plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - … · c. solid phase extraction (spe) ... e. alat...
Post on 22-Jun-2018
216 Views
Preview:
TRANSCRIPT
VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM
BUAH MELON (Cucumis melo L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Florentina Silviana Devi
NIM: 118114149
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
VALIDASI METODE ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM
BUAH MELON (Cucumis melo L.)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Florentina Silviana Devi
NIM: 118114149
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta
2015
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“ Hidup untuk bermimpi, Hidup untuk berusaha, Hidup untuk bersyukur dan
kembalilah pada sebuah mimpi, usaha dan syukur”
Karya ini kudedikasikan untuk orang tua, keluarga, teman-teman dan
almamaterku Universitas Sanata Dharma.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan atas berkat karunia yang telah dilimpahkan
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “VALIDASI METODE
ANALISIS RESIDU DIFENOKONAZOL DALAM BUAH MELON (Cucumis melo
L.)” sebagai tugas akhir untuk mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.).
Selama pelaksanaan penelitian penulis mendapatkan banyak dukungan
motivasi, bantuan arahan, bimbingan, kritik, saran dan doa dari berbagai pihak. Maka
dari itu, penulis ingin mengucapkan terima kasih, terutama kepada:
1. Prof. Dr. Sri Noegrohati, Apt. selaku pembimbing utama skripsi yang telah
memberikan bimbingan, arahan, kritik, saran, doa, semangat motivasi, dan
bantuan lainnya sejak awal hingga akhir penelitian.
2. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt, Selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta
3. Jeffry Julianus, M.Si dan F. Dika Octa riswanto, M.Sc., selaku dosen penguji
yang memberikan kritik dan saran untuk membangun skripsi ini.
4. Sanjayadi M.Si., yang telah banyak memberikan arahan, bimbingan, kritik,
saran, doa, membantu dalam optimasi kesesuaian sistem GC-ECD yang
digunakan serta memberi semangat motivasi dan dukungan sejak awal hingga
akhir penelitian.
5. Nina setiawati, M.Sc., Apt. selaku kepala laboratorium Universitas Sanata
Dharma yang memberikan perijinan untuk menggunakan laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
6. Seluruh dosen dan karyawan fakultas farmasi Universitas Sanata Dharma atas
bantuan selama proses pembelajaran menempuh jenjang S1 Farmasi.
7. Bapak Lukas Sumari dan mamak Katarina Katrin selaku orang tua yang selalu
mendoakan, mendukung, dan memberi motivasi sehingga penulis dapat
menyelesaikan program studi S1 farmasi.
8. Agnes Reka Wati, Stevanus midut, mamak Sri, Biyung, Pakpoh, selaku
keluarga penulis yang selalu mendoakan dan memberi motivasi hingga
penulis menyelesaikan studi S1 Farmasi.
9. Serlika Rostiana, Rizki Seviana, Rushadi Jatmiko, selaku tim skripsi yang
selalu memberikan pengertian, kerja sama, motivasi, dukungan, bantuan doa,
dalam proses penyelesaian skripsi.
10. Mas Bimo, Pak Kethul, Pak Mus, Pak Parlan, Pak Kunto, seluruh staf
laboratorium Universitas Sanata Dharma dan staf keamanan serta kebersihan
Universitas Santa Dharma.
11. Teman-teman FSM-D dan FST-B 2011 selaku teman-teman kelas yang telah
memberikan banyak kesan kenangan dan pengalaman selama empat tahun ini.
12. Seluruh pihak yang mungkin tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah
membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi.
13. Mas bebek, Mas Enggal, dan pak Bantul selaku pemilik ladang melon yang
membantu mengurus melon sebagai subjek uji dalam penelitian hingga panen.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL .......................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ............................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................... v
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................................... vi
PRAKATA ...................................................................................................... vii
DAFTAR ISI ..................................................................................................... x
DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................. xvii
INTISARI ..................................................................................................... xviii
ABSTRACT ..................................................................................................... .xix
BAB I PENGANTAR ....................................................................................... 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
A. Latar Belakang ........................................................................................... 1
1. Permasalahan ........................................................................................ 4
2. Keaslian Penelitian ................................................................................ 4
3. Manfaat Penelitian ................................................................................ 4
B. Tujuan Penelitian ........................................................................................ 5
Bab II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................. 6
A. Difenokonazol ............................................................................................. 6
1. Sifat Fisika Kimia ................................................................................. 7
2. Toksisitas ............................................................................................. 8
B. Kandungan Buah Melon ........................................................................... 10
C. Solid Phase Extraction (SPE) ................................................................... 12
D. Ekstraksi .................................................................................................... 14
E. Gas Chromatography (GC) ...................................................................... 17
1. Pengertian ............................................................................................ 17
2. Prinsip pemisahan ............................................................................... 19
3. Kinerja GC .......................................................................................... 20
4. Instrumentasi ...................................................................................... 22
F. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 29
1. Akurasi ............................................................................................... 30
2. Presisi ................................................................................................. 30
3. Linearitas dan rentang ......................................................................... 31
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
4. Limit of Quantitation (LOQ) ............................................................... 31
G. Metode Kuantifikasi .................................................................................. 31
1. Metode standar eksternal..................................................................... 32
2. Metode standar internal ....................................................................... 32
3. Metode standar adisi ........................................................................... 33
H. Landasan Teori .......................................................................................... 34
I. Hipotesis .................................................................................................... 35
BAB III METODE PENELITIAN.................................................................. 38
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................ 38
B. Variabel Penelitian .................................................................................... 38
1. Variabel bebas ..................................................................................... 38
2. Variabel tergantung ............................................................................. 38
3. Variabel pengacau terkendali .............................................................. 39
C. Definisi Operasional.................................................................................. 39
D. Bahan Penelitian........................................................................................ 40
E. Alat Penelitian ........................................................................................... 41
F. Tata Cara Penelitian .................................................................................. 41
1. Uji kesesuaian sistem GC-ECD .......................................................... 41
2. Preparasi sampel dengan metode QUeChERS .................................... 42
3. Pembuatan seri larutan baku Difenokonazol....................................... 42
4. Optimasi clean-up SPE C18 ................................................................. 43
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
5. Validasi metode analisis ...................................................................... 47
G. Analisis Hasil ............................................................................................ 50
H. Rancangan Penelitian ................................................................................ 55
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 65
A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD ............................................................... 66
1. Optimasi instrument GC-ECD ............................................................ 66
2. Kinerja instrument GC-ECD ............................................................... 67
B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS ........................................ 77
C. Validasi Metode Analisis .......................................................................... 87
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................ 100
A. Kesimpulan ............................................................................................ 100
B. Saran ........................................................................................................ 101
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 102
LAMPIRAN .................................................................................................. 106
BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. 120
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Kandungan dan Komposisi Gizi Buah Melon Tiap 100 gram ........... 10
Tabel II. Kriteria Validasi ................................................................................. 30
Tabel III. Hasil Optimasi Kondisi GC ............................................................ 67
Tabel IV. Nilai Rata-rata N, Rs, danTF Puncak Difenokonazol Kurva Baku Solven
.......................................................................................................... 69
Tabel V.Nilai %RSD Kurva Baku Solven ....................................................... 71
Tabel VI. Uji Sensitivitas .................................................................................. 74
Tabel VII. Nilai Response Factor ..................................................................... 75
Tabel VIII. Nilai %D......................................................................................... 77
Tabel IX. Kadar Air Buah dalam Melon ........................................................... 78
Tabel X. Hasil Optimasi Lama Sentrifugasi ..................................................... 80
Tabel XI. Penentuan Kapasitas SPE (Sigmaaldrich) ....................................... 83
Tabel XII. Optimasi Penentuan Kapasitas SPE C18 .......................................... 83
Tabel XIII. Nilai % Recovery Hasil Optimasi Kelayakan Penggunaan SPE Berulang
.......................................................................................................... 86
Tabel XIV. Hasil Optimasi Clean-up SPE C18 ................................................. 87
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
Tabel XV. Nilai %Recovery Metode Adisi C .................................................. 89
Tabel XVI. Nilai SD, Dan %RSD Metode Adisi C .......................................... 90
Tabel XVII. Nilai %Recovery Metode Adisi B ............................................... 90
Tabel XVIII. Nilai SD, Dan %RSD Metode Adisi B ....................................... 90
Tabel XIX. Nilai %Recovery, SD,Dan %RSD Metode Adisi A ...................... 91
Tabel XX. Nilai N, Rs, TF Dan Tr Dari Kurva Adisi ....................................... 95
Tabel XXI. Hasil % Recovery pada Kisaran 0,263-0,789 ng............................ 95
Tabel XXII. Hasil %RSD sebagai Presisi Kurva Adisi .................................... 96
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur Difenokonazol ..................................................................... 7
Gambar 2. Proses Skematik Prosedur Spe ........................................................ 12
Gambar 3. Diagram Skematik Kromatografi Gas ............................................. 22
Gambar 4. Struktur Difenokonazol ................................................................... 66
Gambar 5. Kromatogram Difenokonazol dalam Pelarut Heksan...................... 68
Gambar 6. Kurva Baku Solvent antara Luas Puncak Difenokonazol/DCB vs Kadar
Difenokonazol ................................................................................. 73
Gambar 7. Luas Puncak Difenokonazol yang Diperoleh dari Hasil Fraksinasi setelah
Washing dengan 5% Meoh Vs 100% UPW .................................. 84
Gambar 8. Luas Puncak Difenokonazol Hasil Elusi Difenokonazol dalam SPE C18 per
mL metanol ......................................................................................... 85
Gambar 9.Linearitas Kurva Adisi ..................................................................... 93
Gambar 10. Kromatogram Kurva Adisi ............................................................ 94
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Perhitungan Resolusi (Rs) .............................................................. 105
Lampiran 2. Perhitungan IDL & IQL ................................................................ 106
Lampiran 3. Certificate Of Analysis DCB .......................................................... 109
Lampiran 4. Certificate Of Analysis Asetonitril ................................................. 110
Lampiran 5. Certificate Of Analysis Heksan....................................................... 111
Lampiran 6. Certificate Of Analysis Metanol ..................................................... 112
Lampiran 7. Certificate Of Analysis MgSO4 ................................................................................. 114
Lampiran 8. Certificate Of Analysis Na2Hsitrat .................................................. 115
Lampiran 9. Certificate Of Analysis Na3Sitrat .................................................... 116
Lampiran 10. Certificate Of Analysis NaCl ........................................................ 117
Lampiran 11. Certificate Of Analysis Formulasi Difenokonazol Donasi dari
PT.Syngenta ................................................................................ 118
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
INTISARI
Kondisi iklim tropis Indonesia yang panas dan lembab memicu perkembangan
dan penyebaran jamur antaknosa (Colletotrichum gloesporioides) menyebakan
kerusakan pada buah melon (Cucumis melo L.). Untuk mengontrol jamur antraknosa,
para petani menggunakan difenokonazol. Oleh karena itu, untuk menjamin
konsumen, tingkat residue difenokonazol yang tertinggal dalam melon diawasi.
Tujuan dari studi ini adalah menvalidasi metode analisis untuk residu difenokonazol
dalam buah melon, agar metode ini dapat diterapkan untuk analisis residu pestisida di
laboratorium Indonesia.
Proses ektraksi pada pengembangan metode ini dibantu dnegan metode LLE
dari QuEChERS, dimana proses cleanup menggunakan SPE C18 dan determinasi
menggunakan GC-ECD serta kuantifikasi standar internal menggunakan
dekaklorobifenil (DCB). Performa kerja GC-ECD menunjukan presisi dari rasio area,
waktu retensi <20%, ketika integritas standar menujukan RSD dari response factor
dan %difference <20%. Range linearitaspada konsentrasi 0,053-0,526 ng dengan r
0,890 - 0,999, Instrumental Detection Limit (IDL) 0,01-0,07 ng/ml dan Instrumental
Quantitation Limit (IQL) 1,06 ng/g . Recovery fortifikasi sampel ekstrak blank pada
konsentrasi 0,158-0,684 ng sebesar 86-91 % dan tidak ada efek matrik secara
signifikan. Kesalahan pada tahap ekstraksi, cleanup dan determinasi secara berturut-
turut 0,133%, 8,753%, dan 8,670%. Recovery fortifikasi sampel pada 0,158-0,684ng
sebesar 71-115% . LOQ sebesar 0,002 g/g dan LLMV 7,364 ng/g, oleh karena itu
metode ini sesuai untuk mengawasi kadar residu difenokonazol dalam buah melon,
yang memiliki Batas Maksimum Residu (BMR) sebesar 0,7 mg/kg.
Kata kunci : Difenokonazol, Residu pestisida, Amistartop, QuEChERS, Solid Phase
Extraxtion, GC-ECD , Validasi Metode.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xix
ABSTRACT
Indonesian tropical climate which is warm and humid promote the
development and spread antrachnose (Colletotrichum gloesporioides) causing
significant damage in melon (Cucumis melo L.). To control the antracmose, farmers
used difenoconazole. For that reason, to assure the safety of the consumer, the level
of difenoconazole residue in melon should be monitored. The purpose of this study is
to develop a valid analytical method for difenoconazole residue in melon can be done
in common pesticide residue laboratory in Indonesia.
The extraction process of the development method was done following the
assisted LLE method of the QuEChERS, while the clean-up process was done using
C18 SPE catridge and determinate by GC-ECD and quantified by internal
standardization using decachlorobiphenyl (DCB) as internal standard. The
performance of the GC-ECD shows precision of ratio area, retention time less than
20%, while the standard integrity shows RSD of the response factor and %difference
<20%. Linearity range was 0,053-0,526 ng with r 0,890-0,999,. Instrumental
detection Limit (IDL) was 0,01-0,07 ng/ml and Instrumental Quantitation Limit
(IQL) was 1,06 ng/g, Recovery of fortified blank extract at 0,158-0,684 ng was 86-
91% and no matrix effect was observed. The error at extraction step, cleanup step and
determination step were 0,133%, 8,753%, and 8,670 % respectively. The recovery of
Fortified sample at 0,158–0,684 ng was 71-115%. The LOQ was 0,002 g/g and the
LLMV 7,364 ng/g, therefore this method is fit for monitoring difenoconazole residue
in melon, which has Maximum Residue Limit (MRL) of 0.7 mg/kg.
Key words: Difenokonazol, Pesticide residue, Amistartop, QuEChERS, Solid Phase
Extraxtion, GC-ECD, method validation
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Indonesia merupakan negara agraris, Sebagian besar penduduk Indonesia
bermata pencaharian sebagai petani. Budidaya tanaman hortikultura yang meliputi
sayuran dan buah-buahan semakin banyak diminati petani, karena komoditas ini
mampu memberikan keuntungan lebih tinggi dibandingkan padi dan palawija dalam
luas area tanam yang sama. Salah satu komoditas hortikultura yang dimaksud adalah
tanaman melon (Samadi,2007).
Melon merupakan salah satu buah yang ekslusif, yang telah memasyarakat.
Melon banyak dibudidayakan di Bogor, Lampung, Jakarta, Jawa Barat, Yogyakarta,
Jawa Tengah (seperti Sukoharjo, Surakarta, Sragen, Karanganyar dan Klaten), dan
Jawa Timur (Malang, Ngawi, Walikukun, Kedung Galar, Ngrambe, Pacitan,
Madiun). Buah ini sangat digemari, terutama apabila dihidangkan sebagai buah segar.
Di dalam perusahaan makanan dan minuman, melon sering kali dimanfaatkan sebagai
bahan penyedap rasa untuk memberikan aroma segar yang khas dari buah melon.
Selain itu saat ini sedang gencar mengenai ekspor buah tropis. Pasar ekspor dunia
menuntut pengadaan buah-buah tropis untuk memenuhi kebutuhan konsumen. Salah
satu buah tropis yang dimaksud adalah melon. Namun ekspor ini terganggu dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
pengadaan buah melon, karena adanya kendala-kendala dalam budidaya buah melon.
Saat ini Indonesia hanya mampu mengekspor buah melon satu bulan sekali.
Iklim tropis di Indonesia menyebabkan budidaya melon tidak terlepas dari
adanya kendala serangan hama penyakit terutama karena jamur antraknosa. Adanya
serangan hama penyakit yang berat dapat menurunkan produktivitas tanaman, bahkan
menyebabkan gagal panen. Oleh karena itu, perlu dilakukan usaha pengendalian
pemberantasan hama dan penyakit. Pengendalian dan pemberantasan fungi umumnya
menggunakan fungisida yang berlebihan sehingga dapat membahayakan kesehatan
konsumen. Sehingga untuk melindungi kesehatan konsumen nasional dan
internasional perlu diadakan pengawasan terhadap kadar fungisida agar tidak
melebihi kadar maksimum yang diperbolehkan (Sudarmo,1999).
Fungisida adalah bahan kimia yang dipergunakan untuk membunuh dan
menghentikan perkembangan jamur. Fungisida yang popular digunakan oleh petani
saat ini adalah AMISTARTOP Azoxystrobin 200 g/L dan Difenokonazol 125 g/L.
Penggunaannya menurut INDOGAP sesuai label adalah maksimum tiga kali aplikasi
dengan konsentrasi 0,5 mL/L. Komposisi fungisida terdiri dari dua bahan zat atau
senyawa kimia yaitu difenokonazol dan azoxystrobin. Difenokonazol merupakan
bahan aktif fungisida golongan tiga yang menghambat pertumbuhan mycelia, dimana
pertumbuhan jamur/fungi menjadi lambat atau berhenti dan efektif untuk mencegah
infeksi selanjutnya atau invasi dari jaringan-jaringan host. Penggunaan dan aplikasi
fungisida pada tanaman akan meninggalkan sisa-sisa fungsida yang disebut dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
residu pestisida. Residu fungisida difenokonazol dengan kadar tertentu pada tanaman
dapat membahayakan kesehatan dan lingkungan sekitar. Oleh karena itu untuk
menjamin bahwa melon asal Indonesia layak konsumsi tanpa adanya dampak negatif
dari residu pestisida perlu dilakukan analisis dengan metode analisis yang valid.
