prezentace aplikace powerpointold-biomikro.vscht.cz/vyuka/bc1/biochemie_i_3_bilkoviny_m.pdf ·...

PROTEINY ( = BÍLKOVINY)

DNA → RNA → protein → modifikovaný protein

- více než 50 % buněčné sušiny organismů

-chemicky se jedná o biopolymery složené z jednoho nebo více

lineárních polypeptidových řetězců, obsahujících obvykle 100 až 2 000

aminokyselinových zbytků (kódovaných AK)

- není obecná klasifikace; lze je rozdělovat např. podle:

-specifické funkce

-chemického složení

-tvaru a rozpustnosti molekul

-lokalizace v organismu

Funkce

(rozmanité)

-strukturní

-obranná (protilátky)

-transportní

-zásobní

-katalytickou

-regulační

-pohybová (myosin a aktin ve svalových vláknech)

Chemické složení

• Jednoduché

• Složené - polypeptidová + neproteinová část

Složené:

• metaloproteiny

• fosfoproteiny

• glykoproteiny

• lipoproteiny

• nukleoproteiny

DĚLENÍ PODLE TVARU MOLEKULY

-globulární - albuminy (rozp. ve vodě)

- globuliny (rozp. v roztocích solí)

-fibrilární

-membránové

DĚLENÍ PODLE LOKLAIZACE V ORGANISMU

-intracelulární (vnitrobuněčné) a extracelulární (mimobuněčné)

-bílkoviny krevní plasmy (též plasmové, plasmatické nebo sérové

proteiny)

Vznik peptidové vazby

Zjednodušené schema – níže uvedená reakce takto neprobíhá Proč?

CH CNH3

+

R1

OO- CH CNH3

+

R2

OO-OO-+ CHNH

3

+C

R1 O

NH CH

R2

C

Polypeptidový řetězec (peptidy, proteiny)

DNA → RNA → protein → modifikovaný protein

Syntéza proteinů animace: http://www.youtube.com/watch?v=PEDQoQuIhkg

Úrovně struktur

-primární struktura - pořadí zbytků aminokyselinových zbytků v lineárním

polypeptidovém řetězci

-sekundární struktura popisuje prostorové vztahy sousedních nebo blízkých

aminokyselinových zbytků

-terciární struktura - prostorové vztahy vzdálených částí řetězce a tím i celkový

tvar molekuly

-kvarterní struktura popisuje vzájemné uspořádání více polypeptidových

řetězců; řada bílkovin není tvořena jediným řetězcem,

složeným do definované terciární struktury; často jde o

oligomery tvořené jedním nebo několika typy tzv.

podjednotek

Struktury bílkovin

Primární struktura bílkovin

( + kovalentní)

pořadí aminokyselinových zbytků v peptidovém řetězci

(kódováno v DNA)

1. Propojení řetězců kovalentními vazbami

2. Odštěpení částí řetězců

3. Úpravy postranních řetězců aminokyselin

4. Připojení mastných kyselin

5. Glykosylace

6. Fosforylace (dočasné či trvalé)

7. Připojení dalších prosthetických skupin (kofaktory

enzymů...)

8. Metaloproteiny (koordinační kovalentní vazby různé síly)

1 - 3: jednoduché bílkoviny

4 - 8: složené bílkoviny

Kovalentní struktura bílkovin

(primární struktura + posttranslační modifikace)

>gi|307229470|ref|ZP_07515881.1| putative Cerebroside-sulfatase [Escherichia coli TA143] MQKTLMASLIGLAVCTGNAFNPVVAAETKQPNLVIIMADDLGYGDLATYGHQIVKTPNIDRLAQEGVKFTDYYAPAPLSSPSRAGLLTGRMPFRTGIRSWIPTGKDVALGRNELTIANLLKAQGYDTAMMGKLHLNAGGDRTDQPQAKDMGFDYSLVNTAGFVTDATLDNAKERPRFGMVYPTGWLRNGQPTPRSDKMSGEYVSSEVVNWLDNKKDSKPFFLYVAFTEVHSPLASPKKYLDMYSQYMSDYQKQHPDLFYGDWADKPWRGTGEYYANISYLDAQVGKVLDKIKAMGEEDNTIVIFTSDNGPVTREARKVYELNLAGETDGLRGRKDNLWEGGIRVPAIIKYGKHLPKGMVSDTPVYGLDWMPTLANMMNFKLPTDRTFDGESLVPVLENKALKREKPLIFGIDMPFQDDPTDEWAIRDGDWKMIIDRNNKPKYLYNLKTDRFETINQIGKNPDIEKQMYGKFLKYKADIDNDSLMKARGDK PEAVTWG

