plagiat merupakan tindakan tidak terpuji uji …
Post on 30-Nov-2021
11 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE
DEOKSIRIBOSA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Carla Kuntari
NIM : 028114097
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2007
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE
DEOKSIRIBOSA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh :
Carla Kuntari
NIM : 028114097
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA 2007
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
SKRIPSI
UJI AKTIVITAS PENANGKAPAN RADIKAL HIDROKSIL OLEH
EKSTRAK ETANOL TEH HIJAU DAN TEH HITAM DENGAN METODE DEOKSIRIBOSA
Oleh :
Carla Kuntari
NIM : 028114097
Telah disetujui oleh :
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
When you walk through a storm,keep your head up high
and don’t be afraid of the dark. At the end of the storm is a golden sky
and the sweet silver song of lark. Walk on through the wind, walk on
through the rain, tho’ your dream be tossed and blown. Walk on, walk
on with hope in your heart. And you’ll never walk alone.
-- OOssccaarr HH.. --
Kupersembahkan karyaku ini kepada: kedua orangtuaku, Drs. B. Rahmanto, M.Hum. dan A.M. Budiarti, AMK.
kakakku Lukas Priyambodo, S.E.,
sahabatku Danang Hendro Pamungkas,
almamaterku,
terima kasih atas doa, semangat, bantuan, dan perhatian yang besar selama
penelitian dan penyusunan karyaku ini
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PRAKATA
Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan yang telah melimpahkan
berkat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul “Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh
Hijau dan Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa” dengan baik. Skripsi ini
disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari peran serta
berbagai pihak yang telah memberikan bimbingan, dorongan, dan saran. Oleh
karena itu, penulis ingin mengucapkan banyak terima kasih kepada :
1. Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma, Yogyakarta.
2. Dra. A. Nora Iska Harnita, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing atas
bimbingan, saran, dan kritik selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini.
3. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. selaku dosen penguji atas saran dan
kritik terhadap skripsi ini.
4. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. selaku dosen penguji atas saran dan kritik
terhadap skripsi ini.
5. Enade Perdana I, S.F., Apt. dan Romo Drs. P. Sunu H., SJ. atas diskusi, kritik,
saran, dan pencarian jurnal-jurnal yang turut mendukung dalam penyusunan
skripsi ini.
vi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6. PT. Pagilaran yang telah memberikan ijin kepada penulis untuk mempelajari
proses pengolahan teh hijau dan teh hitam di pabrik teh PT. Pagilaran
Banjarnegara, Jawa Tengah dan Samigaluh, Yogyakarta.
7. Bapak Mukmin, Bapak Prapto, Mas Parlan, Mas Kunto, Bapak Kasiran, Mas
Kayat, Mas Wagiran, dan Mas Ottok atas pendampingan dan bantuan selama
penelitian.
8. Rekan kerja saat penelitian : Nana, Leny, Ardhyan, dan Vini, terima kasih atas
bantuan selama bekerja di “rumah kedua” dan selama penyusunan skripsi ini.
9. Sahabat-sahabat penulis : Rendeng, Bertha, Winda, Lisa, Novi, Anno, terima
kasih atas jalinan persahabatan yang indah selama ini.
10. Bapak Yus, Arya, Heri, Danang, dan Kris atas bantuannya selama kunjungan
di PT. Pagilaran.
11. Teman-teman praktikum kelompok D dan teman-teman Farmasi angkatan
2002, atas kebersamaannya selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
12. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, terima kasih atas
segala dukungan moril dan materiilnya.
Penulis
vii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak
memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam
kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, Februari 2007
Penulis
Carla Kuntari
viii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
INTISARI
Radikal hidroksil merupakan radikal bebas yang sangat reaktif. Radikal hidroksil dapat memecah rantai DNA dan berperan dalam karsinogenik, mutagenik serta sitotoksik. Dalam tubuh, radikal hidroksil ditangkap oleh sistem antioksidan. Saat jumlah radikal bebas melampaui kapasitas sistem antioksidan, diperlukan antioksidan eksogen. Salah satu antioksidan eksogen adalah polifenol yang terdapat pada teh hijau maupun teh hitam. Polifenol dapat bereaksi dengan radikal hidroksil membentuk produk yang kurang reaktif. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil dinyatakan dalam persen penangkapan (% scavenging) dan nilai penangkapan efektif (effective scavenging) radikal hidroksil sebesar 50% (ES50).
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena ada subjek uji yang dikenakan manipulasi perlakuan. Metode penangkapan radikal hidroksil yang digunakan adalah metode deoksiribosa. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil, yang dihasilkan oleh reagen Fenton, membentuk malondialdehid (MDA) yang dalam suasana asam dan adanya asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen merah muda yang diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 532 nm. Nilai ES50 dihitung dari persamaan regresi linear antara konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam terhadap % scavenging pada berbagai konsentrasi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil dengan nilai ES50 (hasil ekstrapolasi) ekstrak etanol teh hijau adalah 0,281 mg/ml dan ekstrak etanol teh hitam adalah 0,344 mg/ml.
Kata kunci : radikal hidroksil, antioksidan, polifenol, ekstrak etanol teh hijau dan
teh hitam, metode deoksiribosa.
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ABSTRACT
Hydroxyl radical is very reactive free radical. Hydroxyl radical could break DNA chains and play role in carcinogenic, mutagenic, and cytotoxic. Inside the body, antioxidant system can reduce hydroxyl radical but when there is imbalance between the extent of hydroxyl radical and the antioxidant system capacity, body needs exogenous antioxidants. One of them is polyphenols that can be found in green-or black-tea. Polyphenols can react with free radical to form less reactive products. The objective of this research is to know the hydroxyl radical scavenging activity of green-and black-tea ethanolic extract. Hydroxyl radical scavenging activity expressed as percent scavenging and 50 % hydroxyl radical effective scavenging (ES50).
This research is a kind of experimental research, because there is treatment to the research subject. The radical scavenging activity method was measured by the deoxyribose method. The principle of this method is degradation of deoxyribose by hydroxyl radical, which generates from Fenton Reagent, to form malondialdehid (MDA) that upon heating with thiobarbituric acid (TBA) at low pH, yield pink chromogen which can be measured in maximum wavelength at 532 nm. The ES50 value can be count by regeresion linear between green-or black-tea ethanolic extract concentration and percent scavenging in each concentration.
The result of this research indicated that both of green-and black-tea ethanolic extract have hydroxyl radical scavenging activity with ES50 (extrapolated) value of green tea ethanolic extract is 0.281 mg/ml and black tea ethanolic extract is 0.344 mg/ml.
Keywords : hydroxyl radical, antioxidant, polyphenols, green-and black-tea
ethanolic extract, deoxyribose method.
x
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL........................................................................................ ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iii
HALAMAN PENGESAHAN.......................................................................... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... v
PRAKATA....................................................................................................... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... viii
INTISARI......................................................................................................... ix
ABSTRACT ....................................................................................................... x
DAFTAR ISI.................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL............................................................................................ xv
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................... xvii
BAB I PENGANTAR...................................................................................... 1
A. Latar Belakang ........................................................................................... 1
1. Permasalahan ....................................................................................... 4
2. Keaslian penelitian ............................................................................... 4
3. Manfaat penelitian................................................................................ 4
B. Tujuan Penelitian ....................................................................................... 5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA............................................................... 6
A. Radikal Bebas ............................................................................................ 6
B. Antioksidan ................................................................................................ 10
xi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
C. Teh ............................................................................................................. 11
1. Klasifikasi dan pengolahan teh ............................................................ 11
2. Kandungan kimia dalam teh................................................................. 13
3. Manfaat teh .......................................................................................... 16
4. Reaksi radikal bebas dengan polifenol dalam teh ................................ 16
D. Metode Deteksi Radikal Hidroksil............................................................. 19
E. Metode Deoksiribosa ................................................................................. 19
F. Penyarian.................................................................................................... 22
1. Cara penyarian ..................................................................................... 22
2. Cairan penyari ...................................................................................... 24
G. Spektrofotometri UV-Vis........................................................................... 25
H. Landasan Teori........................................................................................... 30
I. Hipotesis..................................................................................................... 31
BAB III METODE PENELITIAN .................................................................. 32
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................. 32
B. Variabel-Variabel Penelitian...................................................................... 32
1. Variabel bebas...................................................................................... 32
2. Variabel tergantung.............................................................................. 32
3. Variabel pengacau................................................................................ 32
C. Definisi Operasional .................................................................................. 33
D. Bahan-Bahan Penelitian ............................................................................. 33
E. Alat-Alat Penelitian.................................................................................... 34
xii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
F. Tata Cara Penelitian ................................................................................... 34
1. Pemilihan sampel ................................................................................. 34
2. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam............................... 35
3. Pembuatan bufer fosfat 20 mM............................................................ 35
4. Pembuatan reagen ................................................................................ 36
5. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM............................................. 37
6. Pembuatan larutan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam 1 mg/ml .... 37
7. Optimasi metode .................................................................................. 38
8. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau
dan teh hitam........................................................................................ 39
G. Analisis Hasil ............................................................................................. 39
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 41
A. Pemilihan Sampel ...................................................................................... 41
B. Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam.................................................. 42
C. Optimasi Metode........................................................................................ 44
1. Penentuan operating time (waktu operasional).................................... 44
2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum............................. 48
D. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau
dan Teh Hitam............................................................................................ 50
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN........................................................... 50
A. Kesimpulan ................................................................................................ 57
B. Saran .......................................................................................................... 57
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 58
xiii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
LAMPIRAN..................................................................................................... 62
BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 76
xiv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR TABEL
Tabel I. Reactive oxygen species (ROS)...................................................... 7
Tabel II. Proses pengolahan teh hijau ........................................................... 12
Tabel III. Proses pengolahan teh hitam.......................................................... 12
Tabel IV. Komposisi dari pucuk daun teh segar ............................................ 13
Tabel V. Karakteristik struktur flavonoid untuk aktivitas penangkapan radikal
yang efektif .................................................................................... 17
Tabel VI. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil ................................. 19
Tabel VII. Pemilihan cara penyarian ............................................................... 24
Tabel VIII. Spektrum warna pada daerah visibel.............................................. 29
Tabel IX. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak
etanol teh hijau pada berbagai konsentrasi..................................... 50
Tabel X. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak
etanol teh hitam pada berbagai konsentrasi ................................... 51
Tabel XI. Persen scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ............. 52
Tabel XII.Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hijau sebelum dan
sesudah konversi ............................................................................ 54
Tabel XIII.Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hitam sebelum dan
sesudah konversi ............................................................................ 54
Tabel XIV. Persentase penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 %
oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ................................... 55
xv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur kimia catechin dalam teh dan epimernya...................... 14
Gambar 2. Struktur kimia theaflavin (a) dan thearubigin (b) ....................... 15
Gambar 3. Struktur kimia flavonol dalam teh .............................................. 15
Gambar 4. Gambaran gugus-gugus pada flavonoid yang memiliki aktivitas
sebagai penangkap radikal bebas ................................................ 18
Gambar 5. Mekanisme reaksi antara gugus catechol dengan radikal
hidroksil ...................................................................................... 18
Gambar 6. Struktur deoksiribosa .................................................................. 19
Gambar 7. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa ........... 21
Gambar 8. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil ................................. 21
Gambar 9. Struktur MDA ............................................................................. 22
Gambar 10. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi kromogen
MDA-TBA .................................................................................. 45
Gambar 11. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA ............................... 46
Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA ............ 47
Gambar 13. Struktur kromogen MDA-TBA................................................... 48
Gambar 14. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi
kromogen MDA-TBA................................................................. 49
Gambar 15. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol
teh hijau dan teh hitam dengan absorbansi ................................. 51
Gambar 16. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol
teh hijau dan teh hitam dengan % scavenging ............................ 55
xvi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Foto ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam ................................ 62
Lampiran 2. Tabel Krejcie............................................................................... 63
Lampiran 3. Tabel random sampling .............................................................. 64
Lampiran 4. Contoh penimbangan bahan........................................................ 65
Lampiran 5. Contoh perhitungan % scavenging ekstrak etanol teh hijau dan
teh hitam ..................................................................................... 74
Lampiran 6. Contoh perhitungan ES50 ............................................................ 75
xvii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Radikal bebas merupakan spesi yang bersifat sangat reaktif karena
adanya elektron yang tak berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986) dan
mempunyai kemampuan untuk menimbulkan kerusakan, termasuk peroksidasi
lipid, lesi DNA (Deoxyribo Nucleic Acid), dan fragmentasi protein dalam sel.
Akumulasi dari kerusakan makromolekuler intraseluler merupakan penyebab
proses penuaan dini, keriput, noda hitam, dan beberapa penyakit degenerasi
seperti kanker dan jantung koroner (Fulder, 2004; Syah, 2006).
Manusia mempunyai sistem antioksidan yang mampu melindungi tubuh
dari radikal bebas. Sistem antioksidan ini dibagi menjadi dua kelompok yaitu
kelompok enzimatik dan non-enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari
superoxide dismutase (SOD), katalase, dan glutathione peroxidase. Antioksidan
non-enzimatik terdiri dari vitamin E, A, provitamin A (beta karoten), dan vitamin
C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan
antioksidan non-enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005).
Selain penggolongan antioksidan di atas, dikenal pula senyawa
antioksidan alami seperti senyawa polifenol yang terdapat pada teh, buah-buahan,
sayuran, anggur, bir, dan kecap (Sofia, 2005) dan senyawa antioksidan sintetik,
yang lazim digunakan pada industri makanan, seperti BHA (butylated
hydroxyanisole) dan BHT (butylated hydroxytoluene). Namun senyawa sintetik ini
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
diduga bersifat karsinogenik (Rajeshwar et al., 2005) dan bersifat toksik pada
dosis tinggi (Halliwell dan Gutteridge, 1999) sehingga mendorong semakin
banyak eksplorasi bahan alam (Kikuzaki dan Nakatani, 1993) seperti polifenol,
vitamin C, dan beta karoten, sebagai sumber antioksidan. Penelitian ini
merupakan salah satu perwujudan eksplorasi bahan alam khususnya teh hijau dan
teh hitam sebagai sumber antioksidan.
Minuman teh dikonsumsi di banyak negara, termasuk Indonesia, serta di
berbagai lapisan masyarakat. Semua jenis teh dibuat dari sumber yang sama yaitu
pucuk dan daun muda tanaman teh (Camellia sinensis (L.) O. Kuntze.).