Analisis penetapan kadar residu pestisida dengan kadar yang kecil pada buah
melon, diperlukan suatu pengembangan metode yang selektif dan sensitif. Dalam
beberapa tahun terakhir ini, salah satu metode analisis baku yang sering digunakan
untuk menganalisis residu pestisida adalah metode baku AOAC 2007.01 yaitu
analisis multiresidu dengan dasar QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, and Safe) yang dalam ekstraksinya menggunakan asetonitril, clean-up
sampel cukup dilakukan dengan dispersive Solid Phase Extraction (d-SPE) kemudian
dideterminasi dengan LC/MS/MS. Analisis dengan LC/MS/MS menjadi kendala bagi
para analisis residu pestisida di Indonesia. Pada umumnya laboratorium analisisis di
Indonesia tidak memiliki instrumen tersebut, begitu juga metode residu
difenokonazol pada matriks buah melon belum tersedia. Oleh karena itu untuk
mengatasi masalah tersebut diperlukan suatu modifikasi metode dengan instrumen
yang mudah ditemui tanpa mengurangi selektifitas dan sensitifitas. Pada penelitian
ini modifikasi QuEChERS dilakukan dengan kromatografi Gas (GC) yang dilengkapi
detektor penangkap elektron (ECD) yang kurang spesifik jika dibandingkan dengan
LC MS/MS. Perlu adanya penyesuaian terutama pada tahap clean-up yang
dilanjutkan dengan validasi penuh menggunakan matriks buah melon.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
1. Permasalahan
Dari uraian masalah di atas, dapat disampaikan perumusan masalah :
a. Apakah instrumen GC-ECD (electron Capture Detector/ECD) sesuai untuk
penetapan kadar residu difenokonazol dalam matriks buah melon?
b. Bagaimana proses validasi metode analisis modifikasi QuEChERS untuk
analisis residu difenokonazol dalam matriks buah melon?
c. Bagaimana optimasi proses ekstraksi dan clean-up residu difenokonazol
dalam matriks buah melon dengan SPE?
2. Keaslian penelitian
Sampai saat ini belum ada penelitian mengenai “Validasi Metode Analisis
Residu Difenokonazol dalam Buah Melon (Cucumis melo L.)”.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis.Penelitian ini dapat memberikan pengetahuan tambahan
terhadap perkembangan metode QuEChERS dalam analisis residu fungisida
difenokonazol dengan menggunakan Gas Chromatography (GC) pada sampel
buah melon.
b. Manfaat praktis. Penelitian ini dapat digunakan sebagai prosedur analisis
penetapan kadar residu fungisida difenokonazol dalam buah melon dengan
hasil yang akurat dengan menggunakan Gas Chromatography Electron
Capture Detector (GC-ECD).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
B. Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian ini adalah
1. Mengembangkan metode QuEChERS dalam analisis penetapan kadar residu
fungisida difenokonazol dalam buah melon hingga didapatkan hasil yang
valid.
2. Mampu melakukan validasi metode analisis residu difenokonazol pada buah
melon (Cucumis melo L.) dengan instrumen Gas Chromatography Electron
Capture Detector (GC-ECD).
Tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Mengetahui proses ekstraksi QuEChERS serta pelarut yang cocok untuk
mencari difenokonazol dari buah melon ( Cucumis melo L.).
2. Mendapatkan komposisi fase diam dan fase gerak optimum pada proses
clean-up menggunakan SPE C18.
3. Mampu menetapkan kadar residu pestisida difenokonazol dengan kondisi
Gas Chromatography Electron Capture Detector (GC-ECD) yang optimal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Difenokonazol
Difenokonazol merupakan fungisida spektrum luas yang digunakan untuk
berbagai penyakit pada berbagai buah, sayur, sereal dan tanaman lainnya. Fungisida
difenokonazol termasuk golongan fungisida triazol yang bekerja secara sistemik dan
memiliki daya preventif dan kuratif. Difenokonazol bekerja menghambat demetilasi
selama sintesis ergosterol sehingga menghentikan perkembangan jamur.
Difenokonazol merupakan molekul yang berpotensi dapat bergerak, tidak mudah
untuk dicuci karena kelarutan dalam air rendah. Difenokonazol tidak volatil, persisten
di dalam tanah dan pada lingkungan akuatik (Anonim1, 2015).
Nama umum : difenokonazol
Sinonim : CGA 169374
Nama IUPAC :1-[2-[2-chloro-4-(4-chloro-phenoxy)-phenyl]-4-
methyl[1,3]dioxolan-2-ylmethyl]-1H-1,2,4-triazole
Rumus molekul : C19H17Cl2N3O3
Massa molekul :406,3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Rumus struktur (terdapat dua cincin karbon kiral pada struktur difenokonazol yang
menghasilkan diastereoisomer pasangan cis-trans) :
Gambar 1. Struktur Difenokonazol (EFSA, 2011).
1. Sifat Fisika Kimia
Bentuk fisik : putih, tidak berbau, bubuk Kristal halus
Titik lebur : 82-83 ºC
Titik didih : 100,8 ºC pada 3,7 mPa
Suhu dekomposisi : 337 ºC
Kepadatan relatif : 1,39 pada 22 ºC
Tekanan uap : 3,32 × 10-8
Pa pada 25 ºC
Kelarutan di dalam air : 15 mg/L pada 25 ºC
Log Pow (koefisien partisi) : 4,4 pada 25 ºC
Konstanta disosiasi dalam pKa : 1,1 pada 20 ºC
Konstanta Henry‟s law : 9,0 × 10-7
Pa m3 mol
-1 pada 25 ºC
Kelarutan dalam pelarut organic : Aseton > 500 g/L
Diklorometan > 500 g/L
Etil asetat > 500 g/L
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Hexan 3,0 g/L
Metanol > 500 g/L
Oktanol 110 g/L
Toluen > 500 g/L
(EFSA, 2011).
2. Toksisitas
Toksisitas Akut
LD50 oral pada tikus : 1453 mg/kg bb
LD50 oral pada mencit : > 2000 mg/kg bb
LD50 dermal pada kelinci : > 2010 mg/kg bb
LD50 inhalasi pada tikus : > 3,3 mg/L (4 jam paparan)
Iritasi kulit : tidak iritasi
Iritasi mata : tidak iritasi
Toksisitas Jangka Pendek
Target/Efek : Tikus : penurunan berat badan dan jantung, penurunan
nafsu makan dan minum, liver (pada dosis tinggi
setelah paparan secara oral), liver dan tiroid setalah
paparan secara dermal
Mencit : penurunan berat badan, penurunan berat
indung telur, liver (pembesaran dan peningkatan berat,
vakuolisasi dan koagulasi nekrosis)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
Anjing : penurunan berat badan, liver (berat meningkat
dan perubahan secara klinis), pembentukan katarak
(pada dosis tinggi)
NOAEL oral : Rat : 20 mg/kgbb/d (90 hari)
Mouse : 34 mg/kgbb/d (90 hari)
Anjing : 31 mg/kgbb/d (28 minggu)
NOAEL dermal : Rat : 100 mg/kgbb/d (28 hari)
Genotoksisitas : difenokonazol mungkin menjadi genotoksik secara in
vivo
Toksisitas Jangka Panjang dan Karsinogenisitas
Target/Efek : Rat : penurunan berat badan, liver (berat relative
meningkat, hepatosit hipertropi)
Tikus : penurunan berat badan, liver (berat meningkat,
perubahan histopatologi termasuk nekrosis, hipertropi,
perubahan lemak dan stasis empedu)
NOAEL : Rat : 1,0 mg/kgbb/d (2 tahun)
Tikus : 4,7 mg/kgbb/d (18 bulan)
Karsinogenisitas : adenoma/karsinoma liver pada mice, hanya pada dosis
tinggi, difenokonazol dianggap tidak menimbulkan
resiko karsinogenik pada manusia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Toksisitas Reproduksi
Target/Efek : Parental : menurunkan berat badan
Keturunan : menurunkan berat badan melalui laktasi
Reproduksi : tidak ada efek samping
NOAEL parental : 16,8 mg/kgbb/d
NOAEL reproduksi : 189 mg/kgbb/d
NOAEL keturunan : 16,8 mg/kgbb/d
Toksisitas Perkembangan
Target/Efek : Perkembangan : variasi skeletal (rat), peningkatan
jumlah resorpsi (rat, rabbit)
Maternal : penurunan berat badan dan nafsu makan
(rat, kelinci), aborsi dan kematian
NOAEL maternal : Rat : 15,6 mg/kg bb/d
Kelinci : 25 mg/kgbb/d
NOAEL perkembangan : Rat : 15,6 mg/kg bb/d
Kelinci : 25 mg/kgbb/d
Neurotoksisitas
Neurotoksisitas akut : data tidak tersedia, tidak ada indikasi neurotoksik
pada studi toksisitas akut
Neurotoksisitas berulang : data tidak tersedia, tidak ada indikasi neurotoksik
pada studi toksisitas akut
Neurotoksisitas tertunda : data tidak tersedia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
B. Kandungan Buah Melon
Kandungan gizi buah melon dapat dilihat pada Tabel.
Tabel I. Kandungan dan Komposisi Gizi Buah Melon tiap 100 gram
Komposisi Gizi Banyaknya (Jumlah)
Energi 29 kcal.
Protein 0,50 gram
Lemak 0,10 gram
Karbohidrat 6,8 gram
Serat 0,70 gram
Abu 0,70 gram
Kalsium 6 mg
Fosfor 6 mg
Kalium 180,00 mg
Zat besi 0,18 mg
Natrium 11 mg
Thiamin 0,07 mg
Riboflavin 0,01 mg
Vitamin B6 0,07 mg
Vitamin C 8,0 mg
Niacin 0,40 mg
Air 91,0 gram
(Roe, 2013).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
C. Solid Phase Extraction (SPE)
SPE C18 kolom digunakan untuk menyaring komponen matriks sampel
nonpolar, terutama pigmen dari ekstrak sampel. Ketika suatu ekstrak yang dielusikan
dengan asetonitril-air, aseton-air, atau asetonitril ke dalam kolom SPE C18, maka
pigmen dan lipid yang bersifat non-polar akan tertahan didalam kolom.
Dua strategi yang diterapkan dalam clean-up SPE untuk ekstrak sampel yaitu
isolasi analit dan isolasi matriks. Pada isolasi analit, analit akan teradsorbsi dalam
sorben SPE non polar. Kolom SPE dapat dibilas dengan larutan berair untuk
menghilangkan campuran koekstraktan, diikuti elusi dari analit yang terjebak dalam
kolom dengan pelarut organik. Analit pestisida dielusi melalui kolom. Strategi kedua
isolasi matriks, strategi ini lebih banyak digunakan dalam clean-up residu pestisida.
Pada umumnya prosedur clean-up dengan SPE isolasi matriks dirancang untuk
menjebak komponen matriks dalam kolom dan mengelusi baik pestisida polar
maupun non-polar melalui kolom.
Gambar 2. Proses Skematik prosedur SPE
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
GC merupakan suatu metode deteksi yang selektif terutama untuk determinasi
pestisida. Sistem GC digunakan untuk skrining berbagai pestisida yang mengandung
heteroatom seperti halogen, fosfor, sulfur dan nitrogen. Detektor sistem GC tidak
hanya memiliki sensitivitas yang tinggi, tetapi juga memiliki spesifitas yang baik,
oleh karena itu suatu clean-up sampel dipersyaratkan sebelum suatu sampel
dideterminasi dengan GC. Pada metode QuEChERS, sampel diekstraksi dengan
gojogan yang kuat dalam pelarut asetonitril. Magnesium sulfat dan NaCl
ditambahkan dan kemudian gojog kuat dan di sentrifugasi. Aliquot yang
menghasilkan supernatan kemudian di clean-up menggunakan dispersive SPE,
dicampur dengan sorben SPE PSA dan MgSO4. Beberapa tipe kolom yang sering
digunakan untuk clean-up dengan SPE yaitu C18, styrene-divivyl benzene (SDVB),
aminopropyl (NH2) , primary secondary amine (PSA), trimethyl ammonium strong
exchange (SAX), graphitized carbon black (GCB), florisil, silica, dan alumina.
Analysis of pesticides in food and environmental sampel (Tadeo,2008)
Ada empat tahapan dalam prosedur SPE yaitu
a. Pengkondisian
Kolom penjerap dialiri dengan menggunakan pelarut sampel untuk
membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan nilai pH yang sama,
sehingga perubahan-perubahan kimia yang tidak diinginkan ketika sampel
diaplikasikan dapat dihindari. Penjerap nonpolar dan penjerap penukar ion
dikondisikan menggunakan metanol kemudian akuades.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
b. Retensi sampel. Sampel dalam pelarut organik dilewatkan ke catridge baik
untuk menahan analit yang dituju, sementara komponen lain terelusi atau
untuk menahan komponen yang tidak diharapkan sementara analit yang
diharapkan terelusi.
c. Pembilasan. Seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap selama
tahap retensi.
d. Elusi. Tahap akhir dari penggunaan SPE untuk mengambil analit yang dituju
jika analit tersebut tetahan pada penjerap (Gandjar dan Rohman, 2009).
D. Ekstraksi
Liquid-liquid Extraction (LLE) merupakan salah satu ekstraksi yang sering
digunakan untuk memisahkan suatu analit dari komponen lain yang tidak diharapkan.
LLE adalah suatu metode pemisahan dengan menggunakan 2 fase pelarut yang saling
tidak bercampur dengan memperhatikan nilai P-nya. Metode ini digunakan dengan
menggunakan tabung sentrifuge dimana hanya memerlukan sampel yang lebih sedikit
(Cairns, 2004).
Ekstraksi cair-cair digunakan sebagai cara untuk praperlakuan sampel atau
clean-up sampel untuk memisahkan analit-analit dari komponen-komponen matriks
yang mungkin mengganggu pada saat kuantifikasi atau deteksi analit. Di samping itu,
ekstraksi pelarut juga digunakan untuk memekatkan analit yang ada dalam sampel
dengan jumlah kecil sehingga tidak memungkinkan atau menyulitkan untuk deteksi
atau kuantifikasinya (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Dalam bentuk paling sederhana, suatu alikuot larutan air digojog dengan
pelarut organik yang tidak campur dengan air. Kebanyakan prosedur ekstraksi cair-
cair melibatkan ekstraksi analit dari fase air ke dalam pelarut organik yang bersifat
non polar atau agak polar seperti heksana, metilbenzen, atau diklorometan. Meskipun
demikian, proses sebaliknya (ekstraksi analit dari pelarut organik non polar ke dalam
air) juga mungkin terjadi (Gandjar dan Rohman, 2007).
Analit-analit yang mudah terekstraksi dalam pelarut organik adalah molekul-
molekul netral yang berikatan secara kovalen dengan substituen yang bersifat non
polar atau agak polar. Sementara itu, senyawa-senyawa polar dan senyawa-senyawa
yang mudah mengalami ionisasi akan tertahan dalam fase air (Gandjar dan Rohman,
2007).
Ekstraksi cair-cair ditentukan oleh distribusi Nerst atau hukum partisi yang
menyatakan bahwa “Pada konsentrasi dan tekanan yang konstan, analit akan
terdistribusi dalam proporsi yang selalu sama diantara dua pelarut yang saling tidak
campur.” Perbandingan konsentrasi pada keadaan setimbang di dalam 2 fase disebut
dengan koefisien distribusi atau koefisien partisi (KD) dan dirumuskan sebagai
berikut: KD =
Keterangan:
KD = koefisien partisi
[S]org = konsentrasi analit dalam fase organik
[S]aq = konsentrasi analit dalam fase air
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
Pada prakteknya, analit seringkali berada dalam bentuk kimia yang berbeda
karena adanya disosiasi (ionisasi), protonasi, dan juga kompleksasi atau polimerasi
karenanya ekspreksi yang lebih berguna adalah rasio distribusi atau rasio partisi (D).
Persamaannya adalah sebagai berikut:
D =
Keterangan:
D = rasio partisi
(Cs)org = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase organik
(Cs)aq = konsentrasi total analit (dalam segala bentuk) dalam fase air
Analit yang mempunyai rasio distribusi besar (104 atau lebih) akan mudah
terekstraksi ke dalam pelarut organik meskipun proses kesetimbangan (yang) berarti
100% solut terekstraksi atau tertahan) tidak pernah terjadi (Gandjar dan Rohman,
2007). Kebanyakan ekstraksi dilakukan dengan menggunakan corong pisah dalam
waktu beberapa menit. Akan tetapi untuk efektivitas ekstraksi analit dengan rasio
distribusi yang kecil (< 1), ekstraksi hanya dapat dicapai dengan mengenakan pelarut
baru pada larutan sampel secara terus menerus (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pelarut organik yang dipilih untuk ekstraksi pelarut adalah pelarut yang
mempunyai kelarutan yang rendah dalam air (< 10%), dapat menguap sehingga
memudahkan penghilangan pelarut organik setelah dilakukan ekstraksi, dan
mempunyai kemurnian yang tinggi untuk meminimalkan adanya kontaminasi sampel
(Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Beberapa masalah yang sering dijumpai ketika melakukan ekstraksi pelarut
yaitu terbentuknya emulsi, analit terikat kuat pada partikulat, analit terserap oleh
partikulat yang mungkin ada, analit terikat pada senyawa yang mempunyai berat
molekul tinggi, dan adanya kelarutan analit secara bersama-sama dalam kedua fase.
Terjadinya emulsi merupakan hal yang paling sering dijumpai. Oleh karena itu, jika
emulsi antara kedua fase ini tidak dirusak maka recovery yang diperoleh kurang baik.
