxidativo 5 Antioxidantes I
Tiacutetulo
CDD 22 ed 616998
4
FOLHA DE APROVACcedilAtildeO
MARIELY CRISTINE AMADOR PESSOcircA
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Farmacecircuticas do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade
Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em
Ciecircncias Farmacecircuticas
Aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e Medicamentos
Aprovado em ____________
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________
Profordf Drordf Marta Chagas Monteiro PPGCFUFPA
(Orientadora)
_________________________________________________________
Profordf Drordf Lilian Lund Amado
PPGEAPUFPA
_________________________________________________________
Profordf Drordf Maacutercia Cristina Furtado Nascimento
PPGNMTUFPA
5
AGRADECIMENTOS
Ao Onipotente
Agrave Universidade Federal do Paraacute e ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
FarmacecircuticasPPGCF-UFPA por fornecerem as ferramentas necessaacuterias para a conclusatildeo
dessa etapa
Agrave Profordf Dra Marta Chagas Monteiro pela confianccedila pelo conhecimento repassado e pelos
conselhos em boa hora
Agraves instituiccedilotildees de sauacutede que me permitiram realizar essa pesquisa UBS Pedreira e URE Dr
Marcello Candia assim como aos enfermeiros e teacutecnicos de enfermagem responsaacuteveis pelo
setor da PQT
Agrave equipe do Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem pelo auxiacutelio na
leitura dos exames hematoloacutegicos
Ao laboratoacuterio de Controle de Qualidade na pessoa da Profordf Dra Roseane Ribeiro Costa por
contribuir para a realizaccedilatildeo dos experimentos
Agrave famiacutelia pelo incentivo para seguir adiante e por cada vitoacuteria conquistada
Aos inuacutemeros amigos por compreenderem as ausecircncias pelas palavras amigas e risadas
compartilhadas
Aos integrantes do Laboratoacuterio de Microbiologia e Imunologia em nome dos momentos de
descontraccedilatildeo em meio aos experimentos de todo santo dia
Ao meu amor pela paciecircncia infindaacutevel companheirismo e mensagens de apoio
E natildeo menos importante a todos os que contribuiacuteram para a realizaccedilatildeo desse estudo
6
ldquoHaacute uma forccedila motriz mais poderosa que o vapor a eletricidade e a energia atocircmica a
vontaderdquo
(Albert Einstein)
7
RESUMO
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa que ainda representa uma preocupaccedilatildeo na sauacutede
puacuteblica mundial no seacuteculo XXI A poliquimioterapia preconizada pela Organizaccedilatildeo Mundial
de Sauacutede (OMS) apesar de ser a barreira mais eficaz no combate ao Mycobacterium leprae eacute
um dos responsaacuteveis pela produccedilatildeo de EROs e desenvolvimento de metemoglobinemia e
anemia hemoliacutetica nos pacientes em tratamento Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi
verificar os possiacuteveis danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de poliquimioterapia
(PQT) ao avaliar paracircmetros hematoloacutegicos e o perfil oxidativo em eritroacutecitos e detectar os
efeitos do tratamento in vitro com os antioxidantes resveratrol (RSV) e aacutecido alfa-lipoico
(ALA) na prevenccedilatildeo da metemoglobinemia e na atividade de enzimas antioxidantes Os
resultados obtidos demonstraram diminuiccedilatildeo dos valores de hemaacutecias e reticulocitose nos
pacientes entre o quarto e o seacutetimo mecircs de tratamento com PQT comparados aos valores
encontrados no grupo controle A formaccedilatildeo de metemoglobina (MetHb) aumentou a partir do
5ordm mecircs de tratamento com PQT e a utilizaccedilatildeo de RSV e ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM
manteve o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes que estavam entre o 4ordm e
6ordm mecircs de uso de PQT Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar
ao controle e uma decrescida atividade de CAT o que possivelmente implica maior produccedilatildeo
de H2O2 O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM elevou em duas
vezes a atividade de SOD em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT no entanto natildeo
alterou a atividade enzimaacutetica de CAT e SOD observada nos pacientes com hanseniacutease Dessa
forma os resultados descritos sugerem que os antioxidantes RSV e ALA nas concentraccedilotildees
testadas in vitro natildeo mostram atividade antioxidante quando utilizados em situaccedilotildees de
estresse oxidativo previamente estabelecidas poreacutem estudos posteriores satildeo necessaacuterios para
verificar os efeitos dose e tempo-dependentes de RSV e ALA como prevenccedilatildeo de danos
oxidativos nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
PALAVRAS-CHAVE hanseniacutease poliquimioterapia dapsona estresse oxidativo
antioxidantes aacutecido α-lipoico resveratrol suplementaccedilatildeo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
3
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)
Biblioteca do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede ndash UFPA
Pessocirca Mariely Cristine Amador 1989-
O efeito in vitro dos compostos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do estresse
oxidativo durante o uso da poliquimioterapia para hanseniacutease Mariely Cristine Amador Pessocirca
orientador Marta Chagas Monteiro mdash 2014
Dissertaccedilatildeo (Mestrado) - Universidade Federal do Paraacute Instituto de Ciecircncias da Sauacutede (ICS)
Programa de Poacutes- Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas Beleacutem 2014
Inclui bibliografias
1 Hanseniacutease 2 Poliquimioterapia 3 Dapsona 4 Estresse oxidativo 5 Antioxidantes I
Tiacutetulo
CDD 22 ed 616998
4
FOLHA DE APROVACcedilAtildeO
MARIELY CRISTINE AMADOR PESSOcircA
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Farmacecircuticas do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade
Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em
Ciecircncias Farmacecircuticas
Aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e Medicamentos
Aprovado em ____________
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________
Profordf Drordf Marta Chagas Monteiro PPGCFUFPA
(Orientadora)
_________________________________________________________
Profordf Drordf Lilian Lund Amado
PPGEAPUFPA
_________________________________________________________
Profordf Drordf Maacutercia Cristina Furtado Nascimento
PPGNMTUFPA
5
AGRADECIMENTOS
Ao Onipotente
Agrave Universidade Federal do Paraacute e ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
FarmacecircuticasPPGCF-UFPA por fornecerem as ferramentas necessaacuterias para a conclusatildeo
dessa etapa
Agrave Profordf Dra Marta Chagas Monteiro pela confianccedila pelo conhecimento repassado e pelos
conselhos em boa hora
Agraves instituiccedilotildees de sauacutede que me permitiram realizar essa pesquisa UBS Pedreira e URE Dr
Marcello Candia assim como aos enfermeiros e teacutecnicos de enfermagem responsaacuteveis pelo
setor da PQT
Agrave equipe do Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem pelo auxiacutelio na
leitura dos exames hematoloacutegicos
Ao laboratoacuterio de Controle de Qualidade na pessoa da Profordf Dra Roseane Ribeiro Costa por
contribuir para a realizaccedilatildeo dos experimentos
Agrave famiacutelia pelo incentivo para seguir adiante e por cada vitoacuteria conquistada
Aos inuacutemeros amigos por compreenderem as ausecircncias pelas palavras amigas e risadas
compartilhadas
Aos integrantes do Laboratoacuterio de Microbiologia e Imunologia em nome dos momentos de
descontraccedilatildeo em meio aos experimentos de todo santo dia
Ao meu amor pela paciecircncia infindaacutevel companheirismo e mensagens de apoio
E natildeo menos importante a todos os que contribuiacuteram para a realizaccedilatildeo desse estudo
6
ldquoHaacute uma forccedila motriz mais poderosa que o vapor a eletricidade e a energia atocircmica a
vontaderdquo
(Albert Einstein)
7
RESUMO
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa que ainda representa uma preocupaccedilatildeo na sauacutede
puacuteblica mundial no seacuteculo XXI A poliquimioterapia preconizada pela Organizaccedilatildeo Mundial
de Sauacutede (OMS) apesar de ser a barreira mais eficaz no combate ao Mycobacterium leprae eacute
um dos responsaacuteveis pela produccedilatildeo de EROs e desenvolvimento de metemoglobinemia e
anemia hemoliacutetica nos pacientes em tratamento Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi
verificar os possiacuteveis danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de poliquimioterapia
(PQT) ao avaliar paracircmetros hematoloacutegicos e o perfil oxidativo em eritroacutecitos e detectar os
efeitos do tratamento in vitro com os antioxidantes resveratrol (RSV) e aacutecido alfa-lipoico
(ALA) na prevenccedilatildeo da metemoglobinemia e na atividade de enzimas antioxidantes Os
resultados obtidos demonstraram diminuiccedilatildeo dos valores de hemaacutecias e reticulocitose nos
pacientes entre o quarto e o seacutetimo mecircs de tratamento com PQT comparados aos valores
encontrados no grupo controle A formaccedilatildeo de metemoglobina (MetHb) aumentou a partir do
5ordm mecircs de tratamento com PQT e a utilizaccedilatildeo de RSV e ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM
manteve o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes que estavam entre o 4ordm e
6ordm mecircs de uso de PQT Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar
ao controle e uma decrescida atividade de CAT o que possivelmente implica maior produccedilatildeo
de H2O2 O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM elevou em duas
vezes a atividade de SOD em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT no entanto natildeo
alterou a atividade enzimaacutetica de CAT e SOD observada nos pacientes com hanseniacutease Dessa
forma os resultados descritos sugerem que os antioxidantes RSV e ALA nas concentraccedilotildees
testadas in vitro natildeo mostram atividade antioxidante quando utilizados em situaccedilotildees de
estresse oxidativo previamente estabelecidas poreacutem estudos posteriores satildeo necessaacuterios para
verificar os efeitos dose e tempo-dependentes de RSV e ALA como prevenccedilatildeo de danos
oxidativos nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
PALAVRAS-CHAVE hanseniacutease poliquimioterapia dapsona estresse oxidativo
antioxidantes aacutecido α-lipoico resveratrol suplementaccedilatildeo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
4
FOLHA DE APROVACcedilAtildeO
MARIELY CRISTINE AMADOR PESSOcircA
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
Farmacecircuticas do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade
Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do tiacutetulo de Mestre em
Ciecircncias Farmacecircuticas
Aacuterea de concentraccedilatildeo Faacutermacos e Medicamentos
Aprovado em ____________
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________________
Profordf Drordf Marta Chagas Monteiro PPGCFUFPA
(Orientadora)
_________________________________________________________
Profordf Drordf Lilian Lund Amado
PPGEAPUFPA
_________________________________________________________
Profordf Drordf Maacutercia Cristina Furtado Nascimento
PPGNMTUFPA
5
AGRADECIMENTOS
Ao Onipotente
Agrave Universidade Federal do Paraacute e ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
FarmacecircuticasPPGCF-UFPA por fornecerem as ferramentas necessaacuterias para a conclusatildeo
dessa etapa
Agrave Profordf Dra Marta Chagas Monteiro pela confianccedila pelo conhecimento repassado e pelos
conselhos em boa hora
Agraves instituiccedilotildees de sauacutede que me permitiram realizar essa pesquisa UBS Pedreira e URE Dr
Marcello Candia assim como aos enfermeiros e teacutecnicos de enfermagem responsaacuteveis pelo
setor da PQT
Agrave equipe do Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem pelo auxiacutelio na
leitura dos exames hematoloacutegicos
Ao laboratoacuterio de Controle de Qualidade na pessoa da Profordf Dra Roseane Ribeiro Costa por
contribuir para a realizaccedilatildeo dos experimentos
Agrave famiacutelia pelo incentivo para seguir adiante e por cada vitoacuteria conquistada
Aos inuacutemeros amigos por compreenderem as ausecircncias pelas palavras amigas e risadas
compartilhadas
Aos integrantes do Laboratoacuterio de Microbiologia e Imunologia em nome dos momentos de
descontraccedilatildeo em meio aos experimentos de todo santo dia
Ao meu amor pela paciecircncia infindaacutevel companheirismo e mensagens de apoio
E natildeo menos importante a todos os que contribuiacuteram para a realizaccedilatildeo desse estudo
6
ldquoHaacute uma forccedila motriz mais poderosa que o vapor a eletricidade e a energia atocircmica a
vontaderdquo
(Albert Einstein)
7
RESUMO
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa que ainda representa uma preocupaccedilatildeo na sauacutede
puacuteblica mundial no seacuteculo XXI A poliquimioterapia preconizada pela Organizaccedilatildeo Mundial
de Sauacutede (OMS) apesar de ser a barreira mais eficaz no combate ao Mycobacterium leprae eacute
um dos responsaacuteveis pela produccedilatildeo de EROs e desenvolvimento de metemoglobinemia e
anemia hemoliacutetica nos pacientes em tratamento Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi
verificar os possiacuteveis danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de poliquimioterapia
(PQT) ao avaliar paracircmetros hematoloacutegicos e o perfil oxidativo em eritroacutecitos e detectar os
efeitos do tratamento in vitro com os antioxidantes resveratrol (RSV) e aacutecido alfa-lipoico
(ALA) na prevenccedilatildeo da metemoglobinemia e na atividade de enzimas antioxidantes Os
resultados obtidos demonstraram diminuiccedilatildeo dos valores de hemaacutecias e reticulocitose nos
pacientes entre o quarto e o seacutetimo mecircs de tratamento com PQT comparados aos valores
encontrados no grupo controle A formaccedilatildeo de metemoglobina (MetHb) aumentou a partir do
5ordm mecircs de tratamento com PQT e a utilizaccedilatildeo de RSV e ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM
manteve o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes que estavam entre o 4ordm e
6ordm mecircs de uso de PQT Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar
ao controle e uma decrescida atividade de CAT o que possivelmente implica maior produccedilatildeo
de H2O2 O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM elevou em duas
vezes a atividade de SOD em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT no entanto natildeo
alterou a atividade enzimaacutetica de CAT e SOD observada nos pacientes com hanseniacutease Dessa
forma os resultados descritos sugerem que os antioxidantes RSV e ALA nas concentraccedilotildees
testadas in vitro natildeo mostram atividade antioxidante quando utilizados em situaccedilotildees de
estresse oxidativo previamente estabelecidas poreacutem estudos posteriores satildeo necessaacuterios para
verificar os efeitos dose e tempo-dependentes de RSV e ALA como prevenccedilatildeo de danos
oxidativos nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
PALAVRAS-CHAVE hanseniacutease poliquimioterapia dapsona estresse oxidativo
antioxidantes aacutecido α-lipoico resveratrol suplementaccedilatildeo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
5
AGRADECIMENTOS
Ao Onipotente
Agrave Universidade Federal do Paraacute e ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias
FarmacecircuticasPPGCF-UFPA por fornecerem as ferramentas necessaacuterias para a conclusatildeo
dessa etapa
Agrave Profordf Dra Marta Chagas Monteiro pela confianccedila pelo conhecimento repassado e pelos
conselhos em boa hora
Agraves instituiccedilotildees de sauacutede que me permitiram realizar essa pesquisa UBS Pedreira e URE Dr
Marcello Candia assim como aos enfermeiros e teacutecnicos de enfermagem responsaacuteveis pelo
setor da PQT
Agrave equipe do Laboratoacuterio de Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem pelo auxiacutelio na
leitura dos exames hematoloacutegicos
Ao laboratoacuterio de Controle de Qualidade na pessoa da Profordf Dra Roseane Ribeiro Costa por
contribuir para a realizaccedilatildeo dos experimentos
Agrave famiacutelia pelo incentivo para seguir adiante e por cada vitoacuteria conquistada
Aos inuacutemeros amigos por compreenderem as ausecircncias pelas palavras amigas e risadas
compartilhadas
Aos integrantes do Laboratoacuterio de Microbiologia e Imunologia em nome dos momentos de
descontraccedilatildeo em meio aos experimentos de todo santo dia
Ao meu amor pela paciecircncia infindaacutevel companheirismo e mensagens de apoio
E natildeo menos importante a todos os que contribuiacuteram para a realizaccedilatildeo desse estudo
6
ldquoHaacute uma forccedila motriz mais poderosa que o vapor a eletricidade e a energia atocircmica a
vontaderdquo
(Albert Einstein)
7
RESUMO
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa que ainda representa uma preocupaccedilatildeo na sauacutede
puacuteblica mundial no seacuteculo XXI A poliquimioterapia preconizada pela Organizaccedilatildeo Mundial
de Sauacutede (OMS) apesar de ser a barreira mais eficaz no combate ao Mycobacterium leprae eacute
um dos responsaacuteveis pela produccedilatildeo de EROs e desenvolvimento de metemoglobinemia e
anemia hemoliacutetica nos pacientes em tratamento Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi
verificar os possiacuteveis danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de poliquimioterapia
(PQT) ao avaliar paracircmetros hematoloacutegicos e o perfil oxidativo em eritroacutecitos e detectar os
efeitos do tratamento in vitro com os antioxidantes resveratrol (RSV) e aacutecido alfa-lipoico
(ALA) na prevenccedilatildeo da metemoglobinemia e na atividade de enzimas antioxidantes Os
resultados obtidos demonstraram diminuiccedilatildeo dos valores de hemaacutecias e reticulocitose nos
pacientes entre o quarto e o seacutetimo mecircs de tratamento com PQT comparados aos valores
encontrados no grupo controle A formaccedilatildeo de metemoglobina (MetHb) aumentou a partir do
5ordm mecircs de tratamento com PQT e a utilizaccedilatildeo de RSV e ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM
manteve o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes que estavam entre o 4ordm e
6ordm mecircs de uso de PQT Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar
ao controle e uma decrescida atividade de CAT o que possivelmente implica maior produccedilatildeo
de H2O2 O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM elevou em duas
vezes a atividade de SOD em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT no entanto natildeo
alterou a atividade enzimaacutetica de CAT e SOD observada nos pacientes com hanseniacutease Dessa
forma os resultados descritos sugerem que os antioxidantes RSV e ALA nas concentraccedilotildees
testadas in vitro natildeo mostram atividade antioxidante quando utilizados em situaccedilotildees de
estresse oxidativo previamente estabelecidas poreacutem estudos posteriores satildeo necessaacuterios para
verificar os efeitos dose e tempo-dependentes de RSV e ALA como prevenccedilatildeo de danos
oxidativos nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
PALAVRAS-CHAVE hanseniacutease poliquimioterapia dapsona estresse oxidativo
antioxidantes aacutecido α-lipoico resveratrol suplementaccedilatildeo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
6
ldquoHaacute uma forccedila motriz mais poderosa que o vapor a eletricidade e a energia atocircmica a
vontaderdquo
(Albert Einstein)
7
RESUMO
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa que ainda representa uma preocupaccedilatildeo na sauacutede
puacuteblica mundial no seacuteculo XXI A poliquimioterapia preconizada pela Organizaccedilatildeo Mundial
de Sauacutede (OMS) apesar de ser a barreira mais eficaz no combate ao Mycobacterium leprae eacute
um dos responsaacuteveis pela produccedilatildeo de EROs e desenvolvimento de metemoglobinemia e
anemia hemoliacutetica nos pacientes em tratamento Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi
verificar os possiacuteveis danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de poliquimioterapia
(PQT) ao avaliar paracircmetros hematoloacutegicos e o perfil oxidativo em eritroacutecitos e detectar os
efeitos do tratamento in vitro com os antioxidantes resveratrol (RSV) e aacutecido alfa-lipoico
(ALA) na prevenccedilatildeo da metemoglobinemia e na atividade de enzimas antioxidantes Os
resultados obtidos demonstraram diminuiccedilatildeo dos valores de hemaacutecias e reticulocitose nos
pacientes entre o quarto e o seacutetimo mecircs de tratamento com PQT comparados aos valores
encontrados no grupo controle A formaccedilatildeo de metemoglobina (MetHb) aumentou a partir do
5ordm mecircs de tratamento com PQT e a utilizaccedilatildeo de RSV e ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM
manteve o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes que estavam entre o 4ordm e
6ordm mecircs de uso de PQT Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar
ao controle e uma decrescida atividade de CAT o que possivelmente implica maior produccedilatildeo
de H2O2 O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM elevou em duas
vezes a atividade de SOD em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT no entanto natildeo
alterou a atividade enzimaacutetica de CAT e SOD observada nos pacientes com hanseniacutease Dessa
forma os resultados descritos sugerem que os antioxidantes RSV e ALA nas concentraccedilotildees
testadas in vitro natildeo mostram atividade antioxidante quando utilizados em situaccedilotildees de
estresse oxidativo previamente estabelecidas poreacutem estudos posteriores satildeo necessaacuterios para
verificar os efeitos dose e tempo-dependentes de RSV e ALA como prevenccedilatildeo de danos
oxidativos nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
PALAVRAS-CHAVE hanseniacutease poliquimioterapia dapsona estresse oxidativo
antioxidantes aacutecido α-lipoico resveratrol suplementaccedilatildeo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
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WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
7
RESUMO
ldquoO EFEITO in vitro DOS COMPOSTOS AacuteCIDO ALFA-LIPOICO E RESVERATROL
EM PARAcircMETROS DO ESTRESSE OXIDATIVO DURANTE O USO DA
POLIQUIMIOTERAPIA PARA HANSENIacuteASErdquo
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa que ainda representa uma preocupaccedilatildeo na sauacutede
puacuteblica mundial no seacuteculo XXI A poliquimioterapia preconizada pela Organizaccedilatildeo Mundial
de Sauacutede (OMS) apesar de ser a barreira mais eficaz no combate ao Mycobacterium leprae eacute
um dos responsaacuteveis pela produccedilatildeo de EROs e desenvolvimento de metemoglobinemia e
anemia hemoliacutetica nos pacientes em tratamento Nesse sentido o objetivo desse trabalho foi
verificar os possiacuteveis danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de poliquimioterapia
(PQT) ao avaliar paracircmetros hematoloacutegicos e o perfil oxidativo em eritroacutecitos e detectar os
efeitos do tratamento in vitro com os antioxidantes resveratrol (RSV) e aacutecido alfa-lipoico
(ALA) na prevenccedilatildeo da metemoglobinemia e na atividade de enzimas antioxidantes Os
resultados obtidos demonstraram diminuiccedilatildeo dos valores de hemaacutecias e reticulocitose nos
pacientes entre o quarto e o seacutetimo mecircs de tratamento com PQT comparados aos valores
encontrados no grupo controle A formaccedilatildeo de metemoglobina (MetHb) aumentou a partir do
5ordm mecircs de tratamento com PQT e a utilizaccedilatildeo de RSV e ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM
manteve o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes que estavam entre o 4ordm e
6ordm mecircs de uso de PQT Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar
ao controle e uma decrescida atividade de CAT o que possivelmente implica maior produccedilatildeo
de H2O2 O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM elevou em duas
vezes a atividade de SOD em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT no entanto natildeo
alterou a atividade enzimaacutetica de CAT e SOD observada nos pacientes com hanseniacutease Dessa
forma os resultados descritos sugerem que os antioxidantes RSV e ALA nas concentraccedilotildees
testadas in vitro natildeo mostram atividade antioxidante quando utilizados em situaccedilotildees de
estresse oxidativo previamente estabelecidas poreacutem estudos posteriores satildeo necessaacuterios para
verificar os efeitos dose e tempo-dependentes de RSV e ALA como prevenccedilatildeo de danos
oxidativos nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
PALAVRAS-CHAVE hanseniacutease poliquimioterapia dapsona estresse oxidativo
antioxidantes aacutecido α-lipoico resveratrol suplementaccedilatildeo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
8
ABSTRACT
The leprosy is an infectious disease that represents a major preoccupation in global public
health in 21st century The treatment with Multi Drug Therapy (MDT) approved by the World
Health Organization (WHO) is the best treatment to Mycobacterim leprae infection however
is one of the factors of increasing Reactive Oxygen Species (ROS) production and the
development of methemoglobinemia and hemolytic anemia in these patients The aim of this
study was to verify the oxidative damage in leprosy patients receiving MDT by evaluation of
hematological and oxidative stress biomarkers and identify the effects of in vitro treatment
with antioxidants alpha-lipoic acid (ALA) and resveratrol (RSV) in antioxidant enzymes
activity and prevention of methemoglobinemia The results revealed a decrease in RBC count
and reticulocytosis in patients receiving MDT during the 4th and 7th month of treatment The
percentual of methemoglobin increased since the fifth month of treatment with MDT and the
treatment with 100 microM RSV-treated and ALA-treated preserved the values similar to control
group only in 4th
to 6th
month of MDT samples The leprosy patients presented values of SOD
activity similar to the control group and a decreased CAT activity leading to an inbalance in
the ratio of both enzymes and possibly resulting in an over-producing of H2O2 The treatment
with RSV and ALA in 100 microM and 500 microM concentrations increases twice the SOD activity
in 4th
month patient samples however these concentrations did not change CAT and SOD
activities found in leprosy patients Such results demonstrate that RSV and ALA did not show
antioxidant activity in installed oxidative stress and subsequent studies are necessary to
evaluate dose-dependent and time-dependent concentrations of RSV and ALA to prevent
oxidative damage in chronic infectious diseases
KEYWORDS leprosy Multi Drug Therapy dapsone oxidative stress antioxidants alpha-
lipoic acid resveratrol supplementation
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
9
LISTA DE ILUSTRACcedilOtildeES
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 20
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona 21
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona 22
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina 24
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico 29
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol 30
Figura 7 Delineamento da pesquisa 34
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina 37
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase 38
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase 39
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo 40
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos 40
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT 44
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de
PQT 45
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 46
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM 47
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM 49
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 50
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM 51
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
10
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM 52
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT
em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM 53
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
11
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo 42
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia 43
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
12
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E SIacuteMBOLOS
ALA Aacutecido alfa-lipoico
ALT Alanina aminotransferase
AST Aspartato aminotransferase
ATP Adenosina trifosfato
CAT Catalase
CFZ Clofazimina
CHCM concentraccedilatildeo hemoglobiacutenica corpuscular meacutedia
Cu2+
Iacuteon cuacuteprico
DADS Diacetildiaminosulfona
DATASUS Departamento de Informaacutetica do SUS
DDS Dapsona
DDS-NOH Dapsona hidroxilamina
DHLA Aacutecido dihidrolipoico
D4 Paciente hanseniano em uso da 4ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D5 Paciente hanseniano em uso da 5ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D6 Paciente hanseniano em uso da 6ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
D7 Paciente hanseniano em uso da 7ordf dose da poliquimioterapia para hanseniacutease
EDTA Aacutecido etilenodiamino tetra-aceacutetico
ERO Espeacutecies reativas de oxigecircnio
ERN Espeacutecies reativas de nnitrogecircnio
Fe2+
Iacuteon ferroso
Fesup3+ Iacuteon feacuterrico
G-6-PD Glicose-6-fosfato desidrogenase
GPx Glutationa peroxidase
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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Baacutesica Vigilacircncia em Sauacutede Dengue Esquistossomose Hanseniacutease Malaacuteria Tracoma e
Tuberculose Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Atenccedilatildeo a Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
Baacutesica - 2 ed rev - Brasiacutelia Ministeacuterio da Sauacutede 2008
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Poliacuteticas de Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
Baacutesica Dermatologia na Atenccedilatildeo Baacutesica Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Poliacuteticas de
Sauacutede- 1ordf ediccedilatildeo - Brasiacutelia Ministeacuterio da Sauacutede 2002 (Seacuterie Cadernos de Atenccedilatildeo Baacutesica
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
13
GR Glutationa redutase
GSH Glutationa reduzida
GSSG Glutationa oxidada
H+ Iacuteon hidrogecircnio
HCM Hemoglobina corpuscular meacutedia
HO Radical hidroxila
IB Iacutendice baciloscoacutepico
κ Kappa
MADDS Monoacetildapsona
MDA Malondialdeiacutedo
MADDS-NOH Monoacetildapsona hidroxilamina
MetHb Metemoglobina
mL mililitro
microL microlitro
microM milimolar
NADH nicotinamida adenosina dinucleotiacutedeo reduzida
NADPH nicotinamida adenosina fosfato reduzida
NAT N-acetiltransferase
NaCl Cloreto de soacutedio
NO2- Nitrito
O2- Radical acircnion superoacutexido
OMS Organizaccedilatildeo Mundial da Sauacutede
PABA Aacutecido para-amino-benzoico
Prx Peroxiredoxina
PQT poliquimioterapia
RO Radical alcoxila
RO2 Radical peroxila
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
14
RMP Rifampicina
Rpm Rotaccedilatildeo por minuto
SINAN Sistema de Informaccedilatildeo de Agravos de Notificaccedilatildeo
SOD Superoacutexido dismutase
TBA Aacutecido tiobarbituacuterico
TBARS Substacircncias reativas ao aacutecido tiobarbituacuterico
TCA Aacutecido tricloroaceacutetico
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
15
SUMAacuteRIO
1 INTRODUCcedilAtildeO 17
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO 19
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia 19
22 Dapsona 21
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos 23
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo 25
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse oxidativo 28
251 Aacutecido alfa-lipoico 29
252 Resveratrol 30
3 OBJETIVOS 32
31 Geral 32
32 Especiacuteficos 32
5 METODOLOGIA 33
51 Materiais 34
52 Anaacutelise Hematoloacutegica 35
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA 35
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA 36
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO DISMUTASE (SOD) 37
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT) 38
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS 39
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA) 39
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-) 40
56 Anaacutelise estatiacutestica 41
6 RESULTADOS 42
61 Anaacutelise hematoloacutegica 43
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
16
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos em uso de PQT 43
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do tratamento in vitro com ALA e
RSV 45
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
48
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do tratamento in vitro com ALA e RSV
51
7 DISCUSSAtildeO 54
CONCLUSAtildeO 61
PERSPECTIVAS 62
REFEREcircNCIAS 63
ANEXOS 70
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
17
1 INTRODUCcedilAtildeO
A hanseniacutease eacute uma doenccedila infecciosa causada pelo bacilo Mycobacterim leprae e
ainda eacute considerada problema de sauacutede puacuteblica no seacuteculo XXI O tratamento preconizado pela
OMS consiste na administraccedilatildeo da poliquimioterapia composta por dapsona (DDS)
ripampicina (RMP) e clofazimina (CFZ) sendo o tempo estabelecido conforme a
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila (paucibacilar ou multibacilar) Embora o esquema
terapecircutico seja a barreira mais eficaz no combate ao bacilo a poliquimioterapia eacute
responsaacutevel por inuacutemeros efeitos colaterais A dapsona eacute apontada na literatura como
causadora dos seguintes efeitos cefaleia nefrites confusatildeo mental siacutendrome sulfocircnica e
dentre os mais graves metemoglobinemia e hemoacutelise (GOULART et al 2002 GREBOGI
2009)
Dentre as ceacutelulas mais afetadas os eritroacutecitos tecircm risco aumentado ao estresse
oxidativo visto que transportam oxigecircnio em altas concentraccedilotildees e estatildeo continuamente
expostos aos radicais livres inclusive aos xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo
(OGA 2008) Com isso a administraccedilatildeo de dapsona pode levar a vaacuterios danos nessas ceacutelulas
promovendo lipoperoxidaccedilatildeo e formaccedilatildeo de radicais livres com consequente depleccedilatildeo de
enzimas responsaacuteveis pelo equiliacutebrio redox induzindo assim metemoglobinemia nesses
pacientes (COLEMAM e HOLDEN 2004 VEGGI et al 2008)
Nesse sentido novas alternativas satildeo avaliadas para minimizar os danos oxidativos
tais como o uso de antioxidantes naturais e sinteacuteticos Os estudos com aacutecido α-lipoico (ALA)
na uacuteltima deacutecada relatam atividades contra intoxicaccedilatildeo por metais pesados danos causados
por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes metaboacutelicas satildeo
relatadas na literatura a capacidade de regeneraccedilatildeo de agentes antioxidantes incluindo
vitaminas C E e glutationa (GSH) inibiccedilatildeo de danos ao DNA mediados por peroxinitritos e
remoccedilatildeo de espeacutecies reativas de nitrogecircnio (BRANDAtildeO 2008 SHAY et al 2009 ABDEL-
ZAHER et al 2011 GOLBIDI et al 2011) O resveratrol eacute um polifenol encontrado em uvas
vinho tinto e algumas espeacutecies de plantas cujas funccedilotildees variam desde a accedilatildeo sequestradora de
radicais livres agrave atuaccedilatildeo no sistema cardiovascular na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria e
prevenccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica (RICE-EVANS et al 1997 FREacuteMONT 2000 SPANIER
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
18
et al 2009) Portanto o presente estudo propotildee verificar a accedilatildeo dos antioxidantes RSV e ALA
frente ao quadro de estresse oxidativo apresentado por pacientes hansenianos submetidos agrave
poliquimioterapia visando a implementaccedilatildeo de terapias suplementares com antioxidantes na
prevenccedilatildeo de danos oxidativos e melhoria da qualidade de vida nesses pacientes
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
19
2 REFERENCIAL TEOacuteRICO
21 Hanseniacutease e poliquimioterapia
Nos dias atuais a hanseniacutease ainda se configura como agravo de sauacutede puacuteblica
