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“PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA
INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU
USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS,
QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO”.
Nombre del Residente
Ismenia Esmeralda de Dios Cisneros
Nombre del Asesor
Oscar Barajas Pastor
Nombre de la Carrera
Ingeniería Bioquímica
Villa de Álvarez, Col., a 5 de Diciembre del 2017
INFORME TÉCNICO DE RESIDENCIA PROFESIONAL QUE PRESENTA:
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS, QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO.
Ingeniería Bioquímica Página 2
LISTA DE ABREVIATURAS
Abreviatura Significado
AG Ácido gálico
ATC Agar de soya tripticaseína
CST Caldo de soya tripticaseína
DMSO Dimetilsulfóxido
DRX difracción de rayos X
EDS 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida
FT-IR espectroscopía de infrarrojo
GPB Gelatina piel de bovino
H2O Agua
IR Espectroscopia infrarroja
MCs Microcápsulas
MCG Microcápsula de gelatina
NaCl Cloruro de Sodio
NaOH Hidróxido de sodio
NCG Nanocápsula de gelatina
NCs Nanocápsulas
NHS N-hidroxisuccinimida
Nm Nanómetro
Nps Nanopartículas
SEM Microscopio electrónico de barrido
TEM Microscopio electrónico de transmisión
TTC 2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio
UFC Unidades formadoras de colonias
ZnO Óxido de zinc
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS, QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO.
Ingeniería Bioquímica Página 3
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 5
JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 9
OBJETIVOS ............................................................................................................................. 10
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................................ 10
OBJETIVO ESPECIFICO ......................................................................................................................... 10
PROBLEMA A RESOLVER ......................................................................................................... 11
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES............................................................................................. 11
PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................................ 12
METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 13-
SÍNTESIS DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS DE ÓXIDO DE ZINC ............................................................ 14
CARACTERIZACIÓN DE NANOPARTÍCULAS ZNO ................................................................................. 15-17
ESPECTROSCOPIA DE INFRARROJO (FT-IR) .................................................................................... 15
DIFRACTOGRAMA DE RAYOS X (XRD) ........................................................................................... 16
MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SEM) ........................................................................... 17
HISTOGRAMA ......................................................................................................................... 18
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES SIN LA INCORPORACIÓN DE
NANOPARTÍCULAS METÁLICAS: ....................................................................................... 19-21
PELÍCULAS LDOPA .............................................................................................................. 19
SÍNTESIS DE PELÍCULA .................................................................................................................... 19
PREPARACIÓN DE PELÍCULA ............................................................................................................ 21
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS .. 21
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES SIN LA INCORPORACIÓN DE
NANOPARTÍCULAS METÁLICAS: ......................................................................................... 22-25
SÍNTESIS DE PELÍCULA .................................................................................................................... 23
PREPARACIÓN DE PELÍCULA ............................................................................................................ 24
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS BIODEGRADABLES CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS
..................................................................................................... ¡ERROR! MARCADOR NO DEFINIDO.25
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE PELÍCULAS POLIMERICAS CON
NANOPARTÍCULAS METÁLICAS DE ZNO. ............................................................................. 26-33
PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN FISIOLÓGICA AL 85% .............................................................................. 26
2,3,5-CLORURO DE TRIFENILTETRAZOLIO AL 0.1% (TTC) .................................................................... 26
PREPARACIÓN DE CALDO DE SOYA TRIPTICASEÍNA ............................................................................... 26
INÓCULO ..................................................................................................................................... 27
PREPARACIÓN DE MUESTRA EN VIALES ......................................................................................... 27-28
PREPARACIÓN DE AGAR TRIPTICASEÍNA ............................................................................................ 29
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Ingeniería Bioquímica Página 4
SIEMBRA ................................................................................................................................ 29-30
CONTEO BACTERIANO ............................................................................................................... 30-32
NANOCÁPSULAS DE GELATINA CON ÁCIDO GÁLICO ....................................................... 33-41
PARTE EXPERIMENTAL .............................................................................................................. 33-34
PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS............................................................................. 34
PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO COMO SOLVENTE METANOL. ................... 35
PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO COMO SOLVENTE ETANOL........................ 36
PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO CÓMO SOLVENTE ACETONA ..................... 37
PREPARACIÓN DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS UTILIZANDO CÓMO SOLVENTE ACETONA UTILIZANDO
ULTRASONIDO ................................................................................................................................... 38
CARACTERIZACIÓN ........................................................................................................... 3939-43
DISCUSIÓN DE RESULTADOS .......................................................................................... 44-45
PELÍCULAS POLIMERICAS ............................................................................................................... 44
NANOCÁPSULAS DE GELATINA .................................................................................................... 45-46
CONCLUSIONES ............................................................................................................. 47-48
PELÍCULAS POLIMERICAS................................................................................................................ 47
NANOCÁPSULAS DE GELATINA ......................................................................................................... 48
RECOMENDACIONES: ......................................................................................................... 49-50
PELÍCULAS POLIMERICAS................................................................................................................ 49
NANOCÁPSULAS DE GELATINA ......................................................................................................... 50
COMPETENCIAS DESARROLLADAS Y/O APLICADAS ...................................................................... 51-52
TRABAJO A FUTURO DE NANOCÁPSULAS ....................................................................................... 53
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 54-56
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Ingeniería Bioquímica Página 5
INTRODUCCIÓN
En los últimos años se ha tomado gran interés en elementos nanométricos, siendo una área de
investigación muy importante debido a la gran cantidad de propiedades y aplicaciones
proporcionadas por este singular tamaño. La nanotecnología es un área interdisciplinaria de
investigación y desarrollo de sustancias o dispositivos en rango nanométrico (1 a 100 nm), siendo
un campo relativamente nuevo de investigación, sin embargo, avanza rápidamente en áreas de
ciencia y tecnología creando nanomateriales para tratamientos médicos, investigación agrícola,
restauración ambiental, aplicaciones energéticas y alimentaría. (Ramirez O., 2015) La
nanotecnología simboliza un escenario nuevo y habilitante que promete proporcionar una amplia
gama de usos novedosos y tecnologías mejoradas para aplicaciones biomédicas. Los motivos
detrás del intenso interés es que la nanotecnología permite la síntesis controlada de materiales.
Dentro de la nanotecnología destacan ciertas partículas de tamaño nanométrico, conocidas como
nanopartículas, las cuales se pueden construir por la unión de átomos individuales o por la
subdivisión de materiales volumétricos.
La reducción de materiales a nanoescala puede alterar con frecuencia sus propiedades eléctricas,
magnéticas, estructurales, morfológicas y químicas, lo que les permite interactuar de forma única
con las biomoléculas de las células y posibilitar su transporte físico hacia las estructuras interiores
de las células. Las partículas a nanoescala normalmente poseen un mayor porcentaje de átomos
en la superficie del material, lo que puede conducir a una mayor reactividad superficial, y puede
maximizar su capacidad de cargarse con agentes terapéuticos para administrarlos a las células
diana. (Rasmussen et al. 2010)
Las NP’s se definen como cualquier material con al menos una dimensión en el rango de 1-100
nm. La forma puede variar (no tiene que ser esférica) y los materiales incluyen metales,
semiconductores, polímeros y materiales basados en carbono. (Zamborini et al. 2012)
Edmundso et al. 2014, define de igual manera a las nanopartículas como un material en la escala
nanométrica (entre 1 y 100 nm en una de sus dimensiones). Sin embargo hay quienes definen a
las nanoparticulas como dispersiones de partículas sólidas con al menos una dimensión en un
rango de tamaño de 10-100 nm. (Horsfall et al. 2014)
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Ingeniería Bioquímica Página 6
Aplicaciones de las nanopartículas
Las nanopartículas metálicas tienen posibles aplicaciones en diversas áreas, como la electrónica,
los cosméticos, los revestimientos, los envases y la biotecnología. Por ejemplo, se puede inducir a
las nanopartículas a fusionarse en un sólido a temperaturas relativamente más bajas, a menudo
sin fundirse, dando lugar a recubrimientos mejorados y fáciles de crear para aplicaciones
electrónicas (por ejemplo, condensadores). (Thakkar et al. 2010) Las nanopartículas metálicas y/
óxidos metálicos o compuestos basados en metales muestran interesantes propiedades biológicas,
ópticas, magnéticas, electrónicas, catalíticas, etc. que, en general, se relacionan con el tamaño y la
forma de los nuevos materiales y pueden ser interesantes desde el punto de vista de su aplicación
práctica. Así, las propiedades únicas que muestran las nanopartículas metálicas provienen de la
alta relación superficie-volumen, del confinamiento cuántico del movimiento electrónico en
nanopartículas semiconductoras, de la resonancia de plasmones superficiales en algunas
partículas metálicas o del súper paramagnetismo en nanomateriales magnéticos.
