random amplified polymorphic dna (rasgele cogaltilmis polimorfik dna) rapd

Random Amplified Polymorphic DNA

(Rasgele Cogaltilmis Polimorfik DNA)

RAPDBekir Col, Ph. D.

Mugla UniversitesiMugla Universitesi

Mart 2007. Molekuler Entomoloji Kurs Notlari

Tarihsel Perspektif• Karl Mullins’in PCR i kesfetmesinden sonra, kisa primerlerin genom

DNAsinda birkac yere baglanabilecegi fark edildi.

• 1990 Williams ve ark. RAPD teknigini gelistirdi. Bu teknik ile 10 nukleotidlik primerler ve kalip DNA kullanilarak rasgale PCR urunleri elde edilebiliyordu .

• RAPD fragmenleri ayirt edilerek, genetik markorler olarak kullanilabildi. Sonradan buna Molekuler Markorler dendi. (bir cesit DNA parmak izi!)

• RAPD teknigine yakin teknikler:– DNA Amplification Fingerprinting (DAF) - Caetano-Anolles et al. (1991) 8

nt buyuklugunde primerler kullandi– Arbitrary Primed PCR (AP-PCR) - Welsh and McClelland (1990) daha

buyukce primerler kullandi ama primer baglanma kabiliyetini diger kosullarla oynayarak arttirdi.

• Polymorphic DNA ne demektir?– "poly" = "many" "morphic" = "shapes" (Bir cok sekil)– DNA dizisi turler arasinda ve ayni turun farkli bireyleri

arasinda goreceli olarak cesitlilik gosterir.– Genom DNA sindaki bazi DNA bolgeleri daha fazla

korunmustur yani cesitlilik gostermez. Bu DNA bolgeleri biyolojik cesitliligin anlasilmasinda kullanilmaz. Ama bazi DNA bolgeleri bireyler arasinda orta derecede ya da cok derecede FARKLILIK gosterebilir. Bu DNA bolgeleri Biyolojik cesitliligi anlamak acisindan daha kullanilislidir. Bu DNA bolgeleri RASGELE olarak RAPD primerleri ile avlanabilir. Ya da alternatifler teknikler vardir. Microsatellite DNA bolgeleri gibi. (Baska bir dersin konusu)

Standard PCR

RAPD analysis, the target sequence(s) (to be amplified) is unknown.

Design a primer with an arbitrary sequence.

simply make up a 10 base pair sequence

carry out a PCR reaction and run an agarose gel to see if any DNA segments were amplified in the presence of the arbitrary primer.

Standard PCR ile RAPD PCR arasindaki fark

Primerlerin baglandiklari yerler acisindan birbirine bakmasi gerekir. Ve iki primer arasindaki mesafenin makul bir uzaklikta olmasi lazim (1-3 kb gibi)

RAPD reaksiyon #1:Oklar primerleri isaret ediyor. Okun yonu extension (uzama) yonunu isaret eder. Rakamlar primerin baglanma bolgelerini isaret eder.1, 2 ve 3 numaralari boglede primerler asagidaki DNA iplikcigive baglanir. 4,5, ve 6 numarali bogedeki primerler ise ustteki DNA iplikcigindeki tamamlayici bolgeye baglanirOrnegin burada sadece 2 tane PCR urunu jelde gozlemlenir. Neden?2 ile 5 primerleri urun A yi, 3 ila 6 ise urun B yi olusturur.1 ila 4 bir urun olusturmaz cunku iki orimer birbirine baksalarda birbirinden cok uzaktalar.4 ila 2 bir urun olusturmaz, cunku ters yone bakkiyorlar. Ha keza 5 ila 3 te de durum boyledir.

RAPD analizi ile genomlar arasinda fakliliklarin bulunmasiOnceki slayttaki durumu dusunun. O bir bireyden elde edilmis DNA olsun. AsagidakiIse baska bir bireyden. Senaryo soyle olabilir.

RAPD reaksiyon #1: Figurde goruldugu gibi 2 numarali primer baglanma bolgesi bu bireyde bulunmuyor. Yani orada polimorfizm var. Burara artik primer baglanamayacak ve 2 ile 5 in olusturudugu PCR urunu gorulmeyecek. Sadece 3 ile 6 nin olusturdugu urun gorulecek.

Sonuc: Eger bir 2 RAPD PCR sonucunu agoroz jel elektroforezinde analiz etseydikAsagidakini gorurduk

RAPD

KALIP DNA

Primer kalip DNA uzerinde bir suru yere baglanir.

Ama sadece birbirine yakin ve 3’OH uclari birbirine bakan primerler PCR sonucu gozlemlenebilen urun DNA verebilirler.

RAPD

KALIP DNA

Primerler ters yone baktigi icin gozlemlenebilir urun olusturmaz

RAPD

KALIP DNA

Primerler ayni yone baktigi icin amplifikasyon (cogaltma olmaz

RAPD

KALIPDNA

Primerlerin baglanma yerleri birbirinden cok uzak. Amplifikason yok

> 2,000 bases

KALIP DNA

Primerlerin birbirine olan

uzakliklari makul.

Amplifikasyon olabilir

100 - 1,500 bp

RAPD

MM 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Agaroz jeldeki RAPD Banlari4mM MgCl2

1.2 U Taq5 pM OPA-16

4mM MgCl2

0.6 U Taq10 pM OPA-16

2mM MgCl2

1.2 U Taq10 pM OPA-16

Magnezyum iyon konsantrasyonunu azaltmak en buyuk PCR bandinin sentezlenmemesine neden oldu. 2-7 de var, 8-10 da yok.

RAPD reaksiyonlari 3 lu tekrar olarak yapildi. Primer ve kalip DNA ayni ama magnezyum kons., polimeraz miktari ve primer kons degistirildi.

Hangi degisken BAND PATERNLERINI en cok etkiler?

Show animation at: RAPD

http://www.rvc.ac.uk/Review/DNA_1/5_RAPD.cfm

Ornek RAPD primerler

Group I was established between pairs I029-I040 and I021-I032 joined by isolates I031, I026, I007, I041, I043, and I023. Group II comprised pair I004-I014, and isolates I033, I018, I012, I003, I006, I022, I030. Isolate I017, which forms group III, showed a banding pattern significantly different from the