Berdasarkan proses pengolahannya, produk teh dibagi menjadi tiga jenis yaitu teh
hijau (tidak difermentasi), teh oolong (semifermentasi), dan teh hitam (fermentasi)
(Tuminah, 2004).
Teh mempunyai banyak manfaat pada kesehatan, diantaranya sebagai
antioksidan (Hartoyo, 2003). Manfaat teh sebagai antioksidan disebabkan oleh
adanya senyawa polifenol yang berperan sebagai penangkap radikal bebas, seperti
radikal hidroksil (Fulder, 2004). Fenol-fenol, senyawa dengan suatu gugus –OH
yang terikat pada karbon cincin aromatik, merupakan antioksidan yang efektif.
(Fessenden dan Fessenden, 1986). Senyawa-senyawa ini bereaksi dengan radikal
bebas dan membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti
aromatik (Cuvelier et al., 1994).
Senyawa polifenol di dalam teh sebagian besar merupakan senyawa
golongan flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Adanya banyak gugus
hidroksi pada senyawa polifenol mengakibatkan senyawa polifenol ini cenderung
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
bersifat polar sehingga dapat larut dalam pelarut seperti etanol atau air. Hal ini
menjadi dasar pembuatan ekstrak teh hijau dan teh hitam menggunakan kombinasi
cairan penyari etanol dan air. Diharapkan di dalam ekstrak etanol teh hijau
maupun teh hitam senyawa polifenol dapat tersari dengan optimal. Teh hijau dan
teh hitam, yang merupakan dua jenis teh yang populer di Indonesia, mengandung
senyawa polifenol (pada persentase yang berbeda antara teh hijau dan teh hitam)
sehingga ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam diduga memiliki aktivitas sebagai
penangkap radikal hidroksil.
Metode pengujian yang dipilih adalah metode deoksiribosa. Metode ini
menggunakan deoksiribosa sebagai model biomolekul dari gula DNA yang
terdapat di dalam tubuh sehingga secara tidak langsung memberikan gambaran
reaksi radikal hidroksil dalam tubuh. Selain itu, metode ini relatif sederhana dan
mudah. Prinsip metode ini adalah degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil,
yang dihasilkan oleh reagen Fenton, menghasilkan malondialdehid (MDA) yang
dapat bereaksi dengan asam tiobarbiturat (TBA) dalam suasana asam membentuk
kromogen berwarna merah muda yang menyerap pada panjang gelombang
maksimum 532 nm (Kunchandy and Rao, 1990). Adanya aktivitas penangkapan
radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam diketahui dengan
persen scavenging yang diperoleh dari selisih absorbansi larutan kontrol (tanpa
sampel) dan larutan dengan sampel dibagi larutan kontrol dikalikan 100%. Nilai
aktivitas penangkapan radikal hidroksil dapat dinyatakan dalam aktivitas
penangkapan efektif 50% radikal hidroksil atau effective scavenging 50% (ES50).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
1. Permasalahan
a. Apakah ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas sebagai
penangkap radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan
dalam % scavenging?
b. Berapa nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh
hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai
ES50?
2. Keaslian Penelitian
Sejauh pengetahuan penulis, uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil
oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa belum
pernah dilakukan. Adapun penelitian yang telah dilakukan adalah aktivitas
antioksidan dari berbagai macam ekstrak teh dikaitkan dengan aktivitas
antimutageniknya (Yen dan Chen, 1995) dan validasi metode deoksiribosa
sebagai uji penangkapan radikal hidroksil oleh vitamin C secara in vitro
(Purwantoko, 2006).
3. Manfaat
a. Manfaat teoritis
Mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol
teh hijau dan teh hitam yang dinyatakan dengan % scavenging dan ES50.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
b. Manfaat metodologis
Memberikan dukungan dari segi penelitian mengenai aplikasi uji
aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada bahan-bahan alam khususnya
ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam.
c. Manfaat praktis
Memberikan pertimbangan mengenai penggunaan teh hijau dan teh hitam
sebagai sumber antioksidan alami.
B. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk:
1. Mengetahui aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh
hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai %
scavenging.
2. Mengetahui nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol
teh hijau dan teh hitam dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam
ES50.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Radikal Bebas
Radikal bebas adalah spesi yang dapat berdiri sendiri yang merujuk kepada
atom atau gugus atom apa saja yang memiliki satu atau lebih elekron tak
berpasangan (Fessenden dan Fessenden, 1986; Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Meskipun suatu radikal bebas tidak bermuatan positif atau negatif, spesi semacam ini
sangat reaktif karena adanya elektron yang tak berpasangan (Fessenden dan
Fessenden, 1986).
Radikal dapat dibentuk dari spesi non-radikal yang kehilangan satu
elektronnya, penggabungan dengan satu elektron, atau terputusnya ikatan kovalen
melalui peristiwa fisi homolitik (homolytic fission). Peristiwa ini terjadi apabila satu
elektron dari pasangan elektron terikat pada masing-masing atomnya (Halliwell dan
Gutteridge, 1999).
Sumber radikal bebas, baik endogen maupun eksogen terjadi melalui
sederetan mekanisme reaksi yaitu pembentukan awal radikal bebas (inisiasi), lalu
perambatan atau terbentuknya radikal baru (propagasi), dan tahap terakhir
(terminasi), yaitu pemusnahan atau pengubahan menjadi radikal bebas stabil dan tak
reaktif (Sofia, 2005).
Reactive Oxygen Spesies (ROS) adalah suatu istilah yang digunakan para
peneliti untuk mencakup tidak hanya radikal oksigen tetapi juga beberapa spesi non-
radikal yang merupakan derivat O2 (Tabel I).
6
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Tabel I. Reactive oxygen species (ROS) (Halliwell dan Gutteridge, 1999; Sofia, 2005)
Radikal Non-radikal
Superoksida, O2 Hidrogen peroksida, H2O2
Hidroksil, OH Asam hipoklorit, HOCl Peroksil, RO2 Ozon, O3
Alkoksil, RO Oksigen singlet, ∆gO2
Hidroperoksil, HO2 Peroksinitrit, ONOO -
Oksigen aktif dalam bentuk superoksida, hidrogen peroksida, dan radikal
hidroksil merupakan hasil sampingan metabolisme normal dan menyerang molekul
biologis yang dapat menyebabkan kerusakan sel atau jaringan (Yen dan Chen, 1995;
Cerutti cit. Yen dan Chen, 1995). Radikal hidroksil merupakan bentuk yang amat
reaktif dan dihasilkan oleh fotolisis ultraviolet hidrogen peroksida dan dapat berlaku
sebagai toksikan primer dan sebagai sumber toksikan sekunder. Radikal hidroksil
yang dihasilkan dekat DNA secara perlahan-perlahan dapat memecah rantai DNA
dan berperan dalam karsinogenik, mutagenik serta sitotoksik (Rafat et al., cit. Roy et
al., 2001).
Dalam sel, ROS sangat cepat ditangkap oleh sistem pertahanan antioksidan
(antioxidant defense system). Saat peningkatan pembentukan ROS tidak dapat
ditanggulangi oleh sistem pertahanan antioksidan, tercetus situasi yang disebut stress
oksidatif. Semua ROS bersifat sangat reaktif karena memiliki konfigurasi elektron
yang tidak stabil sehingga mampu menarik elektron dari molekul lainnya dan
menciptakan radikal-radikal bebas lain yang mampu bereaksi dengan lebih banyak
molekul lainnya (Blokhina, 2000).
Efek oksidatif radikal bebas dapat menyebabkan peradangan dan penuaan
dini. Lipid yang seharusnya menjaga kulit agar tetap segar berubah menjadi lipid
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
peroksida karena bereaksi dengan radikal bebas sehingga mempercepat penuaan.
Kanker disebabkan oleh oksigen reaktif yang intinya memacu zat karsinogenik,
sebagai faktor utama kanker. Oksigen reaktif dapat meningkatkan kadar LDL (low
density lipoprotein) yang kemudian menjadi penyebab penimbunan kolesterol pada
dinding pembuluh darah dengan akibat timbulnya atherosklerosis (Sofia, 2005).
Radikal bebas yang dikenal sangat reaktif adalah radikal hidroksil. Nilai
standar potensial reduksinya adalah 2,31 V. Radikal hidroksil bereaksi sangat cepat
dengan hampir semua tipe molekul dalam sel hidup, yaitu gula, asam amino,
fosfolipid, basa DNA, dan asam organik. Reaksi radikal hidroksil dengan DNA
mengakibatkan kerusakan penting dalam sel, mengingat kerusakan rantai DNA tidak
dapat dengan mudah diperbaiki oleh sel (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Radikal hidroksil dapat dihasilkan dari reaksi Fenton atau reaksi fisi
homolitik ikatan O-O pada H2O2.
Reaksi Fenton: H2O2 + Fe2+ → Fe(III) + OH ¯ + ˙OH
Fisi homolitik: H O O H UV 2 OH
Selain itu, radikal hidroksil juga dapat dibentuk dari reaksi H2O2 dengan adanya ion-
ion logam Cu+ (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Reaksi radikal hidroksil dapat dikelompokkan menjadi tiga macam yaitu:
abstraksi (pemisahan) hidrogen, adisi, dan transfer (perpindahan) elektron. Reaksi
radikal bebas dengan spesi non-radikal menghasilkan radikal bebas baru yang kurang
atau sama-sama reaktif dibandingkan radikal bebas awal. Contoh reaksi abstraksi
hidrogen adalah reaksi antara radikal hidoksil dengan alkohol membentuk air dan
satu elektron tak berpasangan pada atom karbon. Reaksi pemisahan hidrogen ini
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
menjadi sangat penting karena memiliki hubungan secara biologis dengan terjadinya
peroksidasi lipid (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
C C
H
H
H
O
H
H
H + OH C C
H
H
H
O
H
H + H2O
radikal hidroksietil Reaksi adisi radikal hidroksil dapat terjadi pada reaksi radikal hidroksil dengan
senyawa aromatik. Contohnya adisi radikal hidroksil pada cincin purin pada basa
purin DNA menghasilkan radikal δ-hidroksiguanin. Radikal hidroksil juga
mengalami reaksi adisi pada atom yang mempunyai ikatan rangkap.
+ OHC C C C
HO
Jika radikal hidroksil menyerang DNA yang menyebabkan kerusakan pada basanya
(dan gula deoksiribosa) maka hal ini akan memacu pecahnya ikatan pada DNA
(Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Radikal hidroksil berperan pada transfer elektron, contohnya pada reaksi
dengan ion halida. Reaksi transfer elektron dapat terjadi pada reaksi antara radikal
hidroksil dengan ion halida dan dengan ion nitrit. Contoh reaksi radikal hidroksil
dengan ion halida adalah sebagai berikut:
Cl
Cl
Cl
Cl2
OH+ +
+
OH
Cl
Reaksi antara radikal hidroksil dengan ion nitrit adalah sebagai berikut:
NO2 NO2 OH+ +OH
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
B. Antioksidan
Istilah antioksidan sering digunakan namun sangat jarang didefinisikan
secara jelas. Menurut Fessenden dan Fessenden (1986), antioksidan merupakan suatu
inhibitor reaksi radikal bebas yang kadang-kadang dirujuk sebagai suatu “perangkap”
radikal bebas. Kerja yang lazim suatu inhibitor radikal bebas adalah bereaksi dengan
radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif dan relatif stabil. Menurut
Halliwell dan Gutteridge (1999), antioksidan adalah substansi yang bila diberikan
pada konsentrasi rendah dibandingkan substrat yang mudah dioksidasi, secara
signifikan menunda atau menghambat oksidasi substrat tersebut.
Ada dua kategori antioksidan yaitu antioksidan enzim dan antioksidan non-
enzimatik (Harman, 1981). Antioksidan enzim mencakup superoksida dismutase
(SOD), katalase (CAT), dan glutation peroksidase (GPx). Superoksida dismutase
mengubah superoksida menjadi hidrogen peroksida; katalase dan glutation
peroksidase mengubah hidrogen peroksida dari reaksi SOD menjadi air. Sebagai
tambahan, glutatione peroksidase dapat menurunkan peroksidasi lipid secara
langsung (Blokhina, 2000).
Antioksidan non-enzimatik mencakup vitamin E, vitamin C, beta karoten,
glutation, asam urat, dan albumin. Bersama-sama, enzim-enzim dan antioksidan non
enzimatik mengubah ROS menjadi komponen yang lebih aman sebelum ROS
menyebabkan kerusakan pada sel dan jaringan (Fouad, 2005).
Selain penggolongan antioksidan di atas, dikenal pula senyawa antioksidan
alami seperti senyawa polifenol yang terdapat pada teh, buah-buahan, sayuran,
anggur, bir, dan kecap (Sofia, 2005) dan senyawa antioksidan sintetik, yang lazim
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
digunakan pada industri makanan, seperti BHA (butylated hydroxyanisole) dan BHT
(butylated hydroxytoluene).
C. Teh
Semua jenis produk teh berasal dari sumber yang sama yaitu pucuk dan
daun muda tanaman teh (Camellia sinensis). Keberagaman berbagai jenis teh yang
ada disebabkan karena adanya perbedaan dalam proses pengolahannya (Werkhoven,
1988).
1. Klasifikasi dan pengolahan teh
Secara umum, daun teh diolah menjadi teh hijau, teh oolong, dan teh hitam.
Teh hijau dan teh hitam telah umum diproduksi di Indonesia sedangkan teh oolong
diproduksi di China. Perbedaan antara teh hijau dan teh hitam adalah pada ada
tidaknya reaksi enzimatik yang berlangsung selama proses pengolahan teh. Pada teh
hitam, dikenal adanya proses fermentasi sedangkan pada teh hijau proses fermentasi
justru dicegah (Werkhoven, 1988). Pada teh oolong, proses pemanasan daun terjadi
dalam waktu singkat setelah penggulungan sehingga disebut teh semifermentasi.
Karakteristiknya berada di antara teh hitam dan teh hijau (Syah, 2006). Proses
pengolahan teh hijau dapat dilihat pada tabel II sedangkan proses pengolahan teh
hitam dapat dilihat pada tabel III.