Las propiedades de la molécula de núcleo utilizada, modificaciones, funcionalizaciones, su tamaño
y forma, y cualquier estructura secundaria o terciaria que puedan formar las nanopartículas dan
lugar a la multitud de propiedades útiles que presentan las nanopartículas. (Edmundson et al.,
2014).
En la medicina es común encontrarse con una gran variedad de tratamientos para combatir
diferentes padecimientos, tratamientos en los cuales se han ido utilizando diferentes elementos
que complementan los efectos de otras sustancias o aditamentos médicos. Como lo son las
nanopartículas metálicas que tras haber descubierto sus grandes propiedades han revolucionado
la medicina, una de las principales aplicaciones que encontramos se debe a su efecto
antimicrobiano. Siendo principalmente utilizados aquellos metales como la plata, el oro, el zinc,
entre otros.
Nanopartículas de óxido de Zinc
Los óxidos metálicos nanoparticulados, así como las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP), son
únicos porque pueden ser producidos con superficies altas y con estructuras cristalinas inusuales
(Klabunde, 1996). Las propiedades antibacterianas de las nanopartículas de óxido de zinc se
investigaron utilizando microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos. Estos estudios
demuestran que las nanopartículas de ZnO tienen una amplia gama de actividades antibacterianas
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Ingeniería Bioquímica Página 7
hacia varios microorganismos que se encuentran comúnmente en entornos ambientales.
(Padmavathy, 2008)
Materiales bioadhesivos
Se denomina "adhesiva" la sustancia que al estar en contacto entre dos superficies permite una
unión resistente a la separación. Los sustratos o adherentes corresponden a los materiales que se
unen por medio del adhesivo, y al conjunto de interacciones físicas y químicas que se presentan en
la interfase adhesivo-adherente se le conoce como "adhesión"; la "cohesión" corresponde a la
fuerza de atracción que mantiene unidas las moléculas de un material. Mientras que el término
bioadhesión se ha utilizado para describir el fenómeno relacionado con la capacidad que tienen
algunas macromoléculas de origen natural y de síntesis para adherirse a tejidos biológicos, se
fundamenta en los mecanismos conocidos de la adhesión convencional, con la particularidad que
representan las propiedades y características de los tejidos naturales. (Mathiowitz et al. 1999)
Mientras que Suarez, 2013, define al término “Adhesivo biocompatible” a cualquier adhesivo
natural o sintético que vaya a entrar en contacto con tejidos vivos o fluidos biológicos y, en
consecuencia, tenga que ser idóneo para aplicaciones biomédicas de corta o larga duración.
Figura. 1 Superficies presentes en una unión bioadeshiva. (Vallejo et al. 2008)
La adhesión en materiales poliméricos está determinada por uniones físicas, uniones químicas
secundarias y uniones químicas primarias como enlaces iónicos o covalentes. Las uniones químicas
primarias se obtienen a partir de la reacción química de grupos funcionales del material adhesivo
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con el sustrato. En el caso de las uniones químicas secundarias que corresponden a enlaces
químicos de menor energía, se presentan características más apropiadas para la bioadhesión por
su transitoriedad. (Vallejo et al. 2008)
Chittchang et al. 2005 menciona la importancia de las concentraciones del polímero adhesivo, en
altas concentraciones, el polímero puede presentar poca bioadhesión al sustrato, pues adquiere
una conformación replegada y no dispone de grupos suficientes para establecer interacciones
adhesivas. Cuando la concentración del polímero es menor, las uniones se intensifican; sin
embargo, una concentración muy baja favorece la interpenetración, pero la unión formada es
inestable a causa del número escaso de moléculas que penetran por unidad de volumen.
En el presente documento se pretende describir la preparación de películas reforzadas con
nanopartículas de ZnO, utilizando gelatina y ácido gálico, así como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida y N-hidroxisuccinimida como agentes entrecruzantes. Evaluar las propiedades
antimicrobianas de estas biopelículas con nanopartículas metálicas de ZnO, elaborando películas
sin ZnO NP, las cuales fueron utilizadas como control. Este estudio permitirá fijar las bases para
dar origen al desarrollo de un producto con alto valor agregado, más particularmente un apósito
funcional el cual será capaz de liberar de manera controlada ZnO NP para su posterior aplicación
médica, contribuyendo con una mejor cicatrización y evitando infecciones posteriores de la herida.
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JUSTIFICACIÓN
El proceso de cicatrización en pacientes con algún padecimiento como quemaduras, heridas
quirúrgicas o pie diabético es un problema de salud que aqueja a la población en México y en el
mundo. Inclusive durante las cirugías, las cuales se realizan día a día en muchos hospitales, se
generan heridas que tardan en cicatrizar, y en ocasiones a pesar de la costura se pueden llegar a
terminar dejando ciertas zonas por donde las bacterias pueden ingresar y generar una serie de
problemas en el tratamiento médico, que sin duda, alargarían la recuperación del paciente,
trayendo consigo complicaciones en sus obligaciones laborales o familiares.
Dando lugar a complicaciones serias, complejas y debilitantes que acompaña al paciente durante
su vida. Resultando imprescindible el desarrollo de materiales o auxiliares con propiedades
antibacterianas que impidan en gran medida la colonización de microorganismos altamente
ofensivos para el ser humano y evitar con esto complicaciones en estos padecimientos. Motivo por
el cual se han realizado diferentes investigaciones sobre formulaciones de materiales poliméricos
bioadhesivos que pueden ser de gran beneficio para la ciencia médica.
Los sistemas bioadhesivos han sido empleados en el campo de la salud, especialmente para
aplicaciones odontológicas y ortopédicas, como también para uso oftálmico y quirúrgico y
actualmente en el estudio sobre reemplazo de tejidos y la liberación controlada y localizada de
principios activos sobre mucosas. (Vallejos et al. 2008)
Las aplicaciones potenciales de este fenómeno exigen un estudio minucioso sobre los
fundamentos que rigen el comportamiento de los materiales poliméricos que se utilizan para estos
desarrollos cuando se encuentran en contacto con superficies de tipo biológico y cómo, a partir
del entendimiento de estos principios, es posible desarrollar materiales con mejores propiedades
de desempeño y proponer formulaciones optimizadas para utilizar como sistemas bioadhesivos.
Por todo lo planteado anteriormente, sumando las ventajas que representa el uso de las
nanopartículas metálicas como una nueva alternativa como agentes antibacterianos que tienen
grandes ventajas comparadas con antimicrobianos orgánicos y su alta estabilidad ya que no
causan resistencia de microorganismos, se cree posible la incorporación de ZnO NP a biopelículas
o bioadhesivos para el desarrollo de apósitos para pie diabético resulta muy prometedor.
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OBJETIVOS
Objetivo general:
Sintetizar nanopartículas metálicas de óxido de zinc para el desarrollo de nuevos materiales con
aplicaciones médicas, y posteriormente incorporarlas en una matriz polimérica, con la finalidad de
obtener un material que tenga propiedades antibacterianas.
Objetivo específico:
Obtención de nanopartículas de óxido de zinc mediante el método de precipitación
química.
Síntesis de biopelículas poliméricas (ácido gálico-gelatina), el cual será obtenido mediante
una ruta de entrecruzamiento químico.
Incorporación de las nanopartículas de óxido de zinc a películas poliméricas.