mundial Os esforccedilos para melhor enfrentar a doenccedila como a detecccedilatildeo precoce e o tratamento
com a poliquimioterapia satildeo metas da Estrateacutegia Global para Maior Reduccedilatildeo da Carga da
Hanseniacutease ndash Anos 2006-2015 onde o alvo eacute a reduccedilatildeo de novos casos com incapacidade
grau 2 por 100 mil habitantes em ateacute 35 (WHO 2013)
O Brasil figura entre os 10 paiacuteses com maiores taxas de detecccedilatildeo (WHO 2013) e no
ano de 2013 os casos concentraram-se nos estados de Mato Grosso Tocantins Maranhatildeo
Paraacute e Rondocircnia (DATASUS 2014 Fig 1) No mesmo ano os municiacutepios paraenses que
apresentaram maior nuacutemero de notificaccedilotildees foram Beleacutem Ruroacutepolis Parauapebas Marabaacute
Altamira Redenccedilatildeo e Oriximinaacute
A hanseniacutease eacute causada pelo bacilo Mycobacterium leprae pertencente agrave ordem
Actinomycelalis e agrave famiacutelia Mycobacteriaceae o gecircnero Mycobacterium tem como
particularidades a membrana rica em aacutecido micoacutelico o que a torna resistente agraves coloraccedilotildees
usuais o crescimento lento e ser hospedeiro intracelular obrigatoacuterio O bacilo eacute transmitido
pelas vias aeacutereas e uma vez no organismo humano ndash o qual eacute seu principal hospedeiro -
apresenta tropismo por nervos perifeacutericos ceacutelulas de Schwann e macroacutefagos Os sintomas
aparecem entre 2 a 5 anos apoacutes a exposiccedilatildeo ao patoacutegeno e manifestam-se como manchas
esbranquiccediladas acastanhadas ou avermelhadas com alteraccedilotildees de sensibilidade
espessamento dos nervos perifeacutericos e diminuiccedilatildeo ou perda de forccedila nos muacutesculos inervados
por esses nervos (BRASIL 2008)
Desde 1981 o tratamento terapecircutico preconizado pela OMS consiste em esquemas
poliquimioteraacutepicos na finalidade de reduzir a resistecircncia bacteriana (AMADOR 2004
BRASIL 2008 SUZUKI et al 2012) apresentando diferenciaccedilotildees dependendo da
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
20
Figura 1 Prevalecircncia da hanseniacutease no Brasil no ano de 2013 Fonte DATASUS - Ministeacuterio da Sauacutede (2014)
classificaccedilatildeo operacional da doenccedila em paucibacilar (PB) ou multibacilar (MB) As
recomendaccedilotildees da OMS quanto aos tratamentos satildeo
a) O esquema PB combina os faacutermacos dapsona e rifampicina nesta forma seis
doses mensais supervisionadas de 600 mg de rifampicina e doses diaacuterias
autoadministradas de 100 mg de dapsona
b) O esquema MB combina os faacutermacos dapsona clofazimina e rifampicina nesta
forma rifampicina em 12 doses mensais supervisionadas de 600 mg
clofazimina em 12 doses mensais supervisionadas de 300 mg e doses diaacuterias
autoadministradas de 50 mg e doses diaacuterias autoadministradas de 100 mg
de dapsona
A adesatildeo agrave poliquimioterapia constitui-se como etapa primordial para a quebra da
transmissatildeo da doenccedila a primeira dose elimina cerca de 90 da carga bacteriana
(OPROMOLLA 2000) e a associaccedilatildeo entre faacutermacos bactericidas (rifampicina e
clofazimina) e bacteriostaacuteticos (dapsona) minimiza o desenvolvimento de resistecircncia e reduz a
duraccedilatildeo de tratamento (BRUNTON et al 2010) comparados aos riscos da monoterapia
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
21
As reaccedilotildees adversas mais frequentes durante o tratamento variam entre eventos
dermatoloacutegicos como a dermatite esfoliativa e eritrodermia hepaacuteticos como a hepatite
medicamentosa e hematoloacutegicos como a trombocitopenia agranulocitose
metemoglobinemia e anemia hemoliacutetica (BRASIL 2008)
22 Dapsona
Utilizada inicialmente como monoterapia para o tratamento da hanseniacutease a dapsona
(44rsquo-diaminodifenilsulfona) apresenta-se como um poacute cristalino levemente amarelado
inodoro pouco soluacutevel em aacutegua fotossensiacutevel e de foacutermula molecular C12H12N2O2S (Fig 2)
Figura 2 Estrutura quiacutemica da dapsona Fonte GREBOGI 2009
Seu mecanismo de accedilatildeo frente ao M leprae eacute bacteriostaacutetico inibindo a siacutentese
proteica de aacutecido foacutelico por competiccedilatildeo com o aacutecido para-aminobenzoico (PABA
GREBOGI 2009) Aleacutem disso eacute droga de escolha no tratamento de dermatites artrite
reumatoide infecccedilotildees por Pneumocystis carinii e Toxoplasma gondii e em casos de malaacuteria
por P falciparum resistente agrave cloroquina (BRASIL 2006 REIS NETO et al 2006)
Quando administrada oralmente a dapsona apresenta absorccedilatildeo quase completa pelo
trato gastrintestinal ndash entre 80 a 90 - e difunde-se por todos os tecidos concentrando-se
preferencialmente em pele muacutesculos fiacutegado e rins (REIS NETO et al 2006 BRAGHETTO
2007 WOZEL e BLAZUM 2014) e permanecendo nesses oacutergatildeos ateacute 3 semanas apoacutes a
interrupccedilatildeo do tratamento O pico plasmaacutetico eacute alcanccedilado entre 2 a 8h e apoacutes a ingestatildeo de
uma dose de 50 ndash 300 mg de dapsona a concentraccedilatildeo plasmaacutetica maacutexima varia entre 063
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
22
mgL a 482 mgL em doses de 100 mg do faacutermaco as concentraccedilotildees seacutericas variam entre
326 mgL a 195 mgL apoacutes 24h (WOZEL e BLAZUM 2014)
Apoacutes a absorccedilatildeo a dapsona eacute biotransformada por processos de acetilaccedilatildeo e
hidroxilaccedilatildeo (Fig 3) o primeiro mecanismo origina o composto monoacetildapsona
(MADDS) cuja ligaccedilatildeo agraves proteiacutenas plasmaacuteticas eacute superior a 90 por sua vez o segundo
mecanismo produz os metaboacutelitos dapsona hidroxilamina (DDS-NOH) e monoacetildapsona
hidroxilamina (MADDS-NOH) responsaacuteveis pelos efeitos hematotoacutexicos do faacutermaco
(BRAGUETTO 2007)
Figura 3 Biotransformaccedilatildeo da dapsona e monoacetildapsona NAT= N-acetiltransferase CE= Carboxiesterase P450= citocromo P450 DDS= dapsona DDS-NOH= dapsona hidroxilamina MADDS= monoacetildapsona MADDS-NOH= monoacetildapsona hidroxilamina Fonte BRAGHETTO 2007
Por sofrer recirculaccedilatildeo enterohepaacutetica a meia-vida da dapsona varia de 24 a 36 horas
Sua excreccedilatildeo eacute biliar sob a forma de conjugados com aacutecido glicurocircnico (MELLO 2005
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
23
GREBOGI 2009) e em pequenas quantidades na saliva e no leite materno (CARRAZZA
1998)
Satildeo relatados inuacutemeros efeitos adversos da administraccedilatildeo de dapsona embora os de
ordem hematoloacutegica possuam maior gravidade
23 Metemoglobinemia e oxidaccedilatildeo em eritroacutecitos
Denomina-se metemoglobinemia o estado cliacutenico onde mais de 1 da hemoglobina do
eritroacutecito tem o iacuteon Fe2+
convertido para a forma Fesup3+ a qual natildeo eacute capaz de ligar-se
reversivelmente ao oxigecircnio (MELLO 2005)
A hemoglobina (Hb) eacute um tetracircmetro formado por duas cadeias α-globiacutenicas e duas
cadeias β-globiacutenicas Cada globina possui um radical heme como grupo prosteacutetico o qual eacute
composto por um aacutetomo de ferro ndash na conformaccedilatildeo ferrosa ndash coordenado a quatro aneis
pirroacutelicos Uma ligaccedilatildeo covalente eacute formada com um resiacuteduo de histidina da cadeia globiacutenica
a sexta ligaccedilatildeo eacute realizada com ligantes exoacutegenos a exemplo do oxigecircnio e gaacutes carbocircnico
(MELLO 2005 KANIAS e ACKER 2010)
No eritroacutecito a auto-oxidaccedilatildeo da hemoglobina ocorre continuadamente gerando
radical acircnion superoacutexido
HbFe(II)O2 auto-oxidaccedilatildeo
HbFe(III) + O2-
(1)
e a forma predominante de reduccedilatildeo endoacutegena ocorre por meio do sistema NADH
desidrogenase ou diaforase I a metemoglobina formada eacute reduzida pelo citocromo-b5 por
accedilatildeo de NADH e indiretamente a hemoglobina tem o iacuteon Fe3+
convertido em Fe2+
Existe
uma segunda via de reduccedilatildeo e dependente de NADPH denominada NADPH-metemoglobina
redutase ou diaforase II onde este cofator eacute associado ao sistema glicosendash6- fosfato
desidrogenase (G-6-PD MARTINS 1995 OGA 2008 BREGHETTO 2007 Fig 4) essa
via eacute expressa na presenccedila de azul de metileno o qual eacute utilizado na praacutetica cliacutenica em casos
de metemoglobinemia sintomaacutetica
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
24
Figura 4 Mecanismos de reduccedilatildeo da metemoglobina ATP= trifosfato de adenosina G6PD= Glicose 6-Fosfato
Desidrogenase MHb= metemoglobina NAD= nicotiamida adenosina dinucleotiacutedeo NADP= nicotiamida
adenosina dinucleotiacutedeo fosfato Fonte OGA 2008
A partir dos produtos O2- e H2O2 oriundos de processos metaboacutelicos normais haacute
formaccedilatildeo de inuacutemeras espeacutecies lesivas aos eritroacutecitos por reaccedilotildees espontacircneas ou com a
presenccedila de metais como cofatores caracteriacutestica das reaccedilotildees de Fenton e Haber-Weiss
(CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010 VAN ZWIETEN et al 2014)
O2- + O2
- + 2H
+ H2O2 + O2 (2)
O2- + H2O2 O2 + HO
- + HO (reaccedilatildeo de Haber-Weiss) (3)
Fe2+
+ H2O2 Fe3+
+ HO- + HO (reaccedilatildeo de Fenton) (4)
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
25
A exposiccedilatildeo do eritroacutecito aos metaboacutelitos hidroxilados da dapsona DDS-NOH e
MADDS-NOH desencadeia eventos diversos que finalizam com a morte celular
clinicamente diagnosticada como anemia hemoliacutetica Aleacutem dos eventos colocados
anteriormente as reaccedilotildees entre a hemoglobina e produtos da dapsona geram O2- e compostos
nitrosos a exemplo da dapsona-nitrosobenzeno Esses uacuteltimos satildeo detoxificados pelo sistema
NADH metemoglobina redutase eritrocitaacuterio ou pelo complexo GSH-GPx agrave hidroxilamina
formando um ciacuterculo vicioso agrave medida que a hidroxilamina eacute regenerada haacute novos ataques agraves
moleacuteculas de hemoglobina formando novos radicais (COLEMAN 1995 COLEMAN e
HOLDEN 2004 BREGHETTO 2007 VEGGI et al 2008) Ao esgotar as reservas de
glutationa os compostos nitrosos satildeo livres para reagir com agrupamentos tiois ou outras
regiotildees da membrana (COLEMAN 1995)
Os danos agrave membrana celular culminam nos eventos de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e
formaccedilatildeo de neoantiacutegenos O ferro livre eacute fator desencadeante de reaccedilotildees de oxidaccedilatildeo cujos
resultados se refletem na alteraccedilatildeo do citoesqueleto e na exposiccedilatildeo da porccedilatildeo lipiacutedica
intracelular e na consequente oxidaccedilatildeo de aacutecidos graxos pelo peroacutexido de hidrogecircnio
Adicionalmente os produtos da oxidaccedilatildeo do ferro acumulam-se na membrana eritrocitaacuteria e
ativam macroacutefagos (CcedilIMEN 2008 KANIAS e ACKER 2010) concluindo o processo de
remoccedilatildeo precoce dos eritroacutecitos
24 Eritroacutecitos como biomarcadores de estresse oxidativo
Os eritroacutecitos satildeo componentes majoritaacuterios do tecido sanguiacuteneo e a forma que o
conhecemos eacute o resultado de um longo processo de diferenciaccedilatildeo celular iniciado na medula
oacutessea originalmente como ceacutelulas-tronco passam a ser ceacutelulas nucleadas apoacutes a accedilatildeo de
fatores de crescimento sofrem processo de extrusatildeo dos nuacutecleos e satildeo lanccediladas agrave circulaccedilatildeo
como reticuloacutecitos uacuteltimo estaacutegio de maturaccedilatildeo (OLIVEIRA e SALDANHA 2010) Suas
caracteriacutesticas uacutenicas ndash capacidade biossinteacutetica limitada e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e
quiacutemicas ndash fazem do eritroacutecito o modelo experimental ideal pela facilidade de obtenccedilatildeo baixo
custo e sensibilidade aos testes
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
26
O eritroacutecito maduro eacute estruturalmente diferente das outras ceacutelulas do organismo eacute
anucleado possui citoplasma sem organelas e adquire forma de disco bicocircncavo medindo
8microm de diacircmetro Dada a importacircncia dos eritroacutecitos no bom funcionamento das demais
ceacutelulas no organismo esta ceacutelula eacute dotada de elementos e funccedilotildees que garantem a sobrevida
de 120 dias
a) Composiccedilatildeo da membrana A membrana eritrocitaacuteria eacute composta por 60 de lipiacutedios
essencialmente fosfatidilcolina fosfatidiletanolamina fosfatidilserina e
esfingomielina 30 de colesterol e 10 de glicolipiacutedios Ela eacute didaticamente dividida
em dois domiacutenios o primeiro domiacutenio corresponde a uma dupla camada lipiacutedica
atravessada por proteiacutenas transportadoras e estruturais onde as concentraccedilotildees de
esfingomielina e fosfatidilcolina localizadas na porccedilatildeo exterior da membrana e o
colesterol satildeo determinantes para a deformabilidade celular o segundo domiacutenio
corresponde ao citoesqueleto onde a associaccedilatildeo entre filamentos de espectrina e
actina forma redes que cobrem toda a superfiacutecie interna do eritroacutecito Logo a
manutenccedilatildeo da superfiacutecie celular eacute definida pelas interaccedilotildees entre os dois domiacutenios
interaccedilotildees mediadas por multicomplexos proteicos (SMITH 1987 OLIVEIRA e
SALDANHA 2010 PANTALEO et al 2010 MANKELOW et al 2012)
b) Metabolismo do eritroacutecito A ausecircncia de nuacutecleo e mitococircndrias torna inviaacutevel a
geraccedilatildeo de energia pelo ciclo de Krebs portanto o eritroacutecito lanccedila matildeo de vias
diferenciadas para obtenccedilatildeo de energia A via anaeroacutebia ou via de Embdem-
Meyerhof eacute responsaacutevel por 90 do metabolismo eritrocitaacuterio e produz 2 mols de
adenosina trifosfato (ATP) a via das hexoses-monofosfato ou shunt de Rapaport-
Luebering regula a afinidade da hemoglobina por oxigecircnio ao produzir 23-
difosfoglicerato (23-DPG) e se configura como a uacutenica fonte de produccedilatildeo de
nicotinamida adenosina fosfato (NADPH)NADP na ceacutelula (MARTINS 1995 VAN
WIJK e VAN SOLINGE 2005)
c) Defesa antioxidante Os eventos de oxi-reduccedilatildeo satildeo intriacutensecos agrave manutenccedilatildeo da vida
aeroacutebia e nesse contexto haacute um constante equiliacutebrio entre espeacutecies reativas de
oxigecircnio (EROs) e moleacuteculas antioxidantes As EROs satildeo resultantes da reduccedilatildeo
monoeletrocircnica de O2 agrave H2O e podem ser natildeo-radicalares como o peroacutexido de
hidrogecircnio (H2O2) ou radicalares como os radicais acircnion superoacutexido (O2-) hidroxila
(HO) peroxila (RO2
) e alcoxila (RO
) Quando produzidas em proporccedilotildees menores
integram mecanismos endoacutegenos (inflamaccedilatildeo fagocitose sinalizaccedilatildeo intracelular e
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
27
reparo tecidual) e em condiccedilotildees patoloacutegicas satildeo mediadoras de danos em estruturas
celulares DNA lipiacutedios e proteiacutenas (VALKO et al 2007 CcedilIMEN 2008)
Nesse contexto os eritroacutecitos tornam-se mais suscetiacuteveis ao ataque de EROs
que os demais tecidos A exposiccedilatildeo a altas concentraccedilotildees de oxigecircnio o transporte de
xenobioacuteticos oxidantes absorvidos pelo organismo a ameaccedila constante de oxidaccedilatildeo da
hemoglobina e o acuacutemulo de agressotildees fiacutesicas e quiacutemicas sem capacidade de
reparaccedilatildeo reduzem a sobrevida da ceacutelula tal situaccedilatildeo exige um sistema antioxidante
capaz de conter os danos provocados e conferir proteccedilatildeo ao eritroacutecito (MARTINS
1995 OGA 2008) Dentre as enzimas fundamentais nesse processo figuram a
superoacutexido dismutase (SOD) catalase (CAT) e o sistema glutationa-glutationa
peroxidase (GSH-GPx)
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas onde a principal caracteriacutestica eacute a
presenccedila de metais em sua constituiccedilatildeo em humanos as isoformas existentes satildeo Mn-
SOD (mitocondrial) CuZn-SOD (citosoacutelica) e a SOD extracelular (RATMAN et al
2006 CcedilIMEN 2008) A forma citosoacutelica eacute abundante em eritroacutecitos onde converte
O2- em H2O2 e O2 em uma taxa de dismutaccedilatildeo de 2 x 10
9 M
-1 s
-1 representado no
mecanismo abaixo
2 O2- + 2 H
+
SOD H2O2 + O2 (5)
O complexo GSH-GPx tem papel determinante na neutralizaccedilatildeo de espeacutecies
reativas A GSH eacute um tripeptiacutedeo abundante nos eritroacutecitos (na ordem de 2 ndash 10 mM)
e consegue detoxificar H2O2 em baixas concentraccedilotildees especialmente quando este eacute
produzido pela autooxidaccedilatildeo da hemoglobina Duas moleacuteculas de GSH agem como
doador de eleacutetrons gerando duas moleacuteculas de aacutegua e glutationa oxidada (GSSG) por
intermeacutedio da glutationa peroxidase (GPx CcedilIMEN 2008 ZWIETEN et al 2014)
como mostra a equaccedilatildeo
2 GSH + H2O2 GPx
2 H2O + GSSG (6)
A CAT localiza-se nos peroxissomas e funciona como mecanismo adicional de
defesa dada a sua melhor atuaccedilatildeo quando o eritroacutecito eacute exposto a altas concentraccedilotildees
de H2O2 (CcedilIMEN 2008) Adicionalmente a enzima exerce accedilatildeo peroxidativa em
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
28
compostos toacutexicos como fenois formaldeiacutedo e aacutelcoois (RATMAN et al 2008) O
mecanismo cataliacutetico produz aacutegua e oxigecircnio sem produccedilatildeo de outros radicais e eacute
expresso na equaccedilatildeo abaixo
H2O2 CAT
2 H2O + O2 (7)
25 Antioxidantes terapia complementar na prevenccedilatildeo do estresse
oxidativo
Nos uacuteltimos anos os potenciais profilaacutetico e terapecircutico dos antioxidantes tecircm
ganhado importacircncia A descoberta do papel dos radicais livres na patogecircnese do cacircncer
diabetes doenccedilas cardiovasculares e doenccedilas neurodegenerativas direcionou as pesquisas para
novas alternativas de prevenccedilatildeo de danos oxidativos
Tradicionalmente a humanidade faz uso de frutas vegetais gratildeos e ervas com
notoacuterios efeitos antioxidantes Em sua maioria a funccedilatildeo antioxidante eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de
