resultater og diskussion - aarhus universitet...7.6 substitution af acetyl på c1 med azid 8....
Post on 06-Mar-2021
1 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 1 af 34
Indholdsfortegnelse
side
1. Forkortelser
2. Forord
3. Abstract
4. Resumé
5. Indledning
6. Teori
6.1 Glycoproteiner
6.1.1 Fastfase peptid syntese
6.1.2 Native Chemical Ligation
6.1.3 O-bundne glycoproteiner
6.1.4 N-bundne glycoproteiner
6.2 Anomer effekt
6.3 -effekt
2
3
4
4
5
7
8
9
11
13
15
16
7. Resultater og diskussion
7.1 Oxidation af amid med methyl(trifluoromethyl)dioxiran
7.2 Oxidation af amid med 2,2-dimethyldioxiran
7.3 Syntese af oxaziridin med mCPBA
7.4 Syntese af oxaziridin med mmpp
7.5 Hydrolyse af oxaziridin
7.6 Substitution af acetyl på C1 med azid
8. Konklusion
9. Experimental
9.1 General synthetic methodologies
9.2 Apparatus
9.3 Synthesis
10. Referencer
Bilag 1 - Struktur af udvalgte monosaccharider, aminosyrer og
beskyttelsesgrupper
Bilag 2 - Tabel over diverse eksakte masser
Bilag 3 - NMR Spektre
16
18
22
24
25
26
27
28
28
28
33
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 2 af 34
1. Forkortelser
Ac acetyl
Ac2O eddikesyre anhydrid
Asn asparagin
Asp aspartat, asparagin syre
Boc tert-butoxycarbonyl
C celsius
Cosy Correlated spectroscopy
Cys cystein
d dublet
dd dobbelt dublet
DCM dichlormethan
DMF N,N-dimethylformamid
ER endoplasmatisk reticulum
EtOH ethanol
Et2O diethylether
EtOAc ethylacetat
eq ækvivalent
Fmoc Fluorene-methoxy-carbonyl
Fuc fucose
Gal galactose
GalNAc N-acetylgalactosamin
Glc glucose
GlcNAc N-Acetylglucosamin
h time(r)
Hz hertz
J koblingskonstant målt i Hz
M molær
m multiplet
Man mannose
mCPBA 3-chloroperoxybenzoesyre
MeCN acetonitril
MeOH methanol
min minut(ter)
Mmpp magnesium monoperoxyphthalat
hexahydrate
MS massespektroskopi
NCL native chemical ligation
NMR nuclear magnetic resonance,
kernemagnetisk resonans
rt. room temperature, stuetemperatur
ppm parts per million
s singlet
Ser serin
Sia sialic acid, sialin syre
SPPS solid phase peptide synthesis, fast
fase peptid syntese
SAL sugar-assisted ligation
TBAHS tetrabutylammonium
hydrogensulfat (C4H9)4N+HSO4
-
TFA trifluoroacetic acid,
trifluoreddikesyre
THF tetrahydrofuran
Thr threonin
TLC thin layer chromatography,
tyndtlagskromatografi
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 3 af 34
2. Forord
Denne opgave er produktet af det eksperimentelle arbejde i forbindelse med min bachelor opgave og
er udført i gruppe 103, afdeling for Bioorganisk Kemi, på Kemisk Institut ved Århus Universitet.
Projektet er udført under vejledning og supervision af adjunkt Henrik Helligsø Jensen. Projektet
svarer til 10 ECTS points.
I forbindelse med projektet vil jeg gerne takke alle personer tilhørende gruppe 103 på Århus
Universitet, som har været behjælpelige undervejs i processen.
En stor tak rettes specielt til min vejleder Henrik Helligsø Jensen, som har ydet stor hjælp til såvel
praktiske som teoretiske problemstillinger, samt til Ph.D.-studerende Helena S. Christensen og Ph.D.-
studerende Anne Mette Frey, der har læst korrektur på opgaven.
Århus d. 1. august 2007
Helle Christensen
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 4 af 34
3. Abstract
Sugars being attached to proteins have been shown to play a key role in a wide range of biological
processes. Since nature produce glycoproteins as mixtures, the study of these processes is
problematical. The solution to this problem might be to chemically produce well-defined glycan
structures and attach them to proteins, and subsequently to test these products in the relevant
biological processes. A few methods already exist to ligate sugar and protein together, but so far no
method for the synthesis of the naturally occurring amide functionality between the sugar fragment
and the protein in aqueous solution has been described in the literature.
This project seeks to develop a novel method for ligating sugars to peptides in aqueous solution and
thereby synthesize the native -glycosyl amide bond.
The key to this project is to synthesize N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amine, and investigate its
reaction with thioesters in aqueous solution. Inspired by the process referred to as native chemical
ligation, it is believed that an initial attack of the N-OH function onto the thioester carbonyl, followed
by O-N exchange, will result in a stable amide bond.
Unfortunately it was problematically to introduce the acquired hydroxylamide function in the sugar,
and therefore it was not possible to continue the study and test if the amid bond could form.
4. Resumé
Sukre bundet til proteiner har vist sig at spille en vigtig rolle i et væld af biologiske processer. Da
naturen fremstiller glycoproteiner som blandinger, er studiet af disse processer problematisk. En
løsning til dette problem kunne være at kemisk fremstille veldefinerede glycan strukturer og fastsætte
dem til proteiner, og efterfølgende teste disse produkter i de relevante biologiske sammenhænge. Det
eksisterer allerede få metoder til at danne en binding mellem sukker og protein, men indtil nu er ingen
metode til syntese af den naturligt forekommende amidbinding mellem sukker og protein i vandig
opløsning blevet beskrevet i litteraturen.
Formålet med dette projekt er at finde en god måde, hvormed sukre kan bindes til peptider i vandig
opløsning og danne den naturlige -glycosyl amid binding.
Nøglen til dette projekt er at syntetisere N-acetyl-N-hydroxyl glucosyl amin og undersøge dens
reaktion med thioestre i vandig opløsning. Inspireret af processen kaldet native chemical ligation,
kunne det tænkes at N-OH først vil angribe thioester carbonylen, og der derefter vil ske en O-N-
cyklisering, hvorved den naturlige amidbinding dannes.
Desværre var det problematisk at introducere den ønskede hydroxylamid funktionalitet på sukkeret,
og derfor var det ikke muligt at teste om den ønskede amidbinding kunne dannes.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 5 af 34
5. Indledning
Formålet med dette projekt er at finde en god metode til at danne en -N-glycosyl binding mellem et
sukkermolekyle og et peptid i vandige omgivelser, hvori peptidet er stabilt og opløseligt. Nøglen til
denne problemstilling er først at syntetisere N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amin 1 og efterfølgende
undersøge dets reaktion med en thioester i vandig opløsning.
Forventningen er, at et nukleofilt angreb af N-OH (der på grund af -effekten er en meget god
nukleofil) ind på thioester-carbonylen vil resultere i et intermediat, der efterfølgende kan undergå O-
N udskiftning og slutteligt danne en stabil amidbinding, som skitseret i figur 1. Dette er inspireret af
processen kaldet ”Native Chemical Ligation” for proteiner.
ONH2
OH
HOHO
N OHO HN
NH
O
RS
OO
ONH2
OH
HOHO
N
OHN
NH
O
O O
O
O HN
OH
HOHO
N
OHN
NH
O
OO
OH
reduktionO H
N
OH
HOHO
NH
OHN
NH
O
OO
1
Figur 1. Projekt ide.
For at syntetisere 1 anvendes som udgangsstof sukre med D-Glucosamin konfiguration, da N-acetyl-
glucosamin (GlcNAc) naturligt er det saccharid, der er bundet til sidekæden på asparagin (Asn).
Strategien for at fremstille 1 er at forsøge at introducere en N-acetyl-N-hydroxyl-amin gruppe på C2
positionen ud fra angivne måder i litteraturen, hvor lignende forbindelser syntetiseres.
De frie hydroxygrupper på sukkeret skal først beskyttes som acetyl-estre, da estre ikke er særligt
nukleofile og meget mindre polære end hydroxygrupper. På denne måde undgår man uønskede
sidereaktioner, og stoffet gøres mere hydrofobt. Ud over introduktion af N-acetyl-hydroxyl-amid
funktionaliteten på C2 positionen, skal der på C1 positionen sidde en amin. Da aminer er meget
reaktive, kan der i stedet placeres et azid på C1 positionen i den ønskede -position, der efter
afbeskyttelse af hydroxygrupperne, kan reduceres til den ønskede amin 1. Dette er skitseret i figur 2.