Evaluación de la actividad antimicrobiana de NPs de ZnO frente a Escherichia coli ATCC-
8739 y Staphylococcus aureus ATCC-6538.
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PROBLEMA A RESOLVER
La diabetes mellitus constituye un problema de salud universal, que afecta en forma creciente a
todas las sociedades. El pie diabético es una de las complicaciones más frecuentes de los pacientes
diabéticos, debido al déficit inmunológico asociado a esta enfermedad y al inadecuado
tratamiento que llevan por la insuficiente educación que poseen sobre su enfermedad. Es una
afección localizada en los pies de los pacientes diabéticos, cuyos factores determinantes
principales son: la isquemia, la infección y la polineuropatía.
Es por esto que el uso de la medicina alternativa que logre un recubrimiento sobre la zona
afectada, adicionando los beneficios que traen consigo la incorporación de nanopartículas
metálicas, como lo son principalmente propiedades con acción antimicrobiana, aumente su
sustantividad en la parte afectada.
Agilizando la cicatrización que trae consigo cirugías o accidentes, brindando una nueva y mejor
alternativa a personas que sufrieron quemaduras, no solo mejorando los efectos estéticos, sino
además controlar las infecciones que pudieran provocar estos padecimientos por el tiempo del
tratamiento.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Tabla 1. Cronograma de actividades a realizar durante residencia.
Actividades Periodos Agosto Sep. Oct. Nov. Dic.
Síntesis y caracterización de nanopartículas metálicas
mediante diferentes métodos.
Preparación de películas biodegradables con y sin la
incorporación de nanopartículas metálicas.
Evaluación de las nanopartículas sintetizadas
antimicrobiana con diferentes microorganismos.
Preparación de películas biodegradables para su
aplicación en heridas quirúrgicas, quemaduras o en pie
diabético.
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PARTE EXPERIMENTAL
Tabla 2. Materiales y reactivos utilizados en la preparación de biopelículas poliméricas.
Equipos Reactivos Medios de Cultivo
Analizador Termogravimétrico
(TGA), TGA Q500 de TA
instruments
Etanol (C2H5OH) Solución fisiológica
Microscopio electrónico de
barrido (SEM), JEOL, modelo
JSM-7041F.
Agua destilada (H2O)
Caldo de Soya Tripticaseina
(CST)
Espectrofotómetro de
difracción de rayos X (WAXD),
Siemens modelo D5000.
Acetato de zinc dihidratado al
99% ((C2H3O2)2Zn·2H2O)
Agar de Soya Tripticaseina
(AST)
Espectrofotómetro Infrarrojo
(FTIR), Magna 500 Nicolet.
Hidróxido de sodio (NaOH) Solución 1/500 (Caldo de soya
Tripticseina/Agua)
Centrifuga Gelatina de piel de bovino
2,3,5-cloruro de
trifeniltetrazolio al 0.1% (TTC)
Mechero bunsen Ácido gálico Cepas de bacterias
Campana de extracción LDOPA Escherichia coli (ATCC-8739).
Incubadora Lab. Line
Instruments
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDC)
Staphylococcus aureus (ATCC-
6538).
Campana de flujo laminar,
NUAIRE (modelNU-26-40).
N-hidroxisuccinimida (NHS)
Incubadora con agitación, New
Brunswick Scientific.
GLDS
Ultrasonido, Branson. GGAS
Vortex
Autoclave
Estufa
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Metodología
La metodología de la investigación está divida en dos secciones, preparación de las muestras, y la
evaluación antibacteriana de los nanocpmpuestos. La primera sección es la preparación de las
muestras involucra la preparación de las nanopartículas de ZnO, la preparación de la biopelícula
polimérica (gelatina-co-ácido gálico) y la incorporación de las nanopartículas a la biopelícula
polimérica por medio de una solución acuosa. La segunda sección corresponde a la evaluación de
la actividad antibacteriana de las biopelículas poliméricas con ZnO NP.
Figura. 2 Diagrama de metodología de estudio.
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Síntesis de nanopartículas metálicas de óxido de zinc
La síntesis se realizó a partir de la reacción de hidrólisis química bajo la siguiente metodología de
precipitación química. En la síntesis de las nanopartículas se utilizaron 600 mL de etanol, 100 mL
de agua, 0.06 M, acetato de zinc dihidratado al 99% y 0.22 M de hidróxido de sodio. Se vertieron
en un matraz de dos bocas 0.06 M de Acetato de zinc en 600 mL de etanol con un sistema de
reflujo con agitación durante 2 horas a 70 °C. Después se adicionó una solución de 0.22 M de
NaOH y 100 mL de agua los cuales se mantuvieron en agitación por 5 minutos y posteriormente se
enfrió manteniendo la agitación durante 12 horas. Una vez realizado lo anterior, la solución se
centrifugó en viales de 80 mL por 6 minutos a 15000 rpm, se llevó a secar en una estufa a 80 °C
durante 3 h, obteniendo un precipitado de color blanco correspondiente a las ZnO NP, el cual, las
cuales se llevaron a caracterización.
Figura. 3 Diagrama esquemático de la síntesis de nanopartículas metálicas de óxido de zinc
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Figura. 4 Muestra de Nanopartículas de Óxido de Zinc.
Caracterización de nanopartículas ZnO
Realizando análisis de caracterización se estableció su espectro de infrarrojo, estructura cristalina
y tamaño de partícula empleando técnicas como lo son microscopio electrónico de barrido (SEM),
espectroscopia de infrarrojo (FT-IR) y difracción de rayos X (XRD).
Espectroscopia de Infrarrojo (FT-IR)
En la Figura 5, se observa el espectro de FTIR de las nanopartículas de ZnO obtenidas a partir de la
reacción de hidrólisis química. La aparición de una banda ancha a 3400 cm-1 correspondiente al
estiramiento O-H perteneciente a los grupos hidroxilos que se encuentran presentes en la
muestra.
A 1570 cm-1 muestra las bandas de tensión asimétrica, mientras que en 1417 cm-1 aparecen las
bandas de vibración de tensión simétricas del grupo acetato (COO-) provenientes del acetato de
Zinc, lavanda más pronunciada ubicada a 440 cm-1 se puede apreciar la banda del estiramiento del
enlace Zn-O correspondiente al ZnO.
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Figura. 5 FT-IR de NP’s ZnO. El espectro infrarrojo muestra bandas prominentes en (3400 cm-1)
correspondiente al estiramiento O-H perteneciente a los grupos hidroxilos, así como grupos
importantes dentro de nuestra muestra, como es el caso de la banda más significativa (440 cm-1)
se puede apreciar la banda del estiramiento del enlace Zn-O correspondiente al ZnO.
Difractograma de rayos X (XRD)
DRX
Basado en la difracción producida cuando un haz de rayos X es dispersado por un material la DRX
permite caracterizar diferentes materiales cristalinos mediante el uso de la DRX, dispersando las
ondas que interaccionan de forma constructiva para direcciones específicas. (Martin, 2016)
Se muestra en la figura 6, el espectro de difracción de rayos X de las nanopartículas de ZnO y el
espectro de difracción para las nanopartículas de ZnO puro obtenido de la base de datos del
equipo (JCPDS). La detección de los planos característicos del zinc se permitió verificar la presencia
de óxido de zinc en el precipitado obtenido mediante difractometría de rayos x, observando que
las nanopartículas de ZnO adquiridas corresponden a la estructura cristalina tipo wurtzita
hexagonal, compuesta por coordinaciones tetraedrales de átomos de Zinc rodeados por Oxígenos
y viceversa con parámetros de red a= 3.251 y c= 5.205 Å.
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Figura. 6 Patrón de difracción de rayos X de nanopartículas.
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Podemos observar en la Figura 7, la micrografía de SEM de las ZnO NP sintetizadas a partir de la
reacción de hidrólisis química, presentaron una morfología semiesférica, además de la formación
de algunos aglomerados característicos de la síntesis de las nanopartículas metálicas y/o óxidos
metálicos.
Figura. 7 Micrografía de SEM de las ZnO NP a x 150,000.
