obtendo as sequências moleculares: amplificação e sequenciamento almir r. pepato
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Obtendo as sequências moleculares: Amplificação e sequenciamento
Almir R. Pepato
Reação da Polimerase em cadeia (PCR)
Reação da Polimerase em cadeia (PCR)
Otimizando as reações de PCRExtração PolimeraseMg++ Iniciadores (Primers) DNTPTampãoSubstâncias facilitadoras
Temperatura e tempo :
-Denaturação
-Anelamento
-Extensão
ExtraçãoContaminação
Deve- se usar um controle negativo.
Autoclavar ponteiras, frascos etc.
Aliquotar as soluções (isso restringe a
contaminação)
Planejar o espaço físico do laboratório.
Degradação e quantidade:
Quantidade:
Ideal: 0.1-1 μg DNA /100 μl de solução para o PCRMuito DNA: Amplificações espúrias.
O DNA degradado pode ser eventualmente “restaurado”.
Substâncias que inibem o PCR: álcool, formol, fenol, detergentes polares, vários metais.
Cloreto de Magnésio (Mg++) e DNTP
O Mg++ forma complexos com dNTPs, primers e DNA, mas o efeito do dNTPs é mais pronunciado.
Pouco Mg++, pouco produto de PCR/Muito Mg++, baixa especificidade
Iniciadores (Primers)
0,4 mM
0,2 mM
O desenho de primers será objeto de aula a parte. Alguns elementos:
Devem ter de 0-24 nucleotídeos de comprimentoO conteúdo de GC deve estar em 40%-60% Não deve ser auto-complementar nem parear com o seu reversoO par de primers não devem ter Tm’s (veja abaixo) diferindo em mais de 5°CÉ uma boa idéia ter uma timina na extremidade 3’ para primers universais e GC para primers específicos
Substâncias facilitadoras
Substâncias como DMSO (2%-5%), glicerol (500-20%), detergentes apolares, formamida (5%) e BSA podem aumentar o produto das reações ou melhorar a especificidade .
Algumas reações só funcionam com eles!
Ciclo de temperaturasO número de ciclos, temperaturas e tempo de duração de cada etapa do ciclo também é objeto de otimização! Os principais parâmetros são a temperatura de anelameto, o número de ciclos e a duração do tempo de extensão.
Para oligos com < 25nts, Tm ± 4 (G + C) + 2 (A + T). A diferença entre as temperaturas dos primers não deve ser maior que uns 5°C.
A temperatura ideal de anelamento deve ser uns 5°C menor que Tm.
Temperatura ótima esperada: 56,5°C. Inferida pelo gradiente: 63°C
E quando mais nada funciona?
Santa Rita de Cássia, santa das causas impossíveis.
PCR AninhadosConsiste em amplificar um fragmento menor a partir de um produto inespecífico ou escasso de outro PCR.
“Touchdown” e “Hot start”Touchdown: A cada ciclo a temperatura é reduzida, tornando o anelamento cada vez menos específico, mas mais eficiente
Hotstart: A Taq polimerase só é adicionada quando a temperatura atingiu um valor mínimo.
Sequenciamento: Método de Sanger
Originalmente:
Quatro reações diferentes com cada uma das quatro bases modificadas por vez (mais as versões normais de todas)
Sequenciamento: Método de Sanger
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