producción de proteínas recombinantes
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA
QUÍMICA FARMACEUTICO BIOLÓGICA BIOSINTESÍS Y BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Canchola Carrillo Eileen
Muñoz Herrera David
Nava Pintor Edgar Ezequiel
Ocampo Olvera Silvestre Alfredo Semestre 2014/2
Torres Torres Edna Yuzi 30 de Abril del 2014
.
INTRODUCCIÓN
Hormonas, interferones y
diversas enzimas
Técnicas de DNA recombinante Significaron una revolución en la producción de este tipo de compuestos. Permite alterar los genes y expresarlos de tal manera que se pueden obtener proteínas con propiedades funcionales mejoradas o corregir defectos genéticos
•Vector de expresión, un plásmido q contiene secuencias de control de trascripción y traducción en posiciones adecuadas. •Proteínas de eucariontes. El DNA recombinante con la secuencia que codifica la proteína también presenta las secuencias.
MARCO HISTÓRICO
• Biotecnología Aplicación de los principios de la ciencia e ingeniería al procesamiento de materiales por agentes biológicos. La definición actual se refiere también a los productos.
El consumo de la bebida aumentó
al transcurrir los siglos; se tuvieron
que desarrollar métodos que
permitieran obtener grandes
volúmenes.
RECOMBINACIÓN NATURAL Conjugación
Transducción
Transformación
MUTAGÉNESIS Herramienta para el mejoramiento de cepas.
MUTACIÓN Es un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos del DNA.
Puede o no producir un cambio observable en el individuo.
Se presenta súbita y espontáneamente.
10-10 mutaciones por generación por gen
MUTÁGENOS FÍSICOS
• Mutaciones puntuales
• Dímeros de Timina
• Roturas cromosómicas
• Radiación UV
• Rayos γ
• Rayos X
MUTÁGENOS QUÍMICOS
Ácido Nitroso
Agentes alquilantes
Sustancias análogas a las bases nitrogenadas
Sustancias intercalantes
MUTAGÉNESIS INDUCIDA
Someter a los microorganismos a repetidas rondas de Mutagénesis, seguido de una detección y selección apropiadas de los sobrevivientes, ha sido una herramienta muy efectiva en el mejoramiento de muchos microorganismos utilizados industrialmente.
INGENIERÍA GENÉTICA DE MICROORGANISMOS Producción de proteínas en bacterias.
• La tecnología de DNA recombinante ha permitido que
secuencias específicas de ADN sean transferidas de un
organismo a otro.
• Esto puede ser utilizado para incrementar el rendimiento de un
producto mediante la remoción de los cuellos de botella en las
rutas metabólicas y amplificando o modificando pasos
específicos en la ruta metabólica.
• Dado que no hay restricción para el origen de los genes que
expresa un microorganismo, la producción de proteínas de
origen animal y vegetal se ha hecho posible
• La Ingeniería Genética implica la manipulación del DNA
fuera de la célula.
1. Aislamiento y recuperación del gen de interés.
• Regulación de su expresión.
2. 3. Inserción del DNA en la célula huésped mediante un
vector de fácil manipulación.
4. Reproducción.
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN BACTERIAS
Uso de vectores para la inserción del DNA
Usualmente resulta necesario insertar un gen exógeno en un
vector que se replica autónomamente en el microorganismo
hospedero y actúa como un transportador del segmento de
DNA exógeno insertado.
PLÁSMIDOS
• Características
• Origen de replicación
• Gen de resistencia a
antibióticos
• Comúnmente el DNA
exógeno y el plásmido
son cortados con la
misma enzima de
restricción.
• El plásmido recombinante
se introduce por
Transformación
La introducción de plásmidos recombinantes por Transformación se
puede lograr con un tratamiento de Cloruro de Calcio, lo cual somete a
la membrana celular haciéndola más permeable al DNA exógeno.
VECTORES DE FAGO Λ
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Detección y Selección de clones Recombinantes
PCR y Bases de Datos
Expresión de los Genes clonados
Recuperación y Purificación de Proteínas
• Método de hibridación.
• Método fenotípico
• Método inmunológico
Colonias con defectos nutricionales
Métodos Genéticos
BASES DE DATOS
EXPRESIÓN DE LOS GENES INSERTADOS.
ALTOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNA
• Factores genéticos.
Características del gen, estabilidad del ARNm, Promotor empleado, cepa utilizada
• Factores fisiológicos.
Componentes del medio de cultivo, estrategias de cultivo, parámetro en el fermentador.
RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
• Acumulación de proteína en citoplasma
*Lisis de la célula
*Puede ocurrir la formación de cuerpos de inclusión.
• Acumulación de proteínas en el espacio periplasmático.
*Choque osmótico
*Separar por centrifugación
O filtración.
** remoción de ácido nucleicos
mediante agentes policatiónicos
*** precipitación de la proteína
con sale s o resinas de integración
hidrofóbica
**** purificación final por métodos
cromatográficos.
PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA EN E. coli
PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA (RENNINA)
• Es la proteasa (Aspartil-proteasa) que se produce en una mayor proporción en el cuarto estómago de los rumiantes lactantes.
RENNINA
• Se libera como PREPROQUIMOSINA
PRE 16 aa PRO 27 aa QUIMOSINA
PRO 27 aa QUIMOSINA
QUIMOSINA
¿QUÉ HACE LA RENNINA?