Pada proses fermentasi dalam pengolahan teh hitam, enzim polifenol
oksidase akan mengubah senyawa polifenol menjadi theaflavin dan thearubigin.
Secara umum, theaflavin berperan dalam kecerahan (brightness) dan ketajaman
(astringentcy) seduhan teh hitam (Syah, 2006). Pada tanaman, enzim polifenol tidak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
kontak langsung dengan polifenol karena polifenol terdapat dalam vakuola sel
sedangkan enzim polifenol oksidase terdapat dalam sitoplasma (Werkhoven, 1988;
Syah, 2006).
Tabel II. Proses pengolahan teh hijau (Hartoyo, 2003)
Tahap pengolahan Tujuan Pelaksanaan
Pemanasan
Menginaktifkan enzim oksidase dan mengurangi kadar air daun sehingga mudah digulung.
Daun segar dimasukkan dalam rotary panner suhu 90-100°C selama 5 menit.
Penggulungan Membuat bentuk daun menjadi ter-gulung dan memeras cairan sel ke per-mukaan.
Daun digulung dengan orthodox roller kecil selama 10-20 menit.
Pengeringan Mengurangi kadar air, mematikan enzim yang mungkin masih punya aktivitas, memperpanjang masa sim-pan, dan membentuk daun menjadi keriting dan berbutir.
Pengeringan secara bertahap. 1. Tahap 1: menggunakan pengering
sinambung suhu 100 °C selama 20-22 menit.
2. Tahap 2 : menggunakan penge-ring berputar (rotary drier atau boll tea) dengan suhu 80°C selama 60-80 menit.
Sortasi Memisahkan partikel bukan teh, menyeragamkan ukuran dan bentuk partikel, dan menggolong-golongkan dalam grade teh.
Mengayak, menghembus, menghi-langkan serat dan tangkai, dan memotong (bila perlu).
Tabel III. Proses pengolahan teh hitam (Hartoyo, 2003; Werkhoven, 1988; Syah, 2006)
Tahap
pengolahan Tujuan Pelaksanaan
Pelayuan
Mengurangi kadar air daun sehingga mudah digulung dan dihancurkan.
Daun segar dialiri udara hangat (≤ 30°C) dan kelembaban moderat (RH 60%) selama 18-20 jam.
Penggulungan Memperkecil ukuran partikel daun dan menciptakan kondisi fisik terbaik untuk mempertemukan polifenol dengan enzim polifenol oksidase.
Pucuk layu digulung bertahap dengan mesin ortodhox roller (Primary rolling selama 40 menit, rotavane selama 2 menit, dan secondary rolling selama 15 menit).
Fermentasi Mempertemukan polifenol dengan enzim polifenol oksidase.
Meletakkan pucuk tergulung pada baki selama 30 menit dengan suhu ruangan 26-28°C dan kelembaban 85-95%.
Pengeringan Menghentikan aktivitas enzim dan memperpanjang umur simpan.
Pengeringan secara sinambung dengan suhu 90-100°(inlet) selama 25-30 menit.
Sortasi Memisahkan partikel bukan teh, menyeragamkan ukuran dan bentuk partikel, dan menggolong-golongkan dalam grade teh.
Mengayak, menghembus, menghi-langkan serat dan tangkai, dan memotong (bila perlu).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
2. Kandungan kimia dalam teh
Daun teh memiliki banyak senyawa kimia yang merupakan zat bioaktif.
Gambaran mengenai komposisi pucuk daun teh segar disajikan pada tabel IV.
Tabel IV. Komposisi dari daun teh segar (Werkhoven, 1988)
Senyawa % Senyawa %
Polifenol yang dapat difermentasi 20 Fiber kasar, selulosa, lignin 22Polifenol lain 10 Protein 16Kafein 4 Lemak 8Gula dan zat bergetah 3 Klorofil dan pigmen 1,5Asam amino 7 Pektin 4Mineral 4 Amilum 0,5Larut dalam air, total 48 Tidak larut dalam air, total 52
Polifenol, kafein, asam amino, asam organik, mineral, dan gula terdapat
dalam vakuola sel. Enzim-enzim terdapat dalam sitoplasma. Protein, lemak, dan
tepung terdapat dalam protoplasma. Selulosa, pektin terdapat terdapat dalam dinding
sel (Syah, 2006).
Secara garis besar, senyawa-senyawa aktif dalam daun teh dapat
digolongkan menjadi empat kelompok, yaitu: substansi fenol, substansi bukan fenol,
substansi penyebab aroma, dan enzim (Syah, 2006).
a. Substansi fenol. Polifenol dalam teh terdiri dari senyawa golongan
flavonoid terutama subgolongan flavanol dan flavonol. Flavanol dalam teh secara
struktural termasuk subgolongan flavan-3-ol. Catechin utama dalam teh terdiri dari
(-)-Epicatechin, (-)-Epigallocatechin, (-)-Epicatechin 3-gallate, (-)-Epigallocatechin
3-gallate (Hartoyo, 2003; Syah, 2006). Kandungan catechin dalam produk teh hijau
adalah 16-30% berat kering teh (Syah, 2006). Gambar struktur kimia senyawa
catechin dapat dilihat pada gambar 1.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Dalam proses pengolahan teh hitam, catechin dioksidasi oleh enzim
polifenol oksidase menjadi theaflavin dan thearubigin. Secara garis besar, theaflavin
terdiri dari theaflavin, theaflavin 3-galat, theaflavin 3´galat, theaflavin 3,3´ digalat,
yang terbentuk karena adanya reaksi yang terjadi antara quinon (turunan catechin)
dengan gallocatechin (Roy et al., 2001; Hartoyo, 2003).
OH
HO O
OH
OH
OR2
R1
OH
OH
OHO
Galat (X) =
(-)-Epicatechin: R1 = R2 = H(-)-Epigallocatechin: R1 = OH, R2 = H(-)-Epicatechin gallate: R1 = H, R2 = X(-)-Epigallocatechin gallate: R1 = OH, R2 = X
OH
HO O
OH
OH
OR2
R1
OH
OH
OHO
X =
(-)-Catechin: R1 = R2 = H(-)-Gallocatechin: R1 = OH, R2 = H(-)-Catechin gallate: R1 = H, R2 = X(-)-Gallocatechin gallate: R1 = OH, R2 = X
Gambar 1. Struktur kimia catechin dalam teh dan epimernya (Hartoyo, 2003)
Gambar struktur kimia theaflavin dan thearubigin dapat dilihat pada gambar
2. Kandungan theaflavin di dalam teh hitam adalah 0,3-2% dan thearubigin adalah
10-20% dari berat kering teh (Syah, 2006).
Flavonol utama dalam teh adalah quercetin, kaemferol, dan myricetin yang
ada dalam jumlah 2-3%. Gambar struktur kimia flavonol dalam teh disajikan pada
gambar 3. Flavonol ini, terutama terdapat dalam bentuk glikosidanya dan sedikit
dalam bentuk aglikonnya (Hartoyo, 2003). Flavonol merupakan salah satu
antioksidan alami yang terdapat dalam tanaman dan mempunyai kemampuan
mengikat logam. Aktivitas antioksidan flavonol bertambah besar seiring dengan
bertambahnya gugus hidroksil dalam cincin A dan B (Syah, 2006).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
HO O
OR1
OH
OH
HO O
OR2
OH
OH
O
OH
Theaflavin: R1 = R2 = HTheaflavin 3-galat: R1 = X, R2 = HTheaflavin 3'-galat: R1 = H, R2 = XTheaflavin 3,3'-digalat: R1 = X, R2 = X
OH
OH
OHO
Galat =X =
HO O
R
OH
OH
HO O
COOH
COOH
O
OH
R
R = Galat(a) (b)
Gambar 2. Struktur kimia theaflavin (a) dan thearubigin (b) (Hartoyo, 2003; Lambert dan
Yang, 2003)
R1
OOH
HO O
R2
OH
R3A C
B
Myricetin: R1 = R2 = R3 = OHQuercetin: R1 = R2 =OH, R3 = HKaemferol: R1 = OH, R2 = R3 = H
Gambar 3. Struktur kimia flavonol dalam teh (Hartoyo, 2003)
b. Substansi bukan fenol. Termasuk di antaranya adalah karbohidrat
(sukrosa, glukosa, dan fruktosa), pektin, alkaloid (kafein), klorofil, dan zat warna
yang lain, protein dan asam amino, asam organik, substansi resin, vitamin (C, K, A,
B1, dan B2), mineral (Mg, K, F, Na, Ca, Zn, Mn, Cu, dan Se). Selama proses
pengolahan teh, vitamin C mengalami oksidasi sehingga jumlahnya menjadi semakin
kecil. Laju oksidasi vitamin C dipacu oleh temperatur yang tinggi (Syah, 2006).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
c. Substansi penyebab aroma. Munculnya aroma pada teh hitam langsung
atau tidak langsung selalu dihubungkan dengan terjadinya oksidasi senyawa
catechin. Substansi penyebab aroma teh digolongkan menjadi empat yaitu fraksi
karboksilat, fenolat, karbonil, dan fraksi netral bebas karbonil. Ada pendapat lain
yang menyatakan bahwa aroma teh berasal dari penguraian protein, oksidasi
karotenoid menjadi senyawa yang mudah menguap atau karena adanya minyak
essensial dalam teh (Syah, 2006).
d. Kandungan enzim. Enzim yang terkandung dalam daun teh adalah
invertase, amilase, β-glukosidase, oksimetilase, protease, dan peroksidase. Enzim
lain yang tidak penting dalam proses kehidupan tanaman namun penting dalam
proses pengolahan teh adalah polifenol oksidase (Syah, 2006).
3. Manfaat teh
Teh mempunyai banyak manfaat pada kesehatan, diantaranya antioksidan,
menghambat oksidasi LDL (Low Density Lipoprotein), mereduksi kolesterol,
antitrombosis, antimikroba, antivirus, memberikan perlindungan terhadap kanker,
menurunkan tekanan darah, mengurangi kadar gula darah, mempertahankan berat
tubuh ideal, dan mengurangi stress (Hartoyo, 2003).
4. Reaksi radikal hidroksil dengan polifenol dalam teh
Potensi teh sebagai antioksidan disebabkan oleh adanya senyawa polifenol
yang merupakan senyawa flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Senyawa
tersebut mampu menangkap radikal bebas karena gugus hidroksi fenolik yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
terdapat dalam strukturnya. Reaksi antara gugus tersebut dengan radikal bebas akan
membentuk radikal baru yang distabilisasi oleh efek resonansi inti aromatik
(Cuvelier et al., 1994). Tabel berikut menyajikan karakteristik dari struktur flavonoid
yang turut menentukan aktivitas flavonoid sebagai penangkap radikal bebas yang
efektif (Middleton et al., 2000). Gambaran gugus-gugus yang tercantum pada tabel V
disajikan pada gambar 4. Menurut Amić et al. (2003), setelah melakukan analisis
hubungan struktur-aktivitas penangkapan radikal, diindikasikan bahwa flavonoid
yang memiliki gugus catechol pada cincin B dan atau gugus hidroksi pada C3
memiliki aktivitas penangkapan radikal yang tinggi. Mekanisme reaksi flavonoid
dalam teh dengan suatu radikal bebas, misalnya radikal hidroksil, ditunjukkan pada
gambar 5.
Tabel V. Karakteristik struktur flavonoid untuk aktivitas penangkapan radikal yang efektif (Middleton et al., 2000)
• Gugus catechol (O-dihidroksi) pada cincin B, memberikan kemampuan
penangkapan yang besar. • Gugus pyrogallol (Trihidroksi) pada cincin B, memberikan aktivitas yang lebih
tinggi lagi, seperti pada myricetin. Ikatan rangkap C2-C3 pada cincin C memperlihatkan peningkatan aktivitas penangkapan karena memberikan stabilitas pada radikal fenoksi yang dihasilkan.
• 4-oxo (gugus keton pada posisi 4 di cincin C), bila berhubungan dengan ikatan
rangkap pada C2-C3 maka aktivitas penangkapan akan meningkat dengan cara delokalisasi elektron dari cincin B.
• Gugus 3-OH pada cincin C menghasilkan penangkapan yang sangat besar.
Kombinasi ikatan rangkap pada C2-C3 dan 4-oxo memperlihatkan kombinasi terbaik di atas gugus catechol.
• Gugus 5-OH dan 7-OH juga menambah potensi penangkapan pada beberapa kasus.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
HO O
OH
OH
OH
OHEpicatechin
B
CA
OH
OOH
HO O
OH
OH
OHA C
B
Myricetin
1
2
3
456
7
8
2'
3'
4'
5'
6'1
2
3
456
7
8
2'3'
4'
5'6'
= gugus catechol= gugus pyrogallol= gugus 4-oxo= gugus 3-OH= gugus 5-OH, 7-OH= kombinasi gugus 4-oxo dan ikatan rangkap C2-C3
Gambar 4. Gambaran gugus-gugus pada flavonoid yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal bebas (Middleton et al., 2000)
OOH
O
-H2O
-H2O
H
OH
O
OH
O
OH
O
O OHH
O
O
OH
O
O
Gambar 5. Mekanisme reaksi antara gugus catechol dengan radikal hidroksil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
D. Metode Deteksi Radikal Hidroksil
Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil dapat dilihat pada tabel VI.
Tabel VI. Metode dan prinsip deteksi radikal hidroksil (Bors et al., 1979; Halliwell and Gutteridge, 1999)
Metode Prinsip Metode
Pemucatan p-nitrosodimetilanilin (p-NDA)
p-nitrosodimetilanilin bereaksi cepat dengan radikal hidroksil tetapi tidak bereaksi dengan O2˙¯ atau singlet O2. Reaksi ini akan diikuti pemucatan warna kuning.
Metode deoksiribosa Reaksi antara radikal hidroksil dengan deoksiribosa menghasilkan MDA, lalu dipanaskan dengan asam tiobarbiturat pada pH rendah, akan menghasilkan warna merah muda.
Metode triptofan Reaksi antara radikal hidroksil dengan triptofan akan menghasilkan satu set produk yang khas.
Metode dimetilsulfoksida (DMSO)
Radikal hidroksil bereaksi dengan dimetilsulfoksida (DMSO) menghasilkan antara lain gas metana yang dideteksi dengan Gas Liquid Chromatography atau formaldehid yang dideteksi secara kolorimetri.