Emulsi dapat dipecah dengan cara:
a. Penambahan garam ke dalam fase air
b. Pemanasan atau pendinginan corong pisah yang digunakan
c. Penyaringan melalui glass-wool
d. Penyaringan dengan menggunakan kertas saring
e. Penambahan sedikit pelarut organik yang berbeda
f. Sentrifugasi (Gandjar dan Rohman, 2007).
E. Gas Chromatography( GC)
1. Pengertian
Kromatografi adalah suatu metode pemisahan campuran yang
didasarkan pada perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran
tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Berdasarkan fase
gerak yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi dua golongan besar
yaitu kromatografi gas dan kromatografi cair (McNair & Miller, 1998).
Kromatografi gas adalah teknik pemisahan yang mana solut-solut yang
mudah menguap dan stabil dengan pemanasan bermigrasi melalui kolom yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
mengandung fase diam dengan suatu kecepatan yang tergantung pada rasio
distribusinya (Gandjar dan Rohman, 2007).
Kromatografi gas pada dasarnya merupakan metode pemisahan yang
tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi senyawa tanpa menggunakan
baku pembanding. Optimasi kromatografi gas antara lain sensitivitas dan
selekstivitas/spesifitas instrumen terhadap analit yang dianalisis. Polaritas dan
volatilitas dari komponen yang akan dipisahkan menjadi pertimbangan untuk
memilih fase diam yang cocok (Grob, 1995).
Kromatografi Gas merupakan teknik analisis yang cepat, memiliki
hasil yang baik untuk analisis pestisida multikomponen, memiliki sensitifitas
tinggi dengan detektor yang spesifik (Nollet, 2004). Kromatografi gas dapat
digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif
dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi dari komponen yang
kita analisis dengan waktu retensi zat baku pembanding (standar) pada kondisi
analisis yang sama. Analisis kuantitatif diakukan dengan cara perhitungan
relatif dari tinggi atau luas puncak kromatogram komponen yang dianalisis
terhadap zat baku pembanding (standar) yang dianalisis (Johnson &
Stevenson, 1991).
Komponen-komponen yang akan dipisahkan didistribusikan diantara
fase diam dan fase gerak. Suatu kromatografi gas yang baik terdiri dari
komponen-komponen penting yaitu gas pembawa dan regulator tekanan,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
injektor, kolom, oven, detektor, dan pencatat signal (Rouessac dan Annick
2007; Orejuela dan Silva, 2004).
2. Prinsip pemisahan
Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu
senyawa dikurangi dengan interaksi yang mungkin terjadi antara solut dengan
fase diam. Fase gerak yang berupa gas akan mengelusi solut dari ujung kolom
lalu menghantarkannya ke detektor. Fase gerak dalam kromatografi gas juga
biasa disebut sebagai gas pembawa. Syarat gas pembawa adalah tidak reaktif,
dan murni/kering karena kalau tidak murni akan berpengaruh pada detektor
(Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada kromatografi gas, fase diam selalu ditempatkan di dalam sebuah
kolom. Fase diam ini dapat berupa suatu padatan ( Kromatografi Gas-Padat/
Gas Solid Chromatography). Cara penyerapan komponen pada kromatografi
gas padat merupakan proses adsorpsi pada permukaan, sedangkan
Kromatografi Gas Cair dinamakan kromatografi partisi (Soeryadi,1997).
Pemisahan pada kromatografi gas dapat dilakukan pada suhu tetap
yang basanya disebut dengan pemisahan isotermal dan dapat dilakukan
dengan menggunakan suhu yang berubah secara terkendali yang disebut
dengan pemisahan suhu terprogram. Pemisahan isotermal paling baik dipakai
pada analisis rutin atau jika kita mengetahui agak banyak sifat sampel yang
akan dipisahkan. Pilihan awal pada pemisahan isotermal ini adalah suhu yang
digunakan beberapa derajat di bawah titik didih komponen campuran utama.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Ada 2 hal yang perlu diperhatikan terkait dengan penggunaan pemisahan
isotemal ini, yaitu: (1) terkait dengan pemilihan suhu. Jika suhu yang
diguanakan terlalu tinggi maka komponen akan terelusi tanpa terpisah,
sementara jika suhu terlalu rendah maka komponen yang bertitik didih tinggi
akan keluar sangat lambat atau bahkan tetap dalam kolom sehingga akan
mengacaukan proses kromatografi selanjutnya, dan (2) terkait dengan proses
kromatografi, karena makin lama suatu sampel dalam kolom maka semakin
lebar alas puncaknya. Kedua hal ini dapat diatasi jika digunakan pemisahan
dengan suhu terprogram (Gandjar & Rohman,2007).
Pemisahan dengan suhu terprogram mempunyai keuntungan, yakni
mampu meningkatkan resolusi komponen-komponen dalam suatu campuran
yang mempunyai titik didih pada kisaran yang luas. Disamping itu, pada suhu
terprogram juga mampu mempercepat keseluruhan waktu analisis, karena
senyawa-senyawa dengan titik didih tinggi akan terelusi lebih cepat (Gandjar
& Rohman,2007).
3. Kinerja GC
Pemisahan yang terjadi pada analisis dengan kromatografi gas
dipengaruhi oleh efisiensi kolom dan efisiensi pelarut. Efisiensi kolom
menentukan pelebaran puncak kromatogram. Efisiensi kolom dapat diukur
dengan menghitung jumlah lempeng teoritis (N) dan panjang kolom yang
sesuai dengan plat teoritis (Height Equivalent to a Theoritical Plate, HETP).
HETP adalah panjang kolom yang diperlukan untuk mencapai kesetimbangan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
komponen cuplikan diantara fase gerak yang bergerak dan fase diam yang
diam. Semakin banyak jumlah lempeng teoritis, semakin kecil HETP, maka
efisiensi kolom meningkat dan pemisahan yang terjadi akan semakin baik (
Jennings, et all., 1987).
Faktor ikutan didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak tepi
muka sampai tepi belakang puncak dibagi dua kali jarak dari maksimum
puncak sampai tepi muka puncak, jarak-jarak tersebut diukur pada titik yang
ketinggiannya 5% dari tinggi puncak di atas garis dasar. Untuk suatu puncak
yang simetris, factor ikutan (Tf) besarnya satu, dan besarnya harga Tf ini akan
bertambah jika kromatogram semakin tambah berekor (Jennings, et all.,
1987).
Pemisahan yang sebenarnya dari dua puncak yang berurutan diukur
dengan resolusi atau daya pisah. Resolusi merupakan suatu ukuran
keefisienan kolom dan pelarut yang dapat menerangkan sempitnya puncak
dan juga pemisahan antara dua maksimum puncak. Resolusi didefinisikan
sebagai jarak antara dua puncak dibagi dengan jumlah lebar masing-masing
puncak dengan diukur dari alas puncak. Bila nilai resolusi adalah 1 maka
kesempurnaan pemisahan dua puncak adalah 99,7%. Umumnya dalam
praktek, nilai resolusi 1,0 tidak cukup baik karena derajat overlap. Pemisahan
yang baik dicapai pada resolusi sekitar 1,5 atau lebih (Wittkowski &
Matissek,1990).
4. Instrumentasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Pada gambar dibawah ini dapat dilihat skematik dari komponen GC-ECD:
Gambar 3. Diagram skematik kromatografi gas (Nagel, 2004)
1. Gas pembawa. Fase gerak dalam kromatografi gas disebut gas pembawa dan
harus murni dan inert secara kimia. Gas pembawa yang umumnya digunakan
adalah helium, nitrogen, argon, dan hidrogen (Skoog, West, Holler,and
Crouch, 2004).
Pemilihan gas pembawa tergantung pada penggunaan spesifik dan
jenis detektor yang digunakan. Gas pembawa untuk detektor ECD biasanya
adalah N2 dengan kecepatan alir 30-60 mL/menit.Untuk setiap pemisahan
dengan kromatografi gas terdapat kecepatan optimum gas pembawa yang
tergantung pada diameter kolom. Kolom kapiler menggunakan kecepatan alir
gas yang rendah, yakni antara 0,2 – 2 mL/menit. Karena kecepatan alir gas
pembawa pada kolom kapiler sangat rendah, maka pada kebanyakan detektor
ditambah gas tambahan yang ditambahkan ke dalam eluen setelah keluar dari
kolom tetapi belum mencapai detektor. Gas tambahan umumnya sama dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
gas pembawa, meskipun kadangkala digunakan helium. Gas pembawa bekerja
paling efisien pada kecepatan alir tertentu. Gas nitrogen akan efisien jika
digunakan dengan kecepatan alir ± 10 mL/menit, sementara helium akan
efisien pada kecepatan alir 40 mL/menit (Gandjar dan Rohman, 2007).
2. Sample Injector. Ruang injektor atau inlet berfungsi untuk menghantarkan
sampel ke dalam aliran gas pembawa. Sampel yang akan dikromatografi
dimasukkan ke dalam ruang suntik melalui gerbang suntik yang biasanya
berupa lubang yang ditutupi dengan septum atau pemisah karet. Ruang suntik
harus dipanaskan tersendiri (terpisah dari kolom) dan umumnya 10 – 15 ºC
lebih tinggi daripada suhu kolom maksimum. Jadi seluruh sampel akan
menguap segera setelah sampel disuntikkan (Gandjar dan Rohman, 2007).
Pada kolom kapiler, sampel yang diperlukan sangat sedikit bahkan
sampai 0,01 μL, karenanya berbeda dengan kolom kemas yang memerlukan 1
–100 μL sampel. Karena pengukuran secara akurat sulit dilakukan jika sampel
yang disuntikkan terlalu kecil (pada kolom kapiler), maka ditempuh suatu cara
untuk mengecilkan ukuran sampel setelah penyuntikan. Salah satu cara yang
dilakukan adalah dengan menggunakan teknik pemecah suntikan (split
injection). Dengan menggunakan pemecah suntikan ini, sampel yang
banyaknya diketahui, disuntikkan ke dalam aliran gas pembawa dan sebelum
masuk ke kolom, gas pembawa ini dibagi menjadi 2 aliran. Satu aliran masuk
ke dalam kolom dan satunya lagi akan dibuang. Aliran relatif dalam kedua
aliran ini dikendalikan dengan sejenis penghambat seperti katup jarum pada
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
aliran yang dibuang. Laju alir di dalam kedua aliran diukur dan ditentukan
nisbah (rasio) pemecahannya. Jika 1 μL sampel dimasukkan ke dalam
pemecah aliran yang mempunyai nisbah pemecahan 1:100, maka sebanyak
0,01 μL sampel masuk ke dalam kolom dan sisanya akan dibuang (Gandjar
dan Rohman, 2007).
3. Kolom. Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di
dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan komponen
sentral pada kromatografi gas. Terdapat 2 jenis tipe kolom yang digunakan
dalam gas kromatografi, yaitu kolom kemas dan kolom kapiler atau sering
disebut open tubular columns. Dahulu, lebih banyak digunakan kolom kemas
untuk melakukan analisis menggunakan gas kromatografi. Untuk aplikasi
masa kini, kolom kemas digantikan dengan kolom kapiler karena lebih efisien
dan lebih cepat (Skoog, West, Holler, and Crouch, 2004). Semakin sempit
diameter kolom, maka efisiensi pemisahan kolom semakin besar atau puncak
kromatogram yang dihasilkan semakin tajam. Pada umumnya, seorang analis
akan memilih kolom dengan diameter 0,2 mm atau yang lebih kecil ketika
menganalisis sampel dengan konsentrasi sekelumit atau ketika seorang analis
akan memisahkan komponen yang sangat kompleks (Gandjar dan Rohman,
2007). Kolom kapiler terbuat dari silica (SiO2) dan dilapisi dengan polymide
(plastik yang mampu menahan suhu 350 ºC). Pada bagian dalam terdapat
rongga yang menyerupai pipa, oleh karena itu kolom kapiler juga disebut
Open Tubular Columns. Fase diam melekat mengelilingi dinding dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
kolom. Terdapat 4 macam jenis lapisan pada kolom kapiler ini, yaitu: WCOT
(Wall Coated Open Tubular Column), SCOT (Support Coated Open Tubular
Column), PLOT (Porous Layer Open Tubular Column), dan FSOT (Fused
Silica Open Tubular Column). WCOT (Wall Coated Open Tubular Column)
memiliki 0,1–5 μm lapisan tipis fase diam cair yang terdapat pada dinding
bagian dalam kolom. SCOT (Support Coated Open Tubular Column)
memiliki partikel solid yang dilapisi dengan fase diam cair yang terdapat pada
bagian dalam dinding. Pada PLOT (Porous Layer Open Tubular Column)
partikel padat sebagai fase diam aktif. Dengan besarnya luas area yang
dimiliki, SCOT dapat menampung sampel lebih besar daripada WCOT.
Performa SCOT berada diantara WCOT dan kolom kemas. Diameter dalam
kolom kapiler memiliki ukuran 0,10 – 0,53 mm dengan panjang 15 sampai
100 m, umumnya adalah 30 m (Harris, 2010). Menurut Moffat, Osselton, and
Widdop (2011) kolom kapiler menghasilkan resolusi, sensitivitas, daya tahan
yang lebih baik daripada kolom kemas. Kolom kapiler sangat banyak dipakai
atau lebih disukai oleh para ilmuwan. Salah satu penyebabnya adalah
kemampuan kolom kapiler memberikan harga jumlah plat teori yang sangat
besar (> 300.000 plat). Fase diam yang dipakai pada kolom kapiler dapat
bersifat non polar, polar, atau semi polar. Fase diam non polar yang paling
banyak digunakan adalah metil polisiloksan (HP-1; DB-1; SE- 30; CPSIL-5)
dan fenil 5%- metilpolisiloksan 95% (HP-5; DB-5; SE-52; CPSIL- 8). Fase
diam semi polar adalah seperti fenil 50% - metilpolisiloksan 50% (HP-17;
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
DB-17; CPSIL-19), sementara itu fase diam yang polar adalah seperti
polietilen glikol (HP-20M; DB-WAX; CP-WAX; Carbowax-20M). Jenis fase
diam akan menentukan urutan elusi komponen-komponen dalam campuran.
Seorang analis harus memilih fase diam yang mampu memisahkan
komponen-komponen dalam sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Kolom
kemas mengandung partikel padat berukuran halus yang dilapisi dengan fase
diam cair yang dapat menguap. Dibandingkan dengan kolom kapiler, kolom
kemas memiliki kapasitas sampel yang lebih besar tetapi menghasilkan
puncak lebih lebar, waktu retensi lebih lama, dan resolusi yang lebih buruk.
Kolom kemas umumya dibuat dari logam tahan karat atau gelas dengan
diameter dalam 3–6 mm dan panjang 1 – 5 m (Harris, 2010). Efisiensi kolom
akan meningkat dengan semakin bertambah halusnya partikel fase diam ini.
Semakin kecil diameter partikel fase diam, maka efisiensinya akan meningkat.
Ukuran partikel fase diam biasanya berkisar antara 60 – 80 mesh (250 – 170
μm) (Gandjar dan Rohman, 2007).
4. Detektor penangkap electron (Electron capture detector/ECD). Detektor
penangkap elektron (ECD) merupakan detektor yang dilengkapi dengan
sumber radioaktif titrium atau 63
Ni yang menghasilkan partikel-β. Partikel
radioaktif ini bertubrukan dan mengioniasi gas pembawa (make up) gas.
Reaksi ini membentuk awan elektron yang stabil pada sel detektor ECD.
Analit yang mempunyai gugus elektronegatif akan menangkap elektron bebas
yang akan mengurangi jumlah elektron bebas pada awan elektron dalam sel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
detektor ECD. Penangkapan elektron menyebabkan penurunan arus detektor
(Grob, 1995).
Bila fase gerak (gas pembawa N2) masuk ke dalam detektor maka
sinar β akan mengionisasi molekul N2 menjadi ion-ion N2+
dan menghasilkan
elektron (bebas) yang akan bergerak ke anoda dengan lambat. Dengan
demikian, di dalam ruangan detektor terdapat semacam awan elektron bebas
yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-elektron yang terkumpul pada
anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline curent) yang steady dan
memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila komponen sampel (senyawa
dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak masuk ke ruang detektor yang
dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan menangkap elektron sehingga
membentuk ion molekul negatif. Ion molekul ini akan dibawa oleh fase gerak
(carrier gas). Akibatnya setiap partikel negatif dibawa keluar detektor, berarti
menyingkirkan satu elektron dari sistem sehingga arus listrik yang steady tadi
akan berkurang. Pengurangan arus ini akan dicatat oleh rekorder sebagai
puncak pada kromatogram ( Gandjar & Rohman, 2007).
Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung kolom
tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa komponen hasil
pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu sensor elektronik yang
berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan komponen-komponen di
dalamnya menjadi sinyal elektronik (Gandjar dan Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector/ECD)
menggunakan sumber radioaktif yaitu tritium (3H) atau nikel (63
Ni) yang
ditempatkan diantara dua elektroda. Tegangan listrik yang dipasang antara
katoda dan anoda tidak terlalu tinggi, antara 2-100 volt. Dasar kerja detektor
ini adalah penangkapan elektron oleh senyawa yang memiliki afinitas
terhadap elektron bebas, yaitu senyawa yang mempunyai unsur-unsur
elektronegatif (Gandjar danRohman, 2007). Bila fase gerak (gas pembawa N2)
masuk ke dalam detektor maka sinar β akan mengionisasi molekul N2 menjadi
ion dan menghasilkan elektron bebas yangakan bergerak ke anoda dengan
lambat. Dengan demikian, di dalam ruangan detektor terdapat semacam awan
elektron bebas yang dengan lambat menuju anoda. Elektron-elektron yang
terkumpul pada anoda akan menghasilkan arus garis dasar (baseline current)
yang steady dan memberikan garis dasar pada kromatogram. Bila komponen
sampel (senyawa dengan unsur elektronegatif) dibawa fase gerak masuk ke
dalam ruang detektor yang dipenuhi awan elektron, maka senyawa ini akan
menangkap elektron sehingga membentuk ion molekul negatif. Ion molekul
ini akan dibawa oleh fase gerak (carrier gas). Akibatnya setiap partikel
negatif dibawa keluar detektor, berarti menyingkirkan satu elektron dari
sistem, sehingga arus listrik yang steady akan berkurang. Pengurangan arus
ini akan dicatat oleh rekorder sebagai puncak pada kromatogram (Gandjar dan
Rohman, 2007).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
5. Oven.Pemilihan temperatur pada kromatografi gas tergantung pada beberapa
faktor. Temperatur injeksi harus relatif tinggi yang memberikan kecepetan
penguapan yang paling tinggi sehingga memberikan resolusi yang baik.