Lze pohlížet jako na text

URČOVÁNÍ CELKOVÉHO

AMINOKYSELINOVÉHO SLOŽENÍ

AK1-AK2-AK3 ....AKn kyselá nebo bazická hydrolysa AK1 + AK2 + AK3 +....+ AKn

(určit kvalitativní i kvantitativní jednotlivé aminokyseliny -

chromatografické dělení)

Určení N-koncové a C-koncové aminokyseliny

N-koncové:

– Sangerova metoda; reakce s DNF (viz reakce AK)

C-koncové:

-specifické enzymové štěpení (karboxypeptidasy)

-redukce -COOH LiBH4 na -OH, identifikace aminoalkoholu

Určování sekvence – Edmanovo odbourávání

- zbylý polypeptidový řetězec zůstane neporušen (rozdíl proti využití totální hydrolýzy

při Sangerově metodě – jen N-koncová AK); lze tedy opakovat a přímo „číst“ pořadí AK;

princip automatických sekvenátorů – až několik desítek AK

• Určení počtu polypeptidových řetězců v proteinu;

• Rozštěpení disulfidových vazeb mezi řetězci a uvnitř polypeptidových

řetězců;

• Izolace jednotlivých řetězců;

• Vícenásobné specifické štěpení polypeptidových řetězců na kratší

fragmenty;

• Určení pořadí aminokyselin v těchto fragmentech;

• Sestavení primární struktury polypeptidů;

• Určení původního propojení polypeptidových řetězců.

Pozn.

Možnost sekvenování peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie

Určování primární struktury

Určování primární stuktury

1. Nativní struktuře odpovídá minimum Gibbsovy energie, dané

výhodností nekovalentních interakcí.

2. Nativní struktura je zakódována v kovalentní struktuře.

3. Prostorové uspořádání závisí na mnohočetných interakcích

s okolím.

4. Prostorové uspořádání je jistým způsobem hierarchické.

5. Nativní struktura je vždy do jisté míry pohyblivá (konformační

dynamické systémy).

6. Nativní struktura je kooperativní (náhlý denaturační přechod).

Prostorové uspořádání biopolymerů

(obecné znaky)

Stabilizace struktury bílkovin – nekovalentní interakce

Typ interakce

Příklad

*Vazebná energie

(kJ/mol)

vodíkové vazby: voda (led) -O-H...O= 17

„peptidové vazby“ (můstky H…O) =N-H...O=C 15

neutrální a nabitá skupina -COO-...HO-CH2- 15

elektrostatické interakce ion-ion -COO-...+H3N- 20-30

permanentní dipól - permanentní dipól | |

Cd+=Od-...Cd+=Od-

| |

2

Londonovy dispersní interakce mezi dvěma alifatickými

atomy C

0,11

patrové interakce mezi dvěma aromatickými

kruhy Phe

6

hydrofobní interakce

mezi dvěma methylovými

skupinami

1,2

mezi dvěma postranními

řetězci valinu

6

Hydrofobní interakce

- popisuje prostorové uspořádání sousedních nebo blízkých částí polypeptidového řetězce

Sekundární struktura

• konformace polypeptidového řetězce je definována torzními úhly vazby

Cα-N (φ) a vazby Cα- C (ψ) - hodnota těchto úhlů je definována jako 180° v případě, že je řetězec v rovinné, plně rozvinuté konformaci a klesá až k hodnotě –180° (přetočení „na druhou stranu“). Volná rotace je omezena sterickými zábranami mezi atomy vlastní kostry polypeptidového řetězce a sterickou náročností postranních řetězců aminokyselin; rotační úhly mohou tedy nabývat jen určitých hodnot

stereotypní opakování struktury –NH-CHR-CO-

=> tendence k tvorbě periodických prostorových struktur

Základní typy: α-šroubovice

β-struktury

α-šroubovice charakterizovány parametry: výškou závitu,

směrem otáčení (levotočivé a pravotočivé) a počtem

aminokyselinových zbytků nebo počtem atomů na jednu

otáčku šroubovice.

Sekundární struktury bílkovin

V proteinech časo - pravotočivá

šroubovice označovaná jako α-

helix, která je charakterizována

výškou závitu 0,54 nm a 3,6

aminokyselinového zbytku (resp.