O
OH
HOHO
NH2OH
O
OAc
AcOAcO
NH2OAc
beskyttelse af friehydroxygrupper O
OAc
AcOAcO
NOAc
O OH
indtroduktion afN-acetyl-N-hydroxylamid gruppe på C2
O
OAc
AcOAcO
NO OAc
N3
Indtroduktion afazid på C1
O
OH
HOHO
NO OH
NH2
reduktion afazid til aminO
OH
HOHO
NO OH
N3
afbeskyttehydroxygrupper
1
Acetylering
O
OAc
AcOAcO
N OAc
O OAc2 3
Figur 2. Strategi.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 6 af 34
Planen er derfor at syntetisere 2 ud fra angivne måder i litteraturen, hvor lignende forbindelser
syntetiseres, og derefter afbeskytte 2 med en katalytisk mængde natriummethoxid i methanol og
derved danne 3, der kan reduceres til aminen 1 ved hjælp af triphenylphosphin, kaldet Staudinger
reduktion1. Dette er vist i figur 3.
Raju et al.2 angiver en metode, hvorved azider selektivt kan reduceres til aminen ved hjælp af
triphenylphosphin, uden at hydroxy-amid gruppen samtidig reduceres.
ON3
OAc
AcOAcO
N OAcO
cat. MeONa
MeOH ON3
OH
HOHO
N OHO
ONH2
OH
HOHO
N OHO
P SO3NaNaO3S
SO3Na
2 3 1
THF, H2O
Figur 3. Afbeskyttelse og reduktion af azid.
Reduktionen af azidet til aminen skal finde sted, samtidig med at der i opløsningen er en thioester
tilstede, som den netop dannede og meget reaktive amin kan reagere videre med, som vist i Figur 1.
Et delmål i projektet er at undersøge, om der kan ske en O-N-cykliseringen, hvor der sker en acyl
overførsel fra N-OAc til aminen på C1. Det vil sige om reaktionen fra 4 til 5 kan finde sted, som vist i
figur 4.
ON3
OAc
AcOAcO
N OAcO
PPh3
Staudinger reduktion
O
NH2
OAc
AcOAcO
AcNO
O
NH
OAc
AcOAcO
NAc
HO
O
O
reduktion
Protonskift
2
Zn/H+
4 5
ONH
OAc
AcOAcO
NH
O
O
6
Figur 4. Delmål. Kan O-N-cykliseringen finde sted.
Den endelige N-O reduktion af hydroxylamidet 5 til amidet 6 kan ifølge Canne et al.3 udføres med
zink-støv i surt miljø.
Denne reduktions metode skulle også kunne anvendes til reduktionen af 1 efter amidbindingen
mellem sukker og peptid er dannet, som vist i figur 1.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 7 af 34
6. Teori
6.1 Glycoproteiner
Proteiner, hvortil der er bundet et oligosaccharid til en eller flere aminosyresidekæder, kaldes
glycoproteiner og siges at være glycosylerede. Som oftest består oligosaccharider af kæder på 3 til 10
sukre.
Glycosylering af proteiner er den hyppigst forekommende co-translationelle og post-translationelle
modifikation af proteiner. Mere end halvdelen af menneskets proteiner er glycosylerede.4
Glycosylering af aminosyresidekæderne medfører, at der findes mange flere forskellige proteiner i
mennesket, end det antal af proteiner, som generne koder for.
I glycoproteiner er oligosaccharidet kovalent bundet til enten amid nitrogen atomet i sidekæden af
Asn, hvilket kaldes N-glycosylering, eller til oxygenatomet i serin (Ser) eller threonin (Thr) og kaldes
O-glycosylering. N-glycosylering er en co-translationel modifikation, der sker samtidig med
translationen fra mRNA til protein. N-glycosyleringen begynder i endoplasmatisk reticulum (ER) og
fortsætter i Golgi-komplekset, mens O-glycosylering er en post-translationel modifikation og
udelukkende finder sted i Golgi komplekset.5
Sukkermolekyler på overfladen af proteiner kan have mange forskellige roller. De kan assistere
proteinets foldning, forbedre proteinets stabilitet, øge opløseligheden af proteinet, indgå i signal
transduktion, medvirke i intercellulære processer og beskytte peptid-backbone fra
proteinnedbrydende enzymer kaldet peptidaser. De fleste membranproteiner og proteiner der
udskilles fra cellen er glycosylerede. Glycoproteiner er vigtige for immunsystemet (antistoffer og
antigener er glycosylerede proteiner). Andre eksempler på vigtige glycoproteiner er forskellige
hormoner som f.eks. Follikel stimulerende hormon, Thyroid stimulerende hormon og EPO
(Erythropoietin).
I modsætning til biosyntesen af proteiner og nukleinsyrer, er samlingen af oligosaccharider ikke
kontrolleret af en bestemt skabelon. Derfor findes glycoproteinerne som heterogene blandinger,
kaldet glycoformer. Disse glycoformer har det samme peptid-backbone, men kan være glycosylerede
forskellige steder eller have forskellige sukre bundet. Hver af disse glycoformer har forskellige
egenskaber6.
Da glycoproteiner spiller så stor en rolle inden for mange vigtige biologiske processer, er studiet af
disse interessant for at fastslå og forstå deres rolle. Et problem i studiet af glycoproteiner er, som
tidligere nævnt, at biosyntetiske glycoproteiner fremstilles og eksisterer som disse glycoformer. Det
er derfor et problem at have rigeligt tilgængeligt homogent materiale at studere. En løsning på dette
problem er at syntetisere homogene glycoproteiner kunstigt ved hjælp af kemisk syntese.7
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 8 af 34
6.1.1 Fastfase peptid syntese
Peptider kan syntetiseres ved gentagne gange at koble carboxylgruppen på en C-terminal aminosyre
med aminogruppen på en N-terminal aminosyre. Peptid syntesen i opløsning (væske-
fase syntese), men det er nemmere at anvende fastfase peptid syntese (SPPS). En af fordelene ved
SPPS er, at peptid kæden bygges, mens kædens C-terminal er kovalent bundet til en fast fase (kaldet
resin). Dette gør, at det er let at oprense mellem syntesetrinnene, da peptidkæden sidder fast, mens
overskydende reaktanter i væskefasen, samt biprodukter, kan skylles væk. Dette kan gøres
automatisk. På grund af, at der tilsættes overskud af aminosyrer for at opnå højt udbytte i hvert
syntesetrin, er polymerisering af aminosyrer et almindeligt problem i synteser, hvor aminosyrerne
ikke er beskyttede. Derfor beskyttes aminosyrerne. Der findes mange beskyttelsesgrupper, men de to,
der almindeligvis anvendes i SPPS, er tert-butoxycarbonyl (Boc) og fluorene-methoxy-carbonyl
(Fmoc).
Det grundlæggende princip bag SPPS er en gentaget cyklus af kobling og afbeskyttelse af
aminosyrerne. Den frie N-terminale amin på fastfase peptidet kobles til en enkelt N-beskyttet
aminosyre, hvorefter denne aminosyre afbeskyttes under frigivelse af en ny N-terminal amin, der er
klar til at reagere videre med en ny aminosyre, som vist på figur 5. Til sidst kan peptidkæden frigives
fra den faste fase. De mest anvendte resiner idaga kræver trifloureddikesyre (TFA) til kløvningen.
b
R
ONH
O
X
afbeskyttelse,neutralisering
R
OH2N
O-X
R'
OHNH
O
XR
ONH
OR'
HN
O
X
gentagX: beskyttelsesgruppeR, R': aminosyresidekæde
Figur 5. Grundlæggende princip bag SPPS.9
Af de to beskyttelses grupper foretrækkes Fmoc frem for Boc i SPPS til syntese af glycopeptider. For
at fjerne en Boc gruppe kræves sure betingelser, normalt THF, hvilket ikke er kompatibelt med
tilstedeværelsen af syrefølsomme glycosidbindinger. Dette undgås i den trinvise afbeskyttelse af den
base-labile Fmoc beskyttelses gruppe, hvor der normalt anvendes 20% piperidine i N,N-dimethyl-
formamid (DMF). Hydroxygrupperne på saccharidet er oftest beskyttet som acetyl eller benzoyl
estere, der kan fjernes ved behandling med natriummethoxid eller hydrazin, efter at peptidet er blevet
kløvet fra den faste fase.8
Problemet med SPPS er, at fragmenter, der består at mere end 40-50 aminosyrer, er svære at
syntetisere, da det kræver meget højt udbytte i hvert trin, for at få den korrekte aminosyre sekvens i
det endelige peptid.9 En løsning til dette problem er at anvende native chemical ligation (NCL).
a Wang eller Rink
b Den oprindelige Merrifield resin kræver HF.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 9 af 34
6.1.2 Native Chemical Ligation
NCL involverer den selektive kobling af to peptid-fragmenter. Det ene fragment skal have en N-
terminal cystein (Cys) rest, mens det andet fragment skal have en C-terminal thioester funktionalitet.