Temperatur injeksi terlalu tinggi dapat menyebabkan karet septum menjadi
rusak dan menyebabkan tempat injeksi menjadi kotor. Temperatur kolom
berhubungan dengan kecepatan, sensitivitas, dan resolusi. Pada temperatur
kolom yang tinggi, komponen sampel lebih banyak berada pada fase gas
sehingga akan cepat terleusi tetapi resolusi nya menjadi buruk. Pada
temperatur rendah, komponen sampel akan memiliki lebih banyak waktu
untuk berada pada fase diam dan terelusi secara perlahan, resolusi menjadi
meningkat tetapi sensitivitas menurun karena puncak yang dihasilkan akan
melebar. Temperatur detektor harus cukup tinggi untuk mencegah kondensasi
sampel (Christian, 2004).
F. Validasi metode analisis
Metode analisis merupakan serangkaian prosedur yang dapat diterima
dalam mendapatkan hasil analisis suatu sampel. Validasi merupakan proses
verifikasi metode yang sesuai dengan tujuan analisis. Metode dapat berupa hasil
pengembangan metode lain, yang didapat dari suatu literatur atau bahkan dari
pihak ketiga lainnya. Suatu metode mungkin diadaptasikan atau dimodifikasi
untuk dapat memenuhi persyaratan dan kemampuan dari sebuah laboratorium dan
atau untuk tujuan metode yang akan digunakan. Beberapa garis besar kriteria
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
validasi metode residu fungisida menurut CCPR 2003 meliputi akurasi, presisi,
kisaran linearitas, linearitas, dan IQL (CCPR,2003).
Tabel II.Kriteria Validasi
a. Akurasi
Akurasi merupakan kedekatan nilai antara hasil uji dan hasil referensi yang
diketahui. Akurasi dapat ditetapkan dari hasil perolehan kembali (% recovery).
Recovery merupakan fraksi atau persentase dari perolehan kembali suatu analit
setelah ekstraksi dan analisis sampel kosong yang telah ditambahkan standar dengan
konsentrasi yang diketahui (adisi menggunakan reference material). Suatu %
recovery yang dikatakan memenuhi parameter validasi metode residu fungisida jika
berada pada rentang 70 - 120% untuk kisaran konsentrasi > 0,01 mg/kg ≤ 0,1 mg/kg
( CCPR, 2014).
b. Presisi
Presisi adalah Kedekatan antara hasil uji yang diperoleh di bawah kondisi
yang ditetapkan. Presisi dapat ditentukan dengan ≥ 3 replikasi pada ≥ 5 level. Presisi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
dapat ditetapkan dengan melihat % RSD. Suatu metode dikatakan memiliki
keterulangan yang baik jika % RSD < 20 % (CCPR,2003).
c. Linearitas dan rentang
Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon yang
secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel (Harmita, 2004). Suatu linearitas metode
analisis residu fungisida dapat dikatakan baik jika R2 ≥ 0,990 (CCPR,2003).
d. Limit of Quantitation(LOQ)
Konsentrasi terkecil analit yang dapat diukur. Umumnya didefinisikan sebagai
konsentrasi minimum analit dalam sampel uji yang dapat ditentukan dengan presisi
yang dapat diterima (pengulangan) dan akurasi di bawah kondisi yang dinyatakan
dalam hasil uji. IQL yang dapat diterima harus kurang dari ½ MRL atau dibawah
positive list sebesar 0.01 g/g (CCPR,2003).
G. Metode kuantifikasi
Metode kuantifikasi dan proses kalibrasi adalah sama digunakan pada
suatu teknik instrumenal untuk analisis senyawa organik seperti contohnya
pada instrumen kromatografi gas. Determinasi kuantitatif suatu komponen
organik didasarkan pada perbandingan respon instrumental dari suatu
senyawa yang tidak diketahui dengan kalibran. Kalibran disiapkan dengan
standard reference yang diketahui memiliki kemurnian yang tinggi. Beberapa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
pendekatan untuk kuantifikasi yaitu dengan menggunakan metode standar
eksternal, metode standar internal dan metode standar adisi (Czichos, 2006).
1. Metode standar eksternal
Metode standar eksternal merupakan metode yang digunakan untuk
menetapkan konsentrasi senyawa yang tidak diketahui konsentrasinya
dalam suatu sampel dengan menggunakan plot kalibrasi kurva baku
eksternal. Larutan-larutan kurva baku eksternal disiapkan dan
dianalisis secara terpisah dari kromatogram senyawa tertentu yang ada
dalam sampel. Sampel yang mengandung senyawa tertentu yang akan
ditetapkan konsentrasinya dan telah disiapkan,selanjutnya diinjeksikan
dan dianalisis dengan cara yang sama. Konsentrasi senyawa tersebut
ditentukan dengan metode grafik dari plot kalibrasi atau secara
numeric (Rohman, 2009).
2. Metode standar internal
Metode standar internal berdasarkan pada perbandingan respon
relative dari analit terhadap respon satu atau lebih suatu
senyawa.Standar internal ditambahkan ke dalam sampel dan kalibran.
Baku stndar internal merupakan senyawa yang berbeda dengan analit ,
meskipun demikian senyawa ini harus terpisah dengan baik selama
proses pemisahan. Baku internal dapat menghilangkan pengaruh
karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel atau
konsentrasi karena adanya perubahan-perubahan pada ukuran sampel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
atau konsentrasi darena variasi instrumen.suatu baku internal
digunakan jika suatu sampel memerlukan perlakuan sampel yang
sangat signifikan. Perlakuan yang dimaksud adalah tahapan-tahapan
yang meliputi derivatisasi, ekstraksi, filtrasi, dan sebagainya yang
mengakibatkan sampel berkurang. Jika baku internal ditambahkan
pada sampel sebelum dilakukan preparasi sampel, maka baku internal
dapat menjadi faktor koreksi hilangnya sampel-sampel ini. Dalam
penelitian ini baku internal yang digunakan adalah standar internal
DCB karena preparasi pada metode ini melewati tahapan-tahapan
ekstraksi yang cukup panjang.
3. Metode standar adisi
Metode standar adisi didasarkan pada adisi suatu senyawa kalibran
yang diketahui kuantitas atau konsentrasinya kemudian ditambahkan
pada sampel yang tidak diketahui jumlah/konsentrasinya (dengan atau
tanpa penambahan standar internal. Dengan menambahkan paling
sedikit dua atau lebih alikuot standar, suatu kurva dapat disiapkan.
Konsentrasi analit dalam sampel dapat ditentukan dengan ekstrapolasi
kurva kalibrasi. Respon analit harus linier pada kisaran konsentrasi
yang digunakan dalam kurva baku kalibrasi. Suatu pendekatan dalam
standar adisi adalah dengan membagi sampel ke dalam beberapa
bagian yang sama kemudian diadisi dengan konsentrasi standar adisi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
yang meningkat. Selanjutnya dianalisis antara respon analit dengan
konsentrasi yang diinjeksikan (Rohman,2009).
H. Landasan Teori
Difenokonazol merupakan fungisida yang sering digunakan oleh
petani melon untuk mencegah dan mengatasi penyakit pada buah melon,
terutama jamur/fungi antraknosa. mekanisme aksi difenokonazol adalah
dengan menghambat demetilasi sintesis ergosterol. Menurut FAO/WHO
pemaparan pestisida di lingkungan dan residu pestisida menganggu kesehatan
masyarakat, sehingga ditetapkannya batas minimum residu (BMR) yang
diperbolehkan ada dalam buah melon yaitu sebesar 0,7 mg/kg (CCPR,2014).
Pada kenyataannya untuk memantau kadar residu difenokonazol yang berada
dalam buah melon dianalisis menggunakan LC MS/MS. Pada penelitian ini
determinasi dimodifikasi menggunakan GC-ECD. Suatu instrumen GC-ECD
dinyatakan berada pada kondisi optimum ketika mampu memberikan kinerja
efisiensi kolom, selektivitas, keajegan tR dan TF yang baik, demikian pula
%RSD, RF, %D sesuai spesifikasi yang dipersyaratkan.
Pada penelitian dilakukan ekstraksi difenokonazol dengan metode
QuEChERS. Dilakukan clean-up dengan SPE C18 untuk memisahkan
difenokonazol dari koekstraktan yang mengganggu. Proses clean-up bertujuan
untuk memisahkan difenoconazol dari koekstraktan matriks sehingga saat
determinasi puncak difenokonazol tidak terganggu. Selanjutnya dilakukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
validasi penuh metode analisis penetapan kadar difenokonazol dalam buah
melon. Metode yang valid selanjutnya digunakan untuk penetapan kadar.
Hasil clean-up diinjeksikan ke GC-ECD yang telah teroptimasi. Proses
clean-up dikatakan berhasil apabila puncak difenokonazol terpisah dari
puncak lainnya. Parameter validasi metode yang diuji dalam penelitian ini
adalah adalah IDL, IQL, recovery dalam penelitian ini recovery ekstraksi
maupun clean up, determinasi analit dan kisaran kalibrasi.
I. Hipotesis
1. Pelarut yang polaritasnya mendekati difenokonazol dapat digunakan untuk
mengekstraksi difenokonazol pada kulit dan daging buah melon secara
kuantitatif.
2. SPE C18 dapat digunakan sebagai sarana clean up untuk memisahkan matriks
dengan difenokonazol perlu fase gerak yang sesuai.
3. Difenokonazol dapat dipisahkan dengan matriks dengan GC dan ditetapkan
dengan detector ECD.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol Dalam
Buah Melon (Cucumis melo L.)” merupakan jenis rancangan penelitian eksperimental
murni karena terdapat perlakuan terhadap subjek uji. Subjek uji yang dimaksud disini
adalah buah melon.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel
a. Variabel bebas.Variabel bebas dalam penelitian ini adalah massa adisi
difenokonazol yang diadisikan ke dalam ekstrak buah melon, volume fase
gerak saat clean-up, lama sentrifugasi.
b. Variabel tergantung. Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah
jumlah supernatan yang diperoleh, lama sentrifugasi, waktu retensi,
resolusi, efisiensi kolom dengan jumlah lempeng (N), tailing factor, %
perolehan kembali dengan SPE C18, koefisien korelasi (r) antara massa
total difenokonazol dan AUC, slope kurva baku adisi, presisi, limit of
detection (LOD) atau IDL, IQL, limit of quantification (LOQ), koefisien
variansi (CV) dan % perolehan kembali metode standar adisi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
c. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam
penelitian ini adalah kemurnian pelarut yang digunakan, yang dapat
diatasi dengan menggunakan pelarut pro analysis (p.a.) yang memiliki
kemurnian tinggi.
C. Definisi Operasional
1. Difenokonazol yang dianalisis adalah fungisida yang digunakan untuk
mengontrol berbagai sayuran, buah-buahan dan berbagai jenis tanaman, yang
beraksi dengan menghambat demethylasi sintesis ergosterol.
2. Buah melon yang dianalisis adalah buah melon yang berasal dari beberapa pasar
dan toko buah yang ada di Yogyakarta, yang tidak mengandung difenokonazol.
3. Sistem GC-ECD yang digunakan adalah seperangkat GC yang dilengkapi dengan
detektor ECD dengan fase diam C18, suhu kolom, suhu oven, suhu kolom,
injektor, CBM (communication bus module), komposisi fase gerak, gas pembawa
nitrogen, flow rate yang optimum serta komputer yang dilengkai aplikasi penyaji
data kromatogram.
4. Parameter validasi metode clean-up difenokonazol dengan SPE adalah linearitas
yang dilihat dari koefisien korelasi (r) dan akurasi yang dilihat dari % perolehan
kembali.
5. Parameter validasi metode analisis penetapan kadar difenokonazol dengan GC-
ECD yang diamati dalam penelitian ini adalah akurasi, presisi, linearitas, IDL,
dan IQL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
6. Instrument Detection Limit (IDL) merupakan nama lain dari Limit of Detection
(LOD) yaitu konsentrasi terendah yang dapat dideteksi namun tidak dapat
dikuantifikasi.
7. Instrument Quantification Limit (IQL) merupakan batas konsentrasi terendah
yang dapat dikuantifikasi yang memenuhi presisi dan akurasi.
8. Lower Limit Method Validation (LLMV) merupakan konsentrasi terkecil pada
sebuah metode yang telah di validasi.
9. DCB (dekaklorobifenil) merupakan standar internal yang digunakan sebagai
faktor koreksi.
10. QuEChERS (Quick Easy Cheap Effective Rugged And Safe) adalah metode
ekstraksi menggunakan pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS.
11. Campuran garam QuEChERS yang dimaksud dalam penelitian ini adalah
campuran garam QuEChERS campuran MgSO4 4 gram ; NaCl 1 gram ; Na3sitrat
0,5 gram; 0,25 gram Na2Hsitrat.
D. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku difenokonazol
(baku dari PT.Syngeta), standar DCB (Sigma Aldrich) metanol (p.a. E. Merck),
asetonitril (p.a E. Merck), aseton (p.a. E. Merck), akuades (Laboratorium Analisis
Instrumenal Farmasi USD), akuabides (Laboratorium Analisis Instrumenal Farmasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
USD), gas nitrogen UHP dan teknis, sampel buah melon dari berbagai pasar, toko
buah dan swalayan di daerah Yogyakarta.
E. Alat Penelitian
Alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kromatografi gas
(HP, GC-5890 Series II) dilengkapi dengan detektor ECD 63
Ni, Kolom SPE C18
(SPE C18 0,4 g), neraca analitik (Precisi 125 A. SCS Swiss Quality),
ultrasonifikasi,Vortex, Sentrifugasi, hotplate, stopwatch, ultrasonifikasi, seperangkat
komputer dengan CBM-102 (Shimadzu), perangkat lunak Shimadzu Lab solutions:
GC Solution versi 2.30.00SU4), perangkat lunak Powerfit v.6.05, vakum,
mikropipet, glass fin, syringe, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di
laboratorium analisis.
F. Tata Cara Penelitian
1. Uji kesesuaian sistem GC-ECD
Penelitian ini merupakan analisis tingkat kelumit sehingga untuk
mencapai akurasi dan presisi yang baik diperlukan suatu metode analisis dengan
sensitivitas yang cukup tinggi. Uji kesesuaian sistem dilakukan untuk memastikan
bahwa Sistem yang akan digunakan untuk analisis sesuai dengan tujuannya.
Optimasi terhadap sistem GC-ECD di lakukan dalam uji kesesuaian sistem.
Optimasi instrumen GC-ECD dilakukan sesuai dengan prosedur yang ditetapkan
dalam petunjuk operasional alat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
2. Preparasi sampel dengan metode QuEChERS
a. Pengecekan kadar air dalam buah melon. Buah melon dibelah menjadi 4
bagian, diambil salah satu bagian tersebut secara acak. Dipotong sekecil
mungkin menggunakan pisau dan telenan yang sudah dicuci. Kemudian
diblender hingga halus. Ditimbang 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender, lalu dikeringkan dalam oven pada suhu
60°C. Replikasi sebanyak 3 kali. Hasil pengeringan ditimbang dan
dihitung berat rata-ratanya sebagai % kandungan air buah melon.
b. Penentuan waktu dan kecepatan sentrifugasi. Ditimbang dalam tabung
sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan
blender. Kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS. Gojog
larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan
disentrifugasi selama ( 5 menit, 10 menit dan 15 menit dalam 5000
rpm). Amati dan bandingkan jumlah supernatan yang terbentuk.
3. Pembuatan seri larutan baku Difenokonazol
a. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok induk). Sejumlah lebih
kurang 52.6 mg baku difenokonazol ditimbang dengan seksama lalu
dilarutkan ke dalam 1 mL toluen hingga didapat larutan stok induk 52,6
mg/mL.
b. Pembuatan larutan stok difenokonazol (stok A). Sebanyak 40 µL stok
induk difenokonazol dilarutkan dalam 1000 µL toluen hingga didapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
konsentrasi sebesar 0.526 µg/µL yang kemudian disebut dengan stok
A.
c. Pembuatan larutan intermediet. Sejumlah 10 µL stok A diambil dengan
Syringe add dalam 1000 µL heksan sehingga diperoleh larutan
intermediet dengan konsentrasi 0.526 x 10-2
µg/µL.
d. Pembuatan larutan kurva baku solven. Diambil sebanyak 20µL ; 15µL
; 10µL; 7 µL ;5µL ; 4 µL; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok
B kemudian ditambahkan 2 µL DCB add hingga 200 µL dengan pelarut
heksan kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2
µL.
e. Pembuatan larutan kurva baku adisi .Diambil sebanyak 20µL ; 15µL ;
13 µL ; 10µL; 5µL ; 3µL ; 2µL; 1µL dari larutan intermediet stok B
kemudian ditambahkan 2 µL DCB ke dalam flakon berisi ekstrak
matriks yang telah kering add hingga 200 µL dengan pelarut heksan
kemudian diinjeksikan ke dalam kromatografi gas sebanyak 2 µL.
f. Pencucian flakon wadah sampel supernatan. Flakon dicuci
menggunakan akuades kemudian aseton dilanjutkan dengan metanol
dan dikeringkan dalam oven.
g. Pencucian syringe. Syringe dicuci menggunakan aseton kemudian
metanol dan dilanjutkan dengan 5 µL standar difenokonazol. Diulangi
hingga 3 kali.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
4. Optimasi Clean-Up SPE C18
a. Penentuan Kapasitas Solid Phase Extraction (SPE) C18. Ditimbang
dalam tabung sentrifugasi, 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS.
Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama 2 menit dan
disentrifugasi selama 5 menit dalam 5000 rpm. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil sebanyak 1 mL dimasukan
dalam flakon dan dikeringkan dalam oven 60°C hingga tercapai bobot
tetap. Replikasi 3 kali. Kemudian ditimbang dan dihitung rata-rata
berat setelah dikeringkan.
b. Optimasi Washing SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,
kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian
vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya
dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan
menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi
yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1
menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan
yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan
digabung ke dalam flakon supernatant sebelumnya kemudian
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dalam 0,5 mL akuabides selanjutnya di-degassing dengan
ultrasonifikator selama 5 menit. Aplikasikan sampel yang telah di-
degassing ke dalam kolom SPE. Washing SPE C18 dengan berbagai
macam komposisi pelarut, antara lain: 5 mL akuabides tanpa fraksinasi
; 5 mL metanol 5% dengan 5 fraksinasi ; 5 mL UPW 100% dengan 5
fraksinasi. Selanjutnya cuci ekstrak dalam flakon dengan 3 mL
metanol dan elusikan dalam kolom SPE kemudian ditampung dalam
flakon baru untuk dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas
nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan
dan ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke
dalam sistem GC-ECD.
c. Optimasi Elusi SPE. Sebanyak 5 gram buah melon yang telah
dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung sentrifugasi,
kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitrril sebanyak 5mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian
vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya
dan dimasukan dalam flakon. Dilakukan reekstraksi dengan
menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam tabung sentrifugasi
yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan selama 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan
yang terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan
digabung ke dalam flakon supernatan sebelumnya kemudian
ditambahkan 2µL Standar stok B dan dikeringkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dengan 1 mL akuabides kemudian di-degassing dengan
ultrasonifikator selama 5 menit selanjutnya aplikasikan sampel ke
dalam kolom SPE C18. Washing dengan menggunakan akuabides
sebanyak 5 mL kemudian keringkan kolom dengan bantuan gas
nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan (1
mL ; 2 mL ; 3 mL ; 4 mL ; 5 mL) metanol. Masukan metanol ke dalam
flakon untuk mencuci ekstrak, kemudian aplikasikan ke dalam kolom
SPE. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon. Sampel
dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel
yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan ditambahkan
DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem GC-
ECD.
5. Optimasi kelayakan SPE untuk digunakan lebih dari satu kali. Sebanyak 5 gram
buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender ditimbang dalam tabung
sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam QuEChERS tambahkan
asetonitril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit kemudian vortex selama
2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam flakon.
Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke dalam
tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan
selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam
flakon supernatan sebelumnya lalu ditambahkan (7 µL ; 10 µL) Standar stok C
dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah
kering dilarutkan dengan 0,5 mL akuabides kemudian diultrasonifikasi selama 5
menit. Sampel yang telah di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan
pipet Pasteur untuk dimasukan ke dalam SPE. Washing sampel dalam flakon
berisi ekstrak dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL dan diaplikasikan
dalam kolom SPE C18 lalu keringkan kolom dengan bantuan aliran nitrogen.
Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan metanol. Metanol
digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga semua ekstrak
tercuci bersih, aplikasikan ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE
ditampung dalam flakon dan dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas
nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan dengan 200 µL heksan dan
ditambahkan DCB kemudian diambil 2µL untuk diinjeksikan ke dalam sistem
GC-ECD.
6. Validasi Metode Analisis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Validasi metode analisis merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk
membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,
yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Perbedaaan langkah kerja validasi metode
dengan uji kesesuaian sistem adalah kurva baku yang digunakan. Kurva baku yang
digunakan dalam validasi metode analisis adalah kurva baku metode adisi dengan
menggunakan matriks ekstrak buah melon sedangkan pada uji kesesuaian sistem
kurva baku yang digunakan adalah kurva baku solven. Di bawah ini merupakan
langkah kerja secara umum untuk mendapatkan ekstrak buah melon yang siap diadisi:
Sebanyak 5 gram buah melon yang telah dihomogenkan dengan blender
ditimbang dalam tabung sentrifugasi, kemudian ditambahkan campuran garam
QuEChERS tambahkan asetonitrril sebanyak 5 mL. Gojog larutan selama 1 menit
kemudian vortex selama 2 menit dan disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan
5000 rpm. Supernatan yang terbentuk diambil semuanya dan dimasukan dalam
flakon. Dilakukan reekstraksi dengan menambahkan asetonitril sebanyak 5 mL ke
dalam tabung sentrifugasi yang telah diekstraksi sebelumnya, lakukan penggojokan
selama 1 menit vortex 2 menit dan sentrifugasi selama 5 menit. Supernatan yang
terbentuk pada lapisan paling atas diambil semuanya dan digabung ke dalam flakon
supernatan sebelumnya kemudian ditambahkan 2 µL Standar stok B dan dikeringkan
di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen. Sampel yang telah kering dilarutkan
dengan 0,5 mL akuabides kemudian didegassing selama 5 menit. Sampel yang telah
di-degassing dengan ultrasonifikator diambil dengan pipet Pasteur untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
diaplikasikan ke dalam kolom SPE. Washing sampel dalam flakon berisi ekstrak
dengan menggunakan akuabides sebanyak 5 mL lalu keringkan kolom dengan
bantuan aliran nitrogen. Tahap selanjutnya sampel dielusi dengan menggunakan
metanol. Metanol digunakan untuk mencuci flakon berisi sisa ekstrak, cuci hingga
semua ekstrak tercuci bersih, lalu sedikit demi sedikit ekstrak tersebut diaplikasikan
ke dalam kolom SPE C18. Eluat yang keluar dari SPE ditampung dalam flakon dan
dikeringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.
Ekstrak yang didapatkan digunakan sebagai matriks untuk melakukan validasi
metode analisis. Parameter validasi metode yang dinilai adalah sebagai berikut :
a. Presisi (keterulangan) sistem GC-ECD. Presisi dapat ditentukan dari nilai
CV. Parameter presisi dapat diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL
larutan ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol stok B
1ul, 3ul, 5ul, 7ul, 10ul, 13ul, 15ul, 20ul, ke dalam sistem GC-ECD
sebanyak 3 kali. Respon yang berupa luas puncak difenokonazol dari
masing-masing konsentrasi larutan baku yang diperoleh dihitung nilai
rata-rata, SD dan %CV.
b. Linearitas hubungan konsentrasi baku difenokonazol dengan respon
sistem GC-ECD. Koefisien korelasi (r) merupakan parameter yang
diperlukan untuk menentukan linearitas hubungan massa baku
difenokonazol terhadap respon sistem GC-ECD yang telah optimal.
Koefisien korelasi (r) diperoleh dengan menginjeksikan 2 µL larutan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
ekstrak melon yang sudah diadisi standar difenokonazol 0,053 ; 0,0789 ;
0,105 ; 0,132 ; 0,184 ; 0,263 ; 0,395 ;0.526 ng/µL ke dalam sistem GC-
ECD. Linearitas hubungan antara massa difenokonazol yang diinjeksikan
terhadap respon alat, diplotkan dalam bentuk kurva baku dan dihitung
parameter statistiknya seperti intersep (a), slope (b), dan koefisien korelasi
(r) dengan menggunakan program powerfit.
c. Sensitivitas sistem GC-ECD. Sensitivitas sistem GC-ECD yang telah
optimal dapat diketahui dengan menghitung nilai IDL dan slope. Kedua
parameter sensitivitas tersebut dapat ditetapkan dengan menginjeksikan 2
µL larutan baku difenokonazol dengan konsentrasi kurva baku adisi ke
dalam sistem GC-ECD. Nilai IDL dan slope dapat dihitung dari
persamaan kurva baku hasil injeksi.
G. Analisis Hasil
1. Uji kesesuaian instrument GC-ECD
a. Analisis hasil optimasi sistem GC-ECD. Analisis hasil optimasi sistem GC-
ECD dapat dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Optimasi kecepatan
alir gas, inisial temperatur, suhu injektor, suhu kolom, suhu detektor dan suhu
oven yang optimal akan memberikan pemisahan puncak senyawa yang
optimum.
b. Analisis Kinerja instrumen GC-ECD. GC-ECD yang telah optimal untuk
analisis kadar residu difenokonazol, dibuktikan oleh nilai Rs, TF, N, dan tR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
yang memenuhi syarat-syarat batasan yang harus dicapai sebagaimana telah
dijelaskan pada beberapa teori .
1) Waktu retensi (tR).Waktu retensi dari masing-masing senyawa dapat
dilihat pada kromatogram yang dihasilkan. Keajegan rasio tR/standar
internal dan rasio AUC standar/DCB dari penginjekan 6 kali.
Kejegannya dihitung dengan rumus % RSD:
%RSD = 100-%recovery (Harmita,2004).
2) Daya pisah (resolusi). Resolusi dalam penelitian ini ada 2 yaitu
resolusi awal dan resolusi akhir. Resolusi dapat dihitung dengan
rumus:
Rs=
Keterangan : tR= waktu retensi W1 dan W2 = rata-rata lebar zona
3) Tailing factor (TF). Tailing factor atau TF dapat diterima apabila
memiliki nilai <1,2. Jika TF lebih >1,2 maka puncak kromatogram
tersebut mengalami tailing/ pengekoran (Dolan et al,2002)
TF=
4) Jumlah lempeng teoritik (N). Jumlah lempeng teoritik atau N dapat
dihitung dengan rumus :
N= 16(
2
Keterangan : tR: waktu retensi Wb=lebar dasar puncak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
c. Analisis hasil kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif. Analisis hasil Uji
Kesesuaian Sistem GC-ECD secara kuantitatif menghitung parameter-
parameter yang dibutuhkan, berikut ditentukan syarat-syarat nilai parameter
dari nilai CV, r, IDL, dan slope yang harus dicapai agar suatu sistem GC-ECD
dapat dinyatakan sesuai untuk penentuan kadar difenokonazol.
1) Linearitas
Linearitas ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh
dari kurva baku solven hasil plot antara rasio luas puncak
difenokonazol/DCB dan massa standar baku yang diinjeksikan
kedalam regresi linear dengan persamaan y = a + bx dengan
menggunakan powerfit.
2) Sensitivitas
Sensitivitas alat dapat ditentukan dengan menghitung nilai slope, IDL,
IQL dengan rumus :
Slope dapat diperoleh dari persamaan regresi linear y=a+bx (b=slope;
a=intersep)
IDL dapat dihitung dengan rumus:
3,3 ×
Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope
k=3,3.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
3) Presisi (keterulangan)
Nilai presisi atau keterulang dapat diperoleh dengan menghitung
%kesalahan acak (%KV) dengan rumus:
Kesalahan Acak (%KV)=
x 100%
4) Percent Difference (%D)
Percent Difference (%D) dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut
% D=
x 100 %
d. Analisis hasil Optimasi Preparasi Sampel. Pengecekan kadar air dalam buah
melon.Kadar air didalam melon dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Kadar air =
x 100%
e. Validasi metode analisis Hasil modifikasi QuEChERS dan clean-up
1) Linearitas
Linearitas suatu kurva baku ditentukan oleh nilai koefisien korelasi (r).
Koefisien korelasi dapat diperoleh dengan mengeplotkan data antara
rasio luas puncak difenokonazol/standar internal DCB sebagai sumbu
y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x ke dalam
program Powerfit® sehingga didapatkan persamaan regresi linear y=
a + bx.
2) Selektifitas. Data kromatogram antara sampel sebelum dan sesudah
SPE dibandingkan selain itu resolusi antara puncak analit
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
difenokonazol dengan puncak terdekat dihitung (ICH Harmonised
Tripartite,2005).
3) Akurasi. Akurasi dapat dihitung dengan rumus :
Perolehan kembali (recovery) =
× 100%
4) Presisi. Presisi dapat dihitung dengan rumus :
Kesalahan Acak (%RSD) =
× 100%
5) Sensitivitas. Limit of Quantitation(LOQ) dihitung dengan rumus :
10 ×
Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope
k=10
6) Limit of Detection (LOD). Limit of Detection (LOD) suatu sistem
GC-ECD dapat dihitung dengan menggunakan persamaan regresi
linear suatu kurva baku. Berikut adalah rumus untuk menghitung
LOD:
LOD= 3,3 ×
Keterangan: Sa standar deviasi dari intersep kurva baku dan b : slope,
k=3,3 (ICH Harmonised,2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
H. Rancangan Penelitian
1. Metode Adisi
Pada metode adisi dilakukan adisi jalur A, B, dan C untuk membuktikan
hipotesis 1.
Sampel blanko
Adisi A: Sampel +
standard (Ekstraksi)
Adisi B: Sampel
+standard
(Cleanup)
Adisi C: Sampel
+ standard
(Determinasi_
Sampel
sesungguhnya
Kesalahan
ekstraksi +
cleanup +
determinasi
Kesalahan
cleanup +
determinasi
Kesalahan
determinasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
2. Proses Preparasi Sampel : Ektraksi dengan Metode QuEChERS, Clean-up
SPE C18 dan Determinasi GC-ECD
sampling melon dilakukan secara acak dari beberapa pasar di Yogyakarta
Preparasi sampel secara kuartering, kemudian blender dan ditimbang sebanyak 5 gram sampel dalam seuah tabung sentrifugasi
tambahkan 5 mL pelarut asetonitril dan campuran garam QuEChERS kemudian gojog kuat selama 1 menit, vortex selama 2 menit dan lakukan sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000
rpm.
supernatan pada lapisan yang paling atas yang atas diambil. lakukan reekstraksi dengan menambahkan 5 ml asetonitril ke dalam tabung sentrifugasi, gojog, vortex dan sentrifugasi. supernatan yang terbentuk dimasukan dalam 1 flakon supernatan
awal.
keringkan supernatan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.
tambahkan 500 µL akuabides ke dalam flakon yang beerisi ekstrak kemudian lakukan degassing selama 5 menit.
aplikasikan hasil degassing ke dalam kolom SPE yang telah di conditioning dengan 5 mL metanol dan 5 mL akuabides.
washing SPE dengan 5 mL akuabides
dan elusi sampel dalam kolom SPE dengan 3 mL metanol. tampung eluat yang keluar dalam sebuah flakon kemudian keringkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen.
larutkan ekstrak dalam 100 µL heksan ambil 2 µL untuk diinjeksikan ke dalam GC-ECD. analisis kromatogram yang dihasilkan. untuk membuktikan Hipotesis 3.
Tahap 1 : Proses Sampling
dan ekstraksi
Tahap 2 : Proses Cleanup
Tahap 3: Proses Determinasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3. Fraksinasi Elusi SPE C18 Metanol
melon melon melon
Potong melon secara
kuartering dan blender
Timbang 5 gram melon yang
telah diblender
Tambahkan campuran garam
QuEChERS :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3Sitrat
0,25 gram Na2HCitR
55
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Tambahkan 5 ml asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2
selama menit
Sentrifugasi selama 5
menit dalam 5000rpm
Ambil semua supernatan. lakukan
reekstraksi dan gabung supernatan yang
terbentuk dan Tambahkan 50 µL standar A
Uapkan di atas hotplate
dengan bantuan gas nitrogen
Tambahkan 1mL akuabides
Degassing selama 5 menit
Loading pada SPE yang telah
di conditioning
Fraksinasi masing-masing 1
mL
Washing dengan 5 mL
akuabides
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
Keringkan
1 5 2 3 4
Larutkan dengan 200 µL heksan
Dan tambah 2 µL DCB. Ambil 2 µL
kemudian injeksikan ke dalam GC-ECD
Analisis hasil untuk membuktikan
HIPOTESIS 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
4. Optimasi Washing SPE
melon melon melon
Potong melon secara
kuartering dan blender
Timbang 5 gram melon
yang telah diblender
Tambahkan campuran
garam QuEChERS :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3Sitrat
0,25 gram Na2HCitR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Tambahkan 5 ml asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2 selama menit
Sentrifugasi selama 5 menit dalam 5000rpm
Ambil supernatant lapisan atas yang terbentuk.
Lakukan reekstraksi dengan 5 mL asetonitril.
