pode ser usado tanto qualitativa quanto quantitativamente ... · exemplo de aplicação sem bandas...

Pode ser usado tanto qualitativa quanto quantitativamente para medir a ligação antígeno-anticorpo. Dependendo do uso, pode detectar antígenos (hormônios, citocinas, enzimas, ags microbianos, drogas ilícitas) ou anticorpos (anti-HIV, por exemplo) em fluidos corporais ou sobrenadantes de culturas.

O que é necessário:

• Antígeno purificado(se for para detecção ou quantificação de anticorpo);

• Anticorpo purificado (se for para detecção ou quantificação de antígeno);

• Soluções-padrão (controles negativo e positivo);

• Amostra a ser testada;

• Placa de 96 poços;

• Solução de lavagem (tampão);

• Anticorpo acoplado a uma enzima e o substrato da mesma;

• Leitor de ELISA (espectrofotômetro) para quantificação.

Como o ensaio é feito:= ELISA indireto ( para detectar anticorpo) =

+ substrato

= ELISA direto ( para detectar antígeno) =

Amostra contendo várias substâncias

Ag de interesse

+ substrato

Concentração de indicado pela intensidade da cor

Claro → amarelo

Produto colorido

Substrato Ac secundário

Ac primário

Placa sensibilizada com ag

Enzima

Leitor:

Como interpretar os resultados:

Curva padrão obtida no programa “SOFTmax Pro”

Western blot é um método usado para detectar uma certa proteína em uma amostra, usando anticorpo específico para aquela proteína. Além disso, esta técnica também dá informação acerca do tamanho da proteína.

Passo a passo:1) Preparo das amostras e eletroforese em gel (SDS-PAGE):

Eletrodo negativo

Eletrodo positivo

Amostras

Poços

Proteínas grandes

Proteínas pequenas

Placas

Espaçadores

Gel de empilhamento

Gel de resolução

ANODO

CATODO

Direção da transferência

Papel filtro

Papel filtro

Membrana

Gel de poliacrilamida

2) Transferência para a membrana (nitrocelulose ou PVDF):

3) Bloqueio da membrana e incubação com ac primário:

4) Incubação com ac secundário acoplado ao sistema de revelação:

Ac 1ºAc 2º

Revelador

Bloqueio da membrana com proteínas inertes

Ac 1º

A revelação pode ser feita com um substrato colorimétrico (ex.: TMB), que produzirá uma banda colorida.

A revelação pode ser feita com um substrato quimioluminescente (ex.: ECL), que produzirá uma banda colorida.

Resumo:

Exemplo de aplicaçãoSem bandas presentes NegativoBandas tanto para p31 OU p24 E bandas presentes tanto em gp160 OU gp120 Positivo

Bandas presentes, mas padrão não encontra critério para positividade Indeterminado

1.Linha 1, HIV+ soro (controle positivo) 2.Linha 2, HIV- soro (controle negativo) 3.Linha A, Paciente A 4.Linha B, Paciente B 5.Linha C, Paciente C