De to komponenter kombineres og danner selektivt en nativ peptidbinding i vandig opløsning uden
beskyttelsesgrupper. Processen er udviklet af Stephen Kent med flere i The Scripps Research Institute
i 199410
. Mekanismen er vist på figur 6.
[Peptid-1] SR
OH2N
HN
HS
O
[Peptid-2]
[Peptid-1]
H2N
HN
S
O
[Peptid-2]
[Peptid-1] NH
HN
HS
O
[Peptid-2]
O
O
Figur 6. Princippet i Nativ Chemical Ligation.
10
Peptid 1, der har en thioester på carbonylgruppen, bliver angrebet af det nukleofile svovlatom på
Cys-sidekæden i peptid 2. Der sker herved en trans-thioesterifisering. Den dannede thioester undergår
derefter hurtigt en intramolekylær omlejring (S-N-cyklisering), der er favorabel, fordi det involverer
en 5-leddet ring, for til sidst at danne den native peptidbinding.10
Det er vigtigt at sikre, at sidekæden i Cys ikke oxideres og danner en disulfid-linked peptiddimer
inden NCL, da peptid-2-dimeren så er ureaktiv i NCL. Et overskud af thiol svarende til thioester
leavinggruppen kan tilsættes, for at Cys-resten er i den reducerede form. Derudover kan reagenser
som guadinium chlorid anvendes for at øge reaktionshastigheden, da proteinet foldes ud og gør de
reaktive grupper tilgængelige.10
Da NCL bruger thioestere, og disse er ustabile over for base (piperidine anvendes i Fmoc SPPS) men
ikke syre, har Boc-metoden været succesfuld til fremstillingen af Peptid-1 fragmenter i de tilfælde,
hvor der ikke er syre følsomme glycosidbindinger tilstede. For fremstilling af peptid-2 fragmentet
med en N-terminal Cys-rest kan Fmoc metoden anvendes. For at fremstille en både syre og base labil
C-terminal glycopeptid thioester kan almindelig Boc- og Fmoc-metoder ikke anvendes.
En løsning på dette problem er at anvende Fmoc-baseret SPPS på en sulfonamid ”safety-catch” linker
resin.8 Peptidkæden dannes med Fmoc-beskyttede aminosyrer, på nær på den sidste aminosyre, der
kobles på den voksende peptidkæde som en Boc-beskyttet aminosyre.
Efterfølgende behandling med iodoacetonitril medfører alkylering af sulfonamid funktionen, og efter
nukleofil addition af en thiol, frigives den ønskede thioester med syre labil N-terminal-Boc
beskyttelse, samt syrelabile sidekæde beskyttelsesgrupper. Disse kan fjernes med TFA, hvori
thioesteren er stabil. Se figur 7.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 10 af 34
H2NS
OO
R'
OHNH
O
Fmoc R'
NH
O
FmocHN
S
OO Piperidine/DMF
FmocNHCHRCO2H n
R'
NH
O
(oligopeptide)HN
S
OO
FmocHN
1) piperidine/DMF2) BocNHCHRCO2H
R'
NH
O
(oligopeptide)'HN
S
OO
BocHN
I CNbase
HI
R'
NH
O
(oligopeptide)'N
S
OO
BocHN
CN
R'' SH
NH
S
OO
NC
R'
NH
O
(oligopeptide)'BocHN SR''
TFAR'
NH
O
(oligopeptide)'H2N SR''
Figur 7. Princippet i anvendelse af Fmoc-baseret SPPS på en sulfonamid ”safety-catch” linker resin.
6
Bruges denne strategi, skal man kun bruge relativt fortyndet TFA een gang til fjernelse af Boc og
beskyttelsesgrupper på sidekæderne. Disse forhold kan glycosid bindingerne godt klare, hvorfor
denne metode kan anvendes til syntese af glypeptider vha. NCL.9 Havde man i stedet anvendt Boc-
strategien på alle aminosyrerne, skulle TFA anvendes i hvert eneste N-terminale afbeskyttelsestrin,
og dette ville være meget hårdere for de syrelabile glycosidbindinger.
Fordelen ved NCL er, at fragmenter, dannet ved SPPS, kan kobles, og man kan derved syntetisere
længere peptider, end det er mulige at danne alene vha. SPPS. Begrænsningen ved metoden er, at Cys
skal være en del af proteinet og være placeret et godt sted (ideelt set for hver 30-40 aminosyrer i
protein sekvensen), hvilket sjældent er tilfældet, da Cys er den anden mindst forekommende
aminosyre af ud af de 20 naturlige aminosyrer.11
I mange tilfælde er det derfor nødvendigt at introducere en Cys-mutation i peptid-sekvensen hvilket
kan føre til dannelsen af forkerte disulfidbroer ved proteinfoldningen. En alternativ løsning på
problemet er at anvende såkaldte ”ligation auxilliaries”, hjælpemolekyler.12 I denne strategi anvendes
en thiol-hjælpegruppe, der er fastsat til det syntetiske peptids N-terminal, hvorved der dannes en
sekundær amin, og formidler trans-thioesterificationen og den intramolekylære S-N acyl overførsel
på lignende måde som Cys. Dette er vist i figur 8.
SR
O
Aux
HN
SH
R
O O
Aux
S
NH
R
O
O
Aux
N
R
O
O
NH
R
O-Aux-SH
SH
Figur 8. Princippet i NCL ved anvendelse af hjælpegrupper.
12
Når den native peptidbinding er dannet, kan hjælpegruppen fjernes med eksempelvis TFA, hvorefter
den umodificerede peptidkæde er dannet. En ulempe ved disse hjælpemolekyler er, at de kun er
anvendelige på syntetiske peptider, samt at sterisk hindring medfører et krav til udførelsen af
koblingen om, at mindst en af de to terminale aminosyrer, der indgår i reaktionen, er glycin.12
Eksempler på hjælpemolekyler ses i figur 9:
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 11 af 34
HN PeptidSH
MeO
OMe
OMe A
HS
O
HN Peptid
B
MeO OMe
HS
NH
Peptid
C
Figur 9. Forskellige hjælpemolekyler. A: 2-mercaptobenzyl, B: ethanthiol, C 1-aryl-2-mercaptoethyl.12
En nyere strategi til syntese af glycopeptider er ”sugar-assisisted ligation”13
(SAL), der angiver endnu
en løsning til problemet i NCL med mangel på en N-terminal Cys-rest. I SAL er thiolgruppen placeret
på et sukkermolekyle, der er bundet til aminosyrens sidekæde, i stedet for at sidde direkte på selve
aminosyresidekæden. Denne metode kan anvendes for -O og N-linked glycopeptider.11
Fordelen ved denne metode er, at man i stedet for at placere et hjælpemolekyle på N-terminalen af
peptidet, der senere skal fjernes, fordelagtigt anvender et sukkermolekyle, der allerede er bundet til en
aminosyre. Modificering af en acetamido gruppe på C2 positionen med en sulfhydryl-gruppe gør
sukkermolekylet i stand til at medvirke i trans-thioesterificationen med en peptid thioester. Dette sker
via et 14- (O-bundet glycopeptid) eller 15-leddet (N-bundet glycopeptid) ring-intermediat.
Mekanismen er vist i figur 10.
Peptide 2 SR
O
H2NNH
Peptide 1
R
O
O
X
OHO
HN
O
HSPeptide 2
O
H2N NH
Peptide 1
R
O
O
X
OHO
HN
O
S
Peptide 2
O
HN
NH
Peptide 1
R
O
O
X
OHO
HN
O
HS
Figur 10. Sugar assisted ligation. X: O, NHO.
11
For de tidligere nævnte hjælpegrupper, er den N-terminale nukleofil sekundær, hvorimod der i SAL
anvendes en primær amin. Dette medfører et mindre sterisk hindret transitionstate, og gør, at denne
metode har en bredere tolerance overfor valget af de terminale aminosyrer. Efter koblingen af de to
peptidfragmenter kan thiol-delen fjernes ved hydrogenolyse for at gendanne den umodificerede
sukker, eller den modificerede sukker kan ved hjælp af en glycosyl transferase oligomeriseres.11
6.1.3 O-bundne glycoproteiner
I pattedyr og andre eukaryoter er den mest almindelige form for O-glycosylering mucin-typen, hvor
N-acetylgalactosamin (GalNAc) er -O-bundet til -hydroxyl gruppen af enten en Ser eller Thr rest i
proteinet. Muciner er glycoproteiner, der findes på celle overflader eller udskilles fra cellen, og har
mange tætte klynger af sådanne O-bundne GalNAc enheder. De fremstilles blandt andet af epitel
celler, der er specialiserede i slim produktion.14
Ikke alle O-glycosylerede GalNAc glycoproteiner er
muciner, da nogen kun indeholder få O-bundne GalNAc saccharider. Disse siges at være mucin-
lignende. Andre typer af O-glycosylering forekommer, blandt andet -O-N-GlcNAc, der findes som
en modifikation af Ser- og Thr-rester i cytosol- og kerneproteiner.