E. Metode Deoksiribosa
Deoksiribosa (2-deoksi-D-ribosa) merupakan gula yang mempunyai lima
atom karbon yang merupakan turunan dari suatu gula pentosa yaitu ribosa. Gula ini
merupakan bagian dari DNA. Gambar struktur deoksiribosa disajikan pada gambar 6.
Gambar 6. Struktur deoksiribosa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Beberapa produk degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada pH rendah
terdekomposisi menjadi malondialdehid (MDA), yang dapat dideteksi dengan
penambahan asam tiobarbiturat (TBA) menghasilkan kromogen MDA-TBA yang
berwarna merah muda. Pembentukan MDA dari deoksiribosa menjadi dasar uji
penangkapan radikal hidroksil (uji deoksiribosa) (Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Proses degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil terjadi melalui
beberapa tahap. Tahap-tahap ini terjadi pada saat campuran reaksi yang terdiri dari
reagen Fenton (FeCl3, EDTA, H2O2, vitamin C) dan deoksiribosa diinkubasi pada
suhu 37ºC selama 30 menit. Tahap-tahap reaksi tersebut adalah reaksi pembentukan
radikal hidroksil dari reaksi Fenton dan degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil
(Halliwell dan Gutteridge, 1999).
Tahap I. Reaksi pembentukan radikal hidroksil. Radikal hidroksil dihasilkan
melalui reaksi Fenton. Dalam reaksi Fenton, vitamin C berfungsi sebagai reduktor
yang mempercepat proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+. Semakin cepat Fe3+ direduksi
menjadi Fe2+ maka semakin cepat pembentukan radikal hidroksil karena Fe2+ akan
bereaksi dengan H2O2 dan menghasilkan radikal hidroksil (•OH). Penambahan suatu
ligan (EDTA) pada besi dapat meningkatkan konstante kecepatan reaksi antara Fe2+
dengan H2O2. Reaksinya adalah sebagai berikut :
Fe3+EDTA + Asam Askorbat Fe2+EDTA + Asam Dehidro Askorbat
Fe2+EDTA + H2O2 Fe3+EDTA + -OH + •OH
Tahap II. Degradasi deoksiribosa. Radikal hidroksil akan menyerang
deoksiribosa dan mendegradasinya menjadi fragmen-fragmen. Semua posisi pada
struktur gula deoksiribosa memungkinkan untuk diserang oleh radikal hidroksil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
membentuk radikal deoksiribosa melalui reaksi abstraksi hidrogen (gambar 7) yang
dengan adanya O2 akan diubah secara cepat menjadi radikal gula peroksil (gambar
8). Selanjutnya terjadi serangkaian reaksi yaitu disproporsionasi, penataan ulang,
eliminasi air, dan pemecahan ikatan C–C menghasilkan produk karbonil yag
bervariasi. Konstante kecepatan reaksi orde dua dari reaksi antara radikal hidroksil
dengan gula deoksiribosa pada pH 7,4 adalah 3,1 x 109 M-1s-1 (Halliwell dan
Gutteridge, 1999). Beberapa produk degradasi deoksiribosa, saat dipanaskan pada
pH rendah akan terdekomposisi menjadi MDA (gambar 9) (Halliwell dan Gutteridge,
1999).
O
OH2C
HO
HO H
H +
HO
OHH2O_ O
OH2C
HO
H
Deoksiribosa
Gambar 7. Reaksi penyerangan radikal hidroksil pada deoksiribosa (Halliwell dan Gutteridge, 1999)
OOH2C
HO
HO
HO O
OOH2C
HO
HO
H
OO
+
Radikal Gula Peroksil Gambar 8. Reaksi pembentukan radikal gula peroksil (Halliwell danGutteridge, 1999).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
OO
HH Gambar 9. Struktur MDA
F. Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang
tidak dapat larut dengan pelarut cair. Secara umum, cara penyarian dapat dibedakan
menjadi infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian berkesinambungan. Sebagai
cairan penyari digunakan air, eter, atau campuran etanol air. Penyarian dengan
campuran etanol dan air dilakukan dengan cara maserasi atau perkolasi (Anonim,
1986).
1. Cara penyarian
a. Infundasi. Cara infundasi adalah proses penyarian yang umumnya
digunakan untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-bahan
nabati. Sari yang dihasilkan tidak stabil dan mudah dicemari oleh kuman dan kapang.
Oleh sebab itu sari yang diperoleh dengan cara ini tidak boleh disimpan lebih dari 24
jam. Infundasi dibuat dengan cara menyari simplisia dengan air pada suhu 90°C
selama 15 menit (Anonim, 1986)
b. Maserasi. Cara maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana.
Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari
sehingga cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel
yang mengandung zat aktif. Adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di
dalam sel dengan yang di luar sel mengakibatkan pendesakan larutan terpekat dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
dalam sel ke luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan
konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel (Anonim, 1986).
Maserasi dapat dilakukan modifikasi misalnya dengan teknik remaserasi.
Pada teknik ini, cairan dibagi menjadi 2 kemudian seluruh serbuk simplisia
dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan dan diperas,
ampas dimaserasi lagi dengan cairan penyari kedua (Anonim, 1986).
c. Perkolasi. Cara perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan
mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Cairan
penyari akan dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk kemudian cairan akan
melarutkan zat aktif di dalam sel yang dilalui sampai mencapai keadaan jenuh.
Serbuk simplisia yang akan diperkolasi dibasahi terlebih dahulu dengan cairan
penyari kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat perkolasi
(perkolator) sambil tiap kali ditekan. Serbuk kemudian ditutup dengan kertas saring
dan cairan penyari dialirkan hingga di atas permukaan massa masih terdapat lapisan
cairan penyari. Setelah 24 jam, keran dibuka dan diatur hingga kecepatan penetesan
adalah 1 ml per menit. Akhir proses perkolasi ditentukan dengan pemeriksaan zat
secara kualitatif pada perkolat terakhir.
d. Penyarian berkesinambungan. Proses ini merupakan gabungan antara
proses untuk menghasilkan ekstrak cair dan proses penguapan. Alat yang digunakan
misalnya Soxhlet. Pada penyarian ini, cairan penyari dipanaskan hingga mendidih,
kemudian uap penyari akan naik ke atas kemudian akan mengembun karena
didinginkan oleh pendingin balik. Embun akan turun melalui serbuk simplisia sambil
melarutkan zat aktif serbuk simplisia.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
Pemilihan cara penyarian disesuaikan dengan zat aktif yang akan disari,
misalnya dari segi ketahanan zat aktif terhadap adanya proses pemanasan. Selain itu,
bentuk, nilai terapeutik, dan nilai ekonomis juga perlu diperhitungkan. Salah satu
contoh pemilihan cara penyarian dapat dilihat pada tabel VII.
Tabel VII. Pemilihan cara penyarian
No Perihal Perkolasi Maserasi
1 Simplisia keras + 2 Simplisia lunak dan parenkimatik + 3 Sulit diserbuk seperti asam + 4 Bahan tidak kompak seperti Benzoin + 5 Nilai terapeutik besar, misal kina + 6 Nilai terapeutik kurang, misal aroma + 7 Harga mahal + 8 Harga murah +
2. Cairan penyari
Pemilihan cairan penyari harus mempertimbangkan banyak faktor. Cairan
penyari yang baik harus memenuhi kriteria yaitu murah dan mudah didapat, stabil
secara fisika dan kimia, netral, tidak mudah menguap atau terbakar, selektif, tidak
mempengaruhi zat berkhasiat, dan diperbolehkan oleh peraturan (Anonim, 1986).
Farmakope Indonesia Edisi III menetapkan bahwa sebagai cairan penyari
adalah air, eter, atau campuran etanol air. Etanol dapat melarutkan alkaloid basa,
minyak menguap, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid, steroid,
damar, dan klorofil. Lemak, malam, tanin, dan saponin hanya sedikit larut di dalam
etanol. Campuran etanol dan air dapat digunakan untuk meningkatkan penyarian
(Anonim, 1986).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
G. Spektrofotometri UV-Vis
Teknik spektroskopik adalah salah satu teknik fisiko-kimia yang mengamati
tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Tiga hal yang
mungkin terjadi sebagai akibat interaksi atom molekul dengan radiasi
elektromagnetik adalah hamburan (scattering), absorpsi (absorption) dan emisi
(emission) (Mulja dan Suharman, 1995).
Spektrofotometri UV-Vis merupakan anggota teknik analisis spektroskopik
yang dihasilkan dari absorpsi radiasi elektromagnetik oleh atom atau molekul
memakai sumber radiasi elektromagnetik ultra violet dekat (190-380 nm) dan sinar
tampak (380-780 nm) dengan menggunakan instrumen spektrofotometer (Mulja dan
Suharman, 1995).
Ada empat macam transisi elektron di dalam suatu molekul. (1) Elektron
yang tidak berada dalam ikatan. Energi eksitasi elektron ini sangat tinggi dan tidak
memiliki kontribusi pada absorbsi di daerah visibel maupun UV. (2) Elektron pada
ikatan kovalen tunggal (elektron sigma, σ). Energi eksitasi elektron ini juga terlalu
tinggi sehingga tidak memberikan kontribusi pada absorpsi di daerah visibel atau UV
(contohnya pada ikatan kovalen hidrokarbon jenuh). (3) Pasangan elektron bebas
pada kulit terluar (elektron n), contohnya pada N, O, S, dan halogen. Elektron ini
cenderung diikat kurang kuat dibandingkan elekton sigma dan dapat tereksitasi oleh
radiasi visibel atau UV. (4) Elektron pada orbital π (pi), contohnya pada ikatan
rangkap dua atau tiga. Elektron ini paling mudah tereksitasi dan bertanggung jawab
pada sebagian besar spektra pada daerah visibel dan UV (Christian, 2004).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
Efek absorpsi radiasi pada molekul menghasilkan transisi elektron ke
tingkat yang lebih tinggi yang dikenal sebagai orbital antibonding. Transisi yang
paling umum adalah transisi dari π atau n menuju π* (Christian, 2004). Eksitasi
elektron σ→σ* yang diberikan oleh ikatan tunggal, sebagai contoh pada alkana,
membutuhkan energi yang paling besar. Eksitasi elektron π → π* diberikan oleh
ikatan rangkap dua dan tiga (alkena dan alkuna). Pada gugus karbonil (dimetil keton
dan asetaldehid) terjadi eksitasi elektron n → σ* dan eksitasi elektron n → π* yang
terjadi pada λ = 280-290 nm tetapi eksitasinya terlarang karena memberikan nilai
ε=12-16 cm-1mol-1L (Mulja dan Suharman, 1995).
Senyawa organik pada umumnya dan semua gugus atau gugusan atom yang
mengabsorpsi radiasi UV-Vis disebut sebagai gugus kromofor (Mulja dan Suharman,
1995). Gugus kromofor terdiri dari gugus tak jenuh yang menjalani transisi π → π*
dan n → π*. Contoh beberapa kromofor adalah sebagai berikut :
C C C C
N N NO2 C
O
(Fessenden dan Fessenden, 1986).
Pada gugus organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus fungsionil
yang mempunyai elektron bebas seperti –OH, -NH2, dan OCH3 yang memberikan
transisi (n→σ*). Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor akan
mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih
panjang (pergeseran merah = batokromik) disertai peningkatan intensitas (efek
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
CH
CH
CH
CH
hiperkromik). Pergeseran batokromik juga terjadi pada dua ikatan rangkap yang
terkonjugasi butadien ( )(Mulja dan Suharman, 1995).
Kuantitas energi yang diserap oleh suatu senyawa berbanding terbalik dengan
panjang gelombang radiasi:
∆E = hv = λhc
dengan ∆E = energi yang diabsorpsi (erg); h = tetapan Planck (6,6 x 10 -27) erg-det; v
= frekuensi (Hz); c = kecepatan cahaya (3 x 1010 cm/det); λ = panjang gelombang
(cm) (Fessenden dan Fessenden, 1986).
Analisis dengan spektrofotometer UV-Vis melibatkan pembacaan absorban
radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang diteruskan.
Keduanya dikenal sebagai absorban (A) tanpa satuan dan transmitan dengan satuan
persen. Hubungan antara intensitas radiasi elektromagnetik yang diserap oleh sistem
(Io) dengan intensitas radiasi yang ditransmisikan (It) dapat dijelaskan dengan hukum
Lambert-Beer yang menyatakan hubungan antara transmitan dan absorbansi terhadap
intensitas radiasi atau konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang
mengabsorbsi.
Hubungan tersebut dapat dirumuskan sebagai berikut :
bcε
o
t 10II
T −==
ε.c.bT1log ==A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
dimana T = persen transmitan; Io = intensitas radiasi yang datang; It = intensitas
radiasi yang diteruskan; ε = serapan molar (L.mol-1.cm-1); c = konsentrasi (mol.L-1);
b = tebal larutan (cm); A = absorban (Mulja dan Suharman, 1995).
Komponen-komponen pokok spektrofotometer meliputi sumber (1) tenaga
radiasi yang stabil, (2) sistem yang terdiri atas lensa-lensa, cermin, dan celah-celah,
(3) monokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang
gelombang tunggal, (4) tempat cuplikan yang transparan, dan (5) detektor radiasi
yang dihubungkan dengan sistem meter atau pencatat (Sastrohamidjojo, 2001).
Kolorimetri adalah suatu teknik pengukuran cahaya yang diabsorpsi oleh
suatu zat yang berwarna, baik warna yang terbentuk dari asalnya (senyawa tersebut
memang berwarna) maupun warna yang dibentuk dari hasil reaksi dengan zat lain
(Khopkar, 1990). Perubahan warna yang dibentuk dari hasil reaksi dengan zat lain
dapat terjadi karena zat tersebut mengalami perpanjangan gugus kromofor oleh
penambahan zat lain yang sebelumnya juga tidak berwarna dalam suatu larutan atau
karena pembentukan suatu komplek yang berwarna. Pengukuran serapan larutan
berwarna tersebut dilakukan pada panjang gelombang daerah sinar tampak (380-780
nm) (Mulja dan Suharman, 1995).