11 atomy) na jeden závit

- stabilizován vnitrořetězcovými

vodíkovými můstky, které se

vytvářejí podél osy šroubovice

mezi nad sebou ležícími CO a

NH skupinami.

β-struktura - další časté periodické uspořádání polypeptidového řetězce

-bývá stabilizována propojením s antiparalelně (častěji) či paralelně probíhajícím

polypeptidovým řetězcem stejné konformace, s nímž je spojen maximálním možným

počtem meziřetězcových vodíkových můstků. Tak vznikají struktury zvané β-skládaný list

(angl. β-pleated sheet). Jejich plocha bývá různým způsobem zakřivena (tzv. twisted

sheet) nebo může tvořit válec (tzv. β-barrel)

Antiparalelní β-struktura polypeptidového řetězce

Periodické sekundární struktury – zastoupeny v proteinech různou měrou, od několika

procent až po desítky procent z celkové struktury. Mezi těmito útvary se řetězec otáčí

zpět, někdy až o 180º. Tyto ostré změny směru, umožněné určitými sekvencemi

aminokyselin, bývají označovány jako β-ohyby, (angl. β-bend nebo β-turn), protože

často propojují β-struktury. Jsou tvořeny čtyřmi aminokyselinovými zbytky, často se v

nich vyskytuje prolin a glycin. Jsou charakteristické pro globulární bílkoviny, zajišťují

jejich sférický tvar.

Supersekundární struktury např.: Zn-prst, Leu Zip

Alfa helixy v hemoglobinu

Terciární struktura proteinů

-popisuje uspořádání celého polypeptidového řetězce a

tedy i celkový tvar molekuly.

Terciární struktura myoglobinu

Kvarterní struktura

Příklady bílkovin s kvarterní strukturou

Bílkovina Rel.mol.hm.

oligomeru

Počet podjednotek Charakter, funkce

hemoglobin (lidský) 64 500 4 2 + 2 podjednotky dvou typů (a2b2 tetramer),

přenos kyslíku

α-amylasa (lidská) 97 600 2 identické podjednotky, enzym (hydrolytické

štěpení škrobu)

alkoholdehydrogenasa

(kvasinky)

150 000 4 identické podj., enzym (katalysuje redukci

acetaldehydu na ethanol)

ferritin (lidský) 480 000 20 skladování železitých iontů (až 4300 Fe3+)

glutaminsynthetasa

(E.coli)

592 000 12 enzym (synthesa Gln z Glu), kulovité

identické podj. tvoří 2 šestiúhelníky umístěné

nad sebou

pyruvátdekarboxylasa

(E.coli)

4 400 000 72 enzymový komplex, podjednotky 3 typů,

každá katalysuje jednu dílčí reakci (odd. 9.2)

hemocyanin (plži) 8 000 000 160 metalloprotein obsahující Cu2+; přenos O2;

dutý válec 40x40 nm

virus tabákové mozaiky 39 300 000 2130 helikálně uspořádané identické podj. (Mr 17

500) tvořící komplex s RNA

Svinování proteinů (folding)

- neprobíhá náhodným způsobem

- probíhá postupně

- při skládání některých proteinů, zejména bílkovin s

kvarterní strukturou, asistují v buňkách bílkoviny

označované jako chaperony

a) malé dočasné periodické struktury

b) supersekundární struktury

c) strukturní domény a "roztavená" glubule

d) závěrečné úpravy za účasti enzymů

Vlastnosti proteinů

• Nábojové vlastnosti

• Rozpustnost - v závislosti na pH, iontové síle

• Denaturace - ztráta nativní konformace

• Kooperativita (denaturační přechod)

•Optické

Rozpustnost proteinů - v závislosti iontové síle

Kooperativita -důsledky pro vlastnosti biopolymerů

Molekula reaguje na podněty z vnějšího prostředí jako celek; to znamená, že

konformační impuls, vyvolaný v jedné části molekuly, může vyvolat celý řetězec

následků, jež končí konformační změnou v jiné, prostorově vzdálené části molekuly

Sigmoidní charakter - náhlý přechod mezi nativním a denaturovaným stavem je

důsledkem kooperativity nativní struktury

-př. fosforylace enzymů

Absorpce UV záření:

-peptidová vazba (200 – 220 nm)

-aromatické (především Tyr a Trp) u 280 nm ( pro srov. DNA cca 260 nm)

OPTICKÉ VLASTNOSTI

Abs. spektra lidského sérového albuminu (1), lidského imunoglobulinu G (2) a DNA (3) v

ultrafialové oblasti. Koncentrace obou bílkovin je 1 mg/ml, koncentrace DNA 0,1 mg/ml

Keratiny (ř. keras roh) - významná skupina fibrilárních bílkovin; podílejí se na

výstavbě intermediárních filament cytoskeletu vlasů, chlupů, nehtů, rohů a

peří; nerozpustné ve vodě a odolné vůči fyzikálním i chemickým vlivům.