compostos fenoacutelicos flavonoides carotenoides e compostos tioacutelicos os quais protegem o
meio celular de danos provocados pelo estresse oxidativo e reduzem o risco de desenvolver
doenccedilas crocircnicas (LUuml et al 2010)
Ainda que o organismo humano seja dotado de mecanismos antioxidantes endoacutegenos
nas doenccedilas crocircnicas a defesa antioxidante encontra-se diminuiacuteda ou depletada em razatildeo do
aumento de oxidantes Dessa forma a suplementaccedilatildeo externa com elementos antioxidantes se
faz essencial para contrabalancear os efeitos deleteacuterios provocados pelo estresse oxidativo
(RATNAM et al 2006)
Atualmente novas alternativas terapecircuticas satildeo estudadas no intuito de minimizar os
efeitos do estresse oxidativo em quadros de metemoglobinemia Segundo Lima et al (2007)
elementos com conhecido potencial antioxidante tais como vitaminas A C e E zinco
magneacutesio e selecircnio tecircm obtido bons resultados na diminuiccedilatildeo de MetHb estudos com
cimetidina (COLEMAN et al 1992) isossorbida (INAL e EGUumlZ 2004) N-acetilcisteiacutena
(MELLO 2005) e arginina (BRAGUETTO 2007) atestam que a busca por novos antiacutedotos eacute
vaacutelida e promissora
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
29
251 Aacutecido alfa-lipoico
O aacutecido alfa-lipoico (ALA aacutecido 12-ditiolano-3-pentanoico C8H14O2S2 Fig 5) eacute um
composto presente em eucariontes e procariontes e eacute produzido naturalmente a partir de aacutecido
octanoico e cisteiacutena (BRANDAtildeO 2008 GOLBIDI et al 2011) Nos alimentos pode ser
encontrado em carne vermelha (preferencialmente nos muacutesculos e coraccedilatildeo) fiacutegado rins e em
menor quantidade em frutas e hortaliccedilas (SHAY et al 2009)
Figura 5 Estrutura quiacutemica do aacutecido alfa-lipoico Fonte SZELAG et al 2011
No organismo o ALA aparece associado a resiacuteduos de lisina formando lipolisina e
atua indiretamente no metabolismo da glicose como cofator para enzimas dos complexos
piruvato desidrogenase e α-ceto-glutarato desidrogenase (BUSTAMANTE et al 1998 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
As condiccedilotildees do trato gastrintestinal durante a administraccedilatildeo de ALA tornam sua
absorccedilatildeo variaacutevel (SHAY et al 2009) esse composto eacute extensivamente metabolizado no
fiacutegado e apenas 20-30 escapa da biotransformaccedilatildeo hepaacutetica (BRANDAtildeO 2008)
Intracelularmente ALA eacute reduzido em aacutecido diidrolipoico (DHLA) por accedilatildeo de enzimas
desidrogenases (KARAKOYUN et al 2009 SZELAG et al 2011) sua excreccedilatildeo eacute
predominantemente renal na forma de 46-bismetilmercapto-hexanoico
As formas oxidada e reduzida de ALA satildeo conhecidas por notoacuteria capacidade
antioxidante visto que a estrutura quiacutemica permite atuaccedilatildeo em fases aquosa e lipiacutedica ndash
diferentemente dos demais antioxidantes Dentre as propriedades do ALA estatildeo a capacidade
de quelar metais reter EROs e espeacutecies reativas de nitrogecircnio (ERNs) regenerar
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
30
antioxidantes endoacutegenos a exemplo da GSH e vitaminas C e E (PACKER et al 1995 SHAY
et al 2009 GOLBIDI et al 2011)
Nos uacuteltimos anos haacute estudos de utilizaccedilatildeo cliacutenica de ALA na intoxicaccedilatildeo por metais
em danos provocados por isquemia-reperfusatildeo doenccedilas neurodegenerativas e em siacutendromes
metaboacutelicas demonstrando que esse composto pode ser alternativa para o tratamento de
doenccedilas crocircnicas (KARAKOYUN et al 2009 TRIVEDI et al 2004 KUumlLKAMP et al 2009)
252 Resveratrol
O resveratrol (RSV 354-trihidroxiestilbeno Fig 6) eacute uma fitoalexina produzida em
plantas como Kojo-kon (Polygunun cuspidatum) Kashuwu (Polygunum multiflorum)
eucaliptos amora e amendoim em resposta a injuacuterias (SAUTTER et al 2005) O composto foi
detectado pela primeira vez em 1976 onde descobriu-se que o resveratrol era produzido em
folhas de parreira (Vitis viniacutefera) em resposta ao ataque pelo fungo Botrytis cinerea
(FREacuteMONT 2000)
Figura 6 Estrutura quiacutemica dos isocircmeros trans-resveratrol e cis-resveratrol Fonte SAUTTER et al 2005
RSV eacute sintetizado nas plantas sob as formas isocircmeras cis-resveratrol (cis-354rsquo-
trihidroxiestilbeno) e trans-resveratrol (trans-354rsquo-trihidroxiestilbeno) A forma trans eacute
majoritaacuteria e mais estaacutevel no ambiente natural e facilmente muda para a conformaccedilatildeo cis
quando eacute exposta agrave radiaccedilatildeo UV (DELMAS et al 2011)
A administraccedilatildeo oral de RSV tem boa absorccedilatildeo no trato gastrintestinal poreacutem com
baixa biodisponibilidade A facilidade do resveratrol em ligar-se agraves proteiacutenas plasmaacuteticas
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
31
especialmente agrave albumina e agrave hemoglobina e a recirculaccedilatildeo ecircntero-hepaacutetica de seus
metaboacutelitos contribui para a permanecircncia do antioxidante por maior tempo no organismo e
uma melhor distribuiccedilatildeo pelos tecidos As concentraccedilotildees do polifenol na circulaccedilatildeo sanguiacutenea
natildeo excedem 2 microM o RSV eacute rapidamente metabolizado e distribuiacutedo para os tecidos fiacutegado
rins coraccedilatildeo pulmotildees e ceacuterebro satildeo os oacutergatildeos nos quais o antioxidante apresenta altas
concentraccedilotildees Sua excreccedilatildeo ocorre na forma de sulfatos e derivados do aacutecido glicurocircnico na
urina (DELMAS et al 2011 SCHMATZ 2011)
A accedilatildeo antioxidante de RSV eacute atribuiacuteda agrave presenccedila de grupos hidroxila em sua
estrutura quiacutemica os quais satildeo potenciais doadores de iacuteons H+ Dessa forma RSV consegue
sequestrar iacuteons HOO- HO e O2
- e atuar como quelante de metais principalmente iacuteons Cu
2+ e
Fe3+
(RICE-EVANS et al 1997) Tambeacutem satildeo relatadas na literatura atividades bioloacutegicas
relacionadas agrave modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico e inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica inibiccedilatildeo
da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria atividades antitumoral estrogecircnica vasodilatadora e anti-
inflamatoacuteria (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009)
Nesse contexto a utilizaccedilatildeo de antioxidantes como terapia suplementar ao tratamento
de diversas patologias tem como finalidades aumentar a resistecircncia ao estresse oxidativo e
melhorar a qualidade de vida dos indiviacuteduos que os consomem Assim com a anaacutelise dos
componentes do sangue de marcadores do estresse oxidativo e da atividade de enzimas
antioxidantes em pacientes hansenianos em uso de PQT pode-se estabelecer uma relaccedilatildeo entre
a administraccedilatildeo da poliquimioterapia e a ocorrecircncia de danos oxidativos nesses paracircmetros e
abrir possibilidades para terapias que visem minimizar esses eventos Ao realizar o tratamento
desses eritroacutecitos in vitro com RSV e ALA dois promissores antioxidantes estima-se
encontrar concentraccedilotildees para uso terapecircutico que possam aliar a remoccedilatildeo eficaz de EROs ao
estiacutemulo da atividade das enzimas SOD e CAT e dessa forma promover uma melhor
resposta antioxidante frente ao quadro de estresse oxidativo caracteriacutestico da hanseniacutease e
melhorar a qualidade de vida dos pacientes em uso de poliquimioterapia
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
32
3 OBJETIVOS
31 Geral
Avaliar os efeitos dos compotos aacutecido alfa-lipoico e resveratrol em paracircmetros do
estresse oxidativo e na prevenccedilatildeo de danos oxidativos em pacientes hansenianos em uso de
poliquimioterapia
32 Especiacuteficos
Avaliar alteraccedilotildees quantitativas em hemaacutecias hemoglobina plaquetas e reticuloacutecitos
em pacientes hansenianos durante o uso de PQT
Determinar as concentraccedilotildees de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes hansenianos
durante o uso de PQT
Determinar o percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos
durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
Determinar a atividade das enzimas CAT e SOD em eritroacutecitos de pacientes
hansenianos durante o uso de PQT e apoacutes o tratamento in vitro com ALA e RSV nas
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
33
5 METODOLOGIA
A pesquisa foi realizada a partir de coleta de amostras sanguiacuteneas de pacientes das
instituiccedilotildees de sauacutede Unidade de Referecircncia Especializada em Dermatologia Sanitaacuteria ldquoDr
Marcello Cacircndiardquo situada no municiacutepio de Marituba (PA) e na Unidade Baacutesica de Sauacutede da
Pedreira situada no municiacutepio de Beleacutem Tais instituiccedilotildees foram escolhidas por serem pontos
de diagnoacutestico e tratamento ambulatorial da hanseniacutease na regiatildeo metropolitana de Beleacutem
(ANEXOS 2 e 3)
O grupo de estudo compreendeu pacientes portadores de hanseniacutease em tratamento
regular do 4ordm ao 7ordm mecircs todos voluntaacuterios e com idade entre 18 e 65 anos Foram excluiacutedos da
pesquisa os pacientes com histoacuterico de etilismo tabagismo diabetes problemas cardiacuteacos e
coinfecccedilotildees que pudessem interferir nos paracircmetros avaliados A punccedilatildeo venosa era realizada
apoacutes a administraccedilatildeo das doses supervisionadas (D4 D5 D6 e D7) da poliquimioterapia
nesses pacientes
O grupo controle foi composto por voluntaacuterios saudaacuteveis e sem a doenccedila de mesma
faixa etaacuteria que o grupo de estudo e atendendo aos criteacuterios de exclusatildeo estabelecidos Ambos
os grupos foram esclarecidos das finalidades benefiacutecios e riscos da pesquisa assim como a
natildeo obrigatoriedade de adesatildeo por meio de Termo de Compromisso Livre e Esclarecido
conforme as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 (ANEXO 4)
Da coleta de 10 mL de material venoso dos participantes do estudo 2 mL foram
conservados em EDTA dissoacutedico para a investigaccedilatildeo de alteraccedilotildees hematoloacutegicas e 8 mL
foram conservados em heparina para a obtenccedilatildeo de plasma e demais procedimentos (Fig 7)
Ressalta-se que o projeto para realizaccedilatildeo desta pesquisa foi aprovado pelo Comitecirc de
Eacutetica do Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da Universidade Federal do Paraacute e estaacute de acordo com
as diretrizes da Resoluccedilatildeo 19696 do Conselho Nacional de Sauacutede A aprovaccedilatildeo foi registrada
sob o parecer nordm 157263 e CAAE 07763212700000018 (ANEXO 1)
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
34
Figura 7 Delineamento da pesquisa
51 Materiais
A pesagem de reagentes foi realizada em balanccedila semi-analiacutetica Celtac (modelo
FA2104N) O pH dos tampotildees utilizados nos procedimentos foi aferido em pHmetro Gehaka
(PG-1800) As amostras sanguiacuteneas foram centrifugadas em centriacutefuga cliacutenica de acircngulo fixo
(CentriBio) As leituras de absorvacircncia dos testes foram realizadas no espectrofotocircmetro
Spectrum (SP-2000 UV) e no leitor de placa de ELISA TP Reader (Thermoplate) Na
necessidade de agitaccedilatildeo vigorosa ou de aquecimento das amostras utilizaram-se vortex
Certomat e banho-maria Sieger respectivamente
Para o teste de determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina foram utilizados
ferricianeto de potaacutessio e cianeto de soacutedio PA (Dinacircmica) e Triton-X (Sigma) No teste de
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD foram utilizados Hypoxanthine (minimum
99 Sigma) Xanthine Oxidase from bovine milk (Sigma) e Cytochrome C from bovine
heart (95 Sigma) Para determinar a atividade enzimaacutetica de CAT foram utilizados Tris
(hidroximetil) aminometano (TRIS) e peroacutexido de hidrogecircnio ambos da Dinacircmicareg Os
testes de determinaccedilatildeo de nitritos utilizaram N-(1-naphthyl)-ethylenediamine-dihydrochloride
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
35
(Sigma) e Sulfanilamide (minimum 99 Sigma) O tratamento in vitro dos eritroacutecitos foi
realizado com os compostos Resveratrol e Aacutecido α-(plusmn) lipoico ambos daSigmareg
52 Anaacutelise Hematoloacutegica
A amostra conservada em EDTA dissoacutedico foi utilizada para a investigaccedilatildeo de
possiacuteveis alteraccedilotildees hematoloacutegicas Para tanto as anaacutelises foram realizadas no Laboratoacuterio de
Anaacutelises Cliacutenicas do Hospital Geral de Beleacutem (HGEBE) utilizando o contador automaacutetico XT
4000i (Sysmex) Para o presente estudo foram avaliados contagem de hemaacutecias
hemoglobina contagem de plaquetas e percentual de reticuloacutecitos
53 Tratamento in vitro com RSV e ALA
Para o tratamento in vitro foram preparadas soluccedilotildees-matildee dos antioxidantes aacutecido
alfa-lipoico (ALA) e resveratrol (RSV) em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M na concentraccedilatildeo de
1 mgmL A partir de resultados de estudos anteriores de nosso grupo foram escolhidas as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM para as soluccedilotildees-trabalho de RSV e ALA deste estudo as
quais foram obtidas pela diluiccedilatildeo em tampatildeo fosfato de soacutedio 05 M
A amostra heparinizada foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos para a separaccedilatildeo
de plasma e eritroacutecitos A porccedilatildeo de plasma foi armazenada em tubos cocircnicos tipo Eppendorf
(capacidade de 2 mL) para as determinaccedilotildees de peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e nitritos Os eritroacutecitos
foram lavados com soluccedilatildeo de NaCl a 09 por trecircs vezes com rotaccedilatildeo de 3000 rpm por 5
minutos Ao final do processo preparou-se uma suspensatildeo de eritroacutecitos a 50 para cada
material colhido
Os experimentos foram realizados em duplicata e cada suspensatildeo de eritroacutecitos a 50
obtida foi submetida a cinco condiccedilotildees experimentais diferentes totalizando 10 grupos para
cada participante Em tubos de ensaio uma aliacutequota de 400 microL foi retirada de cada suspensatildeo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
36
e foi adicionada a 200 microL do antioxidante avaliado As condiccedilotildees experimentais impostas
foram
a) Amostra sem tratamento com antioxidante (controle)
b) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 100 microM
c) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de ALA 500 microM
d) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
e) Amostra tratada com 200 microL de soluccedilatildeo de RSV 100 microM
Esses grupos foram incubados por uma hora em temperatura ambiente a ao abrigo da
luz Apoacutes o tempo determinado foram separadas em tubos de ensaio as seguintes aliacutequotas
a) 100 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica de CAT
b) 50 microL para as determinaccedilotildees de atividade enzimaacutetica da SOD
c) 200 microL para a determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
531 DETERMINACcedilAtildeO DO PERCENTUAL DE METEMOGLOBINA
A metodologia seguida foi adaptada de Hegesh (1970) O teste consiste na leitura de
absorvacircncias de oximetahemoglobina e MetHb naturalmente presentes nos eritroacutecitos com a
adiccedilatildeo de ferricianeto de potaacutessio (agente metemoglobinizante) e apoacutes a utilizaccedilatildeo de um
agente neutralizador como eacute apresentado na Figura 8
As leituras foram realizadas em duplicata em leitor de ELISA (TP Reader)
Determinou-se a porcentagem de metemoglobina utilizando os valores de absorbacircncia
anotados e empregados na foacutermula
MetHb= x 100 (1)
onde
A1 representa a MetHb encontrada no sangue
A2 representa a transformaccedilatildeo de oxihemoglobina em MetHb
A3 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianometemoglobina
A4 representa a transformaccedilatildeo de MetHb em cianohemoglobina
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
37
Figura 8 Procedimento para determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina
532 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA SUPEROacuteXIDO
DISMUTASE (SOD)
Foi utilizada a metodologia de Mc Cord e Fridowich (1969) com adaptaccedilotildees O teste
mensura a atividade da enzima de forma indireta ao verificar a inibiccedilatildeo da reduccedilatildeo do
citocromo C mediado pela SOD no sistema enzimaacutetico xantinaxantina oxidase em pH 78 a
25degC
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 50 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Uma
aliacutequota deste hemolisado foi adicionada a uma mistura de tampatildeo citocromo C 0075mM
hipoxantina 15 mM e xantina oxidase 56 mM A soluccedilatildeo resultante foi incubada agrave
temperatura ambiente e ao abrigo da luz e apoacutes 15 min foi realizada uma uacutenica leitura na
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
38
faixa de 550 nm em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) O procedimento se encontra
esquematizado na figura abaixo (Fig9)
Figura 9 Procedimento para a determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da superoacutexido dismutase
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de citocromo C para
determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica expressa em Unidade SODmg proteiacutena uma unidade
de SOD eacute a quantidade de enzima necessaacuteria para inibir em 50 a velocidade de reduccedilatildeo do
citocromo C a 550 nm
533 DETERMINACcedilAtildeO DA ATIVIDADE ENZIMAacuteTICA DA CATALASE (CAT)
Foi realizada conforme metodologia proposta por Beutler (1975) onde eacute observada a
reaccedilatildeo cineacutetica de consumo de H2O2 pela enzima em um minuto
Apoacutes a separaccedilatildeo de aliacutequotas para os testes descrita no item 53 obteve-se um
hemolisado a partir dos 100 microL da suspensatildeo de eritroacutecitos de cada grupo estudado Apoacutes a
adiccedilatildeo de TRIS a 8 microL do hemolisado 100 microL da nova soluccedilatildeo foi adicionada agrave soluccedilatildeo de
reaccedilatildeo de H2O2 e lida em espectrofotocircmetro UV-1800 (Shimatzu) por um minuto na faixa de
240 nm em ambiente escuro
Foram anotados os valores de absorbacircncia nos tempos zero (T0) e apoacutes um minuto (T1)
