prof. vinicius campos. seqüenciamento 2 principais fases 1) produção de moléculas - bibliotecas...
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Prof. Vinicius Campos
Seqüenciamento
2 principais fases
1) produção de moléculas
- bibliotecas de gDNA, cDNA, etc.
2) seqüenciamento propriamente dito
- Sanger
Introdução
Maior velocidade Maior eficiência Menor custo
Ferramentas de seqüenciamento buscam:
Tecnologias de sequenciamento
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas)
- Pirosequenciamento
-Nature 437 (2005), 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)
Revolução...
2005 454 sequencing “Massively parallel amplification”
pyrosequencing EmPCR – “Emulsion PCR”
Inovações Comerciais
Roche 454
Princípios do Pirossequenciamento
Princípios do Pirossequenciamento
Princípios do Pirossequenciamento
Princípios do Pirossequenciamento
e.g. N at position 1
Fluorescence-labeled decoder for nucleotide
Fluorescence-labeled decoder for nucleotide
Fluorescence-labeled decoder for nucleotide
Fluorescence-labeled decoder for nucleotide
G
A
T
C
Call for base at position 1G
Princípios do Pirossequenciamento
Visão da Placa de pirossequenciamento pelo equipamento
(75,179)
(188,358)
(75,179)
(188,358)
G
G
1
(75,179)
(188,358)
(75,179)
(188,358)
G A
G A
1 2
(75,179)
(188,358)
(75,179)
(188,358)
G A T
G A T
1 2 3
(75,179)
(188,358)
(75,179)
(188,358)
G A T C
G A T C
1 2 3 4
(75,179)
(188,358)
(75,179)
(188,358)
G A T C
G A T C
1 2 3 4
T
G
5
(75,179)
(188,358)
HUMFTE1A
HSRNPA1
G A T C
G A T C
1 2 3 4
T T A C C C G T G A C A A A T
G T G A C G C T G A A T A A T
5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20
A
A
Sequencia de uma bead específica
G A T C C C A G T G A A T C C T G G G T
Signature
GATCTGCATTCGGTAACAGG 1
2 GATCTTTGTCAACCAAAACA 2
3 GATCCCTGTGAAGACCCAGG 113
4 GATCTTTCCTCCTGGTTACT 16
5 GATCCAGTCAAGGAGAAAGA 36 GATCTGATAGTCCTGAAAAC 22
7 GATCATGGTGATGTACGGGG 1
8 GATCCAGTGCTATTCTGTCA 38
9 GATCAATCCCTCAAGATTTT 312
.
.
23,685 GATCACCATCCCAGTCACCT 2,588
856,567
# of Beads
1
Vantagens
Maior rapidez no sequenciamento Sequenciamento simultâneo
Menor custo
Menos erros na leitura
Novas possibilidades Aprofundar regulação genoma Acompanhar resistência viral e bacteriana em
tempo real Ter acesso a novos genes Entender a terapêutica gênica Integrar informações biológicas com questões de
saúde e doença Avaliação genômica personalizada Avanços ainda inimagináveis
Aplicações comerciais atuais...
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