-O-GalNAc-Ser/Thr strukturen danner et biosyntetisk grundlag for otte forskellige kerne saccharid-
strukturer resulterende fra glycosylering på C3 og/eller C6 hydroxygruppen på GalNAc. Disse
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 12 af 34
kernestrukturer kan forlænges med andre monosaccharider så som sialin syre (Sia), fucose (Fuc)
og/eller gentagne enheder af galactose (Gal) og GlcNAc. Sammen med andre modifikationer, så som
sulfonering, giver disse forlængelser ophav til meget komplekse oligomere saccharid-strukturer, der
kan indeholde vigtige genkendelses elementer involverede i celle-celle genkendelse, der har stor
betydning for immunsystemet.
Syntese af mucin-type glycopeptider kan ske ved at indsætte en beskyttet O-glycosyl aminosyre i et
polypeptid via SPPS. Et problem, i syntesen af komplekse O-glycosyl aminosyrer, er at opnå den
ønskede -selektivitet, når sukker-Ser/Thr bindingen dannes. 7
Den mest almindelige metode til syntese af disse glycopeptider er først at danne den ønskede -O-
Ser/Thr binding, og derefter forlænge GalNAc kernen med yderligere sukre. Ved anvendelse af 2-
azidogalactose halo- og thioglycoside donorer, som vist i figur 11, sikres en høj selektivitet i
glycosylerings-reaktionen8, hvorved de ønskede -O-GalNAc-Ser/Thr byggesten i SPPS kan dannes.
Omdannelse af 2-azidogruppen til en N-acetamidogruppe giver den Fmoc beskyttede -O-GalNAc-
Ser/Thr aminosyre.7
O
OAcAcO
AcON3
X
FmocHN CO2Bn
RHO
glycosylering O
OAcAcO
AcON3
FmocHN CO2Bn
RO
O
OAcAcO
AcOAcHN
FmocHN CO2Bn
RO
X=Br, Cl, SEt Figur 11. Syntese af -O-GalNAc-Ser/Thr byggesten til SPPS for syntese af O-bundne glycopeptider,
Thr:R=Me, Ser; R=H. 7
Forlængelsen af monosaccharidet GalNAc efter den ønskede -O-Ser/Thr binding er dannet, kan ske
ved at beskytte hydroxygrupperne på GalNAc med ortogonale beskyttelsesgrupper på C3, C4 og C6
hydroxygrupperne, hvilket tillader trinvis addition af forgrenede sukre.
Fremstillingen af O-bundne glycopeptider kan også ske ved hjælp af enzymer som glycosyl-
transferaser og glycosidaser. Herved får man selektiv addition af saccharidenhederne, og desuden
opnår man den fordel, at man undgår brugen af beskyttelsesgrupper.
De almindelige metoder nævnt til at danne kemisk fremstillede homologe glycoproteiner kræver et
strengt vandfrit miljø, og anvendelse af polypeptider med beskyttede sidekæder, for at danne den
native glycosid binding.15
Som en løsning på dette er der blevet udviklet flere metoder, kaldet ”chemoselective ligation”15
, hvor
der i vandige omgivelser, og under moderate temperaturer, kan dannes stabile bindinger under
forhold, der ikke er skadelige for de resterende dele af molekylet. Dette sker ved at introducere ikke-
native elektrofile og nukleofile funktionelle grupper på peptidet og monosaccharidet, der
efterfølgende kan reagere og danne en binding, der er analog til en glycosid-binding. Bertozzi et al.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 13 af 34
har for eksempel dannet en oxim-binding mellem et ikke-naturligt keton funktionaliseret peptid og en
-aminooxy GalNAc i stedet for en almindelig glycosid ether-binding. Dette er vist på figur 12. 16
O
OHHO
HOAcHN O
Peptide 2
O
H3C
NH
O
Peptide 1
NH2
O
OHHO
HO
AcHN O
Peptide 2
N
H3C
NH
O
Peptide 1
Figur 12. Syntese af en oxim-binding mellem et keton-funktionaliseret peptid og en -aminooxy GalNAc.
16
6.1.4 N-bundne glycoproteiner
N-glycosylering af proteiner sker biologisk set ved, at oligosaccharidet bindes til Asn ved hjælp af en
oligosaccharyl transferase. Dette kan kun ske, hvis Asn er del af en Asn-X-Ser eller Asn-X-Thr
sekvens, hvor X kan være en hvilken som helst aminosyre, bortset fra prolin. Det vil sige, at
potentielle glycosylerings-sites kan opdages ud fra aminosyresekvensen.17
Oligosaccharidet samles, mens det er bundet til dolichol-phosphat, der sidder i ER membranen.
Derefter overføres oligosaccharidet til amid sidekæden af Asn inde i lumen i ER fra dolichol-
phosphat glycosyldonoren ved hjælp af den membran bundne oligosaccharyl transferase.7 Det fuldt
translaterede glycoprotein bliver derefter trimmet, processeret og yderligere glycosyleret i ER og
Golgi komplekset.
Alle N-bundne oligosaccharider har en fælles pentasaccharid kerne bestående af en Man3GlcNAc2(-
N)-Asn struktur. Lige som med O-bundne saccharider kan yderligere sukre, som for eksempel Gal,
GalNAc, GlcNAc, Fuc og Sia, samt sulfonering, bindes til denne kerne for at øge variationen af
oligosaccharid mønstret i glycoproteinerne.
Funktionerne af N-bundne glycosyleringer er mange. De kan opdeles i to typer: intra- og
extracellulære funktioner. Intracellulært er funktionen af N-bundne glycaner blandt andet at sikre, at
proteinet foldes korrekt. Ekstracellulært kan N-bundne glycaner virke som ligander for
kulhydratreceptorer og som strukturelle elementer, idet den store og fleksible N-bundne glycan kan
øge proteinets stabilitet ved at mindske den konformationelle fleksibilitet af proteinet, uden at den
samlede entropi af systemet mindskes.18
Kemisk syntese af N-bundne glycopeptider kan ske på lignende måde som for O-bundne
glycopeptider, hvor en glycosyl aminosyre bindes til den voksende polypeptidkæde via Fmoc-kemi
SPPS. I dette tilfælde kan hele oligosaccharidet syntetiseres først, og efterfølgende danne -glycosid
bindingen til peptidet.
Glycosyl--N-Asn byggestenen fremstilles almindeligvis ved at koble en reaktiv glycosylamin med
en aktiveret ester af aspartat (Asp)19, som vist på figur 10.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 14 af 34
O
OP
ROPO
NHAc
NH2
P=beskyttelsesgruppeR=H, oligosaccharidR'=aktiveret ester
+
OP
OR'O
NHP
OO
OP
ROPO
NHAc
HN
OP
O
NHP
O
Figur 13. Generel syntese af N-bundne glycosyl aminosyrer vha. kobling af en glycosylamin til aktiveret Asp.
20
Glycosyl aminen kan fremstilles ved reduktion af et glycosylazid under milde betingelser.19
Den nævnte metode til syntese af N-bundne glycopeptider ved hjælp af SPPS anvendes kun til
syntese af små peptidfragmenter. Enzymatiske metoder kan også anvendes, men de er svære at bruge
ved produktion på stor skala. Generelt er syntese af glycopeptider kompliceret på grund af, at
glycosidbindingen mellem (oligo)saccharidet og peptidet er følsom over for kemisk og enzymatisk
hydrolyse.
Som med O-bundne glycopeptider kan metoden ””chemoselective ligation” 21 anvendes til syntese af
større og mere komplekse glycopeptider, hvor ikke-native glycosyl bindinger syntetiseres.
Syntese af unaturlige aminosyrer med sidekæden bundet til et glycosid, via en ikke-nativ glycosid
binding, kan danne glycopeptider, der er stabile over for kemisk og enzymatisk nedbrydning. Disse
glycopeptider kan have potentiel metabolisk aktivitet, som for eksempel inhibitorisk aktivitet mod
glycosidaser.23
Bertozzi et al.21
har for eksempel vha. ”chemoselective ligation” syntetiseret en glycopeptid-analog
ved først at introducere et ikke naturligt ketopeptid vha. SPPS i den voksende peptidkæde, og
efterfølgende reagere denne med et modificeret glycopeptid, for at danne en thiosemicarbazid binding
mellem sukker og protein. Dette er skitseret på figur 14.