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Con la imagen de microscopía fue posible elaborar un histograma formado mediante un análisis de
distribución de tamaños de partícula utilizando un analizador de imágenes WCIF ImageJ en el que
se midieron alrededor de 400 partículas, las cuales presentaron tamaños entre 5 a 47 nm y un
diámetro promedio de partícula de 26 nm. (Figura 8)
Figura. 8 Histograma de frecuencia de las nanopartículas de óxido de zinc.
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Preparación de películas biodegradables sin la incorporación de nanopartículas
metálicas:
PELÍCULAS LDOPA
Síntesis de película La síntesis de biopelícula se llevó a cabo mediante entrecruzamiento químico. En un matraz bola
de dos bocas se adicionaron 70 mL de agua y 5 g de gelatina de piel de bovino, los cuales se
situaron bajo agitación a 350 rpm a 80 °C. Se añadieron 330 mg de LDOPA, 116 mg de EDC y 133
mg NHS, manteniéndose en agitación durante 24 horas a la misma temperatura.
Una vez transcurridas las 24 horas, se retiró el matraz bola y se vertió la mezcla sobre un vaso de
precipitado, con 150 mL de acetona en cada lavado. Durante los lavados se centrifugó a 15,000
rpm por 5 minutos para finalmente retirar el exceso de acetona y recuperando el precipitado con
una espátula, el cual se colocó en un molde y se llevó a la estufa por 24 horas a 80 °C.
Figura. 9 Síntesis de biopelícula.
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Una vez transcurridas las 24 horas se retiró el molde de la estufa y se adicionó 1 g de producto
obtenido de la síntesis, 10 mL de agua desionizada y GLDS, el cual se llevó a agitación en una
plancha de calentamiento a 60 °C a 350 rpm por 2 h hasta que se disolvió completamente. (Figura
10)
Una vez disuelto se vertió sobre una placa con papel teflón y se trasladó a estufa por 24 h a 60 °C
(Figura 11)
Figura. 10 Disolución de muestra de síntesis de biopelícula.
Figura. 11 Preparación de biopelícula.
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS, QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO.
Ingeniería Bioquímica Página 21
Preparación de películas biodegradables con la incorporación de nanopartículas
metálicas
Se adicionó 1 g de la síntesis de la película de gelatina con LDOPA a 10 mL de agua desionizada y
llevó a 60 °C en parrilla de agitación por 2 horas a 350 rpm. Las nanopartículas se adicionaron de
acuerdo al porcentaje de concentración, los cuales fueron de 1, 3 y 5% (10, 30 y 50 mg) siguiendo
este mismo procedimiento en la preparación de la película, solo cambiando la cantidad de
nanopartículas metálicas.
Una vez disuelto por completo, colocó sobre el baño de sonicación por 5 minutos, posteriormente
por 1 hora. Una vez sonicada la mezcla se vertió sobre las placas con papel teflón y se trasladaron
a estufa a 60 °C por 24 horas. Finalmente al solidificar, se retiraron las películas con ayuda de una
espátula y se guardaron para rotular.
Figura. 12 Dispersión de nanopartículas metálicas por sonicación.
Figura. 13 Preparación de biopelícula con nanopartículas metálicas.
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS, QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO.
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Preparación de películas biodegradables sin la incorporación de nanopartículas
metálicas:
PELÍCULAS ÁCIDO GÁLICO
Síntesis de película Para la preparación de las películas se utilizó un matraz bola de dos bocas, conectado a un sistema
de enfriamiento. En el matraz se adicionaron 150 mL de agua desinizadas junto con 10 g de
gelatina de piel de bovino; esta solución se dejó en agitación constante a 80 °C hasta su completa
disolución. Posteriormente se adicionaron 1.5 g ácido gálico, 100 mg de EDC y 120 mg NHS, los
cuales se mantuvieron bajo agitación a 80 °C por 24 h. Transcurridas las 24 horas, se vertió la
mezcla sobre un vaso de precipitado, en el cual se realizaron dos lavados con 300 mL de acetona
en cada lavado. Una vez realizados los lavados, se retiró el exceso de acetona y con ayuda de una
espátula se recuperó el precipitado, el cual se colocó en un molde. La acetona recuperada en cada
lavado fue centrifugada a 15,000 rpm por 5 min para recuperar la mayor cantidad de precipitado,
posteriormente se agregó al molde y fue llevado a la estufa por 24 horas a 80 °C.
Figura. 14 Montaje de equipo de síntesis de biopelícula.
Cómo se muestra en la figura 15, después de 24 horas se retiró el molde de la estufa y se colocó 1
g de producto obtenido de la síntesis junto con 10 mL de agua desionizada y el GGAS el cual se
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Ingeniería Bioquímica Página 23
puso en agitación a 60 °C hasta su completa disolución. Una vez disuelto se vertió sobre una placa
con papel teflón y se puso a secar en una estufa por 24 horas a 60 °C. (figura 16).
Figura. 15 Disolución de muestra de síntesis de biopelícula.
Figura. 16 Preparación de biopelícula.
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Ingeniería Bioquímica Página 24
Preparación de películas biodegradables con la incorporación de nanopartículas
metálicas
En 10 mL de agua desionizada se le adicionó 1 g de la síntesis de la película de gelatina con ácido
gálico, se llevó a 60 °C en parrilla de agitación por 2 horas a 350 rpm. Las nanopartículas se
adicionarán de acuerdo al porcentaje de concentración, los cuales fueron de 1, 3 y 5% (10, 30 y 50
mg). Se siguió el mismo procedimiento en la preparación de la película, solo se modificó en la
cantidad de nanopartículas metálicas.
Después de lograr una completa incorporación de las NPZnO y la disolución de la película de
gelatina, dicha mezcla se sonicó por 5 min, durante 1 horas. Una vez sonicada la mezcla vertió
sobre las placas con papel teflón y se pusieron a secar a 60 °C durante 24 horas. Una vez obtenidas
las películas se procedió a realizar su caracterización mediante diferentes técnicas.
Figura. 17 Dispersión de nanopartículas metálicas por sonicación.
PREPARACIÓN DE PELÍCULAS POLIMÉRICAS CON LA INCORPORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS METÁLICAS PARA SU USO EN PACIENTES CON HERIDAS QUIRÚRGICAS, QUEMADURAS Y PIE DIABÉTICO.
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Figura. 18 Preparación de biopelícula con nanopartículas metálicas.
Figura. 19 Biopelícula.
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Figura. 20 Muestras para evaluación de actividad antibacteriana.
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EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE PELÍCULAS POLIMERICAS
CON NANOPARTÍCULAS METÁLICAS DE ZNO.
La evaluación de la actividad antibacteriana de las nanopartículas de ZnO se desarrolló de acuerdo
al procedimiento estándar de macrodilución en agar descrito en la norma japonesa JIS-Z-2801:200
“Japanese industrial standard”.
Preparación de solución fisiológica al 85%
La solución fisiológica se preparó con 8.5 g de NaCl en 1000 mL de H2O destilada, de dicha solución
se vertieron 9 mL en cada tubos de ensayo y 40 mL en frasco con rosca los cuales se esterilizaron
a condiciones 121 °C de por 15 min.
Figura. 21 Preparación de solución fisiológica.
2,3,5-cloruro de trifeniltetrazolio al 0.1% (TTC)
En la preparación del TTC se adicionaron 200 mg de reactivo TTC en 200 mL H2O destilada, se llevó
a agitación por 15 min a 560 rpm, se colocó en un frasco con rosca y posteriormente se esterilizó a
condiciones de 121 °C durante por 15 min.
Figura. 22 Preparación de TTC 0.1%
Preparación de caldo de soya tripticaseína
Se prepararon 200 mL de caldo de soya tripticaseína (CST), vertiendo 8 g de CST en 200 mL de
agua destilada, se calentó hasta pérdida de la turbidez del agar, posteriormente se vertieron 50
mL del caldo en 4 matraces diferentes, los cuales se esterilizaron a condiciones de 121 °C por 15
min.
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Inóculo
Dentro de campana en condiciones estériles se vertieron, 2 mL de Cepa E. Coli y S. aureus en
matraces con agar estéril y se llevaron a agitación por 24 horas a 180 rpm a 37 °C en un shaker.