Hlavní skupina - α-keratiny - struktura je tvořena α -helixem; dvě tyto

šroubovice se pak stáčejí do levotočivého „kabelu“ (tzv. coiled-coil), jejichž

dvojice vytváří protofilamentum a osmice intermediární filamentum cytoskeletu

Vztah struktury a funkce vybraných proteinů

Imunoglobuliny (Ig) - globulární glykoproteiny krevního séra. Molekula

připomíná tvarem písmeno Y; na jeho horních ramenech jsou lokalizovány

oblasti, které nekovalentně váží antigeny; pro svojí velkou strukturní různorodost

se označují jako variabilní.

Svalové kontrakce - aktin, myosin a tropomyosin

Membránové proteiny

Hemoglobin

Kovalentní modifikace proteinů

aneb translací to nekončí

DNA → RNA → protein → modifikovaný protein

Mají modifikace podstatný význam pro funkci proteinů?

Ano. Nejedná se jen o „kosmetické“ změny

Známo více než 200 typů kovalentních modifikací (in vivo)

translací to nekončí

Čím jsou determinovány možné kovalentní

modifikace?

typem, pořadím a prostorovou lokalizací

aminokyselinových zbytků

aparátem enzymů realizujících modifikace

KOVALENTNÍ

MODIFIKACE (enzymové i neenzymové)

IN VIVO

IN VITRO

NEVRATNÉ

VRATNÉ

PŘIROZENÉ

UMĚLÉ

IN VITRO

VRATNÉ

1. Posttranslační modifikace

role v řadě různých buněčných procesů

svinování proteinů

stabilizace prostorové struktury proteinů

lokalizace proteinů v buňce

přenos signálu

exprese genů

regulace aktivity enzymů

mezibuněčné interakce

Příklady posttranslačních modifikací

Fosforylace vratná modifikace (kinasy / fosfatasy)

obvykle na –OH skupinách zbytků serinu,

threoninu, tyrosinu

významný regulační prvek:

aktivita řady enzymů aktivita glykogen fosforylasy je regulována

fosforylací na zbytku serinu v pozici 14

regulace transkripce

role při přenosu signálu

Regulace transkripce fosforylací

CREB (cAMP - responsive element binding protein) –

transkripční faktor

fosforylace na serin 133 → asociace s CBP; (CREB binding protein)

→ CREB –CBP komplex aktivuje CREB

dependentní transkripci mj. i remodelací

chromatinu acetylací histonů

Glykosylace

připojení sacharidů na proteiny - typické pro extracelulární a membránové proteiny

role glykosylace:

často nutná pro správné svinutí proteinu

stabilizace proteinu

regulace

rozpoznávání

molekulové

mezibuněčné

obrovská variabilita – řada míst glykosylace a každé z nich může být glykosylováno mnoha způsoby

Místa připojení sacharidů na protein

(N) přes asparagin; endoplasmatické retikulum (kotranslační); proteiny krevní plasmy, imunoglobuliny, řada enzymů

(O) přes serin /threonin; Golgi aparát; muciny, kolageny

(C) (přes tryptofan)

(P) (fosfothreonin, fosfoserin)

Mechanismus glykosylace na asparagin

dolichol

Regulace transkripce glykosylací

glykosylace CREBu „brzda“ transkripce - působí opačně než

fosforylace

modifikován serin a threonin

N- acetylglukosaminem

Lipidace - usnadňuje připojení proteinů na membrány, vzájemné

interakce proteinů

Prenylace - připojení farnesyl, dolichol nebo

geranylgeranyl zbytků; farnesylace u některých G proteinů

Acylace – připojení mastných kyselin (myristová, palmitová) přes ester, thioester nebo amid; rhodopsin palmitoylovaný na zbytku cysteinu

farnesylace

Modifikace proteinu jiným proteinem

- proteiny mohou být navázány (např. přes svůj C-konec) ke zbytkům

lysinu jiného proteinu

Ubiquitinylace - nejznámější modifikací tohoto typu

signál pro degradaci proteinu (např. chybně svinutý protein)