O
OH
ROHO
NHAc
NH2
1) Cl2CS0.3 M NaHCO3
2) NH2NH2
.H2O
O
OH
ROHO
NHAc
HN
S
HN
NH2
Peptid 2
O
NH
O
Peptid 1
Peptide 2
N
NH
O
Peptide 1
O
OH
ROHO
NHAc
HN
S
HN
Figur 14. Syntese af glycoprotein med ikke-nativ peptidbinding.
22
Et andet eksempel på dette er syntese af triazol bundne glycopeptider. Kuijpers et al. 23 har ladet et
azid-fuktionaliseret glycosid reagere med en acetylen funktionaliseret aminosyre. Det triazol-bundne
glycopeptid dannes med et godt udbytte for mange forskellige saccharider. Triazol-bindingen er
ifølge Kuijpers stabil under sure og basiske betingelser. Reaktionen er skitseret i figur 15.
O
OAc
AcOAcO
NHAc
N3
NH
CO2MeBoc
Cu(OAc)2, Na-ascorbatH2O, tert-BuOH
O
OAc
AcOAcO
NHAc
NH
CO2MeBoc
NN
N
88%
Figur 15. Cu(II)-katalyseret [3+2] cycloaddition af azid funktionaliseret glucosamine og alkyn-aminosyrer.
23
Som før nævnt, er der indtil videre i litteraturen ikke angivet nogen effektiv måde, hvorpå den native
-glycosyl-amid binding kan dannes i vandige omgivelser vha. kemisk syntese.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 15 af 34
6.2 Anomer effekten24,25
For sukkerkemi er anomer effekten vigtig, da den kan bruges til at styre stereokemien på C1, det
anomeriske carbon atom. Stabiliteten af en bestemt konformer kan almindeligvis bestemmes ud fra
steriske faktorer. For en pyranose ring vil man forvente at -isomeren, med den anomeriske
substituent i den ækvatoriale position, ville være mere stabil end -isomeren, hvor substituenten er i
de mere sterisk hindrede aksiale omgivelser. Det kan imidlertid observeres, at elektronegative
substituenter på C1 i en pyranose ring foretrækker at have en aksial frem for en ækvatorial
orientering. Denne tendens kaldes anomer effekten.
En forklaring på anomer effekten er, at når en elektronegativ substituent (X) er i den aksiale position
på det anomeriske center, vil oxygenatomet i ringen have et af dets lonepair elektroner
O
OH
HOHO
HO X
O
OH
HOHO
HO X Figur 16. Resonansformer.
antiperiplanart til C-X bindingen. Dette lonepair kan
deltage i en stabiliserende to elektron interaktion, som kan
repræsenteres som to resonansformer (figur 16). I orbital
termer vil dette sige, at oxygenets lonepair elektroner kan doneres ind i den antibindende orbital
(LUMO) af C-X bindingen, som vist på figur 17. Den overordnede effekt af denne interaktion er
elektron delokalisering, og derfor er den stabiliserende. Den partielle overførsel af elektron densitet
Figur 17.
fra et heteroatom til en antibindende sigma orbital øges ved tilstedeværelsen af en
elektronegativ substituent. Dette forklarer, hvorfor det kun er elektronegative
substituenter, der medfører denne effekt. Hvis den anomeriske substituent
derimod er i en ækvatorial position, er det ikke muligt for oxygenatomet i ringen
at orientere et lonepair antiperiplanart til C-X bindingen og derfor kan elektroniske stabiliserende
interaktioner ikke finde sted.
6.3 -effekten26
Som vist på Figur 1, side 5, forventes det, at hydroxygruppen på hydroxylamidet 1, ved reaktion med
en thioester, vil være den første til at angribe thioesteren, efterfulgt af en acyloverførsel fra O til N.
Dette skyldes, at hydroxylaminen er en meget god nukleofil. Når to nukleofile atomer er bundet
kovalent til hinanden, øges nukleofiliciteten betydeligt. Dette kaldes -effekten. effekten gør for
eksempel at et oxygenatom i H2O2 er mere nukleofilt end H2O, og amingrupperne i hydrazin,
NH2NH2, og HONR2 er mere nukleofile end hhv. NH3 og HNR2. Der er to mulige forklaringer på
denne effekt. Den ene forklaring er, at lonepair elektroner placeret lige ved siden af en nukleofil
destabiliserer grundtilstanden, og hermed gøres nukleofilen mere reaktiv. En anden forklaring er, at
den induktive tiltrækning af den negative ladning af det naboelektronegative atom medfører dårligere
solvatisering af nukleofilen, der derfor er mere reaktiv i opløsningen.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 16 af 34
7. Resultater og diskussion
7.1 Oxidation af amid vha. methyl(trifluoromethyl)dioxiran
Den første ide til hvordan 1 kunne syntetiseres, er inspireret af en artikel af Detomaso et al.,27
der
beskriver, hvordan N-Boc beskyttede aminosyre metyl estere kan oxideres ved hjælp af
methyl(trifluoromethyl)dioxiran 7 i dichlormethan (DCM) ved -20 til 0 oC med et udbytte på 57-82%.
Amidfunktionaliteten i N- acetyl D-glucosamin 8 minder om carbamat funktionaliteten i N-Boc, så
derfor kunne man forestille sig, at denne metode kunne anvendes til oxidation af 8.
O (CH2)n
OCF3
OO
CH2Cl2N
CH
H
R
OCH3
O
O (CH2)n
O
NCH
OH
R
OCH3
O7
Figur 18. Oidation af carbamat ifølge Detomaso et al.27
For at syntetisere 1 ud fra 8 skal N-H oxideres til N-OH, og der skal udskiftes en hydroxygruppe på
det anomeriske carbon med en amin i -position. I stedet for at placere en reaktiv amin på C1, kan der
i stedet placeres et ureaktivt azid, der senere kan reduceres til aminen, som vist i figur 3, side 6.
Inden der placeres et azid på C1, skal de frie hydroxygrupper acetyleres.
Stereokemien på det anomeriske carbonatom kan kontrolleres, når en nabo carbonylgruppe kan
deltage i reaktionsmekanismen. Ved reaktion af 8 med acetylchlorid, vist i skema 1, reagerer alle 4
hydroxygrupper først via en acyltransfer mekanisme28
og beskyttes som estre, samtidig med der
dannes HCl. Esteren på C1 kan derefter protoneres og efterfølgende dissociere via en SN1
mekanisme. Den derved dannede carbocation kan stabiliseres ved hjælp lonepairet på oxygenatomet i
ringen vha. resonans og af carbonyl oxygenatomet fra acetylgruppen på naboatomet, der kan
stabilisere den dannede glycosylcation ved cyklisering.
Den cykliske oxonium ion kan åbnes med et SN2 angreb af en nukleofil chloridion, hvilket medfører
inversion af konfigurationen på C1. Chloratomet vil derfor sidde ækvatorialt, men da en
elektronegativ substituent på det anomeriske carbon er mest stabil i den aksiale position, vil det
udskiftes via endnu en SN2 reaktion med en anden chloridion i opløsningen, og ligevægten vil være
forskudt mod -anomeren 9. Se skema 1.29
.
O
OH
HOHO
NH
O
OHCl
O
O
OH
HOHO
NH
O
O
O
-HCl
Cl
O
3 x O
OAc
AcOAcO
NH
O
O
O
-3xHCl
H Cl
O
OAc
AcOAcO
NH
O
O
OH
O
OAc
AcOAcO
NHO
O
OH-
O
OAc
AcOAcO
NH O
O
OAc
AcOAcO
HNO
Cl O
OAc
AcOAcO
NH
O
ClCl
O
OAc
AcOAcO
NH
OCl
SN2
8
SN1
SN29
Skema 1. Mekanisme for udskiftning af anomer-OH med Cl.
29
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 17 af 34
Det dannede glycosyl chlorid 9 reagerer hurtigt med gode nukleofiler. Ved tilsætning af natrium azid
kan chloratomet derfor udskiftes med azid ved en SN2- mekanisme, som vist på skema 2. Der igen
sker inversion på det anomeriske carbon, og azidet sidder nu i den ønskede -konfiguration.
O
OAc
AcOAcO
NH
OCl
N3 O
OAc
AcOAcO
HN
O
N3
Cl-9 10
Skema 2. udskiftning af -chlor med azid i -position.
Efterfølgende reduktion af glycosyl azidet 10 vil danne den ønskede amin på C1, men inden
reduktion og afbeskyttelse, skal N-H oxideres til N-OH.