para caacutelculo de atividade enzimaacutetica Os valores foram expressos em Unidade CATmg
proteiacutena onde uma unidade da enzima corresponde ao consumo de 1 microMol de H2O2 em um
minuto em pH 8 e agrave temperatura de 25degC O procedimento encontra-se esquematizado na Fig
10
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
39
Figura 10 Procedimento para determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica da catalase
534 DETERMINACcedilAtildeO DE PROTEIacuteNAS TOTAIS
Para a mensuraccedilatildeo das atividades enzimaacuteticas foi realizada a determinaccedilatildeo de
proteiacutenas totais utilizando-se o kit Proteiacutenas Totais (Doles) Agrave uma soluccedilatildeo de biureto foram
adicionados 25 microL da amostra e duas gotas de NaOH 6M e apoacutes 5 min foi realizada leitura em
leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 550 nm Foi utilizado como padratildeo albumina bovina
a 4 mg dL
54 Determinaccedilatildeo de Malondialdeiacutedo (MDA)
Foi utilizada a metodologia adaptada de Ohkawa et al (1979) O teste quantifica a
presenccedila de hidroperoacutexidos (primeiro estaacutegio de degradaccedilatildeo de lipiacutedios) em amostras a partir
da adiccedilatildeo de aacutecido tiobarbituacuterico a soluccedilatildeo levemente rosada eacute facilmente lida em
espectrofotocircmetro entre 525 nm a 545 nm
Adicionou-se uma aliacutequota de 100 microL de plasma agraves soluccedilotildees de aacutecido tricloroaceacutetico a
10 pv e aacutecido tiobarbituacuterico a 1 pv e a mistura foi levada a banho-maria por 1h a 90degC
Apoacutes centrifugaccedilatildeo o sobrenadante foi lido em espectrofotocircmetro SP-2000 (Spectrum) na
faixa de 530 nm O procedimento encontra-se esquematizado na Figura 11
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
40
Figura 11 Procedimento da determinaccedilatildeo de malondialdeiacutedo
Os valores de absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de malondialdeiacutedo para
determinaccedilatildeo das concentraccedilotildees do analito Os resultados foram expressos em nmol
MDAmL de plasma
55 Determinaccedilatildeo de Nitritos (NO2-)
Foi realizada conforme o meacutetodo de Granger (1999) O meacutetodo avalia
quantitativamente a produccedilatildeo de metaboacutelitos oriundos do oacutexido niacutetrico (NO) o qual estaacute
relacionado indiretamente com o status imunoloacutegico do indiviacuteduo
O plasma utilizado foi adicionado ao reagente de Griess em proporccedilatildeo 11 incubado
por 10 min e lido em leitor de ELISA (TP Reader) na faixa de 540 nm Os valores de
absorbacircncia foram aplicados em curva padratildeo de nitrito e os resultados expressos em mMol
NO2-mL de plasma O procedimento encontra-se esquematizado na ilustraccedilatildeo abaixo (Fig
12)
Figura 12 Procedimento da determinaccedilatildeo de nitritos
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
41
56 Anaacutelise estatiacutestica
Os resultados foram expressos como meacutedia plusmn erro padratildeo da meacutedia e submetidos aos
testes ANOVA-one way para determinar diferenccedilas entre as doses trabalhadas e teste T para
anaacutelise de tratamentos Foi utilizado o teste Bonferroni para identificaccedilatildeo de diferenccedilas entre
doses estudadas Valores de plt005 foram considerados significativos
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
42
6 RESULTADOS
A coleta das amostras de pacientes em tratamento para hanseniacutease e voluntaacuterios sadios
ocorreu no periacuteodo de janeiro de 2013 a maio de 2014 A pouca adesatildeo dos pacientes agrave
pesquisa e ajustes na metodologia do preparo de suspensotildees de eritroacutecitos reduziram o
nuacutemero total de participantes do estudo totalizando 13 pacientes em uso de
poliquimioterapia 3 pacientes que receberam a 4ordf dose de PQT (D4) 3 pacientes que
receberam a 5ordf dose (D5) 4 pacientes na 6ordf dose (D6) e 3 pacientes na 7ordf dose (D7) O grupo
controle foi composto por 7 voluntaacuterios saudaacuteveis nas faixas etaacuterias e criteacuterios de exclusatildeo
semelhantes aos pacientes com hanseniacutease A tabela 1 resume as caracteriacutesticas dos pacientes
participantes do estudo
Tabela 1 Dados epidemioloacutegicos dos participantes do estudo
(n=13)
Gecircnero
Masculino 538 (n=7)
Feminino 462 (n=6)
Faixa etaacuteria
18-40 77 (n=1)
41-65 923 (n=12)
Forma cliacutenica
Paucibacilar 308 (n=4)
Multibacilar 692 (n=9)
IB
0-1 616 (n=8)
1-2 -
+ de 3 232 (n=3)
Natildeo relatado 152 (n=2)
IB iacutendice baciloscoacutepico
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
43
61 Anaacutelise hematoloacutegica
O perfil hematoloacutegico dos pacientes em tratamento para hanseniacutease fornece dados que
podem justificar possiacuteveis intervenccedilotildees na poliquimioterapia visto que satildeo relatados pela
literatura quadros de anemia decorrentes de tratamento terapecircutico com drogas oxidantes a
exemplo da dapsona
Na Tabela 2 eacute possiacutevel observar que todos os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e aumento de reticuloacutecitos em relaccedilatildeo
aos indiviacuteduos sadios (controle) Aleacutem disso os pacientes que estavam na 7ordm dose de PQT
(grupo D7) tambeacutem apresentaram diminuiccedilatildeo nos valores de plaquetas quando comparado ao
controle e as demais doses terapecircuticas de PQT
Tabela 2 Valores de iacutendices hematimeacutetricos de hansenianos em uso de poliquimioterapia
Controle
(n=7)
D0Lit D4 (n=3) D5 (n=3) D6 (n=4) D7 (n=3)
Hemaacutecias (x10
6mL)
488plusmn047 55plusmn07 394plusmn024 408plusmn062 394plusmn041 332plusmn02
Hb (gdL) 1447plusmn137 1467plusmn114 12plusmn082 13plusmn217 1265plusmn126 107plusmn075
Plaquetas (Ummsup3)
2215plusmn742 265 22033plusmn395 18367plusmn528 187plusmn326 16733plusmn1102
Reticuloacutecito ()
102plusmn034 02 422plusmn327 345plusmn064 298plusmn11 31plusmn043
Lit valores baseados em resultados de Ranawaka et al 2008 Deps et al 2012 e Al-Sieni et al 2013
plt005 em relaccedilatildeo ao grupo controle
plt001 em relaccedilatildeo ao grupo controle
62 Determinaccedilatildeo de nitritos e malondialdeiacutedo em pacientes
hansenianos em uso de PQT
Atraveacutes das determinaccedilotildees de nitritos e MDA nos pacientes com hanseniacutease sob
tratamento com PQT pode-se mensurar a extensatildeo dos danos provocados pelo tratamento
poliquimioteraacutepico Observou-se que os pacientes hansenianos em uso de PQT natildeo
apresentaram alteraccedilatildeo significativa nesses paracircmetros (Fig 13 e Fig 14) durante os meses de
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
44
tratamento com PQT quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (NO2- 446 micromolmL plusmn
38 MDA 314 nmolmL plusmn 006)
Figura 13 Determinaccedilatildeo de nitritos em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Figura 14 Determinaccedilatildeo de MDA em pacientes hansenianos em uso de PQT D4 paciente no 4ordm mecircs de PQT D5 paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 paciente no 6ordm mecircs de PQT D7 paciente no 7ordm mecircs de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
45
63 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina avalia a proporccedilatildeo entre os estados
de oxidaccedilatildeoreduccedilatildeo do ferro contido no grupamento heme Notou-se que os pacientes
hansenianos a partir da quinta dose de PQT apresentaram aumento significativo do percentual
de metemoglobina com valores acima de 5 quando comparados a indiviacuteduos sem a doenccedila
(148 plusmn 133) como mostra a Figura 15
Figura 15 Determinaccedilatildeo do percentual de metemoglobina em pacientes hansenianos em uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (ANOVA) plt005 comparado ao grupo controle
Apoacutes uma hora do tratamento in vitro com o composto RSV a concentraccedilatildeo de 100
microM reduziu o percentual de MetHb somente em amostras de pacientes em uso da 5ordf dose do
tratamento com PQT (22 plusmn 12) em relaccedilatildeo agraves amostras sem RSV (51 plusmn 19) Por outro
lado RSV potencializou significativamente o aumento do percentual de MetHb nas amostras
de pacientes em uso da 7ordf dose de PQT (118 plusmn 25) e em indiviacuteduos sem a doenccedila (54 plusmn
26) em relaccedilatildeo a esses mesmos grupos sem o tratamento in vitro (31 plusmn 06 e 15 plusmn 13
respectivamente)
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
REFEREcircNCIAS
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
46
Com exceccedilatildeo do grupo em uso da 5ordf dose de PQT o tratamento in vitro com 500 microM
de RSV foi capaz de potencializar o aumento dos percentuais de MetHb em todas as amostras
de pacientes em uso de PQT elevando principalmente o percentual de metemoglobina
(aproximadamente 5 vezes maior que o controle) das amostras de pacientes em uso da 7ordf dose
de PQT (Fig 16)
Figura 16 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamento in vitro com RSV 100 microM e 500 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
47
O tratamento com eritroacutecitos com ALA na concentraccedilatildeo de 100 microM natildeo alterou o
percentual de metemoglobina nos grupos correspondentes agrave quarta quinta e sexta doses de
PQT em comparaccedilatildeo aos mesmos grupos sem tratamento in vitro e somente potencializou o
aumento de MetHb no grupo correspondente agrave 7ordf dose do tratamento com PQT A incubaccedilatildeo
com 500 microM do antioxidante por sua vez aumentou a formaccedilatildeo de MetHb na amostra
referente agrave 7ordf dose de PQT e em indiviacuteduos sem a doenccedila ao passo que natildeo provocou
diferenccedilas nas amostras correspondentes agraves demais doses de PQT (Fig 17)
Figura 17 Percentual de metemoglobina em eritroacutecitos de pacientes hansenianos em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com ALA 100 microM S indiviacuteduos sem a doenccedila D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
48
65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
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ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
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ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
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ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
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65 Determinaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
A avaliaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica de SOD em pacientes hansenianos em uso de
PQT mostrou que o tratamento com o poliquimioteraacutepico natildeo alterou a atividade enzimaacutetica
da enzima (D4 1997 Umg proteiacutena plusmn 17 D5 197 Umg proteiacutena plusmn 37 D6 1973 Umg
proteiacutena plusmn 87 D7 2005 Umg proteiacutena plusmn 38) apresentando valores semelhantes aos
encontrados nos voluntaacuterios saudaacuteveis (1965 Umg proteiacutena plusmn 117)
O tratamento in vitro dos eritroacutecitos de pacientes em uso de PQT com o composto
RSV nas concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo modificou o desempenho enzimaacutetico de SOD
ao comparar com os resultados obtidos nos respectivos controles Os dados mostram que
somente as amostras de pacientes no 4ordm mecircs de uso de PQT apresentaram aumento
significativo de atividade da SOD em relaccedilatildeo ao mesmo grupo sem o antioxidante Esse
resultado foi visto tanto no tratamento com a concentraccedilatildeo de 100 microM de RSV (2091 Umg
proteiacutena plusmn 63) quanto com a concentraccedilatildeo de 500 microM (209 Umg proteiacutena plusmn 46) como visto
na Figura 18
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
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Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
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7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
49
Figura 18 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com RSV 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
A respeito do tratamento in vitro com ALA as concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo
alteraram o desempenho enzimaacutetico de SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em
uso de PQT visto que os resultados obtidos com a incubaccedilatildeo com o antioxidante
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
50
assemelharam-se aos valores obtidos sem a adiccedilatildeo de ALA em todos os grupos estudados
(Figura 19)
Figura 19 Atividade enzimaacutetica de SOD em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
51
66 Determinaccedilatildeo de atividade enzimaacutetica de CAT e efeitos do
tratamento in vitro com ALA e RSV
Sobre a atividade da enzima catalase (CAT) os hansenianos em uso de PQT
apresentaram diminuiccedilatildeo significativa da atividade de CAT a partir do quarto mecircs de
tratamento em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sem a doenccedila No entanto as concentraccedilotildees de
100 microM e 500 microM de RSV natildeo foram capazes de aumentar a atividade de CAT nos eritroacutecitos
de pacientes em uso de PQT apoacutes o tratamento in vitro (Figuras 20 e 21)
Figura 20 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 100 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
52
Figura 21 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo ao tratamento in vitro com RSV 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
Quanto ao tratamento de eritroacutecitos in vitro com ALA os resultados foram
semelhantes aos encontrados com o tratamento com RSV em todos os grupos analisados as
concentraccedilotildees de 100 e 500 microM natildeo alteraram a atividade de CAT em comparaccedilatildeo aos
mesmos grupos sem a adiccedilatildeo do antioxidante (Figura 22)
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
53
Figura 22 Atividade enzimaacutetica de CAT em eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease em uso de PQT em comparaccedilatildeo aos tratamentos in vitro com ALA 100 microM e 500 microM D4 amostra de paciente no 4ordm mecircs de uso de PQT D5 amostra de paciente no 5ordm mecircs de PQT D6 amostra de paciente no 6ordm mecircs de uso de PQT D7 amostra de paciente no 7ordm mecircs de uso de PQT Resultados expressos em meacutedia plusmn erro padratildeo (Teste T) plt005 comparado ao respectivo grupo controle plt001 comparado ao respectivo grupo controle
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
54
7 DISCUSSAtildeO
A investigaccedilatildeo de efeitos hemoliacuteticos decorrentes do tratamento para hanseniacutease eacute um
passo importante para a identificaccedilatildeo de possiacuteveis disfunccedilotildees hematoloacutegicas hereditaacuterias e
adoccedilatildeo de terapecircuticas que possam prevenir esses danos e trazer qualidade de vida aos
pacientes
Dois dos efeitos adversos da poliquimioterapia conhecidos por sua gravidade satildeo a
anemia hemoliacutetica e a metemoglobinemia Tais efeitos estatildeo relacionados com a dapsona
bacteriostaacutetico que integra o esquema de tratamento que em doses terapecircuticas produz os
compostos DDS-NOH e MADDS-NOH (CARRAZZA 1995) estes metaboacutelitos satildeo
conhecidos na literatura por sua hematoxicidade pois ao ligar-se agrave membrana eritrocitaacuteria
formam siacutetios antigecircnicos e ativam o sistema imunoloacutegico favorecendo a retirada precoce
dessas ceacutelulas por macroacutefagos e levando o indiviacuteduo a um quadro de anemia (COLEMAN
1995 BRADSHAW et al 1997 REILLY et al 1999 COLEMAN e HOLDEN 2004
BORDIN et al 2010) Consequentemente a anemia hemoliacutetica encontrada nesses pacientes eacute
caracterizada pela reticulocitose - resposta normal do organismo agrave perda de hemaacutecias no
sangue perifeacuterico ndash e diminuiccedilatildeo dos niacuteveis de hemoglobina e dos iacutendices hematimeacutetricos
HCM e CHCM (DHALIWAL et al 2002)
Nesse sentido o presente estudo mostrou que os pacientes com hanseniacutease em uso de
PQT a partir da 4ordf ateacute a 7ordf dose apresentaram diminuiccedilatildeo do nuacutemero de hemaacutecias e aumento
de reticuloacutecitos em ateacute trecircs vezes em comparaccedilatildeo aos indiviacuteduos sadios Dados da literatura
sugerem que esses efeitos hematoloacutegicos estatildeo associados ao tratamento com PQT visto que
pacientes com hanseniacutease sem tratamento apresentaram valores normais do nuacutemero de
hemaacutecias e reticuloacutecitos quando comparado aos indiviacuteduos saudaacuteveis (RANAWAKA et al
2008 DEPS et al 2012 AL-SIENI et al 2013)
A metemoglobinemia por sua vez estaacute ligada agrave incapacidade de transporte do
oxigecircnio pela hemoglobina quando o iacuteon ferro estaacute na forma oxidada Nesse estudo foi
observado que os pacientes em tratamento para hanseniacutease apresentaram percentual de
metemoglobina com valores proacuteximos de 5 a partir do quinto mecircs de uso da PQT iacutendice
que se manteve ateacute o seacutetimo mecircs de tratamento mostrando que a poliquimioterapia induziu
metemoglobinemia nesses pacientes Outros trabalhos desenvolvidos por nosso grupo como
os de Schalcher et al (2013) e Schalcher et al (2014) encontraram valores de metemoglobina
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
55
de pacientes hansenianos similares aos valores de indiviacuteduos sem a doenccedila e em estudo
posterior observaram o aumento da produccedilatildeo de MetHb em pacientes hansenianos apoacutes o
iniacutecio do tratamento com PQT sustentando a ideia de que o tratamento com a
poliquimioterapia induz o quadro de metemoglobinemia Segundo Oga (2008) com valores
de metemoglobina inferiores a 10 similar a este estudo o paciente pode apresentar sinais e
sintomas como cansaccedilo cefaleia e dores nos membros inferiores Os niacuteveis de metemoglobina
superiores a 30 satildeo acompanhados de sintomas como vertigem cefaleia ansiedade e
taquicardia e niacuteveis acima de 70 levam a convulsotildees arritmias e morte Esses sintomas
podem se intensificar quando haacute deficiecircncia de G-6-PD condiccedilatildeo essa jaacute relatada na literatura
(GROSSMAN et al 1995 RANAWAKA et al 2008)
Aleacutem das alteraccedilotildees hematoloacutegicas citadas o paciente hanseniano eacute acometido por