Warna dapat dihasilkan oleh proses absorbsi cahaya dengan panjang
gelombang tertentu oleh suatu zat. Senyawa organik dengan konjugasi yang ekstensif
menyerap cahaya dengan panjang gelombang tertentu, karena adanya transisi π → π*
dan n → π*. Apa yang tampak bukanlah warna yang diserap melainkan komplemen-
nya, yang dipantulkan (tabel VIII) (Fessenden dan Fessenden, 1986).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
Tabel VIII. Spektrum warna pada daerah visibel (Skoog et al., 1994)
Rentang Panjang Gelombang (nm)
Warna yang diabsorbsi
Warna Komplementer (warna yang terlihat)
400– 435 Ungu Kuning-Hijau 435 – 480 Biru Kuning 480 – 490 Biru-Hijau Orange 490 – 500 Hijau-Biru Merah 500 – 560 Hijau Merah lembayung 560 – 580 Kuning-Hijau Ungu 580 – 595 Kuning Biru 595 – 650 Orange Biru-Hijau 650 – 750 Merah Hijau-Biru
Pada kolorimetri yang ditentukan kadarnya adalah serapan cahaya pada
larutan berwarna. Oleh karena itu, diperlukan suatu larutan dengan kadar tertentu
yang diketahui dengan konsentrasi yang menaik dan membandingkan warnanya
dengan senyawa yang hendak dianalisis. Pada warna yang sama, maka
konsentrasinya adalah sama (Rooth dan Baschke, 1994).
Konjugasi beberapa gugus kromofor dengan gugus kromofor lain yang sama
akan menyebabkan spektrum absorpsi senyawa hasil konjugasi tersebut sangat
berbeda dengan spektrum absorpsi masing-masing gugus tunggalnya. Dari hasil
konjugasi ini diperoleh kromofor baru. Energi yang dibutuhkan elektron untuk
eksitasi menjadi berkurang dan absorpsi cahaya bergeser ke daerah panjang
gelombang panjang. Jika jumlah gugus terkonjugasi cukup banyak, maka senyawa
akan menjadi berwarna dan mengabsorpsi dalam daerah sinar tampak (Rooth dan
Baschke, 1994).
Beberapa kriteria yang harus dipenuhi dalam analisis secara kolorimetri
adalah selektif, sensitif, ada kesebandingan antara warna dengan konsentrasi, warna
yang dihasilkan stabil, reprodusibel, dan larutan jernih (Vogel, 1994).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
H. Landasan Teori
Radikal hidroksil merupakan contoh radikal bebas yang sangat reaktif dan
dapat berlaku sebagai toksikan primer dan sebagai sumber toksikan sekunder.
Radikal hidroksil dapat memecah rantai DNA dan berperan dalam karsinogenik,
mutagenik serta sitotoksik. Reaksi radikal hidroksil dengan DNA mengakibatkan
kerusakan penting dalam sel, mengingat kerusakan rantai DNA tidak dapat dengan
mudah diperbaiki oleh sel.
Dalam tubuh, radikal hidroksil sangat cepat ditangkap oleh sistem
pertahanan antioksidan yaitu melalui kerja enzim-enzim antioksidan. Saat
peningkatan pembentukan ROS tidak dapat ditanggulangi oleh sistem pertahanan
antioksidan, tercetus situasi yang disebut stress oksidatif. Pada kondisi ini,
diperlukan tambahan antioksidan eksogen. Salah satu antioksidan eksogen alami
adalah senyawa polifenol yang terdapat di dalam teh.
Senyawa polifenol dalam teh merupakan senyawa golongan flavonoid yaitu
golongan flavan-3-ol dan flavonol. Teh hijau maupun teh hitam sama-sama
mengandung flavonoid namun jumlahnya saja yang berbeda. Perbedaan ini
dikarenakan proses oksidasi enzimatik pada polifenol selama pembuatan teh hitam.
Senyawa flavonoid dapat larut dalam cairan penyari yaitu etanol karena senyawa
flavonoid memiliki banyak gugus hidroksi sehingga cenderung bersifat polar. Oleh
karena itu, dapat diindikasikan bahwa di dalam ekstrak etanol teh hijau maupun teh
hitam terdapat senyawa flavonoid. Adanya gugus hidroksi fenolik di dalam struktur
flavonoid menyebabkan adanya kemampuan untuk menangkap radikal hidroksil
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
yang reaktif membentuk radikal bebas baru atau senyawa non radikal yang tidak
reaktif dan relatif stabil.
Metode yang digunakan untuk mengetahui aktivitas penangkapan radikal
hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam adalah metode deoksiribosa.
Metode ini menggunakan spektrofotometri visibel untuk mengukur produk degradasi
deoksiribosa oleh radikal hidroksil yang dihasilkan oleh reagen Fenton. Produk
degradasi deoksiribosa yaitu MDA, yang dalam suasana asam akan bereaksi dengan
TBA membentuk kromogen berwarna merah muda (kromogen MDA-TBA) yang
menyerap maksimum pada 532 nm (Kunchandy dan Rao, 1990). Adanya senyawa
penangkap radikal hidroksil di dalam ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam akan
menurunkan jumlah MDA sehingga jumlah kromogen MDA-TBA akan berkurang
yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi larutan sampel dibandingkan dengan
larutan kontrol. Aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak teh hijau dan
teh hitam dinyatakan dengan % scavenging dan nilainya dalam effective scavenging
(ES).
I. Hipotesis
Ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas sebagai penangkap
radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan dalam % scavenging
dan ES50.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental karena ada
subjek uji yang dikenakan manipulasi perlakuan.
B. Variabel-variabel Penelitian
Variabel–variabel yang digunakan dalam penelitian ini meliputi :
1. Variabel bebas
Dalam penelitian ini variabel bebasnya adalah konsentrasi ekstrak etanol
dan jenis teh (teh hijau dan teh hitam).
2. Variabel tergantung
Dalam penelitian ini variabel tergantungnya adalah persen scavenging
dan ES50.
3. Variabel pengacau
(a) Variabel pengacau terkendali
Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah merk teh hijau
dan teh hitam, bahan-bahan kimia dan alat-alat yang digunakan selama penelitian,
waktu dan lama penyarian, volume cairan penyari yang digunakan, suhu dan
waktu inkubasi larutan uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil.
32
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
(b) Variabel pengacau tidak terkendali
Jenis dan varietas teh, kondisi (iklim, media tanam, ketinggian) tempat
penanaman teh.
C. Definisi Operasional
1. Ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam yang dianalisis dihasilkan melalui
proses remaserasi dengan etanol 70% pada teh hijau dan teh hitam merk X.
2. Persen scavenging adalah persen yang menyatakan kemampuan suatu
senyawa dalam menangkap radikal hidroksil.
% Scavenging = kontrollarutan
sampellarutan kontrollarutan
Absorbansi Absorbansi - Absorbansi x 100 %
3. Larutan kontrol merupakan larutan yang terdiri dari reagen Fenton, larutan
deoksiribosa, bufer fosfat, asam trikloroasetat, dan asam tiobarbiturat.
4. Larutan sampel merupakan larutan kontrol yang telah diberi ekstrak etanol teh
hijau atau teh hitam.
5. Effective Scavenging 50 (ES50) menyatakan besarnya konsentrasi sampel yang
menghasilkan penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50%.
D. Bahan-Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian adalah teh hijau dan teh
hitam (Merk X). Bahan-bahan kualitas p.a.(E.Merck) : dinatrium hidrogen fosfat
(Na2HPO4), kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4), asam tiobarbiturat (TBA), asam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
trikloroasetat (TCA), ferri klorida heksahidrat (FeCl3.6H2O),
Etilendiamintetraasetat garam dinatrium dihidrat (C10H14N2Na2O8.2H2O),
hidrogen peroksida (larutan 30% H2O2), L (+) asam askorbat (Vitamin C). Bahan-
bahan kualitas p.a. (Sigma, USA) : 2-deoksi-D-ribosa. Bahan-bahan kualitas
farmasetis (Brataco) : etanol.. Bahan lain : akuades (Laboratorium Kimia Organik
Universitas Sanata Dharma).
E. Alat-Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Spektrofotometer
UV-Vis (Perkin Elmer Lamda 20), pH-meter (Metrohm 632), vacuum rotary
evaporator (Buchi rotavapor), waterbath (Labo-Tech; Heraeus), vortex (Janke &
Kunkel), neraca elektrik (Scaltec SBC 22), mikropipet 10-100µL dan 100-1000µL
(Acura 825), mikropipet 0,5-5,0 ml (Socorex), tabung reaksi bertutup (Schott-
Germany), dan seperangkat alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium
analisis.
F. Tata Cara Penelitian
1. Pemilihan sampel
Sampel yang digunakan berupa teh hijau dan teh hitam yang sudah
dikemas dan dipasarkan dengan merk X. Sampel diambil sebanyak 80 bungkus
untuk tiap jenis teh dari 100 bungkus yang ada. Pengambilan 80 bungkus sampel
dilakukan dengan teknik random sampling menggunakan tabel bilangan random
(Lampiran 3).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
2. Pembuatan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam
Sebanyak 20 bungkus sampel dari tiap jenis teh, dihomogenkan
kemudian digiling dan dihaluskan dengan menggunakan blender. Serbuk diayak
menggunakan ayakan dengan derajat halus 4/18 (digunakan ayakan nomor mesh
12 sampai 50). Serbuk disimpan dalam botol coklat.
Serbuk sebanyak 300 g dimasukkan dalam bejana tertutup kemudian
direndam dengan cairan penyari yaitu etanol 70 % sebanyak 1 liter dan didiamkan
selama 24 jam. Cairan penyari kemudian dikeluarkan dan ditampung dalam
wadah bertutup. Ampas dimaserasi kembali selama 24 jam dengan 500 ml cairan
penyari. Cara ini diulang hingga didapatkan maserat yang jernih.
Maserat dikumpulkan dan disaring kemudian diuapkan pelarutnya
dengan bantuan vacuum rotary evaporator pada tekanan rendah hingga seluruh
etanol diperkirakan telah menguap. Ekstrak kental dikumpulkan dan diuapkan
kembali di atas waterbath dengan suhu 50°C hingga diperoleh ekstrak kering.
Ekstrak hasil pengeringan kemudian ditimbang dan disimpan dalam desikator.
3. Pembuatan bufer fosfat 20 mM
a. Pembuatan dinatrium hidrogen fosfat 20 mM
Timbang saksama 1,42 g Na2HPO4 dan larutkan dalam akuades hingga
500,0 ml.
b. Pembuatan kalium dihidrogen fosfat 20 mM
Timbang saksama 0,68 g KH2PO4 dan larutkan dalam akuades hingga
250,0 ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Bufer fosfat dibuat dengan bantuan pH meter. Larutan KH2PO4
ditambahkan secara bertetes-tetes pada larutan Na2HPO4 hingga tercapai pH 7,4.
4. Pembuatan reagen
a. Larutan FeCl3 1 mM
Sebanyak lebih kurang 13,52 mg FeCl3.6H2O ditimbang saksama dan
dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak
2,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan dengan
akuades hingga tanda.
b. Larutan EDTA 1 mM
Sebanyak lebih kurang 18,61 mg Na2EDTA.2H2O ditimbang saksama
dan dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil
sebanyak 2,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan
dengan akuades hingga tanda.
c. Larutan Vitamin C 1 mM
Sebanyak lebih kurang 17,61 mg vitamin C ditimbang saksama dan
dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak
1,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan dengan
akuades hingga tanda. Larutan ini harus selalu dibuat baru.
d. Larutan H2O2 20 mM
Sebanyak 0,091 ml larutan H2O2 30 % dimasukkan ke dalam labu ukur
10 ml dan ditambah akuades hingga tanda. Dari larutan tersebut diambil sebanyak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
2,5 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml kemudian diencerkan dengan
akuades hingga tanda.
e. Larutan TCA 5 %
Sebanyak 1,25 g TCA ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades
hingga 25,0 ml.
f. Larutan TBA 1 %
Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam beaker
glass 100 ml, ditambah akuades secukupnya kemudian dipanaskan di atas hot
plate pada suhu 50-55°C hingga larut. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur
25,0 ml dan ditambah akuades hingga tanda.
5. Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM
Sebanyak lebih kurang 20,12 mg deoksiribosa ditimbang saksama dan
dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml. Dari larutan tersebut diambil sebanyak
4,2 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml kemudian diencerkan dengan
akuades hingga tanda.
6. Pembuatan larutan ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam 1 mg/ml
Sebanyak lebih kurang 25 mg ekstrak etanol teh hijau atau hitam
ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 25,0 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
7. Optimasi metode
a. Penentuan operating time (waktu operasional)
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μl larutan
deoksiribosa 2,5 mM, 300 μl FeCl3 1 mM, 300 μl EDTA 1 mM, 300 μl H2O2 20
mM, 4500 μl bufer fosfat pH 7,4, dan 300 μl vitamin C 1 mM. Inkubasi pada suhu
37 ºC selama 30 menit. Setelah itu, larutan ditambah 1 ml TCA 5 % dan 1 ml
TBA 1 % kemudian dipanaskan dengan waterbath pada suhu 80ºC selama 30
menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir
selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang
maksimum teoritis 532 nm selama 1 jam.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μl larutan
deoksiribosa 2,5 mM, 300 μl FeCl3 1 mM, 300 μl EDTA 1 mM, 300 μl H2O2 20
mM, 4500 μl bufer fosfat pH 7,4, dan 300 μl vitamin C 1 mM. Inkubasi pada suhu
37 ºC selama 30 menit. Setelah itu, larutan ditambah 1 ml TCA 5 % dan 1 ml
TBA 1% kemudian dipanaskan dengan waterbath pada suhu 80ºC selama 30
menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir
selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya dari panjang gelombang 400-600
nm.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
8. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau
dan teh hitam
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μl larutan
deoksiribosa 2,5 mM dan ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam sebanyak 200;
400; 600; 800; dan 1000 μl, kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan
300 μl FeCl3 1 mM, 300 μl EDTA 1 mM, 300 μl H2O2 20 mM, bufer fosfat pH
7,4 (penambahan bufer fosfat disesuaikan dengan volume ekstrak etanol yang
ditambahkan sehingga volume akhir larutan adalah 6 ml) dan 300 μl vitamin C 1
mM. Inkubasi pada suhu 37 ºC selama 30 menit. Setelah itu, larutan ditambah 1
ml TCA 5 % dan 1 ml TBA 1 %. kemudian dipanaskan dengan waterbath pada
suhu 80ºC selama 30 menit. Larutan kemudian didinginkan di bawah air mengalir
selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang
maksimum hasil optimasi. Buat larutan kontrol.