Syntesen af 10 fra 8 blev udført efter en metode foreslået af Macmillian et al.30
og forløb uden de
store besværligheder og med et godt udbytte, som ses i skema 3.
O
OH
HOHO
NH
O
OH
O
OAc
AcOAcO
HNCl
O
4 eq Cl
O
DCM, rt
O
OAc
AcOAcO
HN
O
N3
NaN3
TBAHS
DCM, NaHCO3, rt
78%86%8 9 10
Skema 3. Overordnet reaktionsskema for syntese af 10.
30
N-acetyl-D-glucosamin 8 og acetyl chlorid blev blandet og omrørt 3 dage ved stuetemperatur (rt.), så
ligevægten havde god tid til at indfinde sig. Reaktionsblandingen blev oparbejdet og oprenset for at
adskille - og-anomerene. Produktet blev karakteriseret vha. NMR. Udbyttet af -anomeren var på
78%.
Glycosyl chloridet 9 blev opløst i DCM og tetrabutylammonium hydrogensulfat (TBAHS) blev tilsat
sammen med mættet vandigt NaHCO3 og natrium azid. Opløsningen blev omrørt voldsomt i 2 timer
ved rt. indtil TLC viste reaktionen var færdig.
Reaktionsblandingen bestod af et to-fasesystem (vandig og organisk) hvor TBAHS rolle var at være
”phase transfer agent”, mens den voldsomme omrøring øgede kontakten mellem de to faser. Glycosyl
chloridet opløses i den organiske fase, mens den nukleofile azidion befinder sig i vandfasen. TBAHS
øger reaktionshastigheden for reaktionen ved, at den cationiske ammonium-gruppe parres med azid-
anionen, og letter dens overførsel til det organiske solvent, hvor den er meget reaktiv. TBAHS
bevæger sig på den måde mellem de to lag og ekstraherer anioner til det organiske lag.31
Efter oparbejdning og oprensning viste NMR, at det ønskede produkt 10 var dannet. Ideen var nu at
10 skulle oxideres vha. 7 for at danne den ønskede hydroxylamin efter metoden anvendt af Detomaso
et al.27
Bols et al.32
beskriver at 7 kan dannes ud fra ud fra 1,1,1-trifluoriacetone 11 og oxon.c
c Oxon består af 2KHSO5 KHSO4 K2SO4. Det reaktive stof i oxonblandingen er KHSO5.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 18 af 34
Som vist i skema 4, kan det nukleofile oxygenatom på peroxysyren KHSO5 angribe carbonylgruppen
i 11, hvorefter et protonskift gør, at KHSO4 bliver en god leavinggruppe og kan smides ud ved en SN2
lignende mekanisme. Herved dannes 7.
CF3
O OS
OK
O O
O
H
CF3
OS
OK
O O
O
H
O
CF3
OS
OK
O O
OO
CF3
O O
HOS
OK
O OProtonskift
H
117
Skema 4
33. Mekanisme for oxidation af 11 til 7 vha. KHSO5.
Det forventes, at 7 kan reagere videre med amidnitrogenet på 10, som vist i skema 5. Nitrogen atomet
kan lave et nukleofilt SN2-lignende angreb på det ene oxygenatom i 7, hvorved bindingen mellem de
to oxygenatomer brydes. Der dannes et tetraederisk intermediat, og efter et protonskift bliver
hydroxylgruppen en god leavinggruppe. Carbonylgruppen i 11 gendannes, samtidig med at amid-
nitrogenatomet i 10 bliver oxideret til hydroxylamidet 12.
CF3
CF3
O ON
O
R
H CF3N
O R
HO
Protonskift
N
O
R
OH
O
CF3N
O R
O
O
H O
7 tetraederisk intermediat 11
Skema 5. Generel mekanisme for oxidation af amid til hydroxylamid vha. 7.
Glycosyl azidet 10 blev opløst i acetonitril (MeCN) og vand i en kolbe med tøris-acetone kondenser
og nedkølet til 0 oC på isbad. 11 og NaHCO3 blev tilsat efterfulgt af oxon. Rollen af NaHCO3 i
opløsningen er at sørge for det dannede KHSO4 i skema 4 er neutralt, og ikke findes i opløsningen
som KSO4-.
Reaktionsblandingen blev herefter omrørt ved rt., mens reaktionen blev fulgt med TLC. Efter 1 døgn
var der ikke tegn på, at nogen reaktion var sket, så reaktionsblandingen blev oparbejdet, og en 1H-
NMR prøve viste, at NMR spektret var identisk med spektret for 11, der er vedlagt som bilag. Vigtigt
var det, at der stadig kunne observeres en dublet ved 5.58 ppm med Jd=9.2 Hz, der stammer fra N-H.
O
OAc
AcOAcO
HN
O
N3CF3
OO
CH3CN, H2O
NaHCO3, 0 oC
O
OAc
AcOAcO
N
O
N3
OH
0%10 12
Skema 6. Overordnet reaktionsskema.
Der blev ikke brugt mere tid på denne fremgangsmåde. I stedet blev en anden fremgangsmåde
forsøgt.
7.2 Oxidation af amin med 2.2-dimethyldioxiran
Den næste plan for at syntetisere 1 er inspireret af en artikel af Wittman et al.34
, der angiver en
metode til oxidation af en amin til en hydroxylamin ved hjælp af 2,2-dimethyldioxiran 13 uden videre
oxidation til nitro-gruppen.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 19 af 34
Wittman et al. har blandt andet oxideret -methyl glycosidet af 3,4,6-triacetylglucosamin 14, vist i
figur 19, med et godt udbytte.
O
OAc
AcOAcO
H2N
OCH3 O
OAc
AcOAcO
N
OCH3
OHH
O O
acetone, -45 oC til rt76%
13
14
Figur 19. oxidation udført af Wittman et al.
34
Ifølge Wittman et al. opløses 14 i acetone ved -45 oC, hvorefter 13 tilsættes. Reaktions-blandingen
varmer derefter op til rt. Udbyttet for reaktionen angives til 76%. I forsøg på at syntetisere 1 ud fra
denne procedure, bruges som udgangsstof D-glucosamin hydrochlorid 15.
Strategien er først at beskytte hydroxygrupperne på 15 som acetyler, hvorefter aminen på C2 skal
oxideres til hydroxylaminen vha. 13 og efterfølgende acetyleres. Til sidst skal det anomeriske carbon
modificeres til et azid i -position. Efter afbeskyttelse af hydroxygrupperne, kan azidet reduceres til
NH2-gruppen, hvorved 1 er fremstillet.
Acetyleringen af 15 blev udført som beskrevet af Myszka et al.35
NH2-gruppen blev først beskyttet
med p-anisaldehyd, hvorefter de frie hydroxygrupper blev acetyleret med eddikesyre anhydrid
(Ac2O) i pyridin. Fjernelsen af p-methoxybenzylidene gruppen skete med HCl i acetone.
Reaktionerne forløb uden besværligheder og med godt udbytte som vist i skema 7.
O
OH
HOHO
NH2OH
HCl
O
OH
HOHO
NOH
O
O
O
NaOH
O
O O
N71%
15
16
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
86%
O
OAc
AcOAcO
NH2
OAc
92%
O5M HCl
OO
HCl
17
18
Skema 7. Overordnet reaktion for syntese af 1,3,4,6-tetra-O-acetyl--glucosamine hydrochloride 18.
Skema 8 viser mekanismen for imindannelsen mellem aldehydet og aminen 15. Beskyttelse af en
NH2-gruppe som en imin er langsom reaktion uden syrekatalyse, fordi OH-gruppen er en dårlig
leavinggruppe og derfor svær at smide ud fra det tetraederiske intermediat. Vand til stede i
opløsningen, dannet ved reaktion mellem HCl og NaOH, protonerer OH-gruppen, så den bliver en
bedre leavinggruppe. Efterfølgende kan den dannede hydroxid-ion deprotonerer den dannede imin,
hvorved vand gendannes.
O
OH
HOHO
NH2OH
O
O
protonskift O
OH
HOHO
NH OH
HO
O
HO
H
O
OH
HOHO
NH OH
H2O
O
H2O15
-H2O
O
OH
HOHO
NOH
O
H
HO
O
OH
HOHO
NOH
O
H2O
16
Skema 8. Mekanismen for beskyttelse af amin på 15 med p-anisaldehyd (imin-dannelse).