danos provocados pelo sistema imunoloacutegico em resposta agrave infecccedilatildeo As alteraccedilotildees na resposta
imune estatildeo associadas agraves distintas formas cliacutenicas apresentadas a presenccedila da resposta
celular define a forma cliacutenica mais branda da doenccedila (tuberculoide) e a ausecircncia desta a
forma mais severa (virchowiana MENDONCcedilA et al 2008) Os macroacutefagos primeira linha de
ceacutelulas atuantes no combate agrave infecccedilatildeo satildeo ativados e produzem oacutexido niacutetrico (NO) e outros
intermediaacuterios que reagem entre si para formar reativos mais toacutexicos no entanto NO eacute
rapidamente convertido em nitritos (NO2) e nitratos (NO3 MOHANTY et al 2007) Neste
trabalho natildeo houve diferenccedila na concentraccedilatildeo de nitritos encontrados em pacientes em
tratamento para hanseniacutease e a encontrada no grupo de indiviacuteduos saudaacuteveis indicando que a
PQT natildeo influencia a produccedilatildeo desse mediador
As concentraccedilotildees de NO e seus derivados tambeacutem estatildeo associadas ao aparecimento
de reaccedilotildees hansecircnicas tipo 1 e 2 em pacientes com hanseniacutease As reaccedilotildees hansecircnicas ou
estado reacionais satildeo descritas como fenocircmenos inflamatoacuterios agudos que podem ser
localizados ou sistecircmicos e que ocorrem antes durante ou apoacutes o tratamento da hanseniacutease
(MENDONCcedilA et al 2008) Nesse sentido Schoumln et al (1999) verificaram niacuteveis elevados dos
metaboacutelitos do NO em pacientes hansenianos reacionais tipo 1 em comparaccedilatildeo aos pacientes
hansenianos sem episoacutedios reacionais e indiviacuteduos sadios e Mohanty et al (2007) que
encontraram altos niacuteveis de metaboacutelitos de NO na urina de pacientes hansenianos
multibacilares reacionais tipo 2 antes da terapia com corticosteroides quando comparado aos
pacientes hansenianos sem estados reacionais e pacientes reacionais sem uso de corticoides
Esse elevado niacutevel do NO em pacientes reacionais sem uso de corticoide pode ser explicado
pela elevada carga bacilar (IB maior que 3) visto que vaacuterios estudos incluindo o divulgado
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
56
por nosso grupo jaacute relataram que o M leprae pode levar ao aumento de NO e que esse
mediador pode estar envolvidos nos danos neurais observados nos pacientes com hanseniacutease
(SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) Corroborando com os resultados
apontados por Schoumln et al (1999) e Mohanty et al (2007) os baixos niacuteveis de NO encontrados
nos pacientes de nosso estudo podem estar associados a vaacuterios aspectos tais como a baixa
carga bacilar encontrada nesses pacientes (IB entre 0 e 1) em sua maioria e sem histoacuterico de
estados reacionais assim como o pequeno nuacutemero de amostra dos grupos em tratamento e a
baixa sensibilidade da teacutecnica usada para detecccedilatildeo desse radical
A produccedilatildeo de EROs com potencial antimicrobiano para o M leprae pode se difundir
para aleacutem dos locais de infecccedilatildeo e afetar os constituintes lipiacutedicos de membrana em especial
os aacutecidos graxos poli-insaturados que satildeo degradados e formam malondialdeiacutedo (MDA
TRIMBAKE et al 2013) Quando a defesa antioxidante eacute baixa haacute maior propensatildeo agrave
instalaccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica nestas condiccedilotildees o MDA constitui um dos principais
indicadores de danos celulares provocados pela accedilatildeo de EROs
Os pacientes multibacilares tendem a apresentar maior dano celular em oacutergatildeos e
tecidos como evidenciado nos trabalhos de Vijayaraghavan et al (2009) que identificou
niacuteveis de MDA semelhantes em pacientes MB sem tratamento e em uso de PQT e de Abdel-
Hafez et al (2010) no qual os pacientes MB apresentaram niacuteveis seacutericos de MDA mais
elevados que os pacientes PB Esses resultados se contrapotildeem aos encontrados por nosso
grupo que relatou recentemente que os niacuteveis de MDA em pacientes hansenianos natildeo satildeo
alterados com o uso da PQT (SCHALCHER et al 2013 SCHALCHER et al 2014) No
presente estudo o nuacutemero amostral reduzido e pouca sensibilidade do meacutetodo resultaram em
baixos niacuteveis de MDA nos pacientes hansenianos dando falsa sugestatildeo que o PQT natildeo induz
dano a membrana celular e natildeo eleva a peroxidaccedilatildeo lipiacutedica em oacutergatildeos e tecidos
Para conter o avanccedilo de EROs e seus efeitos deleteacuterios em macromoleacuteculas o
organismo dispotildee de um elaborado sistema antioxidante formado por componentes
enzimaacuteticos e natildeo-enzimaacuteticos estes elementos conseguem promover o balanccedilo redox quando
o sistema se expotildee temporariamente agraves EROs e ERNs Dentre outros componentes o sistema
natildeo-enzimaacutetico compreende elementos hidrossoluacuteveis (por exemplo ascorbato urato
flavonoides e glutationa) e componentes lipossoluacuteveis (como os tocoferois carotenoides e
ubiquinol) e o sistema enzimaacutetico conta com as defesas primaacuterias (SOD CAT GPx) e
secundaacuterias a exemplo da GR e da G-6-PD (RATNAM et al 2006)
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
57
A SOD compreende uma famiacutelia de enzimas com capacidade de dismutar O2- em
H2O2 e oxigecircnio e a presenccedila das formas mitocondrial citosoacutelica e extracelular de SOD no
organismo amplia a capacidade de captaccedilatildeo desse radical e evita possiacuteveis danos teciduais
No presente estudo a atividade dessa enzima natildeo apresentou alteraccedilatildeo nos pacientes
hansenianos em uso de PQT durante o periacuteodo de quatro meses e nem em comparaccedilatildeo com
indiviacuteduos sadios
A reduccedilatildeo das taxas de H2O2 produzidas nos processos endoacutegenos envolve a accedilatildeo de
uma terceira enzima aleacutem do complexo GSH-GPx e da CAT As peroxiredoxinas (Prx) satildeo a
terceira classe de enzimas mais abundantes nos eritroacutecitos apresentam sensibilidade a
pequenas quantidades de H2O2 e protegem a Hb da oxidaccedilatildeo endoacutegena aleacutem de promover a
retirada de hidroperoacutexidos presentes na membrana eritrocitaacuteria (LOW et al 2007) Estudos
apontam que a ausecircncia de Prx2 em ratos promoveu o desenvolvimento de anemia hemoliacutetica
com danos oxidativos em eritroacutecitos (LEE et al 2003) e que o metabolismo de peroacutexidos no
organismo natildeo eacute exclusivo de CAT e Gpx mas requer accedilatildeo de Prx (LOW et al 2003
JOHNSON et al 2005) O baixo niacutevel de atividade de CAT verificado nesse estudo pode estar
relacionado agrave maior accedilatildeo de Prx uma vez que a accedilatildeo de CAT eacute dependente das concentraccedilotildees
de H2O2 Aleacutem disso fatores ligados agrave proacutepria doenccedila e a falta de uma dieta alimentar
adequada podem reduzir elementos essenciais para a manutenccedilatildeo da defesa antioxidante
assim como diminuir a funccedilatildeo enzimaacutetica como verificado por Vijayaraghavan et al (2005) e
Vijayaraghavan e Paneerselvam (2011)
Nesse sentido as buscas por antioxidantes mais potentes tecircm norteado as pesquisas
nas uacuteltimas deacutecadas assim como desvendar seus complexos mecanismos de accedilatildeo De maneira
geral os antioxidantes podem reduzir o dano oxidativo diretamente reagindo com espeacutecies
reativas radicalares e natildeo radicalares ou de forma indireta por duas formas inibiccedilatildeo da
atividade ou de expressatildeo de enzimas geradoras de EROs e com a ativaccedilatildeo da atividade de
enzimas antioxidantes intracelulares ou elevaccedilatildeo da atividade enzimaacutetica destas (LUuml et al
2012)
O RSV eacute um polifenol encontrado em uvas amoras e vinho tinto que tem despertado a
atenccedilatildeo de pesquisadores pelos inuacutemeros benefiacutecios aos organismos vivos desde plantas a
mamiacuteferos Relata-se que esse composto atua na inibiccedilatildeo da agregaccedilatildeo plaquetaacuteria na
modulaccedilatildeo do metabolismo lipiacutedico na inibiccedilatildeo da peroxidaccedilatildeo lipiacutedica e na vasodilataccedilatildeo
aleacutem de ter atividades antitumoral e estrogecircnica Como antioxidante o RSV tem reduzida
accedilatildeo direta sobre radicais superoacutexido hidroxila e na formaccedilatildeo de radicais induzida por
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
58
metais no entanto os efeitos protetores deste satildeo atribuiacutedos agrave regulaccedilatildeo positiva da expressatildeo
dos antioxidantes endoacutegenos (FREacuteMONT 2000 SPANIER et al 2009) Por sua vez ALA eacute
encontrado no organismo de eucariontes e participa como cofator no metabolismo da glicose
reduz compostos antioxidantes em sua forma oxidados (como a GSH e as vitaminas C e E) e
vaacuterios estudos comprovam a capacidade de sequestro dos radicais hidroxila aacutecido
hipocloroso e oxigecircnio singlete (PACKER et al 1995)
A accedilatildeo de antioxidantes sobre o Fe2+
ligado agrave hemoglobina assim como na sua forma
livre na circulaccedilatildeo sanguiacutenea eacute de fundamental importacircncia para a quebra do ciclo vicioso
Hb-MetHb-Hb com depleccedilatildeo de antioxidantes endoacutegenos e para impedir a formaccedilatildeo de
metemoglobina e de outros elementos mais toacutexicos atraveacutes das reaccedilotildees de Fenton e Haber-
Weiss nas quais os metais exercem funccedilatildeo de catalisadores Nesse sentido o presente
trabalho mostrou que somente houve accedilatildeo antioxidante de RSV e ALA frente ao Fe3+
quando
utilizados na concentraccedilatildeo de 100 microM e em um seleto grupo de amostras
Os mecanismos de accedilatildeo dos antioxidantes utilizados frente a metais de transiccedilatildeo
diferem entre si como os polifenois que tem na sua estrutura quiacutemica a presenccedila de muitos
grupos hidroxila que apresentam facilidade de doar H+ aos iacuteons HOO
- HO e O2
-
inativando-os (SCHMATZ 2011) Mecanismo semelhante eacute visto em fenocircmenos apoptoacuteticos
induzidos pelo RSV onde se formam complexos ternaacuterios DNA-RSV-Cu2+
que facilitam a
clivagem do DNA No entanto alguns trabalhos apontam que o RSV natildeo atua sobre iacuteons Fe3+
restringindo a accedilatildeo antioxidante do RSV somente a iacuteons Cu2+
(RICE-EVANS et al 1997
FREacuteMONT 2000 LASTRA e VILLEGAS 2007 MIURA et al 2008) Por outro lado os
efeitos quelantes de ALA e DHLA satildeo controversos visto que ambos formam complexos
estaacuteveis com metais permitindo uma faacutecil eliminaccedilatildeo de metais pesados dos sistemas
bioloacutegicos Enquanto ALA tem afinidade para quelar Mn2+
Cu2+
Zn2+
e Pb2+
sua forma
reduzida desempenha funccedilotildees quelanteredutor frente aos iacuteons Co2+
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Pb2+
e
Hg2+
aleacutem de formar complexos mais estaacuteveis com Fe3+
que os formados com Fe2+
(BIEWENGA et al 1997 NAVARI-IZZO et al 2002)
Alguns estudos levantam a hipoacutetese de que ALA e DHLA tecircm accedilatildeo reduzida em
situaccedilotildees onde haacute preacutevia formaccedilatildeo de metemoglobina e que o preacute-tratamento com
antioxidantes pode prevenir o estresse oxidativo causado por agentes oxidantes O estudo de
Coleman e Walker (2000) verificou que a utilizaccedilatildeo de ALA 1 mM favoreceu a formaccedilatildeo de
MetHb in vitro em eritroacutecitos de pacientes diabeacuteticos - os quais satildeo propensos a formar
metemoglobina - expostos ao metaboacutelito MADDS-NOH 01 mM por 5 10 e 15 min mesmo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
59
com preacutevia incubaccedilatildeo do antioxidante por uma hora Em outro trabalho envolvendo a reduccedilatildeo
da formaccedilatildeo de MetHb in vitro com o uso de antioxidantes em tempos de 30 60 e 120 min de
incubaccedilatildeo Coleman e Taylor (2003) observaram que ALA 1mM somente conseguiu reduzir a
formaccedilatildeo de MetHb in vitro apoacutes o preacute-tratamento de eritroacutecitos e apoacutes a administraccedilatildeo
simultacircnea com DDS 015 mM no tempo de 120 min no entanto os mesmos autores
relataram que DHLA na mesma concentraccedilatildeo de 1 mM apresentou maior efeito redutor que
seu precursor no preacute-tratamento de eritroacutecitos e na administraccedilatildeo simultacircnea com DDS 015
mM nos trecircs tempos observados
Em situaccedilotildees de desequiliacutebrio redox o balanccedilo na atividade de SOD e CAT se faz
essencial na regulaccedilatildeo dos niacuteveis dos radicais superoacutexido e H2O2 nas ceacutelulas visto que
detoxificam estes reativos e evitam a formaccedilatildeo e acuacutemulo de radical hidroxila extremamente
deleteacuterio para macromoleacuteculas O presente trabalho mostrou que em relaccedilatildeo agrave SOD as
concentraccedilotildees de 100 microM e 500 microM de RSV aumentaram a atividade enzimaacutetica de SOD
somente em amostras de indiviacuteduos sem a doenccedila e em amostras de pacientes no 4ordm mecircs de
tratamento para hanseniacutease enquanto a atividade foi mantida nas demais doses terapecircuticas
ALA 100 microM estimulou a atividade enzimaacutetica em amostras de indiviacuteduos sadios e em
amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT para hanseniacutease e a concentraccedilatildeo de 500 microM
aumentou a atividade de SOD em amostras de pacientes hansenianos no 5ordm mecircs de tratamento
poliquimioteraacutepico aleacutem dos grupos estimulados com ALA 100 microM Ao avaliar a atividade
de CAT os antioxidantes RSV e ALA diminuiacuteram a funccedilatildeo enzimaacutetica em amostras de
indiviacuteduos sadios nas duas concentraccedilotildees utilizadas no entanto as concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM de ambos os antioxidantes mantiveram a atividade de CAT nos pacientes em
tratamento para hanseniacutease
Estudos mostram que o up-regulation da atividade enzimaacutetica de enzimas
antioxidantes pode auxiliar na profilaxia ou tratamento de distuacuterbios metaboacutelicos que tenham
como ponto de partida a elevaccedilatildeo de EROs aleacutem de facilitar a remoccedilatildeo de radicais lesivos
conferir resistecircncia ao estresse oxidativo e aumentar a sobrevida de indiviacuteduos (MOKNI et al
2007) Haacute relatos de que os antioxidantes RSV e ALA possam atuar indiretamente na
regulaccedilatildeo da expressatildeo gecircnica ao interagir com o fator nuclear NF-κB o qual eacute relacionado
com a expressatildeo de inuacutemeros mecanismos antioxidantes (PACKER 1995) Contudo a
regulaccedilatildeo positiva ou negativa desses antioxidantes eacute dependente dos tipos celulares da
concentraccedilatildeo utilizada e do tempo de exposiccedilatildeo Neste trabalho as particularidades do estudo
in vitro natildeo permitem avaliar de fato a atividade de regulaccedilatildeo enzimaacutetica de RSV e ALA
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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SCHMATZ R Efeitos do resveratrol do suco de uva e do vinho tinto nos biomarcadores de
estresse oxidativo e na atividade de ectoenzimas em ratos diabeacuteticos 2011 144 f Tese
(Doutorado) ndash Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Bioquiacutemica
Toxicoloacutegica Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2011
SCHOumlN T GEBRE N SUNDGVIST T HABETMARIAM H S ENGEDA T
BRITTON S Increased levels of nitric oxide metabolites in urine from leprosy patients in
reversal reaction Leprosy Review v 70 n 1 pp 52-55 1999
SMITH J E Erythrocyte membrane structure function and pathophysiology Vet Pathol v
24 pp 471-476 1987
SPANIER G XU H XIA N TOBIAS S DENG S WOJNOWSKI L
FORSTERMANN U LI H Resveratrol reduces endothelial oxidative stress by modulating
the gene expression of superoxide dismutase 1 (sod1) glutathione peroxidase 1 (gpx1) and
NADPH oxidase subunit (nox4) Journal of Physiology and Pharmacology v 60 suppl 4
pp 111-116 2009
SUZUKI K AKAMA T KAWASHIMA A YOSHIHARA A YOTSU R R ISHII N
Current status of leprosy Epidemiology basic science and clinical perspectives Journal of
Dermatology n 39 pp 121-129 2012
SZELAG M MIKULSKI D MOLSKI M Quantum-chemical investigation of the
structure and the antioxidant properties of alpha-lipoic acid and its metabolites Journal of
Molecular Modeling vol 18 n 7 pp 2907-2916 2011
TRIMBAKE S B SONTAKKE A N DHAT V V Oxidative stress and antioxidant
vitamins in leprosy International Journal of Research in Medical Sciences v 1 n 3 pp
226-229 2013
VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN M T D MAZUR M TELSER J
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology v 39 pp 44-84 2007
VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
enzime abnormalities of glycolysis Blood v 106 n 13 pp 4034-4042 2005
VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
liver Life Sciences v 83 pp 155-163 2008
VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
60
visto que eritroacutecitos natildeo apresentam capacidade biossinteacutetica e um estudo in vivo certamente
permitiria essa avaliaccedilatildeo com maior clareza
Visto que os antioxidantes estudados satildeo sugestatildeo de terapecircutica para minimizar os
danos toacutexicos causados pelo tratamento vigente para o combate da hanseniacutease e pela produccedilatildeo
de reativos toacutexicos causados pela doenccedila per se estudos posteriores satildeo necessaacuterios no intuito
de avaliar modelos experimentais que reproduzam melhor as condiccedilotildees in vivo e verificar
accedilotildees antioxidantes de RSV e ALA tempo-dependentes nas doenccedilas infecciosas crocircnicas
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
63
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64
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Baacutesica - 2 ed rev - Brasiacutelia Ministeacuterio da Sauacutede 2008
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Poliacuteticas de Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
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SCHMATZ R Efeitos do resveratrol do suco de uva e do vinho tinto nos biomarcadores de
estresse oxidativo e na atividade de ectoenzimas em ratos diabeacuteticos 2011 144 f Tese
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TRIMBAKE S B SONTAKKE A N DHAT V V Oxidative stress and antioxidant
