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Patologia molecular: do Patologia molecular: do
gengenóótipo ao fentipo ao fenóótipotipo
Genética Médica
Henriqueta Coimbra Silva
6044
5135 68
22 anos
Cancro da mama
Cancro do ovário
Cancro da mama
Diagnóstico pré-sintomático e de portadoresPesquisa de mutações constitucionais
Medicina preventiva e personalizada
controlo
doente
??Coreia de Huntington
Síndroma de X Frágil
??
◨◨ ◑◑
Diagnóstico pré-sintomático e de portadoresPesquisa de mutações constitucionais
Fibrose quística
Diagnóstico de mutações somáticas no cancro
RAS
RAF
MAP cinases
EGFR
MEKK1
RACGRB2
SOS
membrana celular
Identificação de mutações do KRAS e EGFR: identificação de alvos terapêuticos; avaliação
prognóstica e selecção terapêutica
Patologia molecular: correlaçãogenótipo-fenótipo
Objectivos:
1. Identificar e descrever os diversos tipos de mutações
2. Descrever as características das sequências associadas a elevada taxa de mutação
3. Explicar a correlação genótipo -fenótipo
1. Tipo de Mutações
Inserção com frameshiftVal-Lys-Gly-Cys-CAA TTT CCG ACG A
Delecção com frameshiftVal-Arg-Leu-...stopCAA _TC CGA CGA...
Mutação nonsenseValCAA ATC CGA CGA
Mutação missenseVal-Glu-Ala-AlaCAA CTC CGA CGA
Mutação sinónimaVal-Lys-Ala-AlaCAA TTT CGA CGA
NormalVal-Lys-Ala-AlaCAA TTC CGA CGA
ResultadoAminoácidosDNA
Classifique quanto ao tipo de mutação:
1. Tipo de mutações: mutação nonsense
Gene normal Gene mutado
Transcrição Transcrição
Tradução
Interrupção da tradução
Codão stop
Formação de peptídeo truncado, não funcionalFormação de peptídeo
completo
• mRNA instável → degradação → ausência de síntese de proteína
• Polipeptídeo truncado com alguma função
• Polipeptídeo que interage com outras proteínas
Sequência da cadeia beta normal
Delecção de AA
frameshift Codão stop
Mutação do gene da ββββ-globina associada a ββββ-talassémia
1. Tipo de mutações: mutação com frameshift
Nonsense Mediated Decay: mecanismo que detecta codõesSTOP prematuros.
Actua ao nível do mRNA de modo a impedir a síntese de proteínas truncadas.
Só detecta os codões stop situados a > 50 nucleótidos a montante do local de splicingseguinte
1. Tipo de mutações: mutação missense
A substituição do aminoácido éconservadora?
A mutação está numa região conservada do ponto de vista evolutivo?
A mutação está em algum domínio funcionalmente importante da proteína?
Outros critérios...
Mutação do codão 13 do gene KRAS (GGC>GAC) num cancro do pulmão
Gli13Asp (G13D)
H – CH - COOH
NH2
HOOC - CH2– CH - COOH
NH2
Glicina; grupo I Ácido aspártco; grupo IV
Distância fisicoquímica entre pares de aminoácidos
Tabela de Grantham, compara os aminoácidos quanto à polaridade, volume molecular e composição química.
Frequentemente associam-se a efeito de frameshift e co dões stop prematuros a jusante .
Splicing normal
Retenção de intrão
Eliminação de exão
AG
SR
SRSR
SR
SR
SR
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas sequências de splicing
GT
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
GT
GT
GT
GT
GT
GT
GT
Transplantada renal (glomerulonefrite crónica membranoproliferativa)
• Amenorreia
• Genitais externos hipotróficos
• Cariótipo 46,XY
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas sequências de splicing
Síndroma de Frasier
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas sequências de splicing
A proteína WT1 é um factor de transcrição com funções supressoras tumorais, e que também desempenha um papel crucial no desenvolvimento embrionário do rim e gónadas.
Gene do tumor de Wilms, WT1. Podem formar-se 24 isoformas da proteína WT1 por combinação de 3 mecanismos de controlo da expressão génica.