Tambahkan 50 µL standar larutan A
Uapkan di atas hotplate dengan bantuan gas nitrogen
Tambahkan 0,5mL akuabides
Degassing selama 5 menit
Loading pada SPE yang telah di conditioning
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
B
Washing dengan
5% MeOH
Washing dengan
100 %UPW
Elusikan dengan 3
mL MeOH
Washing dengan
5% MeOH
Tampung hasil
Tampung hasil eluat
Keringkan dan larutkan dalam 200 uL heksan
tambahkan 2 uL DCB
Kemudian injeksikan eluat hasil elusi dan
tampungan washing
A
Analisis hasil kromatogram yang didapatkan
untuk membuktikan Hipotesis 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
5. Uji Kelayakan SPE untuk Digunakan lebih dari 1 kali
melon melon melon
Potong melon secara
kuartering dan blender
Timbang 5 gram melon
yang telah diblender
Tambahkan campuran
garam QuEChERS :
2 gram MgSO4
0,5 gram NaCl
0,5 gram Na3Sitrat
0,25 gram Na2HCitR
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Tambahkan 5 ml asetonitril
Gojog 1 menit dan vortex 2 selama
menit
Sentrifugasi selama 5 menit
dalam 5000rpm
Ambil 5 ml supernatant lakukan
reekstraksi
Uapkan di atas hotplate dengan
bantuan gas nitrogen
Tambahkan 1mL akuabides
Degassing selama 5 menit
Loading pada SPE yang telah di
conditioning
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Washing dengan 3 mL
akuabides
Washing dengan 3 mL
akuabides
Elusi dengan 3 mL metanol
Tamping eluat dan keringkan diatas
hotplate dengan gas nitrogen
Cuci SPE dengan 30 mL metanol
dan 10 mL akuabides
Loading sampel ke-2 dan 3
dengan langkah seperti diatas
Larutkan sampel dalam 200 uL
heksan kemudian injeksikan ke GC-
ECD dan analisis kromatogram
Dan analisis hasil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
BAB IV
PEMBAHASAN
Penelitian yang berjudul “Validasi Metode Analisis Residu Difenokonazol
pada Buah Melon (Cucumis melo L.)” dilakukan untuk membuktikan bahwa metode
ini dapat digunakan untuk analisis difenokonazol dengan dasar QuEChERS (Quick
Easy Cheap Effective Rugged And Safe). Metode ini merupakan hasil modifikasi dari
metode analisis baku AOAC 2007.01 yang merupakan metode analisis multi residu
dengan dasar preparasi sampel QuEChERS. QuEChERS sendiri merupakan ekstraksi
dengan asetonitril, clean-up dengan SPE yang didispersikan kedalam ekstrak dan
karena kesetimbangan yang terjadi pada dispersive SPE hanya satu kali diperlukan
suatu instrumen yang selektifitasnya tinggi untuk determinasi yaitu LC MS/MS.
Determinasi menggunakan LC MS/MS menjadi kendala untuk menerapkan metode
ini di Indonesia. Pada umumnya laboratorium tresida pestisida di Indonesia tidak
memiliki instrumen tersebut, juga alternatif metode baku analisis residu
difenokonazol dalam buah melon belum tersedia hingga saat ini. Salah satu tujuan
penelitian ini adalah untuk mengatasi masalah tersebut yaitu dengan melakukan
modifikasi pada tahapan cleanup dan instrumen untuk determinasinya. Difenokonazol
merupakan suatu senyawa yang memiliki banyak atom klorida, oksida, dan N dengan
elektronegativitas yang tinggi yang dapat dideteksi dengan GC-ECD, sehingga
instrumen GC-ECD digunakan untuk mendeterminasi residu pestisida difenokonazol
dalam buah melon. GC-ECD kurang selektif apabila dibandingkan dengan LC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
MS/MS, sehingga perlu adanya suatu penyesuaian, terutama pada tahap clean-up.
Clean-up dengan SPE kolom dapat memberikan kesetimbangan yang jauh lebih
banyak sehingga ekstrak yang didapat lebih bersih.
Penelitian ini dimulai dari uji kesesuaian sistem GC-ECD diikuti dengan
optimasi preparasi sampel kemudian dilanjutkan dengan validasi penuh metode
analisis.
Gambar 4. Struktur difenokonazol
(EFSA, 2011).
A. Uji Kesesuaian Sistem GC-ECD
1. Optimasi instrumen GC-ECD
Optimasi Instrumen ini dilakukan untuk mengetahui dan mendapatkan
kondisi optimum dari instrumen GC-ECD yang akan digunakan, sehingga
instrumen mampu memisahkan analit target dari koekstraktan matriks yang
menggganggu. Parameter yang dioptimasi meliputi penetapan tipe kolom yang
digunakan, tekanan gas/kecepatan alir (flow rate) gas pembawa baik pada kolom,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
detektor, inlet kolom, suhu injektor, kolom, oven dan detektor. Pada penelitian ini
gas pembawa yang digunakan adalah nitrogen dengan kualitas Ultra High Pure
(UHP) dengan tipe kolom C18. Berdasarkan optimasi yang dilakukan, didapatkan
kondisi GC-ECD yang optimal sebagai berikut :
Tabel III. Hasil optimasi kondisi GC-ECD
Parameter Kondisi optimum
1. Injector (split)
Suhu injector 230ºC
Volume injector 2uL
2. Oven
Panjang kolom 12-50 m
Fase diam 5%-phenyl-methylpolysiloxane
Temperature Terprogram 100 C (3 menit)
30ºC/menit, 245ºC (30 menit)
30ºC/menit, 260ºC(15 menit)
3. Detektor
Detektor ECD63
Ni
Suhu detektor 295ºC
4. Gas
Gas N2 UHP
Flowrate gas 1mL/menit
2. Kinerja instrumen GC-ECD
Instrumen GC-ECD yang telah optimal akan menghasilkan kinerja yang
optimum. Penentuan kinerja GC-ECD baik secara kualitatif maupun kuantitatif
ditunjukkan melalui kromatogram yang dihasilkan. Kromatogram memberikan
informasi berupa puncak-puncak senyawa-senyawa yang ada dalam matriks, dari
hasil tersebut diharapkan instrumen mampu memisahkan antara puncak senyawa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
difenokonazol dengan koekstraktan matriks. Berikut kromatogram hasil kinerja GC-
ECD yang diperoleh pada penelitian ini:
a. Kinerja Pemisahan dengan GC-ECD
Gambar 5. Kromatogram kurva baku difenokonazol dalam
pelarut heksan
Gambar 5 menunjukan bahwa instrumen mampu memisahkan
difenokonazol dari senyawa lainnya. Kinerja pemisahan dengan GC-
ECD dapat dievaluasi berdasarkan nilai N, Rs, dan TF yang
dihasilkan. Berikut tabel nilai rata-rata yang didapat dari hasil 6 kali
penginjekan standar dengan konsentrasi yang sama:
DC
B
Difen
ok
on
azo
l
Azo
xy
strob
in
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Tabel IV. Nilai rata-rata N, Rs, dan TF puncak baku difenokonazol
Parameter Nilai rata-rata
N 42500,088
Rs awal 11,423
Rs akhir 6,809
TF 0,833
Nilai rata-rata N dalam Tabel IV diperoleh dengan
menginjeksikan sebanyak enam kali standar difenokonazol dalam
pelarut heksan dengan konsentrasi 0,526 µg/mL ke sistem GC-ECD.
Jumlah lempeng teoritis (N) menggambarkan jumlah kesetimbangan
yang terjadi dalam sebuah kolom. Semakin tinggi nilai N, semakin
banyak kesetimbangan yang terjadi di dalam kolom. Menurut Grob,
nilai jumlah plat teoritik (N) yang dipersyaratkan adalah lebih dari
7000. Nilai rata-rata yang didapat pada penelitian ini lebih dari 7000
yaitu sebesar 42500,088 sehingga diharapkan frekuensi terjadinya
kesetimbangan analit dalam fase diam dan fase gerak dapat
memungkinkan tercapainya pemisahan difenokonazol secara
sempurna.
Resolusi (Rs) merupakan perbedaan antara waktu retensi 2
puncak yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak.
Sistem GC-ECD dapat dikatakan memiliki kinerja pemisahan yang
baik apabila dapat memberikan nilai Rs <1,5 . Pada Rs lebih dari 1,5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
, GC-ECD mampu memberikan pemisahan puncak yang baik. Nilai
Rs yang diperoleh pada penelitian ini adalah sebesar 11,423 untuk
resolusi awal dan 6,809 untuk resolusi akhir. Resolusi awal ialah
rasio puncak difenokonazol dengan puncak terdekat yang memiliki
tR sebelum puncak difenokonzole (puncak DCB), sedangkan
resolusi akhir ialah rasio puncak difenokonazol dengan puncak
terdekat yang memiliki tR setelah puncak difenokonazol (puncak
azoxystrobin). Berdasarkan hasil resolusi awal dan akhir seperti
yang telah ditunjukan pada tabel di atas, dapat dikatakan bahwa
sistem GC-ECD dalam penelitian memiliki kinerja pemisahan yang
baik.
Puncak yang memberikan nilai TF>1 menunjukan bahwa
puncak tersebut mengalami pengekoran (tailing). Semakin besar
harga TF maka kolom yang dipakai semakin kurang efisien. Pada
penelitian ini diperoleh nilai TF rata-rata sebesar 0.833 sehingga
dapat dikatakan bahwa efisiensi kolom sistem GC-ECD untuk
analisis senyawa difenokonazol cukup baik.
Pada kromatogram di atas senyawa difenokonazol
muncul sebagai puncak pada tR 25,88 dan 25,708. Hal ini karena
difenokonazol memiliki sifat diastereoisomer cis dan trans dengan
dua cincin C kiral pada strukturnya (EFSA,2011). Adanya dua
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
isomer yang memiliki cincin C kiral ini menyebabkan struktur
difenokonazol dapat berputar untuk mencapai posisi stabil. Dua
isomer yang berbeda ini memiliki sifat fisika kimia yang berbeda
dan akan terdeteksi oleh ECD pada tR yang berbeda
(Fessenden,1986).
Pada analisis residu pestisida tidak jarang ditemukan suatu
senyawa yang memiliki multi-peak. Kuantifikasi senyawa multi-
peak seperti difenokonazol dapat dilakukan dengan menggunakan
AUC peak terbesar atau dengan menjumlahkan AUC kedua peak
(USDA,2015). Pendekatan yang lebih sering dilakukan ialah dengan
menjumlahkan AUC peak difenokonazol yang muncul untuk
memperoleh residu keseluruhan. Pendekatan ini lebih sering
diterapkan untuk meminimalkan kesalahan kuantifikasi (Cajka,
2007). Pada penelitian ini kuantifikasi dilakukan dengan
menjumlahkan AUC dua peak difenokonazol yang muncul.
b. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kualitatif
Kinerja instrumen GC-ECD secara kualitatif dapat dilihat dari
parameter %RSD dan keajegan tR serta luas area difenokonazol.
CCPR menyatakan bahwa spesifikasi persyaratan untuk %RSD>20%.
Hasil %RSD dalam penelitian ini memenuhi spesifikasi persyaratan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Tabel V. Nilai %RSD
Kadar (ng)
Rasio
difenokonazol/DCB
Rasio AUC
difenokonazol/DCB
0.789
1,208 1,538
1,219 1,317
1,218 1,575
1,224 1,821
1,208 1,538
Rata-rata 1,215 1,558
SD 0,007 0,179
%RSD 0,591 11,514
c. Kinerja instrumen GC-ECD secara Kuantitatif
Pada penelitian ini evaluasi optimasi uji kesesuaian sistem juga
dilakukan untuk kinerja instrumen GC-ECD secara kuantitatif.
Evaluasi ini dilakukan dengan menghitung nilai koefisien korelasi
untuk linearitas, kisaran linearitas, slope, IDL untuk sensitivitas,
presisi area standar/standar internal dan %CV untuk akurasi.
Parameter-parameter tersebut diperoleh dari seri kurva baku solven.
1) Linearitas
Linearitas suatu metode merupakan ukuran seberapa baik kurva
kalibrasi yang menghubungkan antara respon (y) dengan konsentrasi
(x). Kurva baku untuk mencari linearitas dalam penelitian ini
menggunakan kurva baku solven yang menghubungkan antara respon
yang berupa rasio luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
(y) dengan konsentrasi difenokonazol yang diinjeksikan (x). Besarnya
konsentrasi yang akan diukur berbeda-beda yaitu dimulai dari 0,105-
1,052 ng sesuai kisaran sampel yang akan ditetapkan dan ditambah
standar internal dekaklorobifenil (DCB) dengan konsentrasi 0,0001
mg/mL. Penambahan standar internal dekaklorofenil (DCB) dilakukan
secara konstan yaitu 1 µL dalam 100 µL. Dekaklorofenil (DCB)
berperan sebagai faktor koreksi kesalahan yang terjadi dalam sistem
GC-ECD. Data yang diperoleh kemudian diolah sehingga didapatkan
hasil akhir berupa persamaan regresi linear dengan R2 sebesar 0,999
seperti pada gambar berikut ini :
Gambar 6. Kurva baku solvent antara rasio luas puncak
difenokonazol/DCB vs kadar difenokonazol
Batas nilai R2 yang dipersyaratkan dalam uji kategori
impurities, yaitu ≥0.9900 pada kadar maksimum 1 ppb (AOAC, 2005).
y = 2.1034x + 0.0135 R² = 0.9995
0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200
rasi
o lu
as p
un
cak
dif
eno
con
azo
le/s
tan
dar
inte
rnal
kadar yang ditambahkan (ng)
Difenokonazol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Berdasarkan pada hasil penelitian diatas metode hasil modifikasi
QuEChERS ini memiliki linearitas yang cukup baik.
2) Sensitivitas
Sensitivitas suatu sistem GC-ECD dinyatakan dalam nilai
sebuah Instrument Detection Limit (IDL). IDL didefinisikan sebagai
konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat dideteksi,
meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sinyal yang berbeda
signifikan dari blanko adalah intersep+3s intersep, oleh karena itu
nilai IDL difenokonazol dalam penelitian ini adalah konsentrasi
difenokonazol yang memberikan sinyal sebesar intersep + 3s intersep.
Pada penelitian ini nilai IDL diperoleh dari 3 kurva baku dengan 7
konsentrasi terendah. Kurva baku pada kisaran linearitas 0,053-0,526
ng memiliki nilai IDL sebesar 0,01 g/g.
Tabel VI. Uji sensitivitas
Replikasi Persamaan Linearitas Sa0 Slope
(b)
IDL
(ng/µL)
I F(x) = 0,15707 + 3,03655
x
0,997 0,0297 3,037 0,015
II F(x) = 0,02169 + 2,06485
x
0,999 0,0132 2,065 0,010
III F(x) = -0,07459 + 3,78718 x 0,890 0,183 3,787 0,072
Instrument Quantitation Limit merupakan konssentrasi terkecil
dari kurva baku. IQL dapat diterima keterulangannya dengan nilai
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
%RSD<20%. GC-ECD pada penelitian ini memiliki kemampuan
mendeteksi nilai IQL sebesar 0,053 ng.
3) Presisi
Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis yang
diekspresikan sebagai simpangan baku relative dari sejumlah sampel
yang berbeda signifikan secara statistik. Nilai presisi secara kuantitatif
dinyatakan dalam suatu nilai Respon Faktor, dalam penelitian ini
antara rasio jumlah luas area puncak difenokonazol/standar internal
(DCB) dengan konsentrasi standar difenokonazol. Berikut ini adalah
hasil presisi dari masing-masing dalam penelitian ini :
Tabel VII. Nilai Response factor
Kadar
(ng)
Nilai RF
R1 R2
0,053 5,236 2,156
0,105 4,763 2,214
0,158 3,861 2,393
0,210 3,936 2,185
0,263 3,849 2,097
0,368 3,369 2,155
0,526 3,317 2,088
0,789 3,527 2,123
1,052 3,656 2,122
Rata-
rata 3,946 2,170
SD 0,646 0,093
%RSD 16,367 4,273
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Suatu metode dapat dikatakan baik jika memiliki presisi % RF
<20% pada konsentrasi maksimum 1ppb (CCPR,2003). Berdasarkan
literatur tersebut, presisi penelitian ini dapat diterima dan dikatakan
cukup baik.
4) Akurasi
Kedekatan hasil injeksi antara larutan standar kurva baku
dengan nilai sebenarnya yang digunakan untuk melihat akurasi dalam
penelitian ini dinyatakan dalam percent difference (%D). Syarat
Percent Difference dapat dinyatakan baik apabila nilainya ≤20%
(United State Departement of Agriculture Agricultural Marketing
Service, Sciene & Technology Pesticide Data Program,) Nilai %D
menggambarkan perbedaan antara % analit terukur dengan analit yang
sebenarnya dari sampel. Hasil % D dalam penelitian ini diperoleh :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
Tabel VIII. Nilai %D
Kadar
(ng)
Kadar yang
ditemukan
(ng)
% D
0,053 0,044 15,568
0,105 0,102 2,757
0,158 0,172 9,216
0,210 0,212 0,808
0,263 0,257 2,461
0,368 0,374 1,532
0,526 0,521 0,896
0,789 0,801 1,495
1,052 1,071 1,788
Rata-rata
1,497
SD
0,608
%RSD
0,407
Berdasarkan pada tabel VI di atas, nilai %D difenokonazol masuk
kriteria persyaratan yaitu %D < 20% .
Kesimpulan : Berdasarkan pada nilai presisi, akurasi, kisaran dan
linearitas kurva baku serta IDL dan IQL yang dicapai, GC-ECD dapat
digunakan dalam penetapan kadar residu fungisida difenokonazol.
B. Preparasi Sampel dengan Metode QuEChERS
Preparasi sampel merupakan tahapan penting dalam suatu analisis. Optimasi
pada tahapan preparasi sampel perlu dilakukan dengan tujuan mendapatkan hasil
optimal. Pada penelitian ini optimasi dilakukan terhadap cara kerja preparasi matriks
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
sampel melon dengan metode modifikasi QuEChERS dan optimasi fase diam SPE
C18.
1. Optimasi ekstraksi matriks buah melon
a. Pengecekan kadar air dalam buah melon
Suatu sampel yang digunakan dalam suatu penelitian harus memiliki
kesempatan yang sama untuk dijadikan sampel, sehingga sampling dilakukan
secara acak. Sampel yang dimaksud dalam penelitian ini adalah buah melon
dari beberapa pasar di Yogyakarta. Sampling analytical portion untuk buah
melon dilakukan dengan metode kuartering dan dihomogenkan dengan
blender.
Tujuan dari pengecekan kadar air dalam buah melon adalah untuk
menentukan perlu atau tidaknya tambahan air dalam proses homogenisasi
sampel dengan blender. Proses preparasi sampel dengan metode QuEChERS
mempersyaratkan bahwa kadar air harus >80% tidak diperlukan tambahan air
(Anastasiades). Pada penelitian ini kadar air yang terkandung dalam buah
melon sangat tinggi yaitu lebih dari 90% sehingga tidak perlu adanya
penambahan air dalam homogenisasi sampel.
