purificaciÓn e inmovilizaciÓn de lipasas mediante … · purificacion industrial de enzimas ......
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PURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN DE LIPASASPURIFICACIÓN E INMOVILIZACIÓN DE LIPASASMEDIANTE SU ADSORCIÓN ESPECÍFICA MEDIANTE SU ADSORCIÓN ESPECÍFICA
A LIPASAS INMOVILIZADASA LIPASAS INMOVILIZADAS
Ortiz, C.;Palomo, Ortiz, C.;Palomo, J.MJ.M .;Fernández.;Fernández––Lorente, G.; Fuentes, M.; Lorente, G.; Fuentes, M.; Torres, RTorres, R; ; Guisán, J.M.;FernándezGuisán, J.M.;Fernández--Lafuente, R.Lafuente, R.
LABORATORIO DE BIOCATÁLISISLABORATORIO DE BIOCATÁLISISINSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICAINSTITUTO DE CATÁLISIS Y PETROLEOQUÍMICA--CSICCSIC
PURIFICACION DE ENZIMASPurificación de EnzimasPurificación de Enzimas
Alta actividad volumétricaAlta actividad volumétrica
EE11
R CO
NH
R' COO R''
EE22 EE33
ReacciónReaccióna evitara evitar
ReacciónReaccióna evitara evitarReacciónReacción
deseadadeseada
Reacciones indeseablesReacciones indeseables
Oxidaciones…Oxidaciones…Hidrólisis…Hidrólisis…
Purificación de EnzimasPurificación de Enzimas
PURIFICACION DE ENZIMAS A ESCALA LABORATORIO
UV280
Ve
Adsorción de todas las enzimas (1mg de nuestra enzima/Adsorción de todas las enzimas (1mg de nuestra enzima/mlml))Desorción selectiva de nuestra enzimaDesorción selectiva de nuestra enzimaVarios procesos cromatográficos…Varios procesos cromatográficos…No importa tiempo ni dineroNo importa tiempo ni dinero
PURIFICACION INDUSTRIAL DE ENZIMASPurificación de EnzimasPurificación de Enzimas
Métodos sencillos, rápidos y baratosMétodos sencillos, rápidos y baratosPocos pasos cromatográficosPocos pasos cromatográficosColumnas cromatograficas pequeñasColumnas cromatograficas pequeñas
UV280
Ve
Adsorción selectiva Adsorción selectiva 100 mg/ml columna100 mg/ml columnaConocer mucho mejor los mecanismos de interacciConocer mucho mejor los mecanismos de interaccióónn
Activación interfacial en presencia de interfases
Purificación de LipasasPurificación de Lipasas
Conformación cerrada
Cara Cara externaexterna del Liddel Lid
Conformación abierta
LIPASAS
Interfase hidrofóbica
Conformación abierta
SitioSitio activoactivo
Cara Cara internainterna del Liddel Lidzonazona hidrofóbicahidrofóbicazonazona hidrofílicahidrofílica
LipasasLipasas
LIPASAS
Diferentes conformaciones de lipasas
INACCESIBLE A SUSTRATOSINACCESIBLE A SUSTRATOS
Medios acuosos Medios acuosos Conformación cerradaConformación cerrada
ACCESIBLE A SUSTRATOS ACCESIBLE A SUSTRATOS
Interfases hidrofóbicasInterfases hidrofóbicasConformación abiertaConformación abierta
LipasasLipasas
LIPASAS
Las lipasas muestran actividad esterásica en ausencia de interfases
zonazona hidrofóbicahidrofóbicazonazona hidrofílicahidrofílica
HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones de lipasas en medios acuosos homogéneos
Purificación de LipasasPurificación de Lipasas
LIPASAS Adsorción interfacial sobre soportes a baja fuerza iónica
Soporte Hidrofóbico
Conformación cerrada
Conformación abierta
Pequeños bolsillo hidrofóbicos…Pequeños bolsillo hidrofóbicos…
Solo se absorben a Solo se absorben a Fuerza IFuerza Ióónicanica
PURIFICACION DE LIPASAS POR ADSORCION SELECTIVA, A BAJA FUERZA IONICA, SOBRE A SOPORTES HIDROFOBICOS
