presentation doubs saprolegnia parasitica
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Clonalité de Saprolegnia parasitica, le parasite des poissons du Doubs
Christophe Paul, Lassaâd Belbahri
Contexte
Introduction
� Mortalité importante de poissons dans le bassin du Doubs� Touche les ombres et les truites� Taches blanches (mycoses)
� Confusion sur les causes de cette mortalité� Une saprolegniose est évoquée…
La saprolegniose ? Oui mais…
Introduction
� Saprolegnia spp. présent naturellement dans les cours d’eau� Généralement infection secondaire� Ne touche que des poissons affaiblis
� Pourquoi un taux de mortalité si élevé ???� Pourquoi maintenant ???
� Analyses préliminaires� Prélèvements sur un ombre malade� Mise en culture� «ADN Barcoding» (ITS)
Thierry Arnet
Saprolegnia parasitica s.l.
Introduction
� Oomycète du genre Saprolegnia
� Complexe S. diclina / S. parasitica / S. salmonis(Saprolegnia parasitica s.l.)
� Complexe d’espèces mal définies
� Certaines souches sont très virulentes: si le nb de spores est élevé (Hussein, 2002) :
� Taux de mortalité pour les truites arc-en-ciel (Salmo gairdneri) : 100%
� Taux de mortalité pour les truites brunes (Salmo trutta) : 90-100%
Les sites
Introduction
Le Doubs
� Franco-suisse� Sous-affluent du
Rhône
La Loue
� Résurgence et affluent du Doubs (fr)
2 rivières connectées
Dès 2009 :
Loue
Les sites
Introduction
Le Doubs
� Franco-suisse� Sous-affluent du
Rhône
La Loue
� Résurgence et affluent du Doubs (fr)
La Sorne
� Suisse� Sous-affluent du Rhin
DECONNECTEE DU DOUBS!!
2 rivières connectées
Dès 2009 :
En 2011 :Doubs
Sorne
Projet (OFEV)
Introduction
� Identification du pathogène (18S et ITS)
� Même pathogène pour tous les individus malades ? Espèces?� Liste des espèces sensibles: hôtes?
� Diversité génétique / clonalité (MLST)
� Pathogène résident vs Introduction� Origine du pathogène ?
MLST: MultiLocus Sequence Typing
Matériel et méthodes
� Analyse de la diversité génétique
� Caractérisation d’isolats (bactéries ou eucaryotes) par l’utilisation deséquences d’ADN de plusieurs gènes de ménage (housekeeping genes)
� Fragments internes de 450-500 pb pour chaque gène
� Pour chaque locus (gène), les différentes séquences déterminent des allèlesdistincts et pour chaque isolat les allèles des différents loci définissent unprofil allélique (sequence type)
MLST: MultiLocus Sequence Typing
Matériel et méthodes
MLST: MultiLocus Sequence Typing
Matériel et méthodes
� 2 gènes nucléaires� Beta tubuline� Facteur d’élongation 1 alpha
� 2 gènes mitochondriaux� NADH déshydrogénase sous-unité 1� Cytochrome C oxydase sous-unité 1
� 1 facteur de virulence� Protéase aspartique
Collection de souches
Matériel et méthodes
Nom code Identif Moléculaire Poisson Date prélèvement l ieu de prélèvement
DoubsblessuresD1 Saprolegnia parasitica Thymallus thymallus 17.04.11. La roche plate (Chx-de-Fds)D2 Saprolegnia parasitica Thymallus thymallus 17.04.11. La roche plate (Chx-de-Fds)D3 Saprolegnia parasitica Thymallus thymallus 17.04.11. La roche plate (Chx-de-Fds)D4 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 26.09.11. Bonaparte (Chx-de-Fds)D5 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 26.09.11. Bonaparte (Chx-de-Fds)D6 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 12.05.11. Goumois
LoueP1 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 08.08.11. OrnansP2 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP3 Saprolegnia sp. Salmo trutta 25.11.11. OrnansP4 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP5 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP6 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP7 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP8 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 25.11.11. OrnansP9 Saprolegnia parasitica Barbatula barbatula 25.11.11. Ornans
SorneT1 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT5 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT7 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT8 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. DelémontT10 Saprolegnia parasitica Salmo trutta 14.11.11. Delémont
baiting (Doubs)S1.2 Saprolegnia sp 01.06.11. La Goule (Le Noirmont)S2.2 Saprolegnia sp 01.06.11. Goumois
22 souches
2 types de prélèvements:
� Blessures des poissons malades
� «Baiting» (eau de la rivière)
3 hôtes:
� Ombres (Thymallus thymallus)
� Truites fario (Salmo trutta)
� Loche (Barbatula barbatula)
18S: Saprolegniales
Résultats & Discussion
Saprolegnia spp.
Saprolegnia spp.
Outgroup
18S: Saprolegniales
Résultats & Discussion
Isolats répartis en 2 groupes :
� S. parasitica:
19x blessure
� Saprolegnia sp.
1x blessure 2x éch. d’eau
Saprolegnia spp.
Saprolegnia spp.
Outgroup
18S: Saprolegniales
Résultats & Discussion
Isolats répartis en 2 groupes :
� S. parasitica:
19x blessure
� Saprolegnia sp.
1x blessure 2x éch. d’eau
Saprolegnia spp.
Saprolegnia spp.