A variante de splicing do exão 9 permite a inclusão ou exclusão de três aminoácidos (KTS). As duas isoformas, KTS positivas e KTS negativas, parecem ter diferentes funções e diferentes localizações ao nível do núcleo.
KTS+
KTS-
K - LysT - Thr
S - Ser
Segmento amplificado do exão 9.
Mutação intrónica alterando o segundo local dador de splincing, dando origem preferencial às isoformas WT1-KTS.
A mutação cria um site de restrição para a enzima HinP I
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas sequências de splicing
Exão 9
T>CD FF DC CC ϕX
Estudaram-se os familiares e 50 controlos (100 alelos) por
RFLP coma enzima HinP I
Neomutação, freq <1% na população
Não se estudou o mRNA: o gene só é transcrito durante o desenvolvimento embrionário e no rim
1. Tipo de mutações: mutações intrónicas nas sequências de splicing
As mutações intrónicas afectam o splicing
1. Tipo de mutações: activação de uma sequência críptica de splicing
1. Tipo de mutações: activação de uma sequência críptica de splicing num exão
Uma mutação sinónima pode activar uma sequência crípti ca dadora de splicing no exão 2: parte do exão é eliminado
GT AGGT AG
1. Tipo de mutações: activação de uma sequência críptica de splicing
• Uma mutação sinónima pode ser patogénica
GAG GGC AAA GGC AAA ACA AGT..... GT AG CCA CAG CCT...
GAG G GT AG CC ACA GCC T...
Intrão 16
Intrão 16
GAG GGT AAAG...
exão 16 exão 17
Mutação do gene calpaína 3 responsável por uma forma de distrofia muscular, a LGMD2A. Aparentemente a mutação é silenciosa porque é sinónima , dado que ambos os codões,
GGC e GGT codificam a glicina. No entanto, a mutação activa uma sequência críptica dadora
de splicing originando perda de parte do exão 16, introdução de frameshift e stop prematuro a
jusante.
frameshift
1. Tipos de mutações: mutações das regiões reguladoras
Porque serão patogénicas?
Gene da β-globina e localização das várias mutações associadas à β-talassémia
-29A →→→→G -88C →→→→T
Alguns dos tipos de mutações do gene do receptor das LDL, o LDLR, na origem da hipercolesterolémia familiar.
Frequentemente, uma patologia pode ser provocada por diferentes tipos de mutações num gene – heterogeneidade alélica
Dinucleótidos CpG: 8 a 12 x mais mutações
Transição citosina →→→→ timina, a qual vai emparelhar com adenina
C5 C6
1N
2C
C4
N3
NH2 OCH3
OO
NH2
O
C5 C6
1N
2C
C4
N3
H
H HC5 C6
1N
2C
C4
N3
CH3
H
Desaminação espontâneaMetilação
timina5-metilcitosinacitosina
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
citosina metiltransferase
Replicação normal
Mecanismo de inserção
Mecanismo de delecção
Por deslizamento para trás da nova cadeia
Por deslizamento para trás da cadeia molde
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
Sequências repetitivas – os microssatélites favorecem a ocorrência de inserções e delecções por deslizamento das cadeias durante a replicação. Para certos loci, um número excessivo de repetições pode originar mutações patogénicas, as mutações
dinâmicas .
36 -100
62-86
38-62
10-26
12-39
9-35
(CAG)n
(CAG)n
(CAG)n
Codificante
Codificante
Codificante
AD
AD
XR
Repetições CAG
D. de Huntington
D. de Machado Joseph
D. de Kennedy
Etc..