Purificación de LipasasPurificación de Lipasas
0
500
1000
1500
2000
0 30 60 90Tiempo (minutos)
Act
ividad
Res
idua
l (%
)
HLL
0
200
400
600
800
0 20 40 60Tiempo (minutos)
Act
ividad
Res
idua
l (%
)
PFL
0
200
400
600
800
0 30 60 90
Tiempo (minutos)
Act
ivid
ad R
esid
ual (
%)
RNL
Mecanismo de activación interfacial yPurificación de lipasas
Purificación de LipasasPurificación de Lipasas
Las Las lipasaslipasas se se adsorbenadsorben específicamenteespecíficamente a superficies a superficies hidrofóbicas (a hidrofóbicas (a bajabaja fuerzafuerza iónicaiónica))
CadaCada lipasalipasa se se adsorbeadsorbe de de unauna forma forma diferentediferente a a soportessoportes hidrofóbicos hidrofóbicos diferentesdiferentes
AumentoAumento de de actividadactividad haciahacia sustratossustratos solublessolubles pequeñospequeños y y alteraciónalteración de de susu enantioselectividadenantioselectividad
Purificación de lipasas de otras proteínas(Adsorción selectiva sobre matrices hidrofóbicas)
Purificación de lipasas entre sí(Desorción selectiva con detergentes o co-disolventes)
LipasasLipasas
LIPASAS
Las lipasas muestran actividad esterásica en ausencia de interfases
zonazona hidrofóbicahidrofóbicazonazona hidrofílicahidrofílica
HIPÓTESIS: Equilibrio entre las distintas conformaciones de lipasas en medios acuosos homogéneos
Purificación de LipasasPurificación de Lipasas
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
Lipasa1 Inmovilizada Lipasa2 Soluble
Dimero Lipasa Inmovilizada- Lipasa
LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS LA REACCION INICIAL ENTRE ENZIMAS Y SOPORTES GLIOXILY SOPORTES GLIOXIL
pH 8.0 (NO)pH 8.0 (NO)
NHNH22
pH 10.0 (SI)pH 10.0 (SI)
NHNH22
HH22NN
HH22NN
HH22NN
HH22NN
pH 10.0 (NO)pH 10.0 (NO)
NHNH22
HH22NN
HH22NN
HH22NN
HH22NN
Regiones muy ricasRegiones muy ricasen grupos aminosen grupos aminos
Desarrollo del Soporte Desarrollo del Soporte
Desarrollo del SoporteDesarrollo del Soporte
PUNTO FINAL DE LA MULTIPUNTO FINAL DE LA MULTI--INTERACCION ENZIMAINTERACCION ENZIMA--SOPORTESOPORTE
NaBH4
1mg/ml
O CH2 C
O
H
O CH2 C
O
H
NO CH2 CH
NO CH2 CH
NO CH2 CH NHO CH2 CH2
O CH2 CH2OH
NHO CH2 CH2
NHO CH2 CH2
O CH2 CH2OH
Metodología ExperimentalMetodología Experimental
Selección de la enzima adsorbente
CARA FRONTALCARA FRONTAL CARA OPUESTACARA OPUESTA
LYS
LYS
LYS
LYSLYS
LIPASA DE LIPASA DE PseudomonasPseudomonas fluorescensfluorescens (PFL)(PFL)
lipasa estable y capaz de formar dímeroslipasa con las lisinas en la cara opuesta a su centro activo
Metodología ExperimentalMetodología Experimental
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
Glioxil-Agarosa-lipasa 1-Lipasa 2GlioxilGlioxil--AgarosaAgarosa--lipasa 1lipasa 1
(Soporte)(Soporte)
Lavado con Lavado con aguaagua
Lipasa 1 estabilizadaLipasa 1 estabilizadaSoporte inerteSoporte inerteGlioxilGlioxil--agarosaagarosa
H
O
H
O
H
O
Tritón XTritón X--100100
H2N
H2N
H2N
(pH 10, NaBH4))
LipasaLipasa--SolubleSoluble
ResultadosResultados
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
SDS-PAGEde PFL purificada
20.120.1
94946767
3030
4343
11 3322
Línea 1. Marcadores de peso molecular1. Marcadores de peso molecularLínea 2. Extracto comercial de PFLLínea 2. Extracto comercial de PFLLínea 3. PFL adsorbida sobre Línea 3. PFL adsorbida sobre glioxil agarosaglioxil agarosa--PFLPFL