Tabel IX. Kadar air dalam buah melon
Awal (gram) Berat akhir setelah oven (gram) Selisih
R1 10,068 0,402 9,666
R2 10,007 0,845 9,162
Rata-rata 9,378
% kadar air 93,78%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
1) Ekstraksi dan clean-up dengan metode modifikasi QUECHERS
Metode yang digunakan untuk preparasi sampel pada penelitian ini
adalah metode QuEChERS yaitu ekstraksi dengan pelarut asetonitril dan
campuran garam QuEChERS, clean-up dengan SPE yang didispersikan ke
dalam ekstrak dan dideterminasi.
Pada metode QuEChERS, garam-garam yang digunakan adalah
Magnesium sulfat, Natrium Klorida, Natrium Sitrat dan disodium sitrat
hydrogenate sesquihydrate. Masing-masing garam memiliki kegunaan
yang berbeda, magnesium sulfat anhidrat berfungsi untuk menarik air,
natrium klorida berfungsi sebagai agen salting out effect, sedangkan
natrium sitrat dan disodium sitrat hydrogenate seshydrate ditambahkan
untuk mengontrol pH antara 4-6 (Leung phenoomenex,2012-UCT).
pH sampel dijaga antara 4-6, hal ini dkarenakan pada kisaran pH
4-6 jumlah koekstraktan dalam hasil ekstraksi lebih sedikit dibandingkan
dengan jumlah koekstraktan pada raw material.
Sampel yang telah ditambahkan garam dalam tabung sentrifuge
ditambahkan pelarut asetonitril kemudian di gojog dan di vortex.
Penggojogan bertujuan untuk memecah gumpalan matriks sampel untuk
memperoleh luas permukaan yang besar sehingga kesetimbangan yang
optimum akan lebih mudah tercapai.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Sampel memiliki partikel dengan ukuran dan berat jenis yang
bebeda-beda, untuk memisahkan senyawa yang memiliki ukuran dan
berat jenis yang berbeda dilakukan sentrifugasi. Optimasi sentrifugasi
perlu dilakukan untuk mendapatkan waktu dan kecepatan sentrifugasi
yang optimum.Pada penelitian ini optimasi sentrifugasi dilakukan pada
kecepatan 5000 rpm selama 5, 10.Dan 15 menit. Hasil akhir menunjukan
bahwa selisih supernatan yang terbentuk dari 3 waktu yang berbeda diatas
tidak berbeda signifikan, sehingga waktu yang paling singkat yaitu 5
menit yang digunakan untuk preparasi sampel selanjutnya.
Tabel X. Hasil optimasi lama sentrifugasi
Waktu sentrifugasi
dalam 5000 rpm (menit)
Jumlah supernatant
(mL)
5 4,0
10 4,0
15 4,2
Ada 3 lapisan yang terbentuk setelah sampel disentrifugasi,
berdasarkan berat jenisnya asetonitril (0,789 g/cm3) berada pada
lapisan yang paling atas sedangkan air (1 g/cm3) berada di lapisan
bawah. Difenokonazol memiliki kelarutan yang cukup tinggi dalam air
yaitu 15 mg/L sehingga untuk mengurangi kelarutannya dalam air
sampel ditambahkan garam NaCl yang berfungsi untuk memberikan
salting out effect. Lapisan asetinitrik diambil untuk di analisis
selanjutnya. Pada penelitian ini dilakukan reekstraksi sampel untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
mengantisipasi tertinggalnya analit difenokonazol karena masih
tertahan di dalam matriks sampel. Reekstraksi bertujuan
memaksimalkan ekstraksi analit, sehingga %recovery yang diperoleh
lebih baik. Total supernatan yang diperoleh dari 5 gram sampel
tersebut dikeringkan dengan nitrogen untuk kemudian di clean-up
dengan SPE C18 dan dideterminasi dengan GC-ECD.
a. Optimasi Clean-up dengan SPE C18
Melon merupakan matriks yang kompleks, sebagian besar
kandungan melon bersifat polar salah satu contohnya vitamin C
dan karbohidrat. Senyawa yang menjadi analit target pada
penelitian ini adalah difenokonazol. Clean-up menjadi salah satu
tahapan penting untuk meminimalisir kandungan matriks yang
mengganggu analit target. Clean-up merupakan praperlakuan
sampel yang bertujuan untuk memisahkan analit dari komponen-
komponen matriks yang mungkin menggangu pada saat
pengukuran atau deteksi analit. Clean-up dalam penelitian ini
menggunakan SPE C18 sistem fase terbalik. Clean-up dengan
metode Solid Phase Extraction (SPE) praktis dan hemat pelarut
(Watson,1999). Strategi yang digunakan dalam penelitian ini
diharapkan fase gerak atau pelarut mampu menahan semua residu
analit difenokonazol dalam sebuah SPE C18 dengan ikatan lemah
sehingga analit dapat terelusi. Senyawa-senyawa yang cenderung
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
lebih polar akan ikut terelusi dengan fase gerak. Akuabides
digunakan sebagai fase gerak saat washing sedangkan metanol
digunakan sebagai fase gerak saat elusi. Berdasarkan pada sifat
fisika-kimia, difenokonazol memiliki kelarutan sebesar 15 mg/L
di dalam air sedangkan dalam metanol sebesar 500 g/L, yang
berarti kelarutannya lebih tinggi dalam metanol.
Optimasi clean-up yang dilakukan dalam penelitian ini
adalah optimasi penentuan kapasitas SPE C18, washing dan elusi
SPE C18.
a) Penentuan kapasitas SPE C18
Penentuan kapasitas SPE C18 yang akan digunakan
dalam penelitian dilakukan dengan menimbang berat
ekstrak untuk setiap 1 ml. Hasil penimbangan tersebut
didapatkan bahwa 1 ml sampel yang telah dikeringkan
dalam oven, memiliki bobot sebesar 2,5 mg. Persyaratan
yang harus dipenuhi yaitu bahwa sampel yang akan
diloadingkan ke dalam SPE tidak boleh 5% melebihi berat
catdrige, sehingga SPE yang digunakan dalam penelitian
ini adalah harus lebih dari 50 mg. Semakin besar SPE yang
digunakan kapasitas efisiensi penjerapan analit semakin
besar. Penelitian ini menggunakan SPE C18 denga berat
400 mg.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
Tabel XI. Penentuan kapasitas SPE (Sigmaaldrich).
Bobot
sampel
Volume SPE Minimum
volume eluat
Kapasitas SPE
yang
digunakan
50-100 mg 1 mL 100-200 uL 2,5-10 mg
500mg 3 mL 1-3 mL 25-100 mg
0,5-0,1 g 6 mL 2-6 mL 25-100 mg
2 g 12 mL 10-20 mL 0,1-0,2 g
5 g 20 mL 20-40 mL 1,25-2,5 g
10 g 60 mL 40-100 mL 0,5-1 g
Berdasarkan pada optimasi uji kualitatif pencucian
SPE, SPE layak untuk digunakan berulang sebanyak 3 kali
dengan syarat setiap kali selesai pemakaian, SPE dicuci
dengan 10 ml metanol dan 10 ml akuades. Berikut ini
adalah data dari penentuan kapasitas SPE C18:
Tabel XII. Optimasi penentuan kapasitas SPE C18
R1 R2 R3 R4 Rata-rata (gram)
Berat awal
zat(gram/ml)
0,793 0,788 0,796 0,792
Berat setelah
oven (gram)
0,003 0,003 0,003 0,001 0,0025
b) Optimasi washing SPE C18
Optimasi SPE C18 juga dilakukan pada tahap washing.
Fraksinasi washing dilakukan dengan memvariasi pelarut
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
yang digunakan yaitu 5% MeOH dan 100% UPW. Pada
fraksinasi dengan pelarut 5% MeOH sampel diadisi dengan
2 µl larutan standar intermediet A. Berikut grafik luas
puncak (AUC) difenokonazol dengan hasil optimasi
washing dengan pelarut 5% MeOH dan 100% UPW:
Gambar 7. Luas puncak difenokonazol yang diperoleh dari hasil
Fraksinasi setelah washing dengan 5% MeOH (washing 1) vs 100% UPW
(washing 2)
Diagram diatas menjelaskan bahwa eluat setelah washing
dengan 5% MeOH menghasilkan luas puncak yang lebih
kecil dibandingkan washing dengan 100% UPW.Artinya
senyawa pada saat washing dengan 5% MeOH, analit
difenokonazol banyak yang hilang ikut tercuci sehingga
saat diinjeksikan eluat menghasilkan respon luas puncak
1 2
AU
C
fraksinasi setelah washing
160506 568132,5
Washing 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
yang lebih rendah dibandingkan dengan eluat setelah
washing menggunakan 100% UPW.
c) Optimasi elusi SPE C18
Optimasi elusi SPE C18 dilakukan dengan fraksinasi
menggunakan pelarut metanol dan konsentrasi adisi 2µL
larutan standar stok A yang memiliki konsentrasi sebesar
0,526 g/L. Berikut grafik fraksinasi elusi dengan pelarut
metanol :
G
Gambar 8. Luas puncak hasil elusi difenokonazol
dalam SPE C18 per mL metanol
1 2 3 4 5
AU
C
jumlah Metanol untuk elusi (ml)
342216,75 336295
82787 0 30562,5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Gambar diatas menjelaskan bahwa dengan 3 mL
pelarut MeOH sudah cukup untuk mengelusi analit yang
diharapkan.
d) Optimasi kelayakan penggunaaan SPE secara berulang
Penggunaan SPE berulang dalam penelitian ini
didasarkan pada hasil optimasi yang menyatakan bahwa
SPE C18 400 gram dapat digunakan tidak lebih dari tiga
kali. Optimasi dilakukan dengan mengaplikasikan standar
difenokonazol 0,789 ng ke dalam sebuah SPE yang sama
sebanyak tiga kali. Tujuan dari optimasi ini adalah untuk
melihat %perolehan kembali. Diharapkan bahwa
penggunaan SPE berulang tidak mempengaruhi perolehan
kembali dari masing-masing sampel.
Tabel XIII. %Recovery optimasi kelayakan penggunaan
SPE berulang
Massa
(ng)
AUC
DCB
AUC
difenokonazol Ratio % Recovery % Kesalahan
0,789 16110,5 30015,1 1,863 110,743 10,74292
0,789 20158,1 36603,9 1,816 109,349 9,349369
0,789 25368,2 46977,3 1,852 107,309 7,309574
Rata-Rata 1,8437 109,134 9,133954
SD 1,727
% RSD 1,583
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
Berdasarkan pada data diatas didapatkan % kesalahan
≤20% yang berarti bahwa data optimasi memenuhi kriteria
persyaratan dan bahwa SPE dapat digunakan 3 kali
(AOAC,2005).
Hasil optimasi clean-up dengan SPE C18 pada
penelitian ini adalah sebagai berikut:
Tabel XIV. Hasil optimasi clean-up SPE C18
Optimasi Hasil
Kapasitas SPE C18 ≥ 50 mg, yang digunakan 400
mg
Washing SPE 5 mL akuades
Elusi SPE 3 mL metanol
C. Validasi Metode Analisis
Validasi metode adalah serangkaian proses yang dilakukan untuk
membuktikan bahwa metode analisis memenuhi persyaratan yang telah ditentukan,
yang sesuai dengan tujuan penggunaannya. Kriteria validasi metode analisis residu
pestisida untuk suatu modifikasi metode analisis yang sudah ada adalah LOD, LOQ,
recovery dalam penelitian ini recovery ekstraksi maupun clean-up, determinasi analit
dan kisaran kalibrasi (CCPR,2014).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
87
Pada penelitian ini parameter validasi metode yang diukur adalah linearitas,
kisaran linearitas, selektivitas, sensitivitas, akurasi, presisi, dan LOQ. Kinerja clean-
up dan GC-ECD dievaluasi dalam penelitian ini. Clean-up dilakukan dengan
menggunakan SPE C18, untuk menguji kinerja clean-up SPE C18 yang telah
teroptimasi dilakukan adisi pada ekstrak blanko melon sebelum dilakukan SPE dalam
penelitian ini disebut Adisi B. Selanjutnya untuk menguji kinerja GC-ECD dalam
menetapkan difenokonazol dalam matriks ekstrak melon bersih ( setelah melalui
clean-up SPE C18) dilakukan adisi standar pada ekstrak bersih pada penelitian ini
disebut adisi C. Apabila kedua uji ini memenuhi persyaratan % recovery yang
dipersyaratkan dalam CCPR yaitu 70-120%, dilakukan penetapan akurasi pada
metode analisis ini. Pada penelitian ini LOQ metode teroptimasi ditetapkan pada
konsentrasi terendah yang telah memenuhi kriteria akurasi dan presisi.
1) Adisi C
Penambahan standar adisi ekstrak melon setelah clean-up dilakukan dan
tepatnya sebelum sampel diinjeksikan ke dalam GC. Adisi jalur C bertujuan untuk
menguji kinerja GC-ECD dalam menetapkan difenokonazol dalam matriks
ekstrak buah melon.Berdasarkan pada kromatogram hasil injeksi sampel yang
diadisi, puncak difenokonazol dapat terpisah secara sempurna dari senyawa-
senyawa koekstraktan matriks yang mengganggu. Secara kuantitatif melihat
presisi dan akurasi dari kinerja GC-ECD pada adisi jalur C, nilai recovery standar
yang ditambahkan dan %D dihitung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
88
Tabel XV. Nilai %Recovery dan %D metode adisi C
Kadar yang ditmbahkan
(ng) Recovery
I Recovery
II Recovery
III Rata-rata Recovery %Kesalahan
0,158 66,957 87,274 104,076 86,102 13,898
0,263 81,126 73,215 107,023 87,121 12,879
0,368 85,421 68,960 119,607 91,329 8,671
0,526 85,161 64,120 115,857 88,380 11,620
0,684 84,574 66,968 112,946 88,162 11,838
Tabel XVI. Nilai %D metode adisi C
Kadar yang
ditambahkan
(ng) Replikasi I Replikasi II Replikasi III
0,158 8,462 17,648 13,491
0,263 5,890 2,365 0,152
0,368 3,017 1,487 2,578
0,526 2,607 6,888 5,088
0,684 6,082 1,486 9,857
1) Adisi B
Pada adisi jalur B, adisi ekstrak melon dilakukan sebelum clean-up
dengan SPE C18. Tujuan dari adisi jalur B adalah untuk menguji kinerja clean-
up dengan kolom SPE C18. Kinerja clean-up dengan kolom SPE C18 dapat
dievaluasi dengan nilai recovery kadar yang ditambahkan dan %D yang
menggambarkan akurasi dan presisi dari adisi jalur B.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
89
Tabel XVII. Nilai %Recovery metode adisi B
Massa
(ng)
Recovery
I
Recovery
II
Recovery
III
Rata-rata
Recovery %kesalahan
0,105 81,001 111,599 131,955 108,185 8,185
0,158 69,174 115,640 131,309 105,375 5,375
0,263 91,151 134,959 113,055 13,055
0,368 106,512 112,022 133,738 117,424 17,424
0,526 114,330 120,759 130,603 121,897 21,897
Tabel XVIII. Nilai %D metode adisi B
Massa
(ng) Replikasi I Replikasi II
Replikasi
III
0,105 20,261 5,381 6,301
0,158 8,512 0,784 2,437
0,263 8,090 4,029
0,368 3,478 10,569 4,544
0,526 2,781 6,052 3,134
0,684 3,559 8,682 0,749
2) Adisi A
Pada adisi jalur A, adisi dilakukan sebelum sampel di clean-up dengan
SPE C18. Tujuan dari adisi jalur A adalah untuk menguji keseluruhan proses
dari ekstraksi menggunakan QuEChERS dan kinerja clean-up dengan kolom
SPE C18. Parameter yang teroptimasi pada adisi jalur adisi A adalah akurasi dan
presisi. Berikut ini adalah tabel perolehan kembali atau %recovery dari kadar
yang ditambahkan dan % D selama proses ekstraksi berlangsung :
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
90
Tabel XIX. Nilai %Recovery dan %D metode adisi A
Massa
(ng)
Recovery
I
Recovery
II
Recovery
III
Rata-rata
Recovery %Kesalahan
0,158 109,398 105,163 95,641 103,401 3,401
0,263 76,027 68,882 68,881 71,263 28,737
0,368 79,829 82,448 85,051 82,442 17,558
0,526 101,006 101,476 95,322 99,268 0,732
0,684 88,578 97,674 159,756 115,336 15,336
Massa (ng) Replikasi I
Replikasi II Replikasi III
0,158 28,198 25,193 19,320
0,263 12,010 19,238 16,663
0,368 9,949 9,854 3,845
0,526 11,129 5,828 3,871
0,684 2,921 0,557 68,208
Dari metode adisi tahap A, B, dan C dapat disimpulkan kesalahan dari
masing-masing tahap. Pada tahap A atau metode adisi untuk melihat kinerja
metode analisis sampel blanko yang di fortifikasi memiliki kesalahan ekstraksi
sebesar 0,133% pada LLMV. Pada metode tahap B, sampel blanko yang
difortifikasi sebelum clean-up memiliki kesalahan sebesar 8,753%, dan pada
tahap C memiliki kesalahan sebesar 8,670%.
a) Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk memperoleh
hasil-hasil uji proposional dengan konsentrasi analit pada kisaran yang
diberikan. Linearitas kurva baku adisi menghubungkan antara rasio
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
91
respon luas puncak difenokonazol/standar internal (DCB) sebagai
sumbu y dengan konsentrasi difenokonazol sebagai sumbu x. Hasil
plot kurva baku adisi pada kisaran linearitas 0,105-0,684 ng tersebut
diperoleh slope koefisien korelasi (r) sebesar 0,974. Menurut
Association of Official Analytical Chemist (AOAC, 2005 ) dari suatu
metode dikatakan linear apabila >0.9900. Berdasarkan pada kriteria
tersebut nilai koefisien korelasi yang didapat tidak mencapai
spesifikasi persyaratan yang telah ditetapkan oleh AOAC, hal ini
karena konsentrasi pada penelitian ini sangat kecil mencapai kadar
ppb.