200-1000
200-1700
50-4000
6-54
7-22
5-35
(CGG)n
(GAA)n
(CTG)n
Não codificante
5’UTR
Intrão 1
3’UTR
XR
AR
AD
Grandes repetições
X frágil
Ataxia de Friedreich
Distrofia miotónica (DM1)
InstávelNormalSequênciaLocalizaçãoTransmissãoDoença
Pré-mutação
Doenças associadas a mutações dinâmicas
Mutações com diversos mecanismos patogénicos
Motivos extensos de DNA repetitivo ou com grandes homologias , por exemplo genes e respectivos pseudogenes favorecem a ocorrência de crossing-overs assimétricos entre cromátides irmãs ou entre cromátides de cromossomas homólogos dá origem a delecções /inserções e genes de fusão
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
C4A C4BCYP21A CYP21B
30 Kb 30 Kb
21-hidroxilasePseudogeneNão funcionalCom mutações
O gene CYP21B e o pseudogene CYP21A localizam-se numa sequência repetitiva de DNA de cerca de 30Kb que inclui ainda outro gene também em duplicado, o C4 (C4A e C4B).
Formação de crossing-oversassimétricos; 25% das
mutações
Conversão génica 75% das mutações
Gene de fusão, inactivo
Delecção
Gene mutante com mutações
inactivadoras
Rotura e
reconstrução
Micro conversão
Emparelhamento assimétrico
A maioria das mutações da 21-hidroxilase devem-se a trocas de sequências do CYP21B, com um pseudogene próximo, o CYP21A, por emparelhamento assimétrico.
Mutações da 21-hidroxilase
Mutações patogénicas do gene da 21-hidroxilase (CYP21B) podem ocorrer por cópia a partir do pseudogene CYP21A.
Colesterol
Pregnanolona
Progesterona
Corticosterona
↓↓↓↓ Aldosterona(Perda renal de sódio)
17 α–OH Pregnanolona
↑ 17 α–OH Progesterona
11-deoxicortisol
↓↓↓↓ Cortisol
Deidroepian-drosterona
↑↑↑↑Androstenediona ↑↑↑↑ Testosterona
EstronaEstradiol
Deoxicorticos-terona
CYP21
CYP21
Hipotálamo/Hipófise
Feed-backnegativo
ACTH
Hiperplasia congénita da supra-renal
Hiperplasia congénita da supra-renal por défice da 21-hidroxilase
Pseudo-hermafroditismo femininoVirilização precoce no sexo masculinoSíndrome de perda de sal
Ambiguidade dos genitais externos
A existência de sequências homólogas pode ainda dar origem a outras alterações graves como inversões. Exemplo da hemofi lia A.
No intrão 22 do gene F8 há outros dois genes, o F8B e o F8A. A cerca de 300 Kb, na direcção do telómero, localizam-se os genes F8A* e F8A**, homólogos de F8A. Pode ocorrer inversão por emparelhamento do gene F8A (do intrão 22 do gene F8) com dois genes homólogos, o F8A* e F8A**.
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
Pequenas sequências repetitivas são frequentemente encontradas nos limites de muitas delecções patogénicas do mtDNA na síndroma de Kearns-Sayre.
2. Regiões mais susceptíveis às mutações
3.Mutações: consequências
As consequências de uma mutação dependem da alteração da função da proteína e da função da proteína
na célula/organismo.
• Perda/diminuiçãode função
• Aumento de função
• Nova função
Fenótipos dominantes
Fenótipos recessivos
3. Mutações: consequências
Mutação
Proteína anormal
Perda de função(a maioria)
Aumento de função
Efeito lesivo
Expressão ectópicaou heterocrónica
Causa de Patologia
Acondroplasia
d. Huntington
Hemofilia, β talassémia, etc
Cancro
Proteína normal
↓↓↓↓ quantidade
↑↑↑↑ quantidade
Expressão inapropriada
Mutações que afectam a regulação ou a dosagem génica
Mutações da região codificante
Mutações que afectam a estabilidade do RNA ou o seu processamento
Nova funçãoGene híbrido
α talassémia
D. Charcot-Marie-tooth I
1 3
2
Mutações com perda de função:delecções; frameshift; nonsense; inversões, missense,
Fenótipo recessivo (enzimas, factores de coagulação,..)
50% da proteína assegura a função
Podem associar-se a fenótipos dominantes
3. Mutações: consequências
Mutações com perda de função: exemplo da β-talassémia
A figura representa o gene da β-globina e a localização das várias mutações associadas à β-talassémia. Algumas das mutações localizam-se na região reguladora e limitam a taxa de transcrição. Outras originam proteínas mutantes não funcionais. Doença autossómica recessiva com heterogeneidade alélica.