36
Iminer er normalt ikke særligt stabile og vil hurtigt hydrolyseres hurtigt tilbage til en primær amin og
et aldehyd, men da carbon fra dobbeltbindingen i dette tilfælde bærer en aromatisk substituent, er
iminen stabil. Dette skyldes, at amin dobbeltbindingen er i konjugation med den aromatiske ring.37
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 20 af 34
Iminen kan dog nemt hydrolyseres tilbage til den primære amin og aldehydet ved tilsætning af vandig
syre, hvilket udnyttes senere til afbeskyttelse af aminen.
Acetylering af hydroxygrupperne er vist i skema 9 og foregår ved, at pyridin, der er en svag base og
mere nukleofil end alkoholerne, angriber Ac2O og danner et meget elektrofilt intermediat pga. den
positive ladning. Dette intermediat reagerer derefter med alkoholerne og danner esterfunktionaliteten.
O
O O
N
O
O O
N
O
O
N
O
O
OH
HOHO
N
O
N
O
OH
O
OH
HOHO
N
O
OHO
OH
HOHO
N
O
OH
O
N
mutarotation
HN1616
O
OH
HOHO
N
O
O
O
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
17
Skema 9. Mekanisme for acetylering af hydroxygrupper
38.
Pyridin øger reaktionens hastighed ved at virke som nukleofil. Da pKa af pyridin er 5.23 og pKa af
acetat er 4.75, vil pyridin forbruges i reaktionen, når den deprotonerer den dannede ester, da det er
den stærkeste base. Da pyridin tilsættes som solvent, dvs. i stort overskud, er det dog ikke noget
problem, at den forbruges.
Det er kun -formen af 16, der acetyleres, da -isomeren er sterisk hindret på grund af den store
gruppe på C2. og -isomererne er i ligevægt, da hemiacetalen kan åbnes og lave mutarotation.
Ligevægten mellem og -isomererne drives mod -formen, da denne forbruges i reaktionen.d
Iminen kan efterfølgende hydrolyseres til aminen ved hjælp af syre, som vist i skema 10. Herved
dannes 18, der nu er klar til at blive oxideret.
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
H Cl
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
H
HO
H
O
OAc
AcOAcO
NH2
O
OAc
OH
Protonskift
Cl17
O
OAc
AcOAcO
NH2
OAc O
O H
Cl
O
OAc
AcOAcO
NH2
OAc
HClO
O
+
18
Skema 10. Mekanisme for hydrolyse af imin.
Efter inspiration af Wittman et al. er planen nu at aminen i 18 skal oxideres til hydroxylaminen 19
vha. 13, som vist i skema 11 på næste side. Wittman et al. opløser aminen i acetone og tilsætter
derefter 13.
Ifølge Murray et al.39
kan 13 dannes i en opløsning af vand, acetone, NaHCO3 og oxon.
Strategien er derfor at danne 13 direkte i reaktionsblandingen hvor den skal bruges. NaHCO3 opløser
HCl-saltet 18 og, som tidligere, neutraliserer KSO4- dannet i reaktionen.
d ifølge Le Châteliers princip
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 21 af 34
O
OAc
AcOAcO
NH2
OAc
O O O O
O
OAc
AcOAcO
HN
OAc
OH
KHSO5
18 19
13
Skema 11. Overordnet reaktionsskema for oxidation af amin 18 med 2,2-dimethyldioxiran 13.
18 blev opslemmet i vand, acetone (104 eq), MeCN og NaHCO3 i en rundbundet kolbe med en
tøris/acetone kondenser (-78 oC) og blev nedkølet på isbad til 0
oC. Der blev først forsøgt med
MeCN-tøris-bad på -40 oC, men så frøs hele reaktionsblandingen til is.
Oxon blev tilsat ad flere gange (i alt 2 eq) og reaktionen blev fulgt med TLC. Efter 1 time var alt
udgangsstof omdannet. Efter oparbejdning af reaktionsblandingen kunne produktet identificeres som
en nitron 20, vist i skema 12, vha. NMR og MS.
Reaktionen blev afprøvet igen på samme måde. Denne gang dog på mindre skala og med mindre
acetone (10 eq). I stedet for acetone blev som solvent tilsat mere MeCN samt MeOH, for at sænke
reaktionsblandingens solidificeringspunkt.
Reaktionsblandingen blev nedkølet til -40 oC i et MeCN/CO2 is bad. Oxon (2 eq) blev tilført af flere
gange, og reaktionen blev fulgt med TLC. Det tog nu længere tid, før der kunne observeres en
reaktion på TLC, men dette kan skyldes, det var sværere at fremkalde og aflæse TLC-pladerne på
grund af, der var tilsat MeOH. Inden TLC pladerne kunne fremkaldes, skulle de først varmes svagt på
varmeovnen, da der ellers kun var en stor lang plet at se på TCL pladen. Efter 6 timer blev reaktionen
oparbejdet. NMR og MS viste der igen var dannet en nitron, samt at ikke alt udgangsstof havde
reageret.
Dannelsen af en nitron tyder på, at det ønskede 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-N-hydroxy--D-glucosyl amin
19 er dannet i reaktionene, men da hydroxylaminen er meget nukleofil på grund af -effekten, kan
den reagere videre med overskydende acetone i opløsningen og danne en nitron 20, vist i skema 13.
O
OAc
AcOAcO
HN
OAc
OH
O
O
OAc
AcOAcO
HN
OAc
HO O
Protonskift
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
HO OH2
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
OOH H
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
O
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
HO HO HO
H
H2O
H2O
19
20A
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
O20B
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
O
Skema 12. mekanisme for dannelsen af nitron.
Det er bemærkelsesværdigt, at Wittman et al. kun får dannet en hydroxylamin og ikke en nitron, da
de også bruger acetone som solvent i deres oxidation.
e Mekanismen for oxidation af acetone til 13, er den samme som vist i skema 4, side 18, og oxidationen af 18 til 19
forløber på samme måde som vist i skema 5, side 18.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 22 af 34
For begge reaktioner kunne i lavtopløseligt MS observeres en moltop ved m/z=426.1 som svarer til
den eksakte masse af nitronen 20 (403.1) plus massen af natrium (23.0). Den eksakte masse af den
ønskede hydroxylamin 19 er m/z=386.1 (363.1+Na) og kunne ikke opserveres i nogen af spektrerne
for de to reaktioner. I reaktionen, hvor der kun var tilsat et lille overskud af acetone var der en top ved
370.1 som passer med den eksakte masse af udgangsstoffet 18 plus natrium.
Der blev ikke brugt tid på at oprense reaktionsblandingerne, da de ikke indeholdt det ønskede
produkt. De optagne 1H-NMR spektre er derfor vanskelige at tilordne, da der i det ene tilfælde er
både produkt og udgangsstof i spektret, samt at der tilsyneladende er hindret rotation omkring C-N
bindingen, hvilket giver ophav til at visse hydrogenatomer giver forskellige signaler. I begge spektre
bemærkes 4 s ved 1.54, 1.50, 1.32 og 1.30 ppm, der to og to har samme intensitet. Forholdet mellem
dem er 2:3, og de må hver svare til 3 hydrogen-atomer fra CH3-grupperne på nitronen 20, men er fra
hver sin konformation A og B, vist i skema 12. Ved hjælp af 1H-COSY er signalerne dog tilordnet,
men det kan ikke umiddelbart afgøres hvilke signaler, det hører til hhv. A og B konformationen.
Spektret for 1H-NMR af det første forsøg, med overskud af acetone, er vedlagt som bilag.
7.3 Syntese af oxaziridin med mCPBA
En anden måde at danne en hydroxylamin på er at oxidere en primær amin ved først at danne en imin,
oxidere denne til en oxaziridin og efterfølgende hydrolysere denne.
Ito et al.40
anvender denne fremgangsmåde til at oxidere en primær amin til en hydroxylamin. Først
reagerer aminen med p-anisaldehyd og danner iminen, hvorefter denne oxideres med 3-
chloroperoxybenzoesyre (mCPBA) i 1,2-dichlorethan til en oxaziridin. Hydroxylaminen kan i følge
Ito et al. dannes ved hydrolyse af oxaziridinen vha. hydroxylamin hydrochlorid, NH2OH i HCl.
Tidligere i projektet blev 17 syntetiseret. For at danne 1 er planen at oxidere 17 til en oxaziridin, og
efterfølgende hydrolysere denne til hydroxylaminen 19, der efter acetylering af frie hydroxygrupper,
skal modificeres, så der sidder et azid på C1 i -position, der kan reduceres til en amin.