Gambar 9. Linearitas kurva adisi
y = 1.0133x - 0.0034
R² = 0.9743
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800
rasi
o A
UC
/DC
B
massa (ng)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
92
b) Selektivitas
Selektivitas merupakan kemampuan untuk mengukur analit yang
dituju secara tepat dan spesifik dengan adanya komponen-komponen
lain di dalam matriks sampel. Selektivitas dilakukan untuk matriks
yang kompleks dalam hal ini matriks melon dikategorikan sebagai
matriks yang kompleks, karena di dalam matriks tersebut tidak hanya
terdapat analit target. Optimasi clean-up dengan SPE C18 dapat
meningkatkan selektivitas. Dengan optimasi clean-up, senyawa-
senyawa koekstraktan dalam matriks yang mengganggu dapat
diminimalisir sehingga difenokonazol dapat terpisah sempurna dari
senyawa-senyawa tersebut. Gambar 10 merupakan kromatogram
sampel setelah di clean-up dengan SPE C18. Terlihat bahwa pada
kromatogram sebelum clean-up puncak yang terdeteksi sangat rimbun
sedangkan pada kromatogram setelah clean-up puncak-pucak
koekstraktan matriks berkurang.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
93
Gambar 10.kromatogram kurva adisi
Adanya pemisahan yang baik puncak difenokonazol dengan impurities
lain dibuktikan dengan nilai Rs, TF, N, dan keajegan tR yang ada
dalam Tabel berikut ini :
Tabel XX. Nilai N, Rs, dan tR dari kurva adisi A
Replikasi N Rs awal Rs akhir Tr
1 358888,330 1,732 5,636 29,342
2 123879,864 1.436 4,543 28,064
3 79651,139 3,252 5,312 27,396
4 80304,476 1,211 4,186 27,506
5 63957,803 1,809 1,710 29,459
6 68941,955 1,236 4,224 30,193
d
i
f
e
n
o
k
o
n
a
z
o
l
D
C
B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
94
c) Akurasi
Ketelitian suatu metode analisis terhadap nilai yang terukur dengan
nilai yang diperoleh atau nilai sebenarnya dapat dilihat dengan
menghitung akurasi.Standar internal DCB ditambahkan sebagai faktor
koreksi analit yang hilang. Akurasi diekspresikan dalam %recovery
atau persen perolehan kembali. Tabel XXI di bawah menunjukan hasil
%recovery pada kisaran 0,263-0,789 ng yang diperoleh dalam
penelitian ini :
Tabel XXI. Hasil % recovery pada kisaran 0,263-0,684 ng
Massa
(ng)
Recovery
I
Recovery
II
Recovery
III
Rata-rata
Recovery %Kesalahan
0,158 109,398 105,163 95,641 103,401 3,401
0,263 76,027 68,882 68,881 71,263 28,737
0,368 79,829 82,448 85,051 82,442 17,558
0,526 101,006 101,476 95,322 99,268 0,732
0,684 88,578 97,674 159,756 115,336 15,336
Persen perolehan kembali (%recovery) yang di persyaratkan menurut
CCPR yaitu 70-120%.Tabel menunjukan bahwa dari 3 replikasi diatas
%perolehan kembali senyawa residu difenokonazol memenuhi
persyaratan sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini akurat.
d) Presisi
Presisi merupakan ukuran kedekatan anta serangkaian hasil analisis
yang diperoleh dari beberapa kali pengukuran sampel dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
95
konsentrasi yang sama. Parameter presisi diekspresikan dengan %D.
Spesifikasi persyaratan %D dapat diterima apabila <20%. Hasil dari
%D yang diperoleh dalam penelitian ini disajikan dalam tabel
.Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa metode hasil
modifikasi QUEChERS memiliki presisi yang baik.
Tabel XXII. Hasil %D
Massa (ng) Replikasi I
Replikasi II Replikasi III
0,158 28,198 25,193 19,320
0,263 12,010 19,238 16,663
0,368 9,949 9,854 3,845
0,526 11,129 5,828 3,871
0,684 2,921 0,557
e) Sensitivitas
Limit of Quantification (LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit
terendah dalam sampel yang dapat dideteksi. LOQ menunjukan
sensitivitas dari suatu sistem GC-ECD. Semakin kecil LOQ maka
dapat dikatakan bahwa GC-ECD memiliki sensitivitas yang semakin
tinggi.
Konsentrasi difenokonazol yang harus terdeteksi dalam penelitian ini
adalah setengah dari nilai Batas Minimum Residu (BMR)
difenokonazol yang diketahui yaitu 0,035mg/kg (Codex,2014),
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
96
sehingga LOQ sistem GC-ECD harus lebih rendah dari konsentrasi
tersebut. LOQ yang didapat dalam penelitian ini adalah 0,002 µg/g.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
97
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Asetonitril mampu menjadi pelarut organik dalam proses ekstraksi
difenokonazol dalam buah melon, dengan kesalahan ekstraksi 0,133 pada
LLMV 7,364 ng/g.
2. SPE C18 merupakan metode clean-up yang baik dalam memisahkan
difenokonazol pada matriks buah melon. Recovery fortifikasi sebelum clean-
up dengan kolom SPE C18 113-121% dengan kesalahan 8,753% pada
LLMV.
3. Validasi metode analisis yang dilakukan pada sampel blanko dan sampel
yang di fortifikasi dilakukan pada instrument yang teroptimasi.
a. Kinerja kuantitasi GC teroptimasi adalah rata-rata %D<20%, linearitas
0,890-0,999 pada kisaran 0,053-0,526 ng, dengan IDL 0,01– 0,07ng/mL
dan IQL 1,06 ng/g.
b. Kinerja GC pada ekstrak blanko yang di fortifikasi pada kadarr 0,158-
0,684 ng sebelum diinjeksikan menghasilkan recovery sebesar 86-91%,
dengan kesalahan 8,670% pada LLMV.
c. Kinerja metode analisis sampel blanko yang difortifikasi 0,158-0,684 ng
memberikan recovery pada kisaran 71-115% dan LOQ 0,002 g/g.
Dengan demikian validasi metode analisis ini memenuhi spesifikasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
98
persyaratan untuk memantau kadar residu difenokonazol dalam buah
melon dibawah Batas Minimum Residu (BMR) yang diperbolehkan yaitu
0,7 mg/kg.
B. Saran
1. Perlu membandingkan hasil proses ekstraksi jika menggunakan PSA.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
99
DAFTAR PUSTAKA
Anastassiades, Michelangelo., 2006, QuEChERS Method Background
Informationand Recent Developments, Community Reference
LaboratoryPesticide Residuesusing Single Residue Methods, Stuttgart, p.50,66.
AOAC, 2007, Pesticide Residues in Foods by Acetonitrile Extraction and
Partitioning with Magnesium Sulfate Gas Chromatography/Mass Spectrometry
and Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry, AOAC International,
diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014.
AOAC International, 2012,Appendix F: Guidelines for Standard Method Perfomance
Requirements, AOAC International, P.9.
Cajka,Thomas, et all, 2007, Rapid analysis of Multiple Pesticide Residues in Fruit-
Based Baby Food Using Programmed Temperature Vaporiser Injection-Low-
Pressure Gas Chromatography-High-Resolution Time-of-Flight mass
Spectrometry, Eselvier, p.290.
CCPR,2003, Joint FAO/WHO Food Standards Programme, Codex Alimentarius
Commission, Twenty-Fifth Session, Fao-Who, Italy, P 1-106.
CCPR,2014, Joint FAO/WHO Food Standards Programme Codex Alimentarius
Commission: Report Of The 46th Session Of The Codex Committee On
Pesticide Residues, Switzerland.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
100
Czichos Horst, Tetsuy Saito, and Leslie Smith, 2006, Handbook of Material
Measurement Methods,CRC Press, New York.pp.160-163.
European Food Safety Authorithy (EFSA),2011,Conclusion on the Peer Review of the Pesticide Risk
Assesment of the Active Substance Difenoconazole,EFSA, Journal.9 (1),22-23.
Ermer, J., and Miller, J. H. McB., 2005, Method Validation in Pharmaceutical
Analysis, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGaA, Qeinheim, pp.3,21,63,80.
Fessenden, R.j dan Fessenden, J.S., 1986, Kimia Organik, Jilid 2, Edisi Ketiga
Terjemahan Aloysius Hadyana Pudjaatmaka Ph.D., Erlangga, Jakarta. pp.113-
137.
Gandjar,I.G., dan Rohman, A., 2007, Kimia Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta,
hal.46,53-55,323-324,378-379,460,463-464,468.
Grob, L.R., 1995, Modern Practice of Gas Chromatography, John Wiley and Sons
Inc., New York. P.291-295.
Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungan,
Majalah Ilmu Farmasi, Departemen Farmasi FMIPA UI, Jakarta, pp.117-128.
Horwitz, W., 1984, Official Methods of Analysis of AOAC Interational, 13rd Edition,
AOAC International, USA, p.16.
Jennings, E. L., Mittlehldt, E., & Stremple, P., 1987, Analytical Gas
Chromatography, 2nd
Edition, California, Academic Press, pp 37-61.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
101
Johanes,Oei, 2014, Pengembangan Metode Analisis Deltametrin dalam Matriks Ikan
Nila (Oreochromis niloticus) Dan Aplikasinya Pada Asesmen Resiko
Deltametrin Melalui Asupan Ikan Nila, Usd, Yogyakarta, Hal 36-42.
McNair, H. M. & Miller, J. M., 1998, Basic Gas Chromatography, New York, John
Willey & Sons.
Nollet, Leo., et all., 2005,Chromatographic Analysis of the Environment, Third
Edition, Volume 93, CRC Press (Taylor & Francis Group), New York, p. 46-
49.
RAM 305/03, 2004, Standard Operating Procedure “Residue Analytical Method for
the Determination of Residue of Difenokonazol (ICI5504) and R230310 in Crop
Samples Final Determination by LC-MS/MS”, Syngenta, p.6.
Roe,M., Church,S., Pinchen,H.,Finglas, P., 2013, Nutrient Analysis of Fruit and
Vegetables; Analytical Report,Institute of Food Research, UK,pp.65.
Rohman, A., 2009, Kromatografi untuk Analisis Obat, Penerbit Graha Ilmu,
Yogyakarta, pp.217-230.
Samadi, Budi., 2007, Melon Usaha Tani Dan Penanganan Pasca Panen, kanisius,
yogyakarta, hal. 12,18, 85.
Sanco, 2013, Guidance Document on Analytical Quality Control and Validation
Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed, European, pp 3-36.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
102
Sigma-Aldrich,1998, Guide to Solid Phase Extraction, Supelco Bulletin 910,12.
Sigma Aldrich, http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/sample-
preparation/spe/tube-configuration-guide.html.
Skoog, D.A., West, D.M., Holler F.J., and Crouch S.R., 2004, Fundamental
ofAnalytical Chemistry, 8th edition, Thomson learning, Inc., USA, pp. 948-950,
959.
Soeryadi, I., 1997, Kromatografi, Warta Insinyur Kimia, 17-19.
Sudarmo, Subiyakto., 1991, Pestisida, Kanisius, Yogyakarta, hal 5-10.
UCT, Pesticide Residue Analysis: QuEChERS Informational Booklet, Enviro, USA,
diunduh pada tanggal 03 Oktober 2014.
Sueki H. Leung, Monika M. Kansal, Carl Sanchez, Art Dixon, and Erica Pike
Phenomenex, Inc., 411 Madrid Ave., Torrance, CA 90501 USA, Analyzing
Pesticide Residues in Lettuce by the EN 15662 Method using Phenomenex
roQ™ QuEChERS Kits Followed by LC/MS/MS and GC/MS Analysis, TN-
0052, APPLICATIONS, p. 1.
USDA/AMS PDP, 2015, United States Department of AgricultureAgricultural
Marketing Service, Science & Technology, Pesticide Data Program, US, pp 2-
29.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
103
Watson, D. G., 1999, Pharmaceutical Analysis : A Textbook for Pharmaceutical
Students and Pharmaceutical Chemist, Churcill Livingstone, London,p. 238-
239,320.
Wilson, Keith and John Walker, 2001, Principles and Techniques of Practical
Biochemistry, fifth edition, United Kingdom, Cambridge, p 262-264.
Wittkowski, R., & Matissek, R., ,1990, Cappilary Gas Chromatography in Food
Control and Research, Pennsylvania: Technomic Publishing.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
104
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
105
Lampiran 1. Perhitungan Resolusi (Rs)
Rs=
Rs awal merupakan tR antara puncak pengotor 1 dengan tR difenokonazol 1=
=12,277
Rs awal merupakan tR antara puncak pengotor 1 dengan tR difenokonazol 1=
=6,437
Lampiran 2. Perhitungan LOQ dan LOD
koefisien korelasi (r) Persamaan Sa0 B ng ng/ul ng/g
LOQ ug/g
0.92972 F(x) = -0.05393 + 1.23509 x 0.04824 1.23509 0.117175 0.058587 2.343492 0.002343
d
i
f
e
n
k
o
n
a
z
z
o
l
l
P
e
n
g
o
t
o
r
1
P
e
n
g
o
t
o
r
2
2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
106
LOQ=
= 10 X
= 0,117 ng
LOQ= 0,117 ng/ 2µL= 0,058 ng/µL
LOQ= 0,058 ng/µL X
= 2,343 ng/g= 0,002 µg/g
LOD
Kode Senyawa FX sy/x a0 a1 b Ng ng/ul
5 F(x) = 0.15707 +
3.03655 x 2.98E-02 1.05E-01 3.03655 0.029396 0.014698
7 F(x) = 0.02169 +
2.06485 x 0.013201 0.046498 2.06485 0.019179 0.00959
11 F(x) = -0.07459 +
3.78718 x 0.183007 0.86621 3.78718 0.144968 0.072484
LOD=
= 3,3 X
= 0,02 ng
LOD=0,02ng/2µL= 0,01 ng/µL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
107
Lampiran 3. Certificate of Analysis DCB
3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103 USA Email USA: techserv@sial.com Outside USA: eurtechserv@sial.com
Certificate of Analysis Product Name: DECACHLOROBIPHENYL
purum p.a., >= 99.0 % T Product Number: 442537 Batch Number: WEBC0771Q Brand: Sigma-Aldrich CAS Number: 2051-24-3 Formula: C12Cl10 Formula Weight: 498,66 Quality Release Date: 23 OCT 2013 TEST SPECIFICATION RESULT APPEARANCE (COLOR) COLORLESS WHITE APPEARANCE (FORM) SOLID SOLID MELTING POINT >290,0°C >290,0 °C FLASH POINT >100,0 °C >100,0 °C
Dr. Claudia Geitner Manager Quality Control Buchs, Switzerland
Sigma-Aldrich warrants that at the time of the quality release or subsequent retest date this product conformed to the information contained in this publication. The currentspecification sheet may be available at Sigma-Aldrich.com. For further inquiries, please
contact Technical Service.Purchaser must determine the suitability of the productfor its particular use. See reverse side of invoice or packing slip for additional terms and conditions of sale.
Sigma-Aldrich Certificate of Analysis - Product 71635 Lot BCBM0371V
Page 1 of 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
108
Lampiran 4. Certificate of Analysis Asetonitril
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
109
Lampiran 5. Certificate of Analysis Heksan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
110
Lampiran 6. Certificate of Analysis Metanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
111
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
112
Lampiran 7. Certificate of Analysis Magnesium Sulfat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
113
Lampiran 8. Certificate of Analysis Na2Hsitrat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
114
Lampiran 9. Certificate of Analysis Na3Sitrat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
115
Lampiran 10. Certificate of Analysis NaCl
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
116
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
117
Lampiran 11 . Certificate Of Analysis Formulasi Difenokonazol Donasi dari
PT Syngenta
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
118
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi berjudul “Validasi Metode Analisis Residu
Difenokonazol Pada Buah Melon (Cucumis melo L.)”
memiliki nama lengkap Florentina Silviana Devi. Penulis
dilahirkan di Pajar mataram Lampung pada tanggal 26
Juni1992 sebagai anak pertama dari dua bersaudara, dari pasangan Lukas
Sumari dan Katarina Katrin. Pendidikan formal yang pernah ditempuh oleh
penulis yaitu di TK Fransiskus Xaverius Pajar Mataram Lampung Tengah
(1997-1999), SD Negeri 3 Pajar Mataram Lampung Tengah (1999-2005),
SMP Negeri 2 Qurnia Mataram Lampung Tengah (2005-2008), SMA
Xaverius Pringsewu Lampung (2008-2011). Penulis melanjutkan
pendidikannya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun
2011. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma penulis aktif dalam berbagai kegiatan dan organisasi, antara lain
Pelepasan Wisuda Fakultas Farmasi „‟ Membuka Langkah Untuk Menggapai
Impian‟‟, Guest Lecture On Medicinal Chemistry By Dr. Rob Leurs (Vrije
Universeit, The Netherlands), Seminar Nasional „‟ Pemberdayaan Pasien Self
Management Diabetes Melitus Untuk Meningkatkan Kualitas Hidup‟‟. Hari
Aids Sedunia „‟ Kubangun Dan Kujaga Generasiku Bebas HIV AIDS‟‟
Pelaksanaan Pengembangan Kepribadian Mahasiswa.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
top related