Posteriormente a las 24 horas, se retiraron los matraces con los inóculos y bajo condiciones
estériles en una campana se vertieron en tubos de centrifugación previamente esterilizados, los
cuales se llevaron a centrifugar bajo condiciones de 12000 rpm a 23 °C por 15 min. Una vez
centrifugado, se retiró el caldo y se realizaron 3 lavados con 10 mL de solución fisiológica al 85% a
cada uno de los tubos, cuidando de no retirar la biomasa formada en el fondo del tubo. La
biomasa recuperada de cada microorganismo se resuspendió en 50 mL de una solución fisiológica,
para posteriormente determinar la cantidad UFC/mL mediante un recuento viable de cada
suspensión que contenía ambos microorganismos.
Figura. 23 Preparación del inóculo
Preparación de muestra en viales
En una campana de extracción estéril y con mechero encendido, en un frasco de 500 mL con H2O
destilada y estéril se retiraron 100 mL de H2O destilada que contenía el frasco y se le adicionaron
100 mL de CST, posteriormente se llevó a agitación con suaves movimientos de la mano de lado
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izquierdo y derecho, cuidando no sacar el frasco de la campana, finalmente se retiró 1 mL de
solución, se vertió 1 mL de inoculo y se agito suavemente.
Una vez obtenidas las diluciones para cada muestra, se procedió a inocular cada vial con la
suspensión celular de E. coli y S. aureus ajustada a una densidad óptica de 0.15 (3 a 5 x 105)
considerando que el volumen del inoculo para cada vial fue de 100 μL (50,000 UFC/100μL).
Cabe mencionar que se realizaron 3 repeticiones de cada una de las muestras en los viales, por lo
cual se prepararon 21 viales para cada una de las cepas, con 2 blancos respectivamente. A cada
uno de los viales estériles se les colocó una muestra de película con o sin nanopartículas
respectivamente, posteriormente encima se le colocó una perla de cristal estéril y se le
adicionaron 4 mL de inoculo, a la muestra que no contenía película se le adicionaron únicamente
los 4 mL del inoculo. Enseguida los viales se incubaron bajo condiciones de 37 °C por 24 horas.
Figura. 24 Preparación de muestra en viales.
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Preparación de Agar tripticaseína
Para la preparación de 1 L de Agar tripticaseína (ATC), se vertieron 40 g de agar en 1000 mL de
agua destilada y se llevó a calentamiento hasta que perdió la turbidez del agar. Posteriormente se
adicionaron 500 mL en 2 matraces diferentes y se esterilizó a 121 °C por 15 min.
Una vez estéril, se agregó 1 mL de TTC por cada 100 mL de solución de Agar, el cual da la
pigmentación en caso de que haya crecimiento bacteriano en la siembra.
Figura. 25 Preparación de Agar tripticaseína.
Siembra
La determinación de las UFC se llevó en una campana previamente estéril y con el mechero
encendido. Como se muestra en la figura 26, se realizan 5 diluciones por cada muestra que
corresponde a cada una de las cepas. Dentro de un ambiente estéril, se tomó 1 mL de la muestra
de los viales, colocándola en un tubo el cual fue tapado y agitado vigorosamente, realizando las
diluciones 10-6.
Una vez teniendo las diluciones se realizó la siembra en cada una de las cajas Petri marcadas
previamente, en las cuales se vertió 1 mL de la solución original, así como de las diluciones
realizadas, cuidando de seguir la continuación de cada disolución, posteriormente se le agregaron
a cada caja 20 mL del agar preparado anteriormente, el cual debe estar a no más de 38 °C de lo
contrario podría afectar al crecimiento bacteriano. A continuación se realizaron movimientos en
forma de “8” tanto de lado izquierdo, como derecho y de arriba hacia abajo por 20 segundos en
cada movimiento, de tal manera que incorporemos la muestra y el agar. Después se dejó
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solidificar y una vez sólidos, con la tapa hacia abajo, se colocaron en la incubadora a 37 °C por 24
horas. (Figura 26)
Figura. 26 Procedimiento en la realización de diluciones, las diluciones 10-6, se realizan tomando 1
mL de la muestra de los viales y colocándolo en un tubo el cual se tapa y se agita vigorosamente.
Figura. 27 Siembra de bacterias.
Conteo bacteriano
Transcurridas las 24 horas, se retiraron las cajas de la incubadora y se observaron para evaluar el
crecimiento bacteriano de las películas, realizando el conteo de las UFC/mL y determinar con ello
el número de bacterias presente en la suspensión celular. Este procedimiento se realizó para cada
una de los microorganismos a evaluar, se llevó a cabo con la ayuda de un microscopio
estereoscópico.
Como se observa en la figura 28, para contar las UFC de cada bacteria estudiada se utilizó cloruro
de trifeniltetrazolio (TTC), es un colorante que tiñe las colonias de color rojo, este se coloca antes
de vaciar el agar a las cajas petri mientras todavía se encuentra caliente, mientras más colonias se
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encuentren en el agar, este tomará un color rojo con mayor intensidad. Es importante mantener
marcada cada una de las colonias que se vayan contando para evitar errores y contar nuevamente.
En la figura 29, se muestran un par de cajas Petri con las cuales se trabajaron y en las cuales se
puede observar la técnica con la cual se fueron marcando cada una de las colonias, es importante
mencionar que en el caso de estas dos placas no se observó un exceso del crecimiento bacteriano
por lo que se facilitó el conteo.
Figura. 28 Diagrama de la metodología seguida para llevar a cabo un correcto conteo de bacterias
en medio sólido, en el cual se ejemplifica cuales se deben de contar y cuales se descartan por el
exceso de bacterias dentro de la caja Petri.
En la figura 29, se muestran un par de cajas Petri con las cuales se trabajaron y en las cuales se
puede observar la técnica con la cual se fueron marcando cada una de las colonias, es importante
mencionar que en el caso de estas dos placas no se tuvieron un exceso del crecimiento bacteriano
por lo que se facilitó el conteo.
Figura. 29 Conteo de colonias bacterianas.
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Figura. 29 Imagen del microscopio estereoscópico.
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NANOCÁPSULAS DE GELATINA CON ÁCIDO GÁLICO Durante la estancia realizada en la preparación de películas poliméricas surgió la posibilidad de
preparar nanocápsulas utilizando algunos de los reactivos empleados en la síntesis de las películas
poliméricas.
La preparación de las nanocápsulas (gelatina-co-ácido gálico) se llevó a cabo por el método de
nanoprecipitación sin y con la incorporación de NPZnO. (Gómez, 2014). Una vez obtenidas las
nanocápsulas se procedió a realizar su caracterización mediante diferentes técnicas como
espectroscopia de infrarrojo (FTIR) y microscopía electrónica de transmisión (TEM). En la figura
31, se observa esquemáticamente la metodología que se siguió para la elaboración de
nanocápsulas de óxido de zinc. La metodología de la investigación está divida en dos secciones,
síntesis de gelatina-co-ácido gálico y la preparación de las nanocápsulas de gelatina.
Figura 31. Diagrama de metodología de estudio.
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Parte experimental
Tabla 3. Materiales y reactivos utilizados en la preparación de nanocápsulas de gelatina.
Equipos Reactivos
Analizador Termogravimétrico (TGA), TGA Q500 de TA
instruments
Etanol (C2H5OH)
Microscopio electrónico de barrido (SEM), JEOL, modelo
JCM 6000
Agua destilada (H2O)
Espectrofotómetro de difracción de rayos X (WAXD),
Siemens modelo D5000.
Acetato de zinc dihidratado al 99%
((C2H3O2)2Zn·2H2O)
Espectrofotómetro Infrarrojo (FTIR), Magna 500 Nicolet. Hidróxido de sodio (NaOH)
Centrifuga Gelatina de piel de bovino
Mechero bunsen Ácido gálico
Campana de extracción 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDC)
Incubadora Lab. Line Instruments N-hidroxisuccinimida (NHS)
Campana de flujo laminar, NUAIRE (modelNU-26-40). DMSO
Incubadora con agitación, New Brunswick Scientific.
