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P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Amélioration des défenses de la vigne contre ses maladies- équipe « Résistance Dérivée du Pathogène » (RDP)
C. Demuyter,
S. Bruisson, J. Ocaña,
L. Deglène-Benbrahim, C. Le Jeune, P. Maillot, P. Schellenbaum, L. Valat, B. Walter Université de Haute Alsace, Laboratoire Vigne, Biotechnologies et Environnement, EA-3991, BP50568, 68008 Colmar cedex
2 programmes :
I. Résistance Dérivée du Pathogène (RDP) contre le GFLV, agent du court-noué de la vigne
II. Programme CLOVIS : « CLOnes de VIgneS », nouveaux plants de vigne assainis, moins
sensibles aux pathogènes et améliorant la qualité des vins
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Lutte contre le GFLV : concept de Résistance Dérivée du PathogèneStratégie des microARNs artificiels
I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV
2 axes
Validation de la stratégie sur N. benthamiana
Validation de la stratégie sur Vitis vinifera
Jelly 2011, d'après Antonio Garcia & Simon-Mateo 2008
Constructions (Jelly, 2011)
1A 1DPro1BHel 1EPol 2AHP 2BMP 2CCP
amiR-MP1
amiR-MP4 amiR-CP3
amiR-CP1amiR-RDR1
amiR-RDR3
GFLV-ARN1 GFLV-ARN2
Positions des cibles des amiARNs sur les 2 ARNs génomiques du GFLV
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
- 21 lignées transgéniques obtenues
Agro-infiltration de la cible pour vérifier la dégradation de la cible
Inoculation mécanique du GFLV pour mettre en évidence l’inhibition de la réplication virale
Efficacité lors de l’établissement de la maladie
- Insertion du transgène vérifiée
- Expression de l’amiRNA vérifiée
Détection des amiRNAs dans les lignées transgéniques de N. benthamiana (par sl-RT-PCR)
Axe 1 : Validation de la stratégie sur Nicotiana benthamiana
I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV
(Jelly, 2011)
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Co-culture d’embryons (Chardonnay) avec Agrobacterium tumefaciens
Transformation transitoire in vitro de la vigne
Axe 2 : Validation de la stratégie sur Vitis vinifera
Infiltration de vitroplants (Syrah) avec Agrobacterium tumefaciens
Analyses moléculaires- sl-RT-PCR- 5’RACE PCR- GUS-sensor
Culture produisant des embryons somatiques Isolement de 10-20
embryons somatiques dans une boîte de Pétri
Dépôt d’une goutte de suspension d’agrobactéries
sur chaque embryon
Repiquage sur un milieu contenant des antibiotiques
pour éliminer les agrobactéries
Analyses moléculaires, 24h à 72h après
Jelly N S, Schellenbaum P, Walter B, Maillot P (2012) Transgenic Research 21:1319-1327.
I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV
Pour vérifier la dégradation de la cible
Valat L, Maillot P, Gadat M, Schellenbaum P, Jelly N S, Walter B (2013) 14° Rencontres de Virologie Végétales, 13-17 Janvier, Aussois, France.
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Transformation stable de la vigne
Axe 2 : Validation de la stratégie sur Vitis vinifera
- Différentes lignées transgéniques obtenues
- I-PCR, TAIL-PCR, RSE-PCR (insertion du transgène)
- sl-RT-PCR (expression de l’amiRNA)
- 5’RLM-RACE PCR (dégradation de la cible)Détection des amiRNAs exprimés dans 1 lignée transgénique de vigne (par sl-RT-PCR)
I. Résistance Dérivée du Pathogène contre le GFLV
Analyses moléculaires
Posters RVVS :
Laure Valat, Pascale Maillot, Noémie S. Jelly, Paul Schellenbaum, Bernard Walter. Validation par expression transitoire dans la vigne d’amiRNAs dirigés contre le GFLV : tests GUS-sensor.
Laurence Deglène-Benbrahim, Noémie Jelly, Paul Schellenbaum, Christine Le-Jeune, Bernard Walter, Pascale Maillot. Transformation stable de porte-greffes de vigne pour l’expression d’amiRNAs dirigés contre le GFLV.