vitamins in leprosy International Journal of Research in Medical Sciences v 1 n 3 pp
226-229 2013
VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN M T D MAZUR M TELSER J
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology v 39 pp 44-84 2007
VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
enzime abnormalities of glycolysis Blood v 106 n 13 pp 4034-4042 2005
VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
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VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
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ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
61
CONCLUSAtildeO
A partir dos resultados pode-se concluir que
Os pacientes que fazem uso de poliquimioterapia para hanseniacutease apresentaram
alteraccedilotildees nos paracircmetros hematoloacutegicos como diminuiccedilatildeo nos valores de hemaacutecias e
aumento na porcentagem de reticuloacutecitos o que reforccedila os efeitos hemoliacuteticos da
administraccedilatildeo do tratamento poliquimioteraacutepico
O reduzido nuacutemero amostral da pesquisa e a baixa sensibilidade das teacutecnicas para
determinaccedilatildeo de MDA e nitritos resultaram em valores subestimados desses analitos
nos pacientes estudados
O percentual de metemoglobina aumentou nos pacientes hansenianos durante os meses
de tratamento com PQT O tratamento com RSV e ALA nas concentraccedilotildees de 100 microM
e 500 microM natildeo alterou o percentual de MetHb em amostras de pacientes que estavam
entre o 4ordm e 6ordm mecircs de uso de PQT no entanto potencializou a formaccedilatildeo de MetHb nas
amostras referentes agrave 7ordf dose de tratamento com PQT
Observou-se nos pacientes hansenianos uma atividade de SOD similar ao controle e
uma decrescida atividade de CAT esta possivelmente diminuiacuteda pela accedilatildeo de enzimas
secundaacuterias como a Prx
O tratamento com RSV na concentraccedilatildeo de 100 microM elevou em duas vezes a atividade
de SOD somente em amostras de pacientes na 4ordf dose de PQT a concentraccedilatildeo de 500
microM de RSV assim como as concentraccedilotildees de ALA natildeo alteraram a atividade
enzimaacutetica de CAT e SOD nos eritroacutecitos de pacientes com hanseniacutease
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
gastrintestinais hepatite medicamentosa hipersensibilidade agrave dapsona metemoglobinemia
anemia) e por muitas vezes vista pelos pacientes como causa das complicaccedilotildees decorrentes da
doenccedila No entanto os eventos que ocorrem na hanseniacutease e durante a poliquimioterapia satildeo
eventos multifatoriais envolvendo mecanismos de resistecircncia do bacilo a resposta imune do
hospedeiro e a accedilatildeo da poliquimioterapia no combate ao patoacutegeno Desta forma vale ressaltar
a importacircncia de estudos com novas alternativas terapecircuticas com menor toxicidade e que
possam melhorar a vida do paciente principalmente com diminuiccedilatildeo dos efeitos adversos e
das complicaccedilotildees neuro-imunoloacutegicas ocasionadas pela patologia e pela poliquimioterapia
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REFEREcircNCIAS
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64
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Tuberculose Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Atenccedilatildeo a Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
Baacutesica - 2 ed rev - Brasiacutelia Ministeacuterio da Sauacutede 2008
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Poliacuteticas de Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
62
PERSPECTIVAS
A poliquimioterapia para hanseniacutease eacute a barreira mais eficaz contra o avanccedilo da
infecccedilatildeo pelo Mycobacterium leprae apesar de ser conhecida pelos diversos efeitos colaterais
causados ao longo do tratamento (alteraccedilatildeo da pigmentaccedilatildeo da pele distuacuterbios
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70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
63
REFEREcircNCIAS
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VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
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VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
liver Life Sciences v 83 pp 155-163 2008
VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
64
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Atenccedilatildeo agrave Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
Baacutesica Vigilacircncia em Sauacutede Dengue Esquistossomose Hanseniacutease Malaacuteria Tracoma e
Tuberculose Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Atenccedilatildeo a Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
Baacutesica - 2 ed rev - Brasiacutelia Ministeacuterio da Sauacutede 2008
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Poliacuteticas de Sauacutede Departamento de Atenccedilatildeo
Baacutesica Dermatologia na Atenccedilatildeo Baacutesica Ministeacuterio da Sauacutede Secretaria de Poliacuteticas de
Sauacutede- 1ordf ediccedilatildeo - Brasiacutelia Ministeacuterio da Sauacutede 2002 (Seacuterie Cadernos de Atenccedilatildeo Baacutesica
n 09) - (Seacuterie A Normas e Manuais Teacutecnicos n 174)
BRASIL Ministeacuterio da Sauacutede Fundaccedilatildeo Osvaldo Cruz Memento Terapecircutico Brasiacutelia
Ministeacuterio da Sauacutede 2006 (Seacuterie B Textos Baacutesicos de Sauacutede)
BRUNTON L L PARKER K L BLUMENTAL D K BUXTON I L O Goodman e
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CARRAZZA M Z N A metemoglobinemia e a dapsonemia como indicadores na
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em Toxicologia Universidade de Satildeo Paulo Satildeo Paulo 1998
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390 pp 1-11 2008
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249 1992
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26 n 7 pp 1461-1467 1995
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2003
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2004
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F LATRUFFE N Transport stability and biological activity of resveratrol Annals of The
New York Academy of Sciences v 1215 pp 48-59 2011
DROumlGE W Free radicals in the phisiological control of cell function Physiology Review v
82 pp 47-95 2002
FREacuteMONT L Biological effects of resveratrol Life Sciences v 66 n 8 pp 663-673 2000
65
GOLBIDI S MOHAMMAD B LAHER I Diabetes and alpha lipoic acid Frontiers in
Pharmacology v 2 n 69 2011
GOULART I M B ARBEX G L CARNEIRO M H RODRIGUES M S GADIA R
Efeitos adversos da poliquimioterapia em pacientes com hanseniacutease um levantamento de
cinco anos em um Centro de Sauacutede da Universidade Federal de Uberlacircndia Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical v 35 n5 pp 453-460 set-out 2002
GREBOGI I H Obtenccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de complexos binaacuterios e ternaacuterios da dapsona
2009 98 f Dissertaccedilatildeo (mestrado) - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas
Universidade Federal do Paranaacute Curitiba 2009
GRANGER DL ANSTEY NM MILLER WC WEINBERG JB Measuring nitric
oxide production in human clinical studies Methods in Enzymology v301 pp49-61 1999
GROSSMAN S J SIMSON J JOLLOW D J Dapsone-induced hemolytic anemia effect
on N-hydroxy dapsone on the sulfhydryl status and membrane proteins of rat erythrocytes
Toxicology and Applied Pharmacology v 117 pp 208-217 1992
HALIM NKD OGBEIDE E Haematological alterations in leprosy pacientes treated with
dapsone East African Medical Journal v 79 n 2 pp 100-102 2002
HARRIS E D Regulation of antioxidant enzymes FASEB Journal vol 6 pp 2675-2683
1992
INAL M E EGuumlZ A M The effects of isosorbide dinitrate on methemoglobin reductase
enzyme activity and antioxidant states Cell Biochemistry and Function vol 22 pp 129-
133 2004
JOHNSON RM GOYETTEG JR RAVINDRANATH Y HO Y-S Hemoglobin
autoxidation and regulation of endogenous H2O2 levels in erythrocytes Free Radicals
Biology and Medicine v 39 pp 1407-1417 2005
KANIAS T ACKER J P Biopreservation of red blood cells - the struggle with hemoglobin
oxidation FEBS Journal v 277 pp 343-356 2010
KARAKOYUN B YuumlKSEL M ERCAN F ERZIK C YEGEN B Ccedil Alpha-Lipoic
Acid Improves Acetic Acid-Induced Gastric Ulcer Healing in Rats Inflammation v 32 n 1
February 2009
LEE T -H KIM S -U YU S -L KIM S H PARK D S MOON H -B DHO S H
KWON K -S KWON H J HAN Y -H JEONG S KANG S W SHIN H -S LEE
K -K RHEE S G YU D -Y Peroxiredoxin II is essential for sustaining life span of
erythrocytes in mice Blood v 101 pp 5033ndash5038 2003
LIMA C S Mecanismos de patogenia do Mycobacterium lepra anaacutelise de proteiacutenas
extracelulares e efeitos sobre o metabolismo lipiacutedico do hospedeiro 2008 157 f Tese
66
(Doutorado) - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular Instututo
Oswaldo Cruz Rio de Janeiro 2008
LIMA E S ROLAND I A MAROJA M F MARCON J L Vitamin A and lipid
peroxidation in patients with differents forms of leprosy Revista do Instituto de Medicina
Tropical de S Paulo v 49 n 4 pp 211-214 July-August 2007
LIMA L W O Avaliaccedilatildeo imunohistoquiacutemica da atividade macrofaacutegica e sua relaccedilatildeo com o
fenocircmeno de apoptose na hanseniacutease 2008 92 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitaacuterios Universidade Federal do Paraacute
Beleacutem 2008
LOW F M HAMPTON M B PESKIN A V WINTERBOURN C C Peroxredoxin 2
functions as a noncatalytic scavenger of low-level hydrogen peroxide in the erythrocyte
Blood v 109 pp 2611-2617 2007
LUuml J M LIN P H YAO Q CHEN C Chemical and molecular mechanisms of
antioxidants Experimental approaches and model systems J Cell Mol Med v 14 n 4 pp
840ndash860 2010
MARTINS MASSG O eritroacutecito como indicador de stress in vivo no exerciacutecio fiacutesico e
nas doenccedilas cardiovasculares 1995 235 f Tese (Doutorado) - Faculdade de Farmaacutecia da
Universidade do Porto 1995
MANKELOW T J SATCHWELL T J BURTON N M Refined views of multi-protein
complexes in the erythrocyte membrane Blood Cells Molecules and Dieseases v 49 pp
1-10 2012
MC CORD J M FRIDOVICH I Superoxide dismutase an enzymic function for
erythrocuprein (hemocuprein) The Journal of Biological Chemistry v244 n2 p6049-
6055 Nov1969
MELLO M H N-acetilcisteiacutena e dapsona avaliaccedilatildeo da toxicidade hematoloacutegica e
bioquiacutemica em ratos Wistar 2005 117 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado) - programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Toxicologia Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2005
MENDONCcedilA VA COSTA R D BRITO-MELO G E ANTUNES C M TEIXEIRA
A L Imunologia da hanseniacutease Anais Brasileiros de Dermatologia v 83 n 4 pp 343-
350 2008
MIURA T MURAOKA S IKEDA N WATANABE M FUJIMOTO Y Antioxidative
and prooxidative action of stilbene derivatives Pharmacology amp Toxicology v 86 pp 203-
208 2000
MOHANTY K K GUPTA M GIRDHAR B K GIRDHAR A CHAKMA J K
SENGUPTA U Increased level of urinary patients during Type 2 reactions and decreased
after antireactional therapy Leprosy Review v 78 pp 386-390 2007
67
MORAES N V MELLO M H SOUZA A M SAMPAIO S V QUEIROZ R H C
Potencializaccedilatildeo do efeito metemoglobinizante da dapsona em ratos pela N-acetilcisteiacutena
Revista brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas v 44 n 1 janmar 2008
NAVARI-IZZO F QUARTACCI M F SGHERRI C Lipoic acid a unique antioxidant in
the detoxification of activated oxygen species Plant Physiology and Biochemistry v 40
pp 463-470 2002
OGA S CAMARGO M M A BATISTUZZO J A O Fundamentos da Toxicologia 3ordf
ed Satildeo Paulo Atheneu 2008
OHKAWA H OHISHI M YAGI K Assay for lipid peroxides in animal tissues by
thiobarbituric acid reaction Analytical Biochemistry v 95 pp 351-358 1979
OLIVEIRA S SALDANHA C An overview about erythrocyte membrane Clinical
Hemorheology and Microcirculation v 44 pp 63-74 2010
OPROMOLLA D V A Noccedilotildees de hansenologia Bauru Centro de Estudos Dr Reynaldo
Quagliato 2000
PACKER L WITT E H TRITSCHLER H J Alpha-lipoic acid as a biological
antioxidant Free Radical Biology amp Medicine v 19 n 2 pp 227-250 1995
PANTALEO A DE FRANCESCI L FERRU E VONO R TURRINI F Current
knowledge about the functional roles of phosphorylative changes of membrane proteins in
normal and diseases red cells Journal of Proteomics v 73 pp 445-455 2010
RANAWAKA R R MENDIS S WEERAKOON H S Dapsone-induced haemolytic
anaemia hepatitis and agranulocytosis in a leprosy patient with normal glucose-6-phosphate-
dehydrogenase activity Leprosy Review v 79 pp 436-438 2008
RATMAN D V ANKOLA D D BHARDWAJ V SAHANA D K RAVI KUMAR
M N V Role of antioxidants in prophyilaxis and therapy A pharmaceutical perspective
Journal of Controlled Release v 113 pp 189-207 2006
REIS NETO E T NEVES JUacuteNIOR M T PUCCINELLI M L SATO E I Dapsona no
tratamento do luacutepus eritematoso sistecircmico com manifestaccedilotildees cutacircneas relato de dois casos e
uma breve revisatildeo de literatura Sinopse de Reumatologia n 3 pp 72-81 set 2006
RICE-EVANS C A MILLER N J PAGANGA G Antioxidant properties of phenolic
compounds Trends in Plant Science v 2 n 4 pp 152-159 1997
RODRIGUES L C LOCKHOOD D N J Leprosy now epidemiology progress
challenges and research gaps Lancet Infectiology Diseases v 11 pp 464-470 2011
SAUTTER C K DENARDIN S ALVES A O MALLMANN C A PENNA N G
HECKTHEUER L H Determinaccedilatildeo de resveratrol em sucos de uva no Brasil Ciecircncia e
Tecnologia de Alimentos v 25 n 3 pp 437-442 2005
68
SCHMATZ R Efeitos do resveratrol do suco de uva e do vinho tinto nos biomarcadores de
estresse oxidativo e na atividade de ectoenzimas em ratos diabeacuteticos 2011 144 f Tese
(Doutorado) ndash Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Bioquiacutemica
Toxicoloacutegica Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2011
SCHOumlN T GEBRE N SUNDGVIST T HABETMARIAM H S ENGEDA T
BRITTON S Increased levels of nitric oxide metabolites in urine from leprosy patients in
reversal reaction Leprosy Review v 70 n 1 pp 52-55 1999
SMITH J E Erythrocyte membrane structure function and pathophysiology Vet Pathol v
24 pp 471-476 1987
SPANIER G XU H XIA N TOBIAS S DENG S WOJNOWSKI L
FORSTERMANN U LI H Resveratrol reduces endothelial oxidative stress by modulating
the gene expression of superoxide dismutase 1 (sod1) glutathione peroxidase 1 (gpx1) and
NADPH oxidase subunit (nox4) Journal of Physiology and Pharmacology v 60 suppl 4
pp 111-116 2009
SUZUKI K AKAMA T KAWASHIMA A YOSHIHARA A YOTSU R R ISHII N
Current status of leprosy Epidemiology basic science and clinical perspectives Journal of
Dermatology n 39 pp 121-129 2012
SZELAG M MIKULSKI D MOLSKI M Quantum-chemical investigation of the
structure and the antioxidant properties of alpha-lipoic acid and its metabolites Journal of
Molecular Modeling vol 18 n 7 pp 2907-2916 2011
TRIMBAKE S B SONTAKKE A N DHAT V V Oxidative stress and antioxidant
vitamins in leprosy International Journal of Research in Medical Sciences v 1 n 3 pp
226-229 2013
VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN M T D MAZUR M TELSER J
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology v 39 pp 44-84 2007
VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
enzime abnormalities of glycolysis Blood v 106 n 13 pp 4034-4042 2005
VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
liver Life Sciences v 83 pp 155-163 2008
VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
65
GOLBIDI S MOHAMMAD B LAHER I Diabetes and alpha lipoic acid Frontiers in
Pharmacology v 2 n 69 2011
GOULART I M B ARBEX G L CARNEIRO M H RODRIGUES M S GADIA R
Efeitos adversos da poliquimioterapia em pacientes com hanseniacutease um levantamento de
cinco anos em um Centro de Sauacutede da Universidade Federal de Uberlacircndia Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical v 35 n5 pp 453-460 set-out 2002
GREBOGI I H Obtenccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo de complexos binaacuterios e ternaacuterios da dapsona
2009 98 f Dissertaccedilatildeo (mestrado) - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Farmacecircuticas
Universidade Federal do Paranaacute Curitiba 2009
GRANGER DL ANSTEY NM MILLER WC WEINBERG JB Measuring nitric
oxide production in human clinical studies Methods in Enzymology v301 pp49-61 1999
GROSSMAN S J SIMSON J JOLLOW D J Dapsone-induced hemolytic anemia effect
on N-hydroxy dapsone on the sulfhydryl status and membrane proteins of rat erythrocytes
Toxicology and Applied Pharmacology v 117 pp 208-217 1992
HALIM NKD OGBEIDE E Haematological alterations in leprosy pacientes treated with
dapsone East African Medical Journal v 79 n 2 pp 100-102 2002
HARRIS E D Regulation of antioxidant enzymes FASEB Journal vol 6 pp 2675-2683
1992
INAL M E EGuumlZ A M The effects of isosorbide dinitrate on methemoglobin reductase
enzyme activity and antioxidant states Cell Biochemistry and Function vol 22 pp 129-
133 2004
JOHNSON RM GOYETTEG JR RAVINDRANATH Y HO Y-S Hemoglobin
autoxidation and regulation of endogenous H2O2 levels in erythrocytes Free Radicals
Biology and Medicine v 39 pp 1407-1417 2005
KANIAS T ACKER J P Biopreservation of red blood cells - the struggle with hemoglobin
oxidation FEBS Journal v 277 pp 343-356 2010
KARAKOYUN B YuumlKSEL M ERCAN F ERZIK C YEGEN B Ccedil Alpha-Lipoic
Acid Improves Acetic Acid-Induced Gastric Ulcer Healing in Rats Inflammation v 32 n 1
February 2009
LEE T -H KIM S -U YU S -L KIM S H PARK D S MOON H -B DHO S H
KWON K -S KWON H J HAN Y -H JEONG S KANG S W SHIN H -S LEE
K -K RHEE S G YU D -Y Peroxiredoxin II is essential for sustaining life span of
erythrocytes in mice Blood v 101 pp 5033ndash5038 2003
LIMA C S Mecanismos de patogenia do Mycobacterium lepra anaacutelise de proteiacutenas
extracelulares e efeitos sobre o metabolismo lipiacutedico do hospedeiro 2008 157 f Tese
66
(Doutorado) - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular Instututo
Oswaldo Cruz Rio de Janeiro 2008
LIMA E S ROLAND I A MAROJA M F MARCON J L Vitamin A and lipid
peroxidation in patients with differents forms of leprosy Revista do Instituto de Medicina
Tropical de S Paulo v 49 n 4 pp 211-214 July-August 2007