Outgroup
� toutes les S. parasiticane correspondent pas à«notre» souche
� genre Saprolegniaparaphylétique
Bases de données fiables ???
ITS: Saprolegnia spp.
Résultats & Discussion
Outgroup
Saprolegnia parasitica s.l.
ITS: Saprolegnia spp.
Résultats & Discussion
Isolats répartis en 2 groupes (=18S):
� Complexe S. parasitica s.l.
� Saprolegnia sp.
Outgroup
Saprolegnia parasitica s.l.
18S & ITS
Résultats & Discussion
� 2 populations distinctes de Saprolegnia sont présentes
� 19/20 prélèvements sur les blessures «donnent» Saprolegniaparasitica s.l. Souche virulente
� Pathogène indépendant des espèces de poissons
� Au moins 3 espèces sensibles de 2 familles différentes
� Manque de fiabilité des bases de données + phylogénie peu claire (confusion entre plusieurs espèces)
MLST: séq. concaténées
Résultats & Discussion
� Mêmes groupes qu’avec ITS et 18S
� Groupe 1: très faible variabilité génétique
� Une exception P6
� Groupe 1 correspond génétiquement à une souche du Japon
Outgroup
Groupe 1
Groupe 2
Groupe 1
MLST : profils alléliques
Résultats & Discussion
Groupe 1
� Seulement 4 types alléliques
� 16 souches sur 19 sont identiques
Beta tubulin
Elongation factor
Cytochrome C oxydase
NADH dehydrogenase
Type
D1 1 1 1 1 1
D2 1 1 1 1 1
D3 1 1 1 n/a 1
D4 1 1 1 1 1
D5 1 1 1 n/a 1
D6 1 1 1 n/a 1
P1 1 1 1 1 1
P2 1 1 1 1 1
P4 1 1 1 1 1
P5 1 1 1 1 1
P6 2 2 2 1 2
P7 1 1 1 2 3
P8 1 1 1 3 4
P9 1 1 1 1 1
T1 1 1 1 1 1
T5 1 1 1 1 1
T7 1 1 1 1 1
T8 1 1 1 1 1
T10 1 1 1 1 1
2 populations de Saprolegnia distinctes
Résultats & Discussion
� 1 souche résidente
� Saprolegnia sp.� Grande variabilité génétique� 1 seule isolation à partir de poisson malade� Isolée à partir d’eau de la rivière
� 1 souche pathogène
� Saprolegnia parasitica s.l.� Très faible variabilité génétique = population clonale� Uniquement isolée à partir de poissons malades� D’après MLST, correspond génétiquement à une souche du Japon…
MAIS…
� Pas possible d’établir clairement l’origine de la souche de S. parasitica s.l. du Doubs
� Trop peu de données disponibles
� Seulement 2/4 gènes séquencés pour la souche du Japon
� 4 gènes séquencés pour 1 seule souche de S. parasitica
� Pour les autres souches de S. parasitica, pas ou peu de données concernant les gènes utilisés
� Nécessité de commander les souches disponibles pour un séquençage avec nos primers
Résultats & Discussion
En plus…
Résultats & Discussion
� De nombreux sites sont «ambigus» (hétérozygote)
� 2 bases possibles pour un même site� Séquences différentes sur les 2 chromosomes
� Suggère une reproduction sexuée ou une hybridation
Conclusions
� Saprolegnia parasitica s.l. est toujours présente et active cette année (automne 2011) dans le Doubs et la Loue
� Au moins 3 espèces de poissons sensibles de 2 familles différentes
� S. parasitica s.l. s’est étendue à une rivière non connectée au Doubs
� La population clonale de S. parasitica s.l. suggère une introduction récente dans la région
Perspectives
� Echantillonnage à plus large échelle� Répartition / fréquence� Image plus précise des «génotypes agressifs»� Liste des hôtes possibles
� Déterminer l’origine de la souche pathogène
� Développement d’un test de détection à partir d’échantillons environnementaux (PCR spécifique)
� Séquençage du génome complet de la population clonale
� Eclaircissement de la phylogénie
� Identifier le(s) vecteur(s)
Un vecteur potentiel
Perspectives
� De nombreuses espèces d’écrevisse sont des hôtes potentiels pour les oomycètes
� Saprolegnia parasitica fait partie des parasites identifiés de certaines espècesd’écrevisses (Söderhäll et al., 1991)
� L’introduction d’écrevisses nord-américaines (Procambarus clarkii) en Europe a démontré être à l’origine de la propagation d’Aphanomyces astaci (Aquiloni et al., 2011)
� Découverte en 2005 d’une espèce d’écrevisse nord-américaine (Oronectes juvenilis)dans le Dessoubre , un affluent du Doubs (Chucholl & Daudey, 2008)
� Inquiétant de constater que l’introduction de cette écrevisse pourrait coïncider avec l’apparition de l’épidémie
Remerciements
� L’OFEV pour le financement du projet
� L’office de l’environnement du Jura
� Françoise Pozet, du laboratoire départemental d’analyses du Jura (fr)
� Thomas Wahli, du centre pour la médecine des poissons et des animaux sauvages de l'Université de Berne (FIWI)
� Thierry Arnet
� Edward Mitchell
� Enrique Lara
� Nicole Jeanneret
� Ludovic Roussel-Delif
� Thibaud Goetschi
� Et tous ceux que j’ai oublié…
Merci pour votre attention
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