Ultrasonido, Branson.
Vortex
Autoclave
Estufa
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Preparación de nanocápsulas poliméricas
Las nanocápsulas de Gelatina y ácido gálico que contienen NP de ZnO se prepararon de la
siguiente manera. Se disolvieron 2 g de gelatina (GPB) junto con 0.30 g de ácido gálico (AG), 20 mg
de EDC y 24 mg de NHS en 30 mL de DMSO, a 70 °C durante 5 horas, cuidando que la temperatura
se mantuviera estable en todo momento (Figura 32). Una vez disuelto se midió el pH el cual fue de
7, posteriormente cada hora se midió el pH para contralar cada uno de los factores que pudieran
alterar el producto final de la síntesis.
Figura 32. Metodología utilizada en la síntesis para la preparación de nanocápsulas, en la cual se
muestran las condiciones utilizadas, así como los reactivos y las cantidades de se adicionaron para
la síntesis.
Preparación de nanocápsulas poliméricas.
Las nanocápsulas se formaron bajo la adaptación del método de nanoprecipitación utilizando
diferentes solventes para su precipitación (metanol, etnol y acetona). (Gómez, 2014) Una vez
transcurridas las 5 horas se procedió a la realización de nanocápsulas para lo cual se colocaron 50
mL de metanol a 5°C en un vaso de precipitado de 100 mL y con ayuda de un agitador magnético y
una parrilla de agitación se agitó a 600 rpm por 5 minutos, con una jeringa de insulina se dejó caer
gota a gota la mezcla obtenida de la síntesis, una vez transcurridos los 5 minutos, se retiró de
agitación. (Figura 33.)
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Figura 33. Metodología utilizada en la preparación de las nanocápsulas sin y con la incorporación
de las NPZnO.
Preparación de nanocápsulas poliméricas utilizando como solvente Etanol.
Las nanocápsulas se formaron bajo la adaptación del método de nanoprecipitación utilizando
diferentes solventes para su precipitación (metanol, etnol y acetona) (Gómez, 2014). Se procedió
a la realización de NCs para lo cual se colocaron 50 mL de etanol a 5 °C en un vaso de precipitado
de 100 mL y con ayuda de un agitador magnético y una parrilla de agitación se agitó a 600 rpm por
5 min, con una jeringa de insulina se dejó caer gota a gota la mezcla obtenida de la síntesis, una
vez transcurridos los 5 min, se retiró de agitación.
A continuación se recogieron por centrifugación a condiciones de 10,000 rpm, a 20 °C por 5 min,
de tal manera que pudieran separarse completamente las nanocápsulas del solvente. Las
nanocápsulas obtenidas, se llevaron a liofilizar por 24 horas. El producto final se almacenó dentro
de viales a temperatura ambiente. (Figura, 34)
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Figura 34. Diagrama esquemático de la metodología utilizada en la preparación de nanocápsulas
poliméricas utilizando como solvente Etanol.
Preparación de nanocápsulas poliméricas utilizando cómo solvente Acetona utilizando
ultrasonido
En la figura 36, podemos observar el procedimiento que se llevó a cabo para la preparación de
nanocápsulas de gelatina. Siguiendo el mismo método de nanoprecipitación (Gómez, 2014)
utilizado anteriormente y con la finalidad de reducir el tamaño de la cápsula, se hicieron pruebas
con ayuda del ultrasonido.
En esta preparación de NCs se utilizó como único solvente el etanol tras las pruebas realizadas
anteriormente. La solución que contenía la síntesis de GPB y AG se dejó caer por goteo con una
jeringa de insulina sobre etanol a 5°C, el ultrasonido encendido en todo momento se dejó
encendido por 1 minuto bajo.
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Figura 36. Método de nanoprecipitación
Caracterización Para caracterizar las nanocápsulas fue necesario establecer su tamaño de partícula y la presencia
de grupos funcionales empleando diversas técnicas experimentales como microscopía electrónica
de transmisión (TEM) y espectroscopia de infrarrojo (FT-IR).
Espectroscopia de Infrarrojo (FTIR)
La espectroscopia es el estudio de la interacción entre la radiación electromagnética y la materia
en función de la longitud de onda (λ) o número de ondas (k). En concreto, la espectroscopia IR
analiza la absorción de radiación en el rango IR (4000 a 400 cm-1) por 19 un material, a
determinado número de onda, que se debe a transiciones entre distintos niveles energéticos
asociadas a vibraciones del mismo. Experimentalmente, se hace incidir luz IR y ésta atraviesa la
muestra. Cuando la longitud de onda de vibración de un enlace (o grupo de enlaces) coincide con
alguna de las longitudes de onda incidentes, se produce absorción. (Martin, 2016)
Preparación de la muestra
Pastilla de NCG
Para realizar el estudio de las muestras en polvo se preparó una pastilla de NCG (%). Las pastillas
se prepararon utilizando KBR y pesando 0.06 g de la muestra, siguiendo este mismo procedimiento
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se realizaron las pastillas de gelatina y de ácido gálico, con las cuales se hicieron los FTIR de cada
una de las muestras.
Resultados de IR de nanocápsulas de gelatina (NCG)
Los resultados de FTIR se muestran en la figura 37. En esta figura se logran apreciar los grupos
funcionales que se encuentran presentes en la síntesis como es el caso de grupos aminos (3279
cm-1), las bandas localizadas en (2950 cm-1) encontramos grupos metilenos, en (2850 cm-1)
pertenecen a los grupos metilos, los cuales se deben a la composición de los reactivos utilizados.
Mientras que en otras, (1630 cm-1) grupos amidas, siendo estos tres picos los más significativos en
la gráfica. En bandas como (1528 cm-1) tenemos grupos ácidos, los cuales pueden deberse a la
flexión de las vibraciones del grupo N-H. Las bandas prominentes como es el caso de la banda
(1012 cm-1) la cual se puede tomar como una evidencia del entrecruzamiento del ácido gálico.
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
0
20
40
60
80
100
Inte
nsid
ad
(U
.A.)
Numero de onda (cm-1)
NCG
3279
3077
2936
1630
15281012
Figura 37. Espectro de infrarrojo de las nanocápsulas sintetizadas.
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Microscopía electrónica de trasmisión (TEM)
Preparación de muestra
La muestra para la caracterización al TEM se preparó dispersando una pequeña cantidad de las
nanocápsulas en un vial que contenía 10 mL de etanol, una vez dispersadas mediante el uso de
ultrasonido se procedió a preparar las rejillas Lacey carbón, tomando 1 gota de la solución y
depositándola posteriormente en la rejila hasta sequedad total.
Resultados de TEM
Las imágenes observadas en el TEM muestran figuras amorfas, las cuales no corresponden a las
descritas en la bibliografía, sin embargo dichas figuras alcanzan el tamaño indicado en bibliografía,
el cual corresponde a tamaños entre 200 nm.
La inestabilidad que presenta el producto de la síntesis de GPB con AG pudo haber causado que
durante la preparación de la muestra en la rejilla presentara una descomposición perdiendo su
forma. Sin embargo analizando determinadamente la figura 38, se pueden observar pequeñas
nanocápsulas las cuales fueron marcadas con círculos rojos de tal manera que se pudieran
diferenciar en la imagen, dichas nanocápsulas se encuentran unidas a lo que parece ser un
fragmento de biopolímero.
Las nanocápsulas obtenidas muestran el mismo comportamiento obtenido en microcápsulas
realizadas en las pruebas iniciales, por lo que después de este análisis se tienen evidencias de la
presencia de nanocápsulas.
Se consideran diferentes factores que pudieron haber provocado la aglomeración de
nanocápsulas, tales como; la temperatura, la inestabilidad del material, así como una posibilidad
de que las nanocápsulas se aglomeraran con el método utilizado con ultrasonido, ya que como se
mencionó anteriormente, el material al ser muy inestable y tener poca resistencia antes de que
solidifiquen las nanocápsulas pudieron haber provocado tales anomalías.