LIMA L W O Avaliaccedilatildeo imunohistoquiacutemica da atividade macrofaacutegica e sua relaccedilatildeo com o
fenocircmeno de apoptose na hanseniacutease 2008 92 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado) ndash Programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitaacuterios Universidade Federal do Paraacute
Beleacutem 2008
LOW F M HAMPTON M B PESKIN A V WINTERBOURN C C Peroxredoxin 2
functions as a noncatalytic scavenger of low-level hydrogen peroxide in the erythrocyte
Blood v 109 pp 2611-2617 2007
LUuml J M LIN P H YAO Q CHEN C Chemical and molecular mechanisms of
antioxidants Experimental approaches and model systems J Cell Mol Med v 14 n 4 pp
840ndash860 2010
MARTINS MASSG O eritroacutecito como indicador de stress in vivo no exerciacutecio fiacutesico e
nas doenccedilas cardiovasculares 1995 235 f Tese (Doutorado) - Faculdade de Farmaacutecia da
Universidade do Porto 1995
MANKELOW T J SATCHWELL T J BURTON N M Refined views of multi-protein
complexes in the erythrocyte membrane Blood Cells Molecules and Dieseases v 49 pp
1-10 2012
MC CORD J M FRIDOVICH I Superoxide dismutase an enzymic function for
erythrocuprein (hemocuprein) The Journal of Biological Chemistry v244 n2 p6049-
6055 Nov1969
MELLO M H N-acetilcisteiacutena e dapsona avaliaccedilatildeo da toxicidade hematoloacutegica e
bioquiacutemica em ratos Wistar 2005 117 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado) - programa de Poacutes-
Graduaccedilatildeo em Toxicologia Universidade de Satildeo Paulo Ribeiratildeo Preto 2005
MENDONCcedilA VA COSTA R D BRITO-MELO G E ANTUNES C M TEIXEIRA
A L Imunologia da hanseniacutease Anais Brasileiros de Dermatologia v 83 n 4 pp 343-
350 2008
MIURA T MURAOKA S IKEDA N WATANABE M FUJIMOTO Y Antioxidative
and prooxidative action of stilbene derivatives Pharmacology amp Toxicology v 86 pp 203-
208 2000
MOHANTY K K GUPTA M GIRDHAR B K GIRDHAR A CHAKMA J K
SENGUPTA U Increased level of urinary patients during Type 2 reactions and decreased
after antireactional therapy Leprosy Review v 78 pp 386-390 2007
67
MORAES N V MELLO M H SOUZA A M SAMPAIO S V QUEIROZ R H C
Potencializaccedilatildeo do efeito metemoglobinizante da dapsona em ratos pela N-acetilcisteiacutena
Revista brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas v 44 n 1 janmar 2008
NAVARI-IZZO F QUARTACCI M F SGHERRI C Lipoic acid a unique antioxidant in
the detoxification of activated oxygen species Plant Physiology and Biochemistry v 40
pp 463-470 2002
OGA S CAMARGO M M A BATISTUZZO J A O Fundamentos da Toxicologia 3ordf
ed Satildeo Paulo Atheneu 2008
OHKAWA H OHISHI M YAGI K Assay for lipid peroxides in animal tissues by
thiobarbituric acid reaction Analytical Biochemistry v 95 pp 351-358 1979
OLIVEIRA S SALDANHA C An overview about erythrocyte membrane Clinical
Hemorheology and Microcirculation v 44 pp 63-74 2010
OPROMOLLA D V A Noccedilotildees de hansenologia Bauru Centro de Estudos Dr Reynaldo
Quagliato 2000
PACKER L WITT E H TRITSCHLER H J Alpha-lipoic acid as a biological
antioxidant Free Radical Biology amp Medicine v 19 n 2 pp 227-250 1995
PANTALEO A DE FRANCESCI L FERRU E VONO R TURRINI F Current
knowledge about the functional roles of phosphorylative changes of membrane proteins in
normal and diseases red cells Journal of Proteomics v 73 pp 445-455 2010
RANAWAKA R R MENDIS S WEERAKOON H S Dapsone-induced haemolytic
anaemia hepatitis and agranulocytosis in a leprosy patient with normal glucose-6-phosphate-
dehydrogenase activity Leprosy Review v 79 pp 436-438 2008
RATMAN D V ANKOLA D D BHARDWAJ V SAHANA D K RAVI KUMAR
M N V Role of antioxidants in prophyilaxis and therapy A pharmaceutical perspective
Journal of Controlled Release v 113 pp 189-207 2006
REIS NETO E T NEVES JUacuteNIOR M T PUCCINELLI M L SATO E I Dapsona no
tratamento do luacutepus eritematoso sistecircmico com manifestaccedilotildees cutacircneas relato de dois casos e
uma breve revisatildeo de literatura Sinopse de Reumatologia n 3 pp 72-81 set 2006
RICE-EVANS C A MILLER N J PAGANGA G Antioxidant properties of phenolic
compounds Trends in Plant Science v 2 n 4 pp 152-159 1997
RODRIGUES L C LOCKHOOD D N J Leprosy now epidemiology progress
challenges and research gaps Lancet Infectiology Diseases v 11 pp 464-470 2011
SAUTTER C K DENARDIN S ALVES A O MALLMANN C A PENNA N G
HECKTHEUER L H Determinaccedilatildeo de resveratrol em sucos de uva no Brasil Ciecircncia e
Tecnologia de Alimentos v 25 n 3 pp 437-442 2005
68
SCHMATZ R Efeitos do resveratrol do suco de uva e do vinho tinto nos biomarcadores de
estresse oxidativo e na atividade de ectoenzimas em ratos diabeacuteticos 2011 144 f Tese
(Doutorado) ndash Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Bioquiacutemica
Toxicoloacutegica Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2011
SCHOumlN T GEBRE N SUNDGVIST T HABETMARIAM H S ENGEDA T
BRITTON S Increased levels of nitric oxide metabolites in urine from leprosy patients in
reversal reaction Leprosy Review v 70 n 1 pp 52-55 1999
SMITH J E Erythrocyte membrane structure function and pathophysiology Vet Pathol v
24 pp 471-476 1987
SPANIER G XU H XIA N TOBIAS S DENG S WOJNOWSKI L
FORSTERMANN U LI H Resveratrol reduces endothelial oxidative stress by modulating
the gene expression of superoxide dismutase 1 (sod1) glutathione peroxidase 1 (gpx1) and
NADPH oxidase subunit (nox4) Journal of Physiology and Pharmacology v 60 suppl 4
pp 111-116 2009
SUZUKI K AKAMA T KAWASHIMA A YOSHIHARA A YOTSU R R ISHII N
Current status of leprosy Epidemiology basic science and clinical perspectives Journal of
Dermatology n 39 pp 121-129 2012
SZELAG M MIKULSKI D MOLSKI M Quantum-chemical investigation of the
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TRIMBAKE S B SONTAKKE A N DHAT V V Oxidative stress and antioxidant
vitamins in leprosy International Journal of Research in Medical Sciences v 1 n 3 pp
226-229 2013
VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN M T D MAZUR M TELSER J
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology v 39 pp 44-84 2007
VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
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VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
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VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
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69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
66
(Doutorado) - Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biologia Celular e Molecular Instututo
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67
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Potencializaccedilatildeo do efeito metemoglobinizante da dapsona em ratos pela N-acetilcisteiacutena
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dehydrogenase activity Leprosy Review v 79 pp 436-438 2008
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REIS NETO E T NEVES JUacuteNIOR M T PUCCINELLI M L SATO E I Dapsona no
tratamento do luacutepus eritematoso sistecircmico com manifestaccedilotildees cutacircneas relato de dois casos e
uma breve revisatildeo de literatura Sinopse de Reumatologia n 3 pp 72-81 set 2006
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SAUTTER C K DENARDIN S ALVES A O MALLMANN C A PENNA N G
HECKTHEUER L H Determinaccedilatildeo de resveratrol em sucos de uva no Brasil Ciecircncia e
Tecnologia de Alimentos v 25 n 3 pp 437-442 2005
68
SCHMATZ R Efeitos do resveratrol do suco de uva e do vinho tinto nos biomarcadores de
estresse oxidativo e na atividade de ectoenzimas em ratos diabeacuteticos 2011 144 f Tese
(Doutorado) ndash Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Bioquiacutemica
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SCHOumlN T GEBRE N SUNDGVIST T HABETMARIAM H S ENGEDA T
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the gene expression of superoxide dismutase 1 (sod1) glutathione peroxidase 1 (gpx1) and
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pp 111-116 2009
SUZUKI K AKAMA T KAWASHIMA A YOSHIHARA A YOTSU R R ISHII N
Current status of leprosy Epidemiology basic science and clinical perspectives Journal of
Dermatology n 39 pp 121-129 2012
SZELAG M MIKULSKI D MOLSKI M Quantum-chemical investigation of the
structure and the antioxidant properties of alpha-lipoic acid and its metabolites Journal of
Molecular Modeling vol 18 n 7 pp 2907-2916 2011
TRIMBAKE S B SONTAKKE A N DHAT V V Oxidative stress and antioxidant
vitamins in leprosy International Journal of Research in Medical Sciences v 1 n 3 pp
226-229 2013
VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN M T D MAZUR M TELSER J
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology v 39 pp 44-84 2007
VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
enzime abnormalities of glycolysis Blood v 106 n 13 pp 4034-4042 2005
VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
liver Life Sciences v 83 pp 155-163 2008
VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
67
MORAES N V MELLO M H SOUZA A M SAMPAIO S V QUEIROZ R H C
Potencializaccedilatildeo do efeito metemoglobinizante da dapsona em ratos pela N-acetilcisteiacutena
Revista brasileira de Ciecircncias Farmacecircuticas v 44 n 1 janmar 2008
NAVARI-IZZO F QUARTACCI M F SGHERRI C Lipoic acid a unique antioxidant in
the detoxification of activated oxygen species Plant Physiology and Biochemistry v 40
pp 463-470 2002
OGA S CAMARGO M M A BATISTUZZO J A O Fundamentos da Toxicologia 3ordf
ed Satildeo Paulo Atheneu 2008
OHKAWA H OHISHI M YAGI K Assay for lipid peroxides in animal tissues by
thiobarbituric acid reaction Analytical Biochemistry v 95 pp 351-358 1979
OLIVEIRA S SALDANHA C An overview about erythrocyte membrane Clinical
Hemorheology and Microcirculation v 44 pp 63-74 2010
OPROMOLLA D V A Noccedilotildees de hansenologia Bauru Centro de Estudos Dr Reynaldo
Quagliato 2000
PACKER L WITT E H TRITSCHLER H J Alpha-lipoic acid as a biological
antioxidant Free Radical Biology amp Medicine v 19 n 2 pp 227-250 1995
PANTALEO A DE FRANCESCI L FERRU E VONO R TURRINI F Current
knowledge about the functional roles of phosphorylative changes of membrane proteins in
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RANAWAKA R R MENDIS S WEERAKOON H S Dapsone-induced haemolytic
anaemia hepatitis and agranulocytosis in a leprosy patient with normal glucose-6-phosphate-
dehydrogenase activity Leprosy Review v 79 pp 436-438 2008
RATMAN D V ANKOLA D D BHARDWAJ V SAHANA D K RAVI KUMAR
M N V Role of antioxidants in prophyilaxis and therapy A pharmaceutical perspective
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REIS NETO E T NEVES JUacuteNIOR M T PUCCINELLI M L SATO E I Dapsona no
tratamento do luacutepus eritematoso sistecircmico com manifestaccedilotildees cutacircneas relato de dois casos e
uma breve revisatildeo de literatura Sinopse de Reumatologia n 3 pp 72-81 set 2006
RICE-EVANS C A MILLER N J PAGANGA G Antioxidant properties of phenolic
compounds Trends in Plant Science v 2 n 4 pp 152-159 1997
RODRIGUES L C LOCKHOOD D N J Leprosy now epidemiology progress
challenges and research gaps Lancet Infectiology Diseases v 11 pp 464-470 2011
SAUTTER C K DENARDIN S ALVES A O MALLMANN C A PENNA N G
HECKTHEUER L H Determinaccedilatildeo de resveratrol em sucos de uva no Brasil Ciecircncia e
Tecnologia de Alimentos v 25 n 3 pp 437-442 2005
68
SCHMATZ R Efeitos do resveratrol do suco de uva e do vinho tinto nos biomarcadores de
estresse oxidativo e na atividade de ectoenzimas em ratos diabeacuteticos 2011 144 f Tese
(Doutorado) ndash Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Bioquiacutemica
Toxicoloacutegica Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2011
SCHOumlN T GEBRE N SUNDGVIST T HABETMARIAM H S ENGEDA T
BRITTON S Increased levels of nitric oxide metabolites in urine from leprosy patients in
reversal reaction Leprosy Review v 70 n 1 pp 52-55 1999
SMITH J E Erythrocyte membrane structure function and pathophysiology Vet Pathol v
24 pp 471-476 1987
SPANIER G XU H XIA N TOBIAS S DENG S WOJNOWSKI L
FORSTERMANN U LI H Resveratrol reduces endothelial oxidative stress by modulating
the gene expression of superoxide dismutase 1 (sod1) glutathione peroxidase 1 (gpx1) and
NADPH oxidase subunit (nox4) Journal of Physiology and Pharmacology v 60 suppl 4
pp 111-116 2009
SUZUKI K AKAMA T KAWASHIMA A YOSHIHARA A YOTSU R R ISHII N
Current status of leprosy Epidemiology basic science and clinical perspectives Journal of
Dermatology n 39 pp 121-129 2012
SZELAG M MIKULSKI D MOLSKI M Quantum-chemical investigation of the
structure and the antioxidant properties of alpha-lipoic acid and its metabolites Journal of
Molecular Modeling vol 18 n 7 pp 2907-2916 2011
TRIMBAKE S B SONTAKKE A N DHAT V V Oxidative stress and antioxidant
vitamins in leprosy International Journal of Research in Medical Sciences v 1 n 3 pp
226-229 2013
VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN M T D MAZUR M TELSER J
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology v 39 pp 44-84 2007
VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
enzime abnormalities of glycolysis Blood v 106 n 13 pp 4034-4042 2005
VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
liver Life Sciences v 83 pp 155-163 2008
VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
68
SCHMATZ R Efeitos do resveratrol do suco de uva e do vinho tinto nos biomarcadores de
estresse oxidativo e na atividade de ectoenzimas em ratos diabeacuteticos 2011 144 f Tese
(Doutorado) ndash Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Ciecircncias Bioloacutegicas ndash Bioquiacutemica
Toxicoloacutegica Universidade Federal de Santa Maria Santa Maria 2011
SCHOumlN T GEBRE N SUNDGVIST T HABETMARIAM H S ENGEDA T
BRITTON S Increased levels of nitric oxide metabolites in urine from leprosy patients in
reversal reaction Leprosy Review v 70 n 1 pp 52-55 1999
SMITH J E Erythrocyte membrane structure function and pathophysiology Vet Pathol v
24 pp 471-476 1987
SPANIER G XU H XIA N TOBIAS S DENG S WOJNOWSKI L
FORSTERMANN U LI H Resveratrol reduces endothelial oxidative stress by modulating
the gene expression of superoxide dismutase 1 (sod1) glutathione peroxidase 1 (gpx1) and
NADPH oxidase subunit (nox4) Journal of Physiology and Pharmacology v 60 suppl 4
pp 111-116 2009
SUZUKI K AKAMA T KAWASHIMA A YOSHIHARA A YOTSU R R ISHII N
Current status of leprosy Epidemiology basic science and clinical perspectives Journal of
Dermatology n 39 pp 121-129 2012
SZELAG M MIKULSKI D MOLSKI M Quantum-chemical investigation of the
structure and the antioxidant properties of alpha-lipoic acid and its metabolites Journal of
Molecular Modeling vol 18 n 7 pp 2907-2916 2011
TRIMBAKE S B SONTAKKE A N DHAT V V Oxidative stress and antioxidant
vitamins in leprosy International Journal of Research in Medical Sciences v 1 n 3 pp
226-229 2013
VALKO M LEIBFRITZ D MONCOL J CRONIN M T D MAZUR M TELSER J
Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease The
International Journal of Biochemistry and Cell Biology v 39 pp 44-84 2007
VAN WIJK R VAN SOLINGE W The energy-less red blood cell is lost erythrocyte
enzime abnormalities of glycolysis Blood v 106 n 13 pp 4034-4042 2005
VAN ZWIETEN R VERHOEVEN A J ROOS D Inborn defects in the antioxidant
system of human red blood cells Free Radical Biology and Medicine v 67 pp 377-386
2014
VEGGI L M PRETTO L OCHOA E CATANIA V A LUQUITA M G
TABORDA D R POZZI E J S IKUSHIRO S COLEMAN M D ROMA M G
MOTTINO A D Dapsone induces oxidative stress and impairs antioxidant defenses in rat
liver Life Sciences v 83 pp 155-163 2008
VIJAYARAGHAVAN R PANEERSELVAM C Erythrocyte antioxidant enzymes in
multibacillary leprosy patients International Journal of Applied Biology and
Pharmaceutical Technology v 2 n 2 pp 409-412 2011
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
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Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
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ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
Secretaria de Sauacutede do Estado do Paraacute- SESPA
73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
do estudo
69
VIJAYARAGHAVAN R SURIBABU C S OOMMEN P K PANNEERSELVAM C
Vitamin E reduces reactive oxygen species mediated damage to bio-molecules in leprosy
during multi-drug therapy Current Trends in Biotechnology and Pharmacy v 3 n 4 pp
428-439 2009
WOZEL G BLASUM C Dapsone in dermatology and beyond Arch Dermatol Res v
306 pp 103-124 2014
WORLD HEALTH ORGANIZATION Global Leprosy update on the 2012 situation
Weekly Epidemiological Record n 35 pp 365-380 2013
ZELKO I N MARIANI T J FOLZ R J Superoxide dismutase multigene family a
comparison of the CuZn-SOD (sod1) Mn-SOD (sod2) and EC-SOD (sod3) gene structures
evolution and expression Free Radical Biology amp Medicine v 33 n 3 pp 337ndash349 2002
70
ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
Eacutetica em Pesquisa em Seres Humanos ndash Instituto de Ciecircncias da Sauacutede da
Universidade Federal do Paraacute
71
ANEXO 2Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pela Unidade de
Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
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ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
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73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
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ANEXOS
ANEXO 1 Parecer de autorizaccedilatildeo para desenvolvimento da pesquisa emitido pelo Comitecirc de
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Universidade Federal do Paraacute
71
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Referecircncia Especializada ldquoDr Marcello Cacircndiardquo
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72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
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73
ANEXO 3Termo de Consentimento Livre e Esclarecido utilizado com pacientes participantes
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72
ANEXO 3 Autorizaccedilatildeo para desenvolvimento de pesquisa na UBS Pedreira emitido pela
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do estudo
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