G. Analisis Hasil
Analisis hasil pada penelitian ini meliputi penentuan % scavenging yang
dihitung dari selisih antara absorbansi larutan kontrol dan absorbansi larutan
sampel dibagi absorbansi larutan kontrol dikalikan 100%.
% Scavenging = kontrollarutan
sampellarutan kontrollarutan
Absorbansi Absorbansi - Absorbansi x 100 %
Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil sebesar 50% (ES50) diperoleh dari
persamaan regresi linier antara % scavenging dan konsentrasi ekstrak etanol teh
hijau atau teh hitam pada berbagai konsentrasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
Persamaan regresi linier : y = bx + a
Perhitungan ES50 :
ba - 50ES50 =
Keterangan: a : intersep b : slope
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pemilihan Sampel
Sampel yang digunakan berupa produk teh hijau dan teh hitam yang
sudah dikemas dan dipasarkan dengan merk X. Produk teh hijau atau teh hitam
yang dipilih merupakan produk yang berasal dari satu pabrik dengan nomor batch
yang sama dan tanggal kadaluarsa yang sama. Diasumsikan produk yang terpilih
memiliki kemiripan dalam hal jenis teh yang ditanam, lokasi dan iklim tempat
tumbuh, dan cara pengolahan teh sehingga dapat meminimalkan variasi hasil
penelitian.
Jumlah produksi pabrik yang memproduksi teh tersebut tidak diketahui
secara pasti. Oleh karena itu, ditetapkan jumlah populasi sampel penelitian yaitu
100 bungkus teh untuk masing-masing teh hijau dan teh hitam. Ukuran sampel
ditentukan dengan tabel Krejcie. Menurut tabel Krejcie, penentuan ukuran sampel
didasarkan atas kesalahan 5% sehingga jumlah sampel yang diambil memiliki
taraf kepercayaan 95% terhadap populasi. Dari tabel tersebut, bila jumlah populasi
100 maka jumlah sampel 80 (Sugiyono, 1998).
Pemilihan sampel didasarkan pada teknik sampling jenis teknik random
sampling menggunakan cara randomisasi dari tabel bilangan random (De Muth,
1999). Teknik ini memungkinkan semua individu dalam populasi baik secara
sendiri-sendiri atau bersama-sama memiliki kesempatan yang sama untuk dipilih
menjadi anggota sampel. Cara randomisasi dari tabel bilangan random memiliki
41
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
kelebihan yaitu prosedurnya sangat sederhana dan dapat menghindari dari
kemungkinan penyelewengan (Hadi, 1980). Caranya yaitu sebanyak 100 bungkus
masing-masing jenis teh diberi nomor 001 sampai dengan 100 kemudian dipilih
nomor secara random melalui tabel bilangan random hingga didapatkan 80
bungkus untuk masing-masing jenis teh.
B. Ekstrak Etanol Teh Hijau dan Teh Hitam
Pembuatan serbuk bertujuan untuk memperkecil ukuran partikel
simplisia sehingga permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari
semakin luas (Anonim, 1986). Luas permukaan yang lebih besar akan
mengoptimalkan pembasahan serbuk simplisia oleh cairan penyari sehingga hasil
penyarian juga optimal.
Berdasarkan Materia Medika Indonesia Edisi I, kecuali dinyatakan lain,
seluruh simplisia harus dihaluskan menjadi serbuk dengan derajat halus (4/18).
Derajat halus dinyatakan dengan nomor pengayak. Derajat halus yang dinyatakan
dengan 2 nomor (4/18) mempunyai pengertian semua serbuk dapat melalui
pengayak dengan nomor terendah (4) dan tidak lebih dari 40% melalui pengayak
dengan nomor tertinggi (18). Jenis pengayak yang digunakan dinyatakan dengan
nomor yang menunjukkan jumlah lubang tiap cm dihitung searah panjang kawat.
Penentuan jenis ayakan, yang dinyatakan dengan nomor mesh, dilakukan melalui
konversi angka derajat halus yaitu mengkalikan 4/18 dengan 2,54 (1 inchi). Hasil
konversi menunjukkan nomor mesh yang digunakan adalah 10/45 namun karena
terbatasnya ketersediaan alat maka digunakan ayakan dengan nomor mesh 12/50.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
Penggunaan nomor mesh yang berbeda ini tidak memberikan pengaruh yang
berarti pada hasil penyarian karena meskipun serbuk lebih halus namun serbuk
tidak masuk ke dalam maserat pada saat proses penyaringan ampas. Serbuk yang
diambil adalah serbuk yang dapat melalui ayakan dengan nomor mesh 12 dan
serbuk yang tidak lebih dari 40%nya melewati ayakan dengan nomor mesh 50.
Produk teh yang digunakan sudah dalam bentuk sediaan yang kering.
Pada sediaan ini, lapisan air pada dinding sel yang terdiri dari selulosa sudah
menguap sehingga terjadi pengerutan sel. Pengerutan akan menyebabkan
timbulnya pori-pori yang terisi oleh udara. Saat serbuk dibasahi oleh cairan
penyari, cairan akan mengelilingi selulosa sehingga serbuk mengalami
pembengkakan kembali (Anonim, 1986). Proses perendaman serbuk bertujuan
memberikan kesempatan kepada cairan penyari memasuki seluruh pori-pori dalam
serbuk sehingga proses penyarian menjadi lebih sempurna.
Penyarian dilakukan dengan metode remaserasi. Penyari yang digunakan
adalah etanol dengan konsentrasi 70% dengan pertimbangan kombinasi etanol dan
air mempunyai sifat polar yang diharapkan mampu melarutkan senyawa polar
maupun yang semi polar. Senyawa polifenol merupakan senyawa yang cenderung
bersifat polar karena mengandung banyak gugus hidroksil sehingga diharapkan
senyawa polifenol dalam teh hijau dan teh hitam dapat terekstraksi ke dalam
pelarut etanol. Dengan proses remaserasi hingga diperoleh maserat jernih,
diharapkan senyawa polifenol tersari optimal. Proses pemekatan bertujuan
menghilangkan cairan penyari hingga didapatkan ekstrak dengan konsentrasi
tertentu. Ekstrak etanol teh hijau maupun teh hitam diuapkan pelarutnya hingga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
menjadi ekstrak kering. Jumlah ekstrak etanol yang diperoleh adalah 108,39 g
ekstrak etanol teh hijau dengan rendemen sebesar 36,13% dan 88,59 g ekstrak
etanol teh hitam dengan rendemen sebesar 29,53%.
C. Optimasi Metode
1. Penentuan operating time (waktu operasional)
Penentuan operating time bertujuan mendapatkan waktu pengukuran
absorbansi dengan nilai stabil. Pengukuran absorbansi saat operating time
memberikan tingkat reprodusibilitas yang tinggi pada pengukuran ulang sehingga
meminimalkan kesalahan hasil penelitian. Operating time ditentukan pada saat
terbentuk warna yang stabil yang ditandai dengan nilai absorbansi yang stabil.
Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan
kontrol dengan tujuan mendapatkan operating time senyawa kromogen MDA-
TBA tanpa adanya gangguan dari senyawa lain. Pengukuran absorbansi dilakukan
setelah larutan kontrol diinkubasi pada suhu 37°C dan 80°C kemudian
didinginkan selama 5 menit di bawah air mengalir. Waktu pengukuran absorbansi
larutan kontrol adalah 60 menit pada panjang gelombang teoritis yaitu 532 nm
(Kunchandy dan Rao, 1990). Hasil pengukuran absorbansi menunjukkan
operating time pada menit 0 sampai menit 60 dengan nilai absorbansi stabil yaitu
0,974 (Gambar 10).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
Gambar 10. Kurva hubungan waktu (menit) dengan absorbansi kromogen MDA-TBA
Kestabilan nilai absorbansi menunjukkan bahwa jumlah kromogen
MDA-TBA relatif stabil. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA dipercepat
dengan adanya panas. Pada penelitian ini, panas yang diterima larutan berasal dari
tahap pemanasan dengan waterbath pada suhu 80ºC. Setelah 30 menit melalui
tahap pemanasan, larutan didinginkan selama 5 menit hingga suhu larutan sama
dengan suhu lingkungan. Ketiadaan panas ini memperlambat reaksi pembentukan
kromogen MDA-TBA.
Pada metode deoksiribosa, proses degradasi deoksiribosa menjadi MDA
terjadi pada saat larutan campuran diinkubasi pada suhu 37ºC. Selanjutnya larutan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
campuran dibuat suasana asam (pH rendah) melalui penambahan TCA. MDA
kemudian akan bereaksi dengan TBA membentuk kromogen MDA-TBA. Selain
memberikan suasana asam, penambahan TCA menghambat proses oksidasi
Vitamin C sehingga proses reduksi Fe3+ menjadi Fe2+ terhambat pula.
Terhambatnya reaksi ini mengakibatkan terhambatnya pembentukan radikal
hidroksil sehingga terjadi penurunan kecepatan degradasi deoksiribosa oleh
radikal hidroksil.
Selain memberikan suasana asam, penambahan TCA berfungsi sebagai
katalis pembentukan kromogen MDA-TBA. Adanya H+ mengakibatkan
pengubahan salah satu gugus keton pada TBA menjadi suatu gugus enol (gambar
11). Gugus enol menyebabkan TBA menjadi lebih reaktif sehingga TBA dapat
bereaksi dengan MDA. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA dapat dilihat
pada gambar 12.
N
N
OS
O
H
H
H
H
TBA
N
N
OS
O
H
H
H
H H+ H
Gambar 11. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA
Senyawa MDA yang dihasilkan dari reaksi degradasi deoksiribosa
merupakan senyawa yang tidak berwarna. Reaksi pengkoplingan MDA dengan
TBA membentuk kromogen yang berwarna merah muda (gambar 13). Warna ini
terjadi karena perpanjangan gugus kromofor dan penambahan gugus auksokrom.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
N
N
H
OS
H
O
H
H+
HO
HO
+H+
TBA MDA
N
N
H
OS
H
O
OH
HH
H
O
+
N
N
H
O S
H
O
H
H
TBA
+H+
N
N
H
OS
H
O
H
OH
H
OH
N
N
H
O S
H
O
+H+
H
-H2O
N
N
H
OS
H
O
H H
OH
N
N
H
O S
H
O
N
N
H
OS
H
O
H H
N
N
H
O S
H
O
H
+H+
H
H
-H2O
N
N
H
OS
H
O
N
N
H
O S
H
O
+H+
N
N
OHS
OH
N
N
HO S
OH
+H+
H
+H+
N
N
OHHS
OH
N
N
HO S
OH
MDA-TBA(warna merah muda)
Gambar 12. Mekanisme reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA (Purwantoko, 2006)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
(------) Gugus kromofor
(------) Gugus auksokrom
Gambar 13. Struktur kromogen MDA-TBA
2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Panjang gelombang maksimum merupakan panjang gelombang di mana
terjadi eksitasi elektronik yang memberikan absorban maksimum (Mulja dan
Suharman, 1995). Tujuan penentuan panjang gelombang maksimum dalam
penelitian ini adalah memperoleh panjang gelombang di mana kromogen MDA-
TBA memberikan absorban yang maksimum. Panjang gelombang maksimum
yang diperoleh digunakan untuk mengukur absorban kromogen MDA-TBA.
Penentuan panjang gelombang maksimum dapat digunakan untuk
identifikasi molekul yang bersifat karakteristik yang artinya panjang gelombang
maksimum bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UV-
Vis dan tidak bergantung pada struktur molekul suatu senyawa. Dengan demikian,
senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama belum tentu merupakan senyawa
yang identik. Hal ini menyebabkan panjang gelombang maksimum dipergunakan
sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif.
Dalam analisis kuantitatif, pengukuran nilai absorban dilakukan pada
panjang gelombang maksimum. Alasannya adalah perubahan absorban untuk
setiap satuan konsentrasi adalah paling besar pada panjang gelombang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
maksimum, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum. Di
samping itu, pita serapan di sekitar panjang gelombang maksimum tersebut relatif
datar dan kemungkinan terjadinya kesalahan pada pengukuran ulang menjadi kecil
dengan demikian memenuhi hukum Lambert-Beer (Mulja dan Suharman, 1995).
Gambar 14. Kurva hubungan panjang gelombang (nm) dengan absorbansi kromogen
MDA-TBA Penentuan panjang gelombang maksimum pada penelitian ini dilakukan
pada larutan kontrol, yaitu larutan tanpa tambahan sampel dengan tujuan
mendapatkan panjang gelombang maksimum senyawa kromogen MDA-TBA
yang berwarna merah muda. Hasil scanning kromogen MDA-TBA yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm menunjukkan bahwa panjang
gelombang maksimum kromogen MDA-TBA adalah 531,8 nm (gambar 14).
Menurut Kunchandy dan Rao (1998), panjang gelombang maksimum teoritis
kromogen MDA-TBA adalah 532 nm. Selisih panjang gelombang maksimum
teoritis dengan hasil penelitian adalah 0,2 nm. Selisih nilai ini masih memenuhi
selisih nilai yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi IV (1995)
yaitu kurang dari 2 nm.
D. Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh
Hijau dan Teh Hitam
Pada penelitian ini, penentuan aktivitas penangkapan radikal hidroksil
oleh ekstrak teh hijau dan hitam dilakukan dengan metode deoksiribosa.
Berdasarkan penelitian Purwantoko (2006), metode deoksiribosa memiliki
akurasi, presisi, dan linearitas yang baik sehingga dapat digunakan untuk menguji
aktivitas penangkapan radikal hidroksil. Pada penelitian ini prosedur kerja
maupun konsentrasi deoksiribosa mengacu pada penelitian Purwantoko (2006).