α-talassémias; Distrofia muscular de Duchenne
De LINE-1 no gene F8 na hemofilia A
Distrofia muscular de Duchenne
gene F8 na hemofilia A
β-talassémia
CDKN2A no cancro
Mutação da α-globina na α talassémiaβ-talassémia (Q39X)
β-talassémia; mucoviscidose; ...
β-talassémia; s. Papillon-Lefèvre
β-talassémia; s. Papillon-Lefèvre
Mucoviscidose
s. Ehlers Danlos tipo VII (procolagénio resistente à clivagem)
Fibrose quística (pF508del)
Delecção
Inserções
Disrupção da estrutura de um gene
translocação
nversão
Inibição do promotor
mutação
metilação
Destabilização do mRNAmutação do site de poliadenilação
pelo NMD
Interferência no splicing
Frameshift
Mutação nonsense
Mutação missense em aac. essencial
Mutação que interfira com o processamento pós-tradução
Mutação que impeça a correcta localização na célula
ExemploAlteração com perda de função
• X frágil : (CGG)>200 na região 5’UTR do gene FMR1→ metilação da região promotora e ausência de expressão do gene – perda de função – X recessiva
Mutações dinâmicas em regiões não codificantes
Principal causa de atraso mental hereditário no sexo masculino
Prognatismo; grandes pavilhões auriculares
Mutações com perda de função
Síndroma de X-frágil
A proteína FMR1 é importante para o desenvolvimento e maturação do SNC onde regula a tradução de vários mRNAs.
Mutações com perda de função
A osteogénese imperfeita é uma doença que afecta o esqueleto e que surge por mutações nos genes que codificam as cadeias α1 ou α2 do colagénio.
GeneCOL1A1
GeneCOL1A2
O colagénio é uma proteína multimérica formada por duas cadeias αααα1 e uma cadeia αααα2
2n αααα1
n αααα2
Cromossoma 17 Cromossoma 7
αααα2 αααα1
Mutações com perda de função
Apenas n/4 de proteínas normais
3n/4 de proteínas anormais não funcionais
Mutação missense
GeneCOL1A1
GeneCOL1A2
n αααα2n αααα1 normais e n cadeias αααα1 mutadas
COL1A1 COL1A2
n/2 moléculas normais
n α1 n α2
Só se sintetizampeptídeos normais
Delecções
Efeito dominante negativo – a proteína mutada interfere com a proteína normal
→→→→ Os heterozigotos são doentes
→→→→ Mutação missense com consequências mais graves do qu e a delecção
Efeito dominante negativo: mutação com perda de função associada a fenótipos dominantes
n αααα2n αααα1
Gene
Localização da mutação nonsense Efeito
Na ausência de correcção pelo NMD, mutações nonsense podem originar proteínas truncadas na origem de fenótipos dominantes por efeito dominante negativo
Mutações com perda de função
Haploinsuficiência : redução de 50% da função causa
patologia- fenótipo dominante
JAG1
EXT1PMP22
ELN
TRPS1PAX3
118340
133700162500
185500
190350193500
S. de Alagille
Exostose múltiplaNeuropatia Tomaculosa
Estenose aórtica supra-valvular
S. Trico-rino-falângicoS. Waardenburg tipo 1
GeneMIM#Patologia
Efeito de dosagem génica
• via de sinalização “quantitativa” – taxa de ocupação de receptor
• actuação por competição
• cooperação ou interacção entre proteínas
Mutações com perda de funçãoFenótipo recessivo (enzimas, factores de coagulação,..)
50% da proteína assegura a função
Podem associar-se a fenótipos dominantesEfeito dominante negativoHaploinsuficiência
3. Mutações: consequências
Mutações com ganho de função
Fenótipo dominantes50% da proteína não asseguram a função
Mutações com ganho de função – efeito tóxico da proteína
Doença de Huntington:
(CAG) 36 a >100
Autossómica dominante
• No 1º exão do gene HD → sequência de poliglutamina no terminal
amina da proteína huntingtina
• Formam-se agregados de proteína no núcleo e citoplasma
• Morte celular no estriado e cortex cerebral
6-35 normal36-40 penetrância incompleta> 40 penetrância completa
Redução de 25-30% do peso do cérebro
Acondroplasia. Normalmente, a ligação de factor de crescimento FGF activa o receptor FGFR3 tendo como consequência a inibição da proliferação dos condrócitos na placa de crescimento. A mutação causa a activação constitutiva do receptor , independentemente da ligação do ligando, pelo que o crescimento dos ossos longos é inibido.
