pibic 2013/2014 – ufam oncologia experimental e toxicologia clínica manaus - am
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Avaliação da citotoxicidade e da genotoxicidade de uma naftoquinona furano sintetizada a partir de 2-hidroxi-1,4-
naftoquinona (Lawsona)
1
SOUSA, Leilane Bentes; RIBEIRO, Gilderlany Gomes de Souza; CARDOSO, Mariana Filomena do Carmo; SILVA, Fernando de Carvalho da; FERREIRA, Vitor Francisco; VASCONCELLOS, Marne Carvalho de. Universidade Federal do Amazonas – UFAM.
PIBIC 2013/2014 – UFAM
Oncologia experimental e
toxicologia clínicaManaus - AM
Introdução
2
Naftoquinonas
• Derivadas do naftaleno• Família das quinonas• Dois grupos carbonílicos nas posições 1,2 ou 1,4 do anel
naftaleno
Figura 1: Estrutura química da 1,2-naftoquinona (A) e 1,4-naftoquinona (B).
• Extrato da folha Lawsonia inermis -> Cosmético e tratamento de micoses
Antifúngica Antitumoral
Antibacteriana
Antiviral
Introdução
3
IVS 320
• Naftoquinona furano• Derivada da Lawsona• Antifúngico contra Cryptococcus
spp. e diferentes espécies de Candida
IVS320 - 1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano-5,10(3aH,10bH)-diona
Antitumoral ??
Objeti vo
4
Avaliar o potencial citotóxico e genotóxico da IVS320
(1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano-
5,10(3aH,10bH)-diona) na linhagem de fibroblastos
humano não-tumoral (MRC5).
Metodologia
5
Obtenção da amostra:
Amostra:
Obtida sinteticamente a partir de 2-hidroxi-1,4-naftoquinona (Lawsona – C10H6O3) e cedida pelo Prof. Vitor Francisco Ferreira da
Universidade Federal Fluminense .
IVS320 - 1H-ciclopenta[b]nafto[2,3-d]furano-5,10(3aH,10bH)-diona
Metodologia
6
Cultura de células
Meio de cultura Dulbeco’s Modified Eagle Medium (DMEM), contendo 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e 1% de antibiótico Penicilina/Estreptomicina.
Fibroblasto Humano não-tumoral (MRC5);
Linhagem:
Cultura celular:
As células foram mantidas em estufa a 5% de CO2 e 37oC.
Fonte: Arquivo pessoal
Metodologia
7
Cultura de célulasObtenção da amostra
Avaliação da Citotoxicidade Avaliação da Genotoxicidade
Alamar Blue Teste do Cometa
IVS320
Plaqueamento e tratamento
-Placas de 96 poços- 0,5 x 104 cél/poço- Curva 0,3125uM a 20uM
-Placas de 24 poços- 20 x 104 cél/poço- 1μM; 2,5 μM e 5 μM
- pH Alcalino- pH Neutro- ID e FD
- CI50
Controle positivo: DOXORRUBICINA
Controle negativo:DMSO
(Ahmed et al, 1994) (Singh et al, 1988)
Resultados e discussão
8
Citotoxicidade
SubstânciaCI50 (µM)
24 h 48 h 72 h
IVS320 3,83 (3,24 – 4,52) 3,44 (3,13 – 3,77)3,76 (3,38 –
4,18)
Doxorrubicina 3,90 (3,15 – 4,83) 0,43 (0,37 – 0,50)0,34 (0,27 –
0,43)Tabela 1: Efeito da IVS320 sobre a linhagem de fibroblasto humano não - neoplásico (MRC5) nos tempos de tratamento de 24, 48 e 72h. Os valores estão representados como CI50 (intervalo de confiança de 95%).
Doxorrubicina foi utilizada como controle positivo.
c
•A IVS320 foi capaz de ser menos tóxica que a doxorrubicina em 48 e 72h de tratamento;
•FREIRE et al (2010)
Resultados e discussão
9
Genotoxicidade –Índice de Dano Total
Gráfico 1- Índice de dano ao DNA em células MRC-5, após 3h de tratamento com a IVS320. A- Cometa alcalino; B- Cometa neutro. * p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo, quando comparado ao DMSO (0,2%) por ANOVA seguido de teste Tukey.
A B
•Cometa Alcalino: A IVS320 apresentou aumento significativo no ID nas concentrações de 2,5 e 5,0 µM comparado ao DMSO e DOX.
•Cometa Neutro: A IVS320 apresentou diminuição significativa no ID em todas as concentrações testadas comparado a DMSO e DOX.
Resultados e discussão
10
Genotoxicidade – Frequência de dano
A B
Gráfico 2- Frequência de dano ao DNA em células MRC-5, após 3h de tratamento com a IVS320. A- Cometa alcalino; B- Cometa neutro.
0 1 2 3 40
20
40
60
80
100
Alcalino
Fre
quê
ncia
de
Dan
o
DMSOdox1,02.55,0
0 1 2 3 40
20
40
60
80
100
Neutro
Fre
quê
nci
a d
e D
ano
DMSODox1,02,55,0
Doxorrubicina
Alcalino: Graus 1 e 2
Neutro: Graus 3 e 4
IVS320 (2,5 µM)
Alcalino: Grau 3
Neutro: Grau 1
Conclusão
11
IVS 320
Baixa citotoxicidade em linhagem de fibroblasto não-neoplásico comparada a Doxorrubicina após 48 e 72h de tratamento;
Apresentou genotoxicidade em todas as concentrações testadas, em menor intensidade que a Doxorrucinica no ensaio do cometa em pH neutro (quebra de fitas duplas);
Ensaios complementares são necessários para comprovar sua segurança e verificar se o tipo de dano causado ao DNA das células
é reversível ou não.
Agradecimentos
12
À Deus e minha família Profa. Dra. Marne Carvalho de Vasconcellos Mariana Filomena do Carmo Cardoso Prof. Dr. Fernando de Carvalho da Silva Prof. Dr. Vitor Francisco Ferreira Gilderlany Gomes de Souza Ribeiro
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas e à todos que contribuíram diretamente para a realização desta pesquisa.
Referências Bibliográfi cas
13
AHMED, S. A.; GOGAL, R. M.; WALSH, J. E. A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes an alternative to [3H] thymidine incorporation assay. Journal of immunological methods, v. 170, n. 2, p. 211-224, 1994.
FERREIRA, M. P. S.; CARDOSO, M. F. C.; SILVA, F. C.; FERREIRA, V. F.; LIMA, E. S.; SOUZA, J. V. B. Antifungal activity of synthetic naphthoquinones against dermatophytes and opportunistic fungi: preliminary mechanism-of-action tests. Ann Clin Microbiol Antimicrob, v. 13, n. 26, 2014.
FREIRE, C. P. V. et al. Synthesis and biological evaluation of substituted a- and b-2,3-dihydrofuran naphthoquinones as potent anticandidal agents. Med. Chem. Commun., v. 1, p. 229-232. 2010.
SINGH, N. P.; MCCOY, M. T.; TICE, R. R.; SCHNEIDER, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research, Volume 175, Issue 1, pp. 184-191, 1988.
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