Tabel IX. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hijau
dengan berbagai konsentrasi
Konsentrasi ekstrak etanol teh hijau (mg/ml) Replikasi 0 0,033 0,067 0,100 0,133 0,167
I 0,967 0,755 0,731 0,670 0,631 0,607 II 0,976 0,729 0,705 0,664 0,637 0,620 III 0,968 0,721 0,698 0,655 0,623 0,605 IV 0,940 0,716 0,696 0,654 0,632 0,579 V 0,917 0,688 0,663 0,617 0,584 0,559
Rata-rata 0,954 0,722 0,699 0,652 0,621 0,594 SD 0,025 0,024 0,024 0,021 0,022 0,025
CV (%) 2,576 3,344 3,481 3,167 3,460 4,137
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
Tabel X. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan ekstrak etanol teh hitam dengan berbagai konsentrasi
Konsentrasi ekstrak etanol teh hitam (mg/ml) Replikasi
0 0,033 0,067 0,100 0,133 0,167 I 0,982 0,674 0,647 0,638 0,629 0,620 II 0,986 0,670 0,651 0,626 0,591 0,572 III 0,955 0,650 0,620 0,585 0,578 0,548 IV 0,921 0,619 0,601 0,584 0,581 0,577 V 1,004 0,671 0,662 0,641 0,616 0,601
Rata-rata 0,970 0,657 0,636 0,615 0,599 0,584 SD 0,032 0,023 0,025 0,028 0,022 0,028
CV (%) 3,334 3,527 3,932 4,591 3,750 4,750 Berdasarkan pada tabel IX dan X, absorbansi larutan kontrol lebih tinggi
daripada larutan sampel karena pada larutan kontrol tidak terdapat senyawa
penangkap radikal hidroksil sehingga deoksiribosa langsung didegradasi oleh
radikal hidroksil. Pada larutan sampel, dimungkinkan terdapat senyawa
penangkap radikal hidroksil yang mengakibatkan penurunan jumlah degradasi
deoksiribosa. Terbukti dengan adanya penurunan absorbansi kromogen MDA-
TBA dari larutan sampel pada berbagai konsentrasi.
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
0 0.05 0.1 0.15 0.2
Konsentrasi (mg/ml)
Abs
orba
nsi*
Teh hijauTeh hitam
Gambar 15. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau
maupun teh hitam dengan absorbansi kromogen MDA-TBA
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
Seperti terlihat pada gambar 15, semakin besar konsentrasi ekstrak etanol
yang ditambahkan maka terjadi penurunan absorbansi. Penurunan absorbansi ini
disebabkan peristiwa penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau
dan teh hitam. Peristiwa ini mengakibatkan penurunan jumlah radikal hidroksil
yang akan mendegradasi deoksiribosa akibatnya terjadi penurunan MDA. Adanya
penurunan jumlah MDA mengakibatkan penurunan jumlah kromogen MDA-TBA
yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi larutan dengan sampel pada
berbagai konsentrasi dibandingkan dengan larutan kontrol.
Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh ekstrak etanol teh hijau
maupun teh hitam dinyatakan sebagai persen scavenging. Nilai persen scavenging
dihitung dari selisih antara purata absorbansi blanko dengan purata absorbansi
sampel pada konsentrasi tertentu, dibagi purata absorbansi blanko dikalikan
100%.
Tabel XI. Persen scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam
% Scavenging Konsentrasi ekstrak etanol
(mg/ml) Ekstrak etanol teh
hijau Ekstrak etanol
teh hitam 0,033 24,3 32,3 0,067 26,8 34,4 0,100 31,7 36,6 0,133 34,9 38,2 0,167 37,7 39,8
Semakin besar harga % scavenging ekstrak etanol maka semakin besar
pula aktivitas penangkapan radikal hidroksilnya. Aktivitas penangkapan radikal
hidroksil sangat tergantung pada konsentrasi ekstrak etanol yang ditambahkan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
Peningkatan konsentrasi ekstrak berbanding lurus dengan % scavenging seperti
terlihat pada tabel XI.
Besarnya konsentrasi ekstrak etanol teh hijau yang dibutuhkan untuk
menangkap radikal hidroksil sebanyak 50% dinyatakan sebagai ES50 dan disajikan
pada tabel XII. Nilai tersebut didapatkan dari persamaan regresi linier antara
konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam (x) dengan % scavenging (y).
Dari hasil perhitungan diperoleh persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hijau
adalah y = 104,437 x + 20,636 dengan nilai r = 0,994 sedangkan ekstrak etanol teh
hitam adalah y = 57,284 x + 30,632 dengan nilai r = 0,997. Nilai koefisien
korelasi (r) yang mendekati satu menunjukkan adanya hubungan yang kuat antara
variabel bebas (konsentrasi ekstrak etanol) dengan variabel tergantung (%
scavenging).
Kurva persamaan regresi linier yang menunjukkan pengaruh penambahan
ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam dengan berbagai konsentrasi terhadap
besarnya aktivitas penangkapan radikal hidroksil tidak layak saji karena memiliki
nilai α mendekati 90° (hampir tegak lurus), oleh karena itu dilakukan konversi
supaya nilai α mendekati 45° sehingga kurva menjadi layak saji. Konversi
dilakukan dengan mengalikan nilai x (konsentrasi ekstrak etanol) dengan angka
80. Hasil perhitungan persamaan regresi linier sebelum dan sesudah konversi
disajikan pada tabel XII dan XIII.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Tabel XII. Persamaan regresi linier ekstrak etanol teh hijau sebelum dan sesudah konversi
Ekstrak etanol teh hijau Sebelum konversi Setelah konversi
Konsentrasi (mg/ml)
% Scavenging
Konsentrasi (mg/80ml)
% Scavenging
0,033 24,3 2,64 24,3 0,067 26,8 5,36 26,8 0,100 31,7 8,00 31,7 0,133 34,9 10,64 34,9 0,167 37,7 13,36 37,7 a = 20,636 a = 20,636 b = 104,437 b = 1,305 r = 0,994 r = 0,994 α = 89,451° α = 52,547°
Tabel XIII. Pesamaan regresi linier ekstrak etanol teh hitam sebelum dan sesudah konversi
Ekstrak etanol teh hitam Sebelum konversi Setelah konversi
Konsentrasi (mg/ml)
% Scavenging
Konsentrasi (mg/80ml)
% Scavenging
0,033 32,3 2,64 32,3 0,067 34,4 5,36 34,4 0,100 36,6 8,00 36,6 0,133 38,2 10,64 38,2 0,167 39,8 13,36 39,8 a = 30,632 a = 30,632 b = 56,284 b = 0,703 r = 0,997 r = 0,997 α = 88,982° α = 35,128°
Hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam
pada berbagai konsentrasi dengan % scavenging disajikan pada gambar 16.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
45,0
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00
Konsentrasi ekstrak etanol (mg/80ml)
% S
cave
ngin
g
Ekstrak etanol teh hijau Ekstrak etanol teh hitamLinear (Ekstrak etanol teh hijau) Linear (Ekstrak etanol teh hitam)
Gambar 16. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam dengan % scavenging
Dari persamaan regresi linier, dapat ditentukan nilai ES50 dari ekstrak
etanol teh hijau dan teh hitam. Berikut adalah nilai ES50 (hasil ekstrapolasi)
ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam (tabel XIV)
Tabel XIV. Persentase penangkapan efektif radikal hidroksil sebesar 50 % oleh ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam
Ekstrak Etanol ES50 (mg/ml)
Teh hijau 0,281 Teh hitam 0,344
Nilai ES50 berbanding terbalik dengan kemampuan senyawa untuk
menangkap radikal hidroksil. Semakin besar harga ES50 maka aktivitas
penangkapan radikal hidroksil semakin kecil. Nilai ES50 ekstrak etanol teh hijau
lebih kecil daripada teh hitam sehingga diindikasikan bahwa ekstrak etanol teh
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
hijau memiliki kemampuan penangkapan radikal hidroksil lebih besar daripada
ekstrak etanol teh hitam.
Senyawa di dalam ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam yang diduga
memiliki aktivitas penangkapan radikal hidroksil adalah senyawa polifenol.
Secara umum senyawa ini memiliki banyak gugus hidroksil yang berfungsi
sebagai penangkap radikal bebas. Senyawa polifenol yang terdapat dalam teh
termasuk dalam golongan flavonoid subgolongan flavan-3-ol dan flavonol. Pada
teh hijau dan teh hitam sama-sama mengandung kedua golongan tersebut. Hanya
pada teh hijau kandungan catechin lebih besar daripada teh hitam karena pada teh
hitam terjadi oksidasi catechin menjadi theaflavin dan thearubigin. Namun
meskipun kandungan catechin teh hijau lebih besar daripada teh hitam, ekstrak
etanol teh hijau dan teh hitam tetap memiliki aktivitas penangkapan radikal
hidroksil karena catechin, theaflavin, dan thearubigin sama-sama memiliki gugus
hidroksil yang mampu menangkap radikal hidroksil. Selain itu, menurut Leung et
al.(2001), catechin dan theaflavin memiliki sifat antioksidan yang sebanding.
Dengan demikian, radikal hidroksil, yang dibentuk melalui reaksi Fenton, dapat
ditangkap oleh senyawa polifenol dalam ekstrak etanol teh hijau maupun teh
hitam.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
a. Ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam memiliki aktivitas sebagai penangkap
radikal hidroksil dengan metode deoksiribosa yang dapat diketahui dari %
scavenging masing-masing ekstrak etanol.
b. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil pada ekstrak etanol teh hijau dan
teh hitam dengan metode deoksirobosa yang dinyatakan sebagai ES50 (hasil
ekstrapolasi) adalah 0,281 mg/ml pada ekstrak etanol teh hijau dan 0,344 mg/ml
pada ekstrak etanol teh hitam.
B. Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai identifikasi senyawa
polifenol yang memiliki aktivitas sebagai penangkap radikal hidroksil yang terdapat
pada ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam.
57
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
DAFTAR PUSTAKA
Amić, D., Davidović-Amić, D., Bešlo, D., and Trinajstić, N., 2003, Structure-
Radical Scavenging Activity Relationship of Flavonoids, CCACAA, 76 (1), 55-61.
Anonim, 2005, Green Tea Extract: Ancient Health Secret of the Orient,
http://www.kirlian.org/life_enhancement_products/n37.html, diakses tanggal 4 April 2005.
Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 2-10, 13, Departemen Kesehatan Republik
Indonesia, Jakarta. Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid I, 136, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1979, Farmakope Indonesia, Edisi III, 9, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 7, Departemen Kesehatan
Republik Indonesia, Jakarta. Blokhina, O., 2000, Anoxia and Oxidative Stress: Lipid Peroxidation, Antioxidant
Status, and Mitochondrial Functions in Plants, Dissertation, University of Helsinki.
Bors, H., Michel, C., and Saran, M., 1979, On the Natural of Biochemically
Generated Hydroxyl Radicals: Studies using the Bleaching of p-nitrosodimethylaniline as a Direct Assay Method, Eur. J. Biochem., 95, 621-627.
Cerruti, P. cit. Yen, Gow-Chin and Chen, Hui-Yin, 1995, Antioxidant Activity of
Various Tea Extracts in Relation to Their Antimutagenecity, J. Agric. Food. Chem, 43(1), 27-32.
Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, Sixth Edition, 126-132, John Wiley
& Sons, Inc., USA. Cuvelier, M.E., Richards, H., and Besset, C., 1994, Comparison of The
Antioxidative Activity of some Acid Phenols: Structure-Activity Relationship, Biosci. Biotech. Biochem., 56 (2), 324-325.
De Muth, J.E., 1999, Basic Statistic and Pharmaceutical Statistical Applications,
572, Marcel Dekker Inc., New York.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Fessenden, R.J. dan Fessenden, J.S., 1986, Organic Chemistry, diterjemahkan oleh Pudjaatmaka, H.A., Edisi ketiga, Jilid 1, 223-224, 240, Erlangga, Jakarta.
Fouad, T., 2005, Antioxidants, nature and chemistry,
http://www.thedoctorslounge.net/medlounge/articles/antioxidants, diakses tanggal 21 Juni 2005.
Fulder, S., 2004, The Miracle of Green Tea for Your Daily Intake, diterjemahkan
oleh Trisno Rahayu Wilujeng, 23, Prestasi Pustaka, Jakarta. Hadi, S., 1980, Metodologi Research, Jilid 1, 75, 77-78, Andi Offset, Yogyakarta. Halliwel, B. and Gutteridge, J.M.C., 1999, Free Radicals in Biology and
Medicine, Third Edition, 368-369, 839, Oxford University Press, New York.
Halliwel, B., Gutteridge, J.M.C., and Aruoma, O.I., 1987, The Deoxyribose
Method: A Simple “Test-Tube” Assay for Determination of Rate Constants for Reaction of Hydroxyl Radicals, Anal. Biochem., 165, 215-219, Academic Press, London.
Harman, D., 1981, The Aging Process, Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7124.
Hartoyo, A., 2003, Teh dan Khasiatnya bagi Kesehatan, 9-13, 23-35, Kanisius,
Yogyakarta. Khopkar, S.M., 1985, Basic Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkan
oleh A. Saptorahardjo, 193, UI Press, Jakarta. Kikuzaki, H. and Nakatani, N., 1993, Antioxidant Effects of Some Ginger
Constituents, J. Food Sci., 58 (6), 1407. Kunchandy, E. and Rao, M.N.A., 1989, Oxygen Radical Scavenging Activity of
Curcumin, Inter. J. Pharm., 58, 237-240. Lambert, J.D. and Yang, C.S., 2003, Mechanisms of Cancer Prevention by Tea
Constituents, Supplement: Proceedings of the Third International Scientific Symposium on Tea and Human Health, The American Society for Nutritional Sciences, J. Nutr., 133 (10), 3262S-3267S.
Leung, L.K., Su, Y., Chen, R.,Zhang, Z., Huang, Y., and Chen, Zhen-Yu, 2001,
Theaflavins in Black Tea and Catechins in Green Tea Are Equally Effective Antioxidants, J. Nutr., 131, 2248-2251.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
Middleton Jr., E., Kandaswami, C., and Theoharis, C.T., 2000, The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer, Pharmacol Rev., 52 (4), 673-751.
Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 19,26,27,31,32, Airlangga
University Press, Surabaya. Purwantoko, A., 2006, Validasi Metode Deoksiribosa sebagai Uji Penangkapan
Radikal Hidroksil oleh Vitamin C secara In Vitro, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Rafat, H.S. et al., cit. Roy, M., Siddiqi, M., and Bhattacharya, R., 2001, Cancer
Chemoprotection: Tea Polyphenol Induced Cellular and Mollecular Responses, Asian Pacific J. Cancer Prev., 2, 109-116.