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Figura 38. Nanocápsulas de gelatina observadas por microscopía electrónica de trasmisión (TEM).
La realización de liofilización en la muestra es importante para mantener sólidas las NCG, así como
la posibilidad de realización de caracterización bajo crio-TEM si la muestra no es liofilizada
previamente, esto bajo consideración en caso de no liofilizar conociendo la inestabilidad del
material y su comportamiento a temperatura ambiente y fuera del solvente.
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Microscopio electrónico de barrido (SEM)
El análisis se realizó con microscopio electrónico de barrido (SEM) con la finalidad de obtener
información precisa con respecto a su morfología, ya que a simple vista no se puede tener la
información necesaria con la cual se pueda comprobar que el material utilizado en la preparación
de las NCG sea apropiado, por lo cual se realizó dicha caracterización.
La microscopía indicó claramente que las microcápsulas de gelatina (MCG) presentan una forma
esférica, una superficie rugosa y porosa, tal como se aprecia en la figura 39.
Figura 39. Micrografías de microcápsulas de gelatina obtenidas por Microscopio electrónico de barrido. A) forma de MCG y b) superficie de MCG.
La porosidad observada en una de las (MCG), pudiera deberse al tipo de material con el cual se
está trabajando y su vez por la metodología seguida en su elaboración. Otras de las características
que presentan es que su grosor, no se pudiera saber si esta característica es mayor a otras hasta la
realización de pruebas comparativas.
Se pueden apreciar claramente dos MCG, de las cuales ambos casos la distribución de tamaño es
bastante homogénea. Esto queda comprobado al observar los resultados obtenidos del tamaño de
partícula de ambas MCG, la diferencia es insignificante y esto pudiera deberse por la técnica con la
cual se elaboraron, ya que resulta complicado tener exactitud cuándo se trabaja por goteo.
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DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Películas poliméricas
Para el método de precipitación química utilizado, se corroboró que se pueden obtener
nanopartículas de óxido de zinc con una morfología semiesférica y un tamaño de partícula
polidisperso.
Con respecto a las biopelículas que se realizaron se tuvieron defectos en la textura de estas, ya
que no se hinchaban tras la adición de agua e impedía el ablandamiento por lo que dificultaba al
momento de cortarlas. Durante la síntesis de las biopelículas fue importante que la temperatura
estuviera estable ya que cualquier cambio podría provocar alguna alteración sobre la reacción.
También se considera importante la adición exacta de los reactivos para lograr que la síntesis se
llevara a cabo correctamente y se lograra la obtención de un buen producto, teniendo igual
cuidado con respecto al tiempo de reacción durante la elaboración de las biopelículas, al no
realizarse en el tiempo establecido el producto obtenido podría no ser el deseado y teniendo
defectos o alteraciones por su composición.
Siguiendo las indicaciones de la norma Japonesa (JIS-Z-2801:200) las pruebas antibacterianas se
realizaron 5 veces por cada cepa y película polimérica, de tal manera que pudiera corroborar los
resultados con los obtenidos con respecto al efecto antibacterial de las nanopartículas de óxido de
zinc sobre las biopelículas poliméricas.
Con la preparación de películas con incorporación de nanopartículas, se evaluó su actividad
antibacteriana en cada una de las películas, teniendo resultados favorables en todos los
porcentajes de nanopartículas que se adicionaron a las películas, se inhibió el crecimiento en todas
las cajas con diluciones de dichas películas, teniendo crecimiento únicamente en los blanco, de tal
manera que se puede comprobar que las nanopartículas de ZnO tienen un efecto bacteriostático e
inhibitorio en el crecimiento bacteriano a concentraciones relativamente bajas tanto para E. coli
como S. aureus.
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Nanocápsulas de gelatina con ácido gálico
Las nanocápsulas de GPB y AG se prepararon de acuerdo con el método de nanoprecipitación
(Gómez, 2014) y debido a las características que presentó la fase orgánica se modificó el uso de
solventes utilizando etanol, acetona y metanol a 5 °C.
Las microcápsulas poliméricas obtenidas en los primeros ensayos se hicieron a partir de la síntesis
de gelatina con diferentes concentraciones de DMSO, las pruebas arrojaron que aquellas síntesis
que formaban mejor las MCs, fueron las que tenían 100% de DMSO, además con el uso de
diferentes solventes, tales como el metanol, etanol y acetona. Sin embargo tras los resultados se
descartó el metanol, ya que las MCs no alcanzaban a tomar una forma sólida en menor tiempo y
se deshicieron en el solvente, ya que este dejó en constante agitación.
En la figura 39, se pueden observar microcápsulas poliméricas (MCs) que se formaron a partir del
uso de acetona como solvente y además se puede decir que estas mostraron mejor apariencia
física y resistencia. Sin embargo, cuando se utilizó como solvente el etanol y una vez liofilizadas las
nanocápsulas fueron estas las que mantuvieron su forma semiesférica y aquellas que se formaron
cuando se utilizó acetona como solvente se pegaron y perdieron la forma esférica, la única ventaja
que se mostró al utilizar acetona, fue que el tamaño era menor a aquellas MCs donde se utilizó
etanol. Después de obtener estos resultados, se omitió el uso de acetona para la formación de
nanocápsulas, de tal manera que al utilizar el ultrasonido, el único solvente utilizado fue el etanol.
Figura 39. A) Microcápsulas de gelatina con ácido gálico usando como solvente acetona. B), C) Microcápsulas de gelatina usando como solvente etanol.
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Al utilizar el método de nanoprecipitación (Gómez, 2014), no se obtuvieron los resultados
esperados con respecto al tamaño de las capsulas, ya que estas aún no tenían un tamaño que
entrará a la escala nanométricas que manejaban algunas bibliografías, por lo que sé considera que
el método puede ser modificado para lograr conseguir el tamaño deseado.
Relación en la identificación de absorción por espectroscopia infrarroja
En la figura 40, se muestra la comparación de infrarrojos de ácido gálico (A) y gelatina (B) con
relación a las nanocápsulas de gelatina (C). La banda (1015 cm-1) la cual se puede tomar como una
evidencia del entrecruzamiento del ácido gálico, al igual que en la banda (945 cm-1), mientras que
en otras se atribuyen a los grupos funcionales que se encuentran presentes en la síntesis como es
el caso de grupos aminos (3288 cm-1), (1627 cm-1) grupos amidas, estos cuatro picos son de los
más significativos en la gráfica y son de gran relevancia para saber el comportamiento que tuvo la
reacción al final en las nanocápsulas. Los picos localizados en (2866 cm-1) se encuentran los grupos
metilos, en (2925 cm-1) encontramos grupos metilenos, los cuales se deben a la composición de los
reactivos utilizados. En bandas como (1521 cm-1) tenemos grupos ácidos, los cuales pueden
deberse a la flexión de las vibraciones del grupo N-H.
Figura. 40 Comparación de los espectros infrarrojos de ácido gálico (A) y gelatina (B) en relación
con las nanocápsulas de gelatina (C).
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CONCLUSIONES
Conclusión de películas poliméricas
Se lograron la obtención de un producto, biopelículas por medio de entrecruzamiento químico
utilizando un sistema de ultrasonido y empleando concentraciones del 1 y 3% de nanopartículas
de ZnO metálica. Dichas biopelículas de gelatina-co-ácido gálico con nanopartículas de óxido de
zinc presentaron una excelente actividad antibacteriana contra E. coli y S. aureus.
Para el método de precipitación química utilizado, se corroboro que se pueden obtener
nanopartículas de óxido de zinc con una morfología semiesférica. Así como la obtención de
biopelículas por medio de entrecruzamiento químico las cuales se caracterizaron para determinar
sus propiedades y composición química.
La incorporación de las nanopartículas en las biopelículas mostraron que estas no afectan las
propiedades físicas de las biopelícula, sin embargo la metodología seguida para la dispersión de
estas Np’s si afecta su efecto, así como su concentración.