Inmovilización de PFL sobre glioxil-agarosa
BlancoBlancoSobrenadanteSobrenadanteSuspensiónSuspensión
0
20
40
60
80
100
0 6 12 18 24Tiempo (h)
Act
ivid
ad R
esid
ual (
%)
Adsorción de PFLsobre glioxil-agarosa-PFL
BlancoBlancoSobrenadanteSobrenadante
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4Tiempo (h)
Act
ivid
ad R
esid
ual (
%)
ResultadosResultados
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
B
94
67
43
30
Mr (kDa)
20.1
1 2 3
Línea 1. Marcadores de peso molecularLínea 1. Marcadores de peso molecularLínea 2. Extracto comercial BTLLínea 2. Extracto comercial BTLLínea 3. Fracción BTL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 3. Fracción BTL adsorbida a glioxil agarosa PFL
A
0
25
50
75
100
0 20 40 60
Tiempo (min)
Act
ivid
ad R
esid
ual (
%)
Adsorción de BTLsobre glioxil-agarosa-PFL
BlancoBlancoSobrenadanteSobrenadante
Adsorción del extracto enzimático de Bacillus thermocatenulatus (BTL)
ResultadosResultados
Purificación de lipasas por interacción lipasa-lipasa
Línea 1. Marcadores de peso molecularLínea 1. Marcadores de peso molecularLínea 2. Extracto comercial RMLLínea 2. Extracto comercial RMLLínea 3. Fracción RML adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 3. Fracción RML adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 4. Extracto comercial HLLLínea 4. Extracto comercial HLLLínea 5. Fracción HLL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 5. Fracción HLL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 6. Extracto comercial ROLLínea 6. Extracto comercial ROLLínea 7. Fracción ROL adsorbida a glioxil agarosa PFLLínea 7. Fracción ROL adsorbida a glioxil agarosa PFL
9494
6767
4343
3030
MrMr ((kDakDa))
20.120.1
11 22 33 44 55 66 77
Lipasas purificadas a partir de los extractos comerciales de Lipasas purificadas a partir de los extractos comerciales de ••RhizomucorRhizomucor mieheimiehei (RML)(RML)••HumicolaHumicola lanuginosalanuginosa (HLL)(HLL)••RhizopusRhizopus oryzaeoryzae (ROL)(ROL)
ResultadosResultados
Desarrollo de Biocatalizador de lipasa 2 Inmovilizada sobreSoporte glioxil-agarosa-lipasa1
Glioxil-Agarosa-lipasa 1
SerSer
(D(D--pNPpNP))
Glioxil-Agarosa- Lipasa 1-Lipasa 2
Lipasa 2Lipasa 2
Modulación de las propiedades funcionales de lipasas mediante interacción lipasa-lipasa
ResultadosResultados
Modulación de las propiedades funcionales de lipasas mediante interacción lipasa-lipasa
DerivadoPFL
ActividadEspecífica
(U/g)
Conversión(%)
ee E
Octil-agarosa-PFL 23 14.6 97 76 SGlioxil-agarosa-PFL 0.019 15 81 9.6 S
Glioxil-agarosa-PFL*-PFL 0.077 9.4 99 >100 S
Hidrólisis enantioselectiva del (R,S) HPBEt 10 mMcon derivados de PFL, a pH 5 y 25 ºC
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
CONCLUSIONES
La lipasa de Pseudomonas fluorescens inmovilizada covalentemente sobre soportes glioxil-agarosa resultó ser un excelente soportehidrofóbico para la adsorción selectiva de otras lipasas.
Es posible obtener dímeros glioxil-agarosa-PFL-Lipasa, pudiéndose utilizar este método como estrategia de purificación e inmovilización de diferentes extractos crudos de lipasas.
Diferentes derivados de una misma lipasa presentaron distintaspropiedades catalíticas (Actividad y Enantioselectividad) en lasmismas condiciones de reacción.
MUCHAS GRACIASMUCHAS GRACIAS
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