Rajeshwar, Y., Kumar, G.P.S., Gupta, M., and Mazumder, U.K., 2005, Studies
On In Vitro Antioxidant Activities of Methanol Extract of Mucuna pruriens (Fabaceae) Seeds, Eur. Bull. Drug Res., 13 (1), 31-39.
Robinson, T., 1991, The Organic Constituens of Higher Plants, diterjemahkan
oleh Kosasih Padmawinata, Edisi 6, 281-293, Penerbit ITB, Bandung. Rooth, H.J. and Blaschke, G., 1994, Pharmaceutical Analysis, diterjemahkan oleh
Kisman, S. dan Ibrahim, S., 359-361, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Roy, M., Siddiqi, M., and Bhattacharya, R., 2001, Cancer Chemoprotection: Tea
Polyphenol Induced Cellular and Mollecular Responses, Asian Pacific J. Cancer Prev., 2, 109-116.
Skoog, D.A., West, D.M., and Haller, F.J., 1994, Analytical Chemistry: an
Introduction, Sixth Edition, 412-414, Saunders College Publishing, Florida.
Sofia, D., 2005, Antioksidan dan Radikal Bebas, http://www.chem-is-try.org,
diakses tanggal 4 April 2005. Sugiyono, 1998, Statistika untuk Penelitian, 62, CV.Alfabeta, Bandung. Syah, A.N.A., 2006, Taklukkan Penyakit dengan Teh Hijau, 46, 69, AgroMedia
Pustaka, Jakarta. Syamsuhidayat, S.S. dan Hutapea, 1991, Inventaris Tanaman Obat Indonesia,
Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Tuminah, S., 2004, Teh [Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast)] sebagai Salah Satu Sumber Antioksidan, Cermin Dunia Kedokteran, 144, 52-54.
Vogel, 1994, Buku Ajar Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik, diterjemahkan
oleh Pudjaatmaka, H.A. dan Setiono, L., 846-848, EGC, Jakarta. Werkhoven, 1988, Tea Processing, 4-6, 128, FAO Agricultural Services Bulletin,
Amsterdam. Yen, Gow-Chin and Chen, Hui-Yin, 1995, Antioxidant Activity of Various Tea
Extracts in Relation to Their Antimutagenecity, J. Agric. Food. Chem, 43 (1), 27-32.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Lampiran 1.
Foto ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam
Keterangan: A : Ekstrak etanol teh hijau B : Ekstrak etanol teh hitam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Lampiran 2.
Tabel Krejcie (Sugiyono, 1998)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
Lampiran 3.
Tabel bilangan random (De Muth, 1999)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Lampiran 4.
Contoh penimbangan bahan
M = (L) volume
mol ; mol =
(g/mol) molekul)(berat BM(g)zat berat
M = (L) volume
1x(g/mol) BM
(g)zat berat
Berat zat (g) = (L) x volume(g/mol) BM x (mol/L) M
a. Bufer Fosfat pH 7,4
1) Na2HPO4 20 mM
BM : 141,96
Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) :
20 x10-3 M = L 0,5
1 x /molg 141,96
g a
a = L 0,5 x g/mol 141,96 x M 10 x 20 -3
a = 1,4196 g
Bobot zat hasil penimbangan : 1,42146 g
Perhitungan kadar :
M = L 0,5
1xg/mol 141,96
g 1,42146
M = 0,02003 M = 20,03 mM
2) KH2PO4 20 mM
BM : 136,09
Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) :
a = L 0,25 x g/mol 136,09 x M 10 x 20 -3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
a = 0,68045 g
Bobot zat hasil penimbangan : 0,6807 g
Perhitungan kadar :
M = L 0,25
1xg/mol 136,09
g 0,6807
M = 0,02001 M = 20,01 mM
b. Reagen Fenton
1) Larutan FeCl3 1 mM
Perhitungan bobot zat yang harus ditimbang (a) untuk mendapatkan
larutan FeCl3 5 mM adalah :
a = L 0,01 x g/mol 162,21 x M 10 x 5 -3
a = 0,008115 g
BM FeCl3 = 162,21 g/mol
BM H2O = 18,02 g/mol
Bahan yang tersedia adalah FeCl3.6H2O (BM = 270,33 g/mol). Oleh
karena itu, bobot FeCl3.6H2O yang harus ditimbang (b) untuk
mendapatkan larutan FeCl3 dengan konsentrasi akhir 5 mM adalah :
b = g 0,008115 x 162,21270,33
b = 0,0135165 g
Bobot zat hasil penimbangan : 0,01453 g
Sejumlah 0,01453 g FeCl3.6H2O yang telah ditimbang kemudian
dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Perhitungan kadar :
M = L 0,01
1xg/mol 270,33
g 0,01453
M = 5,38.10-3 M
Selanjutnya larutan ini diencerkan hingga mendapatkan larutan FeCl3
konsentrasi 1 mM. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan
rumus :
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 5,38 mM = 10,0 ml x 1 mM
V1 = 1,86 ml ~ 1,9 ml.
Sebanyak 1,9 ml larutan FeCl3 5,38 mM diambil, dimasukkan dalam labu
ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir
larutan hasil pengenceran adalah 1,0 mM.
2) Larutan EDTA 1 mM
Perhitungan bobot zat yang harus ditimbang (a) untuk mendapatkan
larutan EDTA 5 mM adalah :
a = L 0,01 x g/mol 290,22 x M 10 x 5 -3
a = 0,014511 g
BM Na = 22,99 g/mol
BM EDTA = 290,22 g/mol
BM H2O = 18,02 g/mol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Bahan yang tersedia adalah Na2EDTA.2H2O (BM =372,24 g/mol). Oleh
karena itu, bobot Na2EDTA.2H2O yang harus ditimbang (b) untuk
mendapatkan larutan EDTA 5 mM adalah :
b = g 0,014511 x 290,22372,24
b = 0,018612 g
Bobot zat hasil penimbangan : 0,01886 g
Sejumlah 0,01886 g Na2EDTA.2H2O yang telah ditimbang kemudian
dilarutkan dalam akuades hingga 10,0 ml.
Perhitungan kadar :
M = L 0,01
1xg/mol 372,24
g 0,01886
M = 5,07.10-3 M
Selanjutnya larutan ini diencerkan hingga mendapatkan larutan EDTA
konsentrasi 1 mM.
Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan rumus :
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 5,07 mM = 10,0 ml x 1 mM
V1 = 1,97 ml ~ 2,0 ml.
Sebanyak 2,0 ml larutan EDTA 5 mM diambil, dimasukkan dalam labu
ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir
larutan hasil pengenceran adalah 1,0 mM.
3) Larutan H2O2 20 mM
Bahan yang digunakan : larutan H2O2 30%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
BM : 34,02 g/mol
Perhitungan molaritas larutan H2O2 30%
M = L 0,1
1xg/mol 34,02g 30
M = 8,818 M
Larutan H2O2 30% kemudian diencerkan hingga didapatkan larutan H2O2
konsentrasi 20 mM. Pengenceran dilakukan sebanyak 2 tahap. Volume
pengambilan larutan dihitung menggunakan rumus: V1 x C1 = V2 x C2
Tahap 1:
V1 x 8,818 x 103 mM = 10,0 ml x 80 mM
V1 = 0,0907 ml ~ 0,091 ml.
Sebanyak 0,091 ml larutan H2O2 30 % diambil kemudian dimasukkan ke
dalam labu ukur 10 ml kemudian ditambahkan air hingga tanda.
Konsentrasi akhir larutan hasil pengenceran adalah 80 mM.
Tahap 2:
V1 x 80 mM = 10,0 ml x 20 mM
V1 = 2,5 ml
Larutan ini diambil sebanyak 2,5 ml, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml
kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil
pengenceran adalah 20 mM
4) Larutan Vitamin C 1 mM
Bahan yang digunakan : Vitamin C
BM : 176,13 g/mol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Larutan Vitamin C 10 mM
Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) :
a = L 0,01 x g/mol 176,13 x M 10 x 10 -3
a = 0,01761 g
Bobot zat hasil penimbangan : 0,01768 g
Sejumlah 0,01768 g Vitamin C yang telah ditimbang kemudian dilarutkan
dalam akuades hingga 10,0 ml.
Perhitungan kadar :
M = L 0,01
1xg/mol 176,13
g 0,01768
M = 1,00.10-2 mM
Larutan ini kemudian diencerkan hingga mendapatkan larutan Vitamin C
konsentrasi 1 mM. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan
rumus: V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mM = 10,0 ml x 1 mM
V1 = 1,0 ml.
Larutan ini diambil sebanyak 1,0 ml, dimasukkan dalam labu ukur 10 ml
kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil
pengenceran adalah 1,0 mM.
c. Deoksiribosa 2,5 mM
Bahan yang digunakan : 2-Deoksi-D-ribosa
BM : 134,13 g/mol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Larutan Deoksiribosa 15 mM :
Perhitungan bobot zat yang akan ditimbang (a) :
a = L 0,01 x g/mol 134,13 x M 10 x 15 -3
a = 0,02012 g
Bobot zat hasil penimbangan : 0,02114 g
Sejumlah 0,02114 g Deoksiribosa yang telah ditimbang kemudian dilarutkan
dalam akuades hingga 10,0 ml
Perhitungan kadar :
M = L 0,01
1xg/mol 134,13
g 0,02114
M = 15,8.10-3 mM
Larutan ini kemudian diencerkan hingga mendapatkan larutan Deoksiribosa
konsentrasi 2,5 mM. Volume pengambilan larutan dihitung menggunakan
rumus: V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 15,8 mM = 25,0 ml x 2,5 mM
V1 = 3,96 ml ~ 4,0 ml.
Larutan ini diambil sebanyak 4,0 ml, dimasukkan dalam labu ukur 25 ml
kemudian ditambahkan air hingga tanda. Konsentrasi akhir larutan hasil
pengenceran adalah 2,5 mM.
d. Ekstrak etanol konsentrasi 1 mg/ml
(1) Teh hijau
Bobot zat yang akan ditimbang : 0,025 g (dalam 25,0 ml)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
Bobot zat hasil penimbangan : 0,02532 g
Konsentrasi = ml 25,0
g 0,02532
= 1,01.10-3 g/ml
= 1,01 mg/ml
(2) Teh hitam
Bobot zat yang akan ditimbang : 0,025 g (dalam 25,0 ml)
Bobot zat yang ditimbang : 0,02539 g
Konsentrasi = ml 25,0
g 0,02539
= 1,02.10-3 g/ml
= 1,02 mg/ml
e. TBA (Asam Tiobarbiturat) 1%
Bobot zat yang akan ditimbang : 0,025 g (dalam 25,0 ml)
Bobot zat hasil penimbangan : 0,24967 g
Perhitungan kadar :
Kadar = 100%x ml 25,0
g 0,24967
= 0,999 %
f. TCA (Asam Trikloroasetat) 5 %
Bobot zat yang akan ditimbang : 1,25 g (dalam 25,0 ml)
Bobot zat hasil penimbangan : 1,23893 g
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
Perhitungan kadar :
Kadar = 100%x ml 25,0
g 0,49556
= 4,96 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
Lampiran 5. Contoh perhitungan % scavenging ekstrak etanol teh hijau dan teh hitam
Rumus yang menyatakan besar penangkapan radikal hidroksil :
% Scavenging = 100% x Absorbansi
Absorbansi Absorbansikontrollarutan
sampel larutankontrollarutan −
a. Ekstrak etanol teh hijau
% Scavenging :
• Konsentrasi 0,033 mg/ml = 100% x 0,954
0,7220,954−= 24,3 %
• Konsentrasi 0,067 mg/ml = 100% x 0,954
699,0954,0 −= 26,8 %
• Konsentrasi 0,100 mg/ml = 100% x 0,954
652,0954,0 −= 31,7 %
• Konsentrasi 0,133 mg/ml = 100% x 0,954
621,0954,0 −= 34,9 %
• Konsentrasi 0,167 mg/ml = 100% x 0,954
594,0954,0 −= 37,7 %
b. Ekstrak etanol teh hitam
% Scavenging :
• Konsentrasi 0,033 mg/ml = 100% x 0,970
657,0970,0 −= 32,3 %
• Konsentrasi 0,067 mg/ml = 100% x 0,970
636,0970,0 −= 34,4 %
• Konsentrasi 0,100 mg/ml = 100% x 0,970
615,0970,0 −= 36,6 %
• Konsentrasi 0,133 mg/ml = 100% x 0,970
599,0970,0 −= 38,2 %
• Konsentrasi 0,167 mg/ml = 100% x 0,970
584,0970,0 −= 39,8 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
Lampiran 6. Contoh perhitungan ES50
Perhitungan ES50 dilakukan dengan cara mencari persamaan regresi linier antara
konsentrasi ekstrak etanol teh hijau atau teh hitam (sebagai nilai x) vs %
scavenging (sebagai nilai y).
a. Ekstrak etanol teh hijau
A = 20,636
B = 104,437
r = 0,994
Persamaan regresi linier : y = 1,305 x + 20,636
ES50 = 305,1
636,2050−
= 22,501 mg/80ml
= 0,281 mg/ml
b. Ekstrak etanol teh hitam
A = 30,631
B = 56,284
r = 0,997
Persamaan regresi linier : y = 0,703 x + 30,632
ES50 = 703,0
632,3050−
= 27,550 mg/80ml
= 0,344 mg/ml
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Penangkapan
Radikal Hidroksil oleh Ekstrak Etanol Teh Hijau dan
Teh Hitam dengan Metode Deoksiribosa” ini bernama
Carla Kuntari, lahir di Yogyakarta pada tanggal 4
November 1984, anak kedua dari pasangan Drs. B.
Rahmanto, M.Hum. dan A.M. Budiarti, AMK. Penulis telah
menyelesaikan pendidikannya di Taman Kanak-kanak
Kanisius Demangan Baru Yogyakarta pada tahun 1989, di
Sekolah Dasar Kanisius Demangan Baru Yogyakarta pada
tahun 1996, di Sekolah Menengah Pertama Negeri 8 Yogyakarta pada tahun 1999,
dan di Sekolah Menengah Atas Stella Duce 1 Yogyakarta tahun 2002. Penulis
kemudian melanjutkan studinya di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta pada tahun 2002. Selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta penulis pernah menjadi asisten praktikum
Formulasi dan Teknologi Sediaan Semi Solid, Formulasi dan Teknologi Sediaan
Steril, Botani Dasar, Kimia Analisis, dan Kimia Farmasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
top related