Las películas poliméricas presentaron efectos antibacterianos y un gran potencial para ser
utilizados como agente para combatir infecciones provocadas por algunos tipos de bacterias Gram
positivo y Gram negativo, esto debido a su peculiaridad manera de actuar de las nanopartículas
metálicas, ya que una vez que el ZnO mata o envuelve la membrana celular, las nanopartículas de
ZnO permanecen fuertemente adsorbidos en la superficie de la membrana incluso así las
nanopartículas de ZnO continúan liberando peróxidos en el medio. Aunque de las películas
poliméricas faltaría hacer más estudios para conocer la compatibilidad que tiene el material con la
piel y la cicatrización en humanos.
Aunque se ha probado la eficiencia que las películas poliméricas tienen y su gran potencial para
ser utilizados como agente para combatir infecciones provocadas por algunos tipos de bacterias
Gram positivo y Gram negativo, faltaría hacerse más estudios para conocer la compatibilidad que
tiene el material con la piel y la cicatrización en humanos.
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Conclusión de nanocápsulas de gelatina
Para el método de nanoprecipitación utilizado, se corroboró que se pueden obtener nanocápsulas
de gelatina con una morfología semiesférica. La parte orgánica se obtuvo por medio de
entrecruzamiento químico el cual se caracterizó para determinar sus propiedades y composición
química.
Se modificó parte de la metodología seguida, utilizando solventes a temperaturas de 5°C. Aunque
se utilizaron diferentes solventes y se tuvieron buenos resultados con acetona, al momento de
liofilizar, las nanocápsulas tuvieron perdida de forma, aglomerándose y adquiriendo una textura
viscosa, por lo cual se decidió solamente trabajar con etanol el cual dio buenos resultados una vez
que se liofilizaron las muestras.
Debido a la inestabilidad del material con el cual se trabajó es importante y fundamental la
liofilización de las nanocápsulas para lograr obtener un producto duradero, además de mantener
dentro de viales de cristal cerrados, en un lugar seco y fresco, ya que el cambio de temperatura
puede afectar las nanocápsulas provocando perdida de forma o rompimiento de la misma,
liberando su contenido y exponiéndolo.
Modificando parte de la metodología seguida, se utilizó el ultrasonido resultando parte
fundamental en la metodología, a su vez de la utilización del solvente a temperaturas de 5°C, con
la cual aumentaba el tiempo de solidificación de las NCG. Aunque se utilizaron diferentes
solventes y se tuvieron buenos resultados con acetona, al momento de liofilizar, las nanocápsulas
tuvieron perdida de forma, aglomerándose y adquiriendo una textura viscosa, por lo cual se
decidió solamente trabajar con etanol el cual dio buenos resultados una vez que se liofilizaron las
muestras.
Debido a la inestabilidad del material con el cual se trabajó es importante y fundamental la
liofilización de las nanocápsulas para lograr obtener un producto duradero, además de mantener
dentro de viales de cristal cerrados, en un lugar seco y fresco, ya que el cambio de temperatura
puede afectar las nanocápsulas provocando perdida de forma o rompimiento de la misma,
liberando su contenido y exponiéndolo.
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Recomendaciones: Películas poliméricas
Es importante que al momento de verter la solución sobre las placas no excedan los 10 mL
por placa, ya que podría llegar a tener un espesor inadecuado para su manejo y podría ser
difícil de cortar, así como su aplicación.
Es importante mantener estéril el área de trabajo y seguir el protocolo al realizar los
análisis microbiológicos para evitar contaminación en las cajas y de esta manera obtener
los resultados más confiables en nuestro análisis. Además de esta manera se evitara tener
algún problema de salud por el mal manejo de microorganismos.
Nanocápsulas de gelatina
Tener buen manejo de la temperatura ya que esta juega un papel importante en el
entrecruzamiento. A una alta temperatura puede provocar una degradación de la gelatina,
ya que está en especial siendo una proteína a una temperatura mayor de 80 °C puede
perder sus propiedades.
El tiempo en el cual se llevó a cabo la reacción es otro punto importante, ya que a un
menor tiempo es posible no tener entrecruzamiento, de igual manera un tiempo más
prolongado de reacción puede provocar degradación.
El uso de solventes a temperaturas menores de 5 °C ayudan a obtener una capsula con
mejor forma y consistencia más firme.
Es importante tener una aguja fina con la cual se vaya liberando la parte orgánica sobre el
solvente, siempre recordando de que debe mantenerse a goteo y debe ser muy cerca del
solvente de tal manera que se pueda conseguir la más fina capsula posible.
La agitación es un factor primordial en la elaboración de las nanocápsulas, ya que esta
parte del proceso, ayuda a solidificar las NCG sin que están se peguen antes de tener
firmeza, además ayuda a dispersarlas.
Es importante mantener un periodo muy corto durante el uso del ultrasonido, ya que un
periodo largo puede provocar la ruptura de las nanocápsulas, de igual manera se
recomienda no tener la potencia tan elevada y siempre mantenerse a las revoluciones
mencionadas en la metodología.
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La centrifugación se recomienda para separar las nanocápsulas del solvente y es
importante no exceder las revoluciones por minuto mencionadas en la metodología, ya
que pudieran provocar la ruptura de las nanocápsulas.
La liofilización es una parte esencial, ya que por la inestabilidad del material este vuelve a
su estado líquido a temperatura ambiente una vez que esta fuera del solvente, por lo que
es importante liofilizar inmediatamente después de centrifugar.
Es importante mantener las nanocápsulas de gelatina en un frasco cerrado y en un lugar
fresco, ya que el cambio de temperatura pudiera provocar que se pegaran
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Competencias desarrolladas y/o aplicadas
Competencias genéricas:
Instrumentales
• Capacidad de análisis y síntesis
• Capacidad de organizar y planificar
• Conocimientos básicos de la carrera
• Comunicación oral y escrita
• Habilidades básicas de manejo de la computadora incluyendo dibujo asitido por computadora.
• Habilidad para buscar, discriminar y analizar información proveniente de fuentes diversas.
• Tomar decisiones.
Interpersonales
• Capacidad crítica y autocrítica.
• Trabajo en equipo.
• Habilidades interpersonales.
• Capacidad de comunicación.
Sistémicas
• Capacidad de aplicar los conocimientos en la práctica.
• Habilidades de investigación.
• Capacidad de aprender.
• Capacidad de generar nuevas ideas (creatividad).
• Habilidad para trabajar en forma autónoma.
• Búsqueda del logro.
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Química analítica: fue de las principales competencias que aplique durante el desarrollo del
proyecto de investigación que realice en mi estancia, esto debido a que es fundamental el
conocimiento en la preparación de soluciones.
Además de la aplicación de competencias adquiridas en dicha materia, tuve la oportunidad de
desarrollar habilidades en la preparación de diferentes soluciones, mejorar técnicas como lo son la
medición, pipeteo, cálculos, así como el reconocer diferentes reactivos.
Microbiología: fue otras de las competencias fundamentales durante el desarrollo del proyecto
debido a que se realizó una parte antibacteriana en la cual se utilizaron diversas metodologías,
tales como siembra en placa, preparación de medios de cultivos, diluciones, conteo bacteriano,
entre otros.
Análisis instrumental: un parte importante en la caracterización fue la interpretación de los datos
arrojados por diferentes instrumentos, como fue el caso del IR, en el cual con el apoyo de
bibliografía se interpretaron las bandas que arrojó durante la medición.
Química orgánica: en este proyecto fue importante el dominio de la química orgánica ya que fue
parte fundamental durante la preparación de las películas biopoliméricas. De igual manera para la
síntesis de nanopartículas fue necesaria la aplicación de diferentes metodologías vistas en química
orgánica.
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Trabajo a futuro de nanocápsulas
Este material obtenido tiene un amplio campo de estudio para conocer como este interacciona
con las nanopartículas y como todo en conjunto trabajan.
Se plantea para trabajo a futuro lo siguiente:
Realizar estudio para establecer sus propiedades mecánicas.
Realizar estudios de liberación de las nanopartículas de óxido de zinc.
Determinar con mayor exactitud la cantidad de nanopartículas que puede absorber
las nanocápsulas dependiendo de la concentración.
Realizar estudios de citotoxicidad para el material.
Realización de caracterización bajo cryo-TEM.
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