SUMOylace (SUMO: Small Ubiquitin-like Modifier) - role v

řadě buněčných procesů: transport mezi jádrem a cytosolem,

regulace transkripce, apoptosa, stabilizace proteinu, odpověď

na stres

Acetylace - obvyklá na N – koncích některých proteinů nebo zbytcích lysinu; N-terminální serin histonu H4 acetylován

Hydroxylace - konverze prolinu na hydroxyprolin v kolagenu katalyzovaná prolyl-4-hydroxylasou

Jodace - thyroglobulin jodován (na Tyr) při syntéze thyroxinu

Karboxylace - karboxylace prothrombinu (srážení krve) na zbytek Glu (účast vitaminu K)

Methylace - methylací mohou být modifikovány například histony; lysine 20 histonu H4 může být mono- nebo di- methylován

methylace

acetylace

Nukleotidylace - připojení mononukleotidu reguluje aktivitu některých

enzymů; utilizace dusíku v E. coli: glutamin synthetasa specificky

adenylována (kovalentní připojení AMP) na zbytku tyrosinu; adenylovaná

forma je inaktivní; stupeň adenylace je řízen regulačním proteinem PII

schopnost proteinu PII regulovat adenylaci glutamin synthetasy je

řízena jeho uridinylací (kovalentní připojení UMP) na zbytku

Sulfatace – různé typy (O-, S-, N-); na Tyr (protein – protein interakce)

Připojení prostetických skupin - hem (globin a cytochrom), FAD, biotin

Vytvoření disulfidových vazeb - typické pro extracelulární proteiny; formace disulfidových můstků - po

svinutí proteinu do (téměř) finální podoby

Aktivace zymogenů - odštěpením sekvence, která kryje jejich aktivní centrum - proteasy

(chymotrypsin, trypsin, trombin)

2. Enzymová modifikace (in vitro)

Defosforylace kaseinů ve zrajících

sýrech (fosfatasa)

vliv na štěpení a následně chuťové

vlastnosti sýrů; vstřebávání

vápníku

možnost ovlivnění procesu

(přídavek fosfatasy)

3. Neenzymové modifikace (in vivo i in

vitro)

Oxidativní poškození

působením volných radikálů ROS (reactive oxygen species)

vodíku (H2O2), peroxid vodíku, hydroxyl etc.; mohou vznikat produkty buněčného metabolismu např. superoxid z mitochondrie 2 O2

−. oxid dusnatý (NO), peroxonitrát (NO3

− ; vznik: H2O2 + NO2− → ONOO− + H2O),

oxidace methioninu (in vivo i in vitro) možnost enzymové opravy neenzymové modifikace

enzymem methioninsulfoxidreductasou - konverze

oxidovaných zbytků zpět na methionin

chlorotyrosin, nitrotyrosin a bityrosin v lipoproteinech artherosklerotického plaku

oxidace methioninu

Glykace

navázání molekuly cukru (např. glukosy nebo

fruktosy) na molekulu proteinu (in vitro i in vivo) na rozdíl od glykosylace není katalyzována enzymově

Příklady: in vitro - při tepelné úpravě pokrmů (při vyšších teplotách)

obsahujících jak proteiny, tak sacharidy

in vivo - glykace hemoglobinu - valin na N-konci; diagnostická aplikace

Kvantifikace proteinů s využitím kovalentních značek

ICAT (Isotope Coded Afinity Tags), kvantifikace/studium Cys

iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification)

Kovalentní imobilizace enzymů

možnost opakovaného použití

stabilizace enzymu

vyloučení kontaminace enzymem příp. jeho

autokatalytickými produkty (proteasy)

4. Umělé modifikace proteinů

Eupergit C

kopolymer vážící proteiny

přes oxiranové skupiny

reakcí s -NH2 s volnými

skupinami zbytků lysinu

více bodové kovalentní

připojení → stabilizace

vysoká stabilita při pH 1 až

12

penicilin amidasa na

Eupergitu C - 60% původní

aktivity po 800 cyklech

Význam kovalentních modifikací proteinů

pro funkci živých organismů (setkání s medvědem)

v potravinářství (výroba sýrů)

biotechnologie (kovalentní imobilizace enzymů)

diagnostické metody v medicíně (glykace)

proteomika (kvantifikace proteinů)