(Jelly, 2011)
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Projet (2010-2014) :
- labellisé par le pôle de compétitivité VITAGORA (Dijon)
- soutenu par le Fonds Unique Interministériel & OSEO
Consortium regroupant :- Pépinières Viticoles Guillaume (Charcenne, 71)- SEDIAG - Anticorps et Diagnostics (Dijon, 21)- Association Technique Viticole de Bourgogne (ATVB, Beaune, 21)- Equipe RDP du LVBE
II. Programme CLOVIS« CLOnes de VIgneS », nouveaux plants de vigne assainis,moins sensibles aux pathogènes et améliorant la qualité des vins
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
3 objectifs d’innovation stratégique :- développer une méthode plus sensible de diagnostic des pathologies de la vigne
- produire des plants assainis et moins sensibles aux pathogènes : mycorhizés et/ou producteurs de resvératrol
- accroître la diversité de l’offre accessible aux viticulteurs en développant et produisant de nouvelles vignes
Deux axes de recherche – développement pour notre équipe
Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir)
Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne
II. Programme CLOVIS
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Origine de la diversité génétique chez la vigne :- altérations génétiques (changements dans la séquence d’ADN)
- altérations épigénétiques (variations non codées par la séquence d’ADN modifiant
l’expression des gènes) Clone 1 AACCAGTAACCAGT-------AATGCTGCCGGATGC
Clone 2 AACTAGTAACCAGTGATCGATAATGCTGCCGGATGC
SNP Insertion/Délétion Méthylation (C)
Me
II. Programme CLOVIS
But : étude de la variabilité génétique et épigénétique de clones de Pinot Noir
- évaluer la diversité de clones (marqueurs moléculaires « neutres »)
- définir des technique(s) fiable(s) et informative(s) pour visualiser les variations et permettant la
distinction clonale (« technique de routine »)
Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir)
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Technique de marquage moléculaire :MSAP : Methylation Sensitive Amplified Polymorphism
(Etude réalisée sur 40 clones, agréés et nouvelles obtentions)
Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir)
II. Programme CLOVIS
Résultats- Présence de bandes polymorphes stables et instables
- 9 combinaisons d’amorces; 23 marqueurs polymorphes stables
- 38 profils distincts (37 uniques et 1 partagé par 3 clones)
Þ distinction épigénétique des clones
Ocaña et al, 2013, Molecular Biotechnology, DOI 10.1007/s12033-013-9675-3
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Symbioses mycorhiziennes arbusculaires
- tolérance aux stress biotiques et abiotiques
But :
=> Produire des plants de vigne mycorhizés moins sensibles aux pathogènes
II. Programme CLOVIS
Etudes réalisées :
- contrôle de l’installation de la mycorhization
- analyse de l’expression de gènes marqueurs de défense
* après élicitation
* suite à l’inoculation de pathogènes
- mesure de l’évolution des teneurs en stilbènes
Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne
Suivi de la mycorhization :
Inoplant Dijon
Champignon mycorhizogène à arbuscules dans un système racinaire
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
II. Programme CLOVIS
Recherche de gènes potentialisés par la mycorhization (marqueurs de « priming »)
- Éliciteurs chimiques (voie SA et voie JA/ETH)
- Infection par des micro-organismes pathogènes (biotrophes et nécrotrophes)
- Analyse de l’expression de gènes de défense par qPCR
Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne
Expression de gènes de défense dans des feuilles de plants de Pinot Noir mycorhizés ou non, traités avec du Bion®
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
Etude de l’expression de gènes marqueurs de défense - Persistance du « priming » dans le temps
- Suivi du taux de mycorhization
- Maintien du priming de gènes de défense
Etude de l’effet protecteur des mycorhizes vis-à-vis de bioagresseurs
- Infection par Plasmopara viticola et Botrytis cinerea
II. Programme CLOVISAxe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigne
Sébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter, 2012. Journées francophones des mycorhizes 2012, 5-7 sept, Nancy, France.
Sébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter, 2012. 1st world congress on the use of biostimulants in agriculture, 26-29 nov, Strasbourg, France.
Feuille de Pinot Noir infectée par Botrytis cinerea
P. Schellenbaum – Equipe RDP du LVBE – RVVS 01 juillet 2013
II. Programme CLOVIS
Poster RVVS
Axe 1 : Sélection clonale et sanitaire de la vigne (Pinot Noir)Juan Ocaña, Bernard Walter, Paul Schellenbaum. Distinction of Vitis vinifera cv Pinot noir clones by stable MSAP markers.
Axe 2 : Effet de la mycorhization sur la stimulation des défenses de la vigneSébastien Bruisson, Pascale Maillot, Laurence Deglène-Benbrahim, Armelle Gollotte, Bernard Walter. Effet de la mycorhization sur l’expression des gènes de défense de la vigne après élicitation chimique ou inoculation de pathogènes.
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