• Coagula la leche por la hidrólisis de k-caseina
PROBLEMA
¿Solución? Rennina producida por hongos como Mucor o Endothia
PRO 27 aa QUIMOSINA
Rennina recombinante
QUIMOSINA RECOMBINANTE
• Fusión al extremo N-terminal de LacZ o TrpE
• La secuencia de la proquimosina se insertó nmediatamente después del RBS y el codón ATG
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS EN LEVADURAS
GENOMA NUCLEAR S. CEREVISIAE
Distribución genoma S. cerevisiae Comparación en tamaño de genomas
GENOMA NO NUCLEAR
YAC’S “YEAST ARTIFICIAL CHROMOSOMES”
Centromérico Episomal (Lanzadera)
MEJORA EXPRESIÓN GENÉTICA
Acetilación
Otras
• Glicosilación
• Insertar genes de glicosilación humanos
• Deleción de genes de glicosilación
• Cadena de oligohistidina
CEPA E. COLI K12 JA 198, VECTOR PBR322, GEN PROQUIMOSINA ERAN 3 SEGMENTOS SE INSERTAN EN EL VECTOR Y SE DEJA LA CEPA CON EL
VECTOR EN MEDIO PARA FORMAR CUERPOS DE INCLUSIÓN.
PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B
POR LEVADURAS
VACUNA DE LA HEPATITIS B Antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg)
9 RESIDUOS DE G
3 RESIDUOS DE G
GLUCOSILACION, PLEGAMIENTO Y ACETILACIÓN DE HBSAG
Humano
• N-Glucosilado
• Exportado hacia la membrana vía Golgi
• Plegamiento en partículas de 22 nm
• Acetilado
Levadura
• No glucosilado
• Se acumula en el citoplasma
• Plegamiento en partículas de 22 nm
• Una fracción se acetila
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
Uso Terapeútico
PROTEÍNAS RECOMBINANTES: USO
TERAPÉUTICO •Factor de necrosis tisular-α
Anticuerpos
•Interferones, Interleucinas , TNF Cáncer y infecciones virales
•Eritropoyetina, Hirudin, Uroquinsa, Activador de plasminógeno tisular
Enfermedades cardiovasculares
•Insulina, Hormona del crecimiento Hormonas
•Endorfinas, Neuropéptidos Enfermedades Neurológicas
•Hepatitis-B Vacunas
•Factor de crecimiento epidermico, de fibroblastos y factor VIII de la coagulación
Cicatrizantes y factores de coagulación
DNASAS: FIBROSIS QUÍSTICA
DNasas 260 aa (Pulmozyme®, FDA 1996)
Viscosidad
del moco
ERITROPOYETINA
EPOGEN® 1989
SOMATOTROPINA (HGH)
hGH
191 aa
Cadáveres Bovino o porcino
Recombinante
(E. coli)
SOMATOTROPINA
192 aa N-formilmetionina
N-formilmetionil-Hgh PROTROPIN® 1985
INSULINA
• Primera proteína recombinante de uso farmacéutico.
E. Coli
o S. cerevisiae
Cadena A Cadena B
Insulina
Humulin® , FDA 1981
INTERFERÓN
IFN-α IFN-β
IFN-γ
• Hepatitis C
• Cáncer renal
• Leucemias
• Mieloma • Esclerosis múltiple
• Leucemia
• Cáncer renal
INTERFERÓN
INTERLEUCINAS
IL-2
(PROLEUKIN®, FDA 1992)
Carcinoma renal
FACTOR ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TISULAR
(TPA)
tPA (Serín proteasa)
Plasminógeno Plasmina Disolución del
coágulo
COLÁGENO
Pichia augusta
Pichia pastoris
Colágeno tipos I y III
REFERENCIAS
• Lauersen, K. J.; Berger, H.; Mussgnug, J. H.; Kruse, O. Efficient recombinant protein production and secretion from nuclear transgenes in Chlamydomonas reinhardtii . Journal of Biotechnology 167 (2013) 101-110.
• Singer, M; Berg, P. Genes y Genomas. Una perspectiva cambiante. 1993, 1a edición, Ediciones Omega, S.A, Barcelona, España. pp 227-229.
• Klug, W. S; Cummings, M.R. Conceptos de Genética. 1999, 5a edición, Prentice Hall, México. pp 453- 454 y 504.
• Glazer, AN. Nakaido, Hiroshi.(2007) Microbial Biotechnology. Fundamentals of applied microbiology. 2da Edición. Cambridge University Press. Cambridge, UK. p. 90-143.
REFERENCIAS
• Waites, MJ. (2001) Industrial Microbiology: An Introduction. Blackwell Science. London, UK. p. 80-84. 173-177.
• Mellor, J., M. J. Dobson, N. A. Roberts, M. F. Tuite, J. S. Emtage, S. White, P. A. Patel, A. J. Kingsman and S. M. Kingsman. 1983. Efficient synthesis of enzymatically active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae. GENE 24: 1-14
• J. M. Cregg1, ,†, J. F. Tschopp1, C. Stillman1, R. Siegel1,High–Level Expression and Efficient Assembly of Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic Yeast, Pichia Pastoris, Nature Biotechnology 5, 479 - 485 (1987) doi:10.1038/nbt0587-479
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