G1138A
90% mutação missense (glicina>arginina)
Mutações com ganho de função
Activação constitutiva do receptor
Fenótipo dominante
Mutações pontuais: protooncogene RET
Codão609611618620634
Dimerização
Autofosforilação
Activação das vias de transdução de sinal
Proliferação celular e cancro
Síndroma MEN2A: cancro medular da tiróide e adenoma das supra-renais
Mutações com ganho de função
Ganho de função ou nova função
Leucemia mielóide crónica
Paramiotonia congénita
BCR-ABLOncogene
SCN4A
Insensibilidade a inibidores(proteína quimérica)
Canal iónico permanentemente aberto
Doença de Huntington
Distrofia miotónica
HD
DMPK
Efeito citotóxicoproteínaRNA?
MEN2A (síndroma tumoralhereditária)RET
oncogene
Activação de receptor(mutação pontual)
Doença de Charcot-Marie-ToothPMP22Aumento da expressão(duplicação do gene)
Mecanismo Gene Doença
• Espectro de mutações mais restrito
• A patologia não se associa a delecções ou disrupções do gene
• Mutações em locais específicos
• Modelos in vitro: “knockout”
Ganho de função?
Há muitas excepções,...
Variabilidade das doenças monogénicas?
• Penetrância incompleta
• Expressividade variável
• Penetrância com a idade
6044
5135 68
22 anos
RAD51
MAP3K1
FGFR2
MAP3K
TNRC9
Associação de polimorfismos dos genes FGFR2 e TNRC9:
↑ cancro da mama aos 70 anos, para portadoras de mutação do
BRCA2, de 41% (sem alelos de risco) para 70% (4 alelos de risco)
Genes modificadores do BRCA1 e do BRCA2
Common Breast Cancer-Predisposition Alleles Are Associated with Breast Cancer Risk in BRCA1and BRCA2 Mutation CarriersAntoniou et al, Am J Hum Genet, 2008Estudo em 10.358 portadoras de mutações do BRCA1/BRCA2
Cancro da mama hereditário: genes modificadores
Querubismo – penetrância variável com o sexo
• Querubismo (Displasia fibrosa familiar dos maxilares)
• Expansão progressiva, indolor e simétrica, dos maxilares; regride após a puberdade
• Alterações da erupção dentária
� AD� Mutações no gene 3BP2� Penetrância de 100% no
sexo masculino e de 50 a 70% no sexo feminino
Proteína 3BP2 – envolvida na activação e desgranulação dos mastócitos e activação dos osteoclastos
Proliferação do tecido conjuntivo fibroso com numerosas células gigantes multinucleadas
A presença da mutação não assegura o fenótipo patológico
Exemplo da fenilcetonúria: metabolopatia autossómica recessiva, por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase, com deficiência mental e alterações neurológicas em homozigotos mutados, apenas na ausência de dieta pobre em fenilalanina. Diagnóstico perinatal pelo “teste de Guthrie ”.
◨◨ ◑◑
Doença por efeito tóxico de metabolitos maternos sobre os fetos, mesmo que estes sejam heterozigotos - fenocópia
Mãe com fenilcetonúria, homozigota mutada.
Se não fizer dieta durante a gravidez
Penetrância incompleta e expressividade variável em doenças monogénicas
� Correlação genótipo-fenótipo (tipo e localização da mutação)
� Interferências do meio
� Genes modificadores: polimorfismos, mutações
� Interferências com polimorfismos do mesmo gene
� Dificuldades no diagnóstico
� e no prognóstico� DPN? � Diagnóstico de portadores?� Avaliação do risco para a descendência?
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