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc= N
R
R'
OO
HO
Cl=
OO
HO
R''
HH
17
NR
R' HO
O
H O
R''
NR
HR'
O
OH
O
R''
H-ClN
R
HR'
O
HN
R
HR'
O
H
NH2OH
NR
HR'
O
H
NHR
HR'
ON
Protonskift
H OH
-HH
NOH
H
H
O
N
OH
O
OAc
AcOAcO
NH
OAc
HO
+
19
1721
21
Skema 13. mekanisme for dannelse af oxaziridin og efterfølgende hydrolyse.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 23 af 34
Som det ses på skema 13, sker dannelsen af oxaziridinen i et enkelt conserted trin. Den nukleofile
dobbeltbinding på 17 angriber det ene elektrofile oxygenatom på mCPBA, samtidig med at de to
elektroner fra O-H bindingen angriber dobbeltbindingen. Hydrogen atomet fra O-H bindingen
overføres til oxygenatomet i carbonylen på mCPBA, der efter reaktionen bliver omdannet til en 3-
chlorobenzosyre.
Den dannede oxaziridin 21 kan derefter protoneres på N, hvorved den treleddede ring åbnes og
danner en carbokation, der kan stabiliseres ved hjælp af et lonepair på oxygenatomet. Hydroxyl-
aminen kan angribe denne oxonium ion og alt i alt dannes den ønskede hydroxylamin 19 samt 4-
methoxybenzaldehyd oxim 21, som ses på skema 13.
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAcmCPBA
Na2CO3
ClCH2CH2Cl
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
O
10-14%
1722
Skema 14. Overordnet reaktionsskema for syntesen af oxaziridin 22.
Den ønskede oxidation, som ses på skema 14, blev udført to gange som beskrevet af Ito et al., og
begge gange var udbyttet meget dårligt. 17 blev opløst i dichlorethan og omrørt på isbad. Na2CO3
(1.4 eq) og mCPBA (1.1 eq) blev tilsat, hvorefter reaktionsblandingen blev omrørt 1 time på isbad, og
derefter natten over ved rt. TLC viste, at der var dannet et stof, der var mindre polært end
udgangsstoffet, og som derfor løb længere på TLC, samt at der var dannet stof, der stort set ikke løb
meget anderledes end udgangsstoffet. Reaktionen blev oparbejdet ved at tilsætte vand og ekstrahere
med DCM, hvorefter den organiske fase blev vasket med en mættet vandig opløsning af NaCl og
tørret med MgSO4. Produktet blev oprenset ved hjælp af søjlechromatografi i 1:2 ethylacetat
(EtOAc):pentan. Der blev opsamlet 3 fraktioner.
1H-NMR og MS viste, at produktet var oprenset dårligt, da udgangsstof 17 og produkt 22 var
copolært i det valgte solventsystem, og derfor adskilles dårligt på søjlen. Ud over 17 og 22 viste MS
og 1H-NMR, at der var dannet p-anisaldehyd. Dette kan skyldes, at der ikke har været nok base
tilstede i reaktionsblandingen, så iminen 17 er blevet hydrolyseret til 18 (af 3-chlorobenzoesyre) efter
samme mekanisme som vist i skema 10, side 20. Underligt nok ses 18 ikke i hverken MS eller 1H-
NMR. Dette skyldes måske, at 18 er meget mere hydrofil end 17 og 22 og derfor ikke er blevet
ekstraheret med over i den organiske fase ved oparbejdningen.
Udbyttet af oxaziridinen var på 10%, mens kun 4% af udgangsstoffet var opsamlet. Resten af stoffet
må være gået tabt undervejs i reaktionen, muligvis er det blevet i vandfasen under oparbejdningen.
Forsøget blev udført igen. Denne gang blev reaktionsblandingen omrørt 2 timer på isbad, og henstod i
alt 2 dage ved rt. Der blev tilsat i alt 4,7 eq Na2CO3 og 3,6 eq mCPBA. Reaktionen oparbejdes som
tidligere i beskrevet men denne gang uden at tilsætte vand. I stedet tilsættes DCM efterfulgt af mættet
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 24 af 34
vandigt NaHCO3. Til oprensningen blev der denne gang som eluent anvendt 1:10 EtOAc:DCM. Der
bemærkes en interessant ting ved skift af eluent i forhold til det forrige forsøg.
Skitse af TLC-plader
u c p
1:2 ethyl acetate pentan
u c p
1:10 ethylacetat :DCM
Når der anvendes 1:2 EtOAc:pentan løber
oxaziridinen længere end produktet, mens det er
omvendt, når der som eluent anvendes 1:10
EtOAc:DCM. Der opsamles ligesom i det forrige
forsøg 3 fraktioner. 17 og 22 er denne gang bedre
adskilt i den valgte solventsystem.
Produktet karakteriseres på samme måde som i det tidligere forsøg ud fra MS og NMR. Udbyttet for
denne reaktion er 14%, og kun 12% af udgangsstoffet er opsamlet. Denne fremgangsmåde er ikke
særligt effektiv til syntese af den ønskede oxaziridin, og der går meget stof til spilde undervejs.
Måske er det anvendte mCPBA ikke særligt godt, da det ikke er helt nyt, og muligvis er meget
mCPBA omdannet til den korresponderende syre. Oxaziridinen forsøges i stedet at blive fremstillet
ud fra en anden metode.
7.4 Syntese af oxaziridin med mmpp
Gould et al. 41
fremstiller en imin ud fra en primær amin og p-anisaldehyd og oxiderer derefter
iminen til den tilsvarende oxaziridin vha. magnesium monoperoxyphthalate hexahydrate (mmpp).
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
H
O
O
O
O
OH
2
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
H
Mg2+
O
38%
2217
Skema 15. Overordnet reaktionsskema for syntese af oxaziridin vha. mmpp.
Mekanismen for oxidationen er som vist på skema 14.
Denne fremgangsmåde forsøges først på lille skala (0.200g sukker) med bedre udbytte end i de to
forrige forsøg med mCPBA. Iminen opløses i diethylether (Et2O) og absolut ethanol (EtOH) og
omrøres ved 0oC, hvorefter mmpp tilsættes og omrøres 2½ time. TLC viser at der stadig er
udgangsstof tilbage, så der tilsættes ekstra mmpp (i alt 2,4 eq), hvorefter blandingen omrøres ved rt
natten over. Efter oparbejdning og oprensning viser MS og NMR at oxaziridinen er dannet med et
udbytte på 38%. Denne fremgangsmåde forsøges igen på større skala (5.00g) med et udbytte af
oxaziridinen på 28%.
Vandfasen fra oparbejdningen gemmes (den er ugennemsigtig og gullig), da den måske indeholder
noget af udgangsstoffet, der er blevet hydrolyseret til 18, eller noget af den dannede oxaziridin, der er
hydrolyseret til hydroxylaminen 19, og derfor er for polær til at blive trukket med over i den
organiske fase ved ekstraktionen. Vandfasen inddampes med toluene, hvorefter Ac2O og pyridin
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 25 af 34
tilsættes og omrøres 2 timer, for at acetylere frie hydroxygrupper og gøre stoffet mere upolært.
Reaktionsblandingen oparbejdes og oprenses, men MS og NMR viser at de oprensede stoffer ikke er
nogen af de forventede stoffer (17, 18, 22 eller 23) hvorefter der ikke gøres mere ud af dette.
7.5 Hydrolyse af oxaziridin
Den dannede oxaziridin 22 skal nu hydrolyseres til 19. Som tidligere nævnt kan hydrolysen af
oxaziridinen udføres med NH2OH i HCl ifølge Ito et al.40
Mekanismen for hydrolysen er tidligere
angivet i skema 13, side 22.
Oxaziridinen opløses i MeOH, hvorefter NH2OH i HCl tilsættes og reaktionsblandingen omrøres ved
rt. i 1 døgn. Reaktionsblandingen inddampes, hvorefter der tilsættes Ac2O og pyridin for at acetylere
hydroxylaminen 19 og frie OH-grupper. Den dannede N-OH på 19 er som sagt en god nukleofil, og
kan tage en acetyl fra andre sukre i opløsningen på C1,3,4 og 6-positionen.
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
O
NH2OH HCl
MeOH O
OAc
AcOAcO
NAc
OAc
AcO
O
O O
N
1)
2)
N
OH
+
O
22
0%23
O
OAc
AcOAcO
NH
OAc
HO19
N
OAc
+
O21
Skema 16. hydrolyse af oxaziridin vha. NH2OH∙HCl.
Reaktionsblandingen oparbejdes og oprenses vha. søjlekromatografi. Der opsamles 3 forskellige
fraktioner. 1H-MNR og MS viser at der er dannet 21 (m/z=216,0 inkl. Na). I de to andre fraktioner er
der en moltop ved hhv. m/z=413.2 og m/z=398.0, der ikke passer med den forventede masse af det
ønskede produkt 23 på m/z=470.1 (m/z=447.1+Na). Massen af produktet, hvis det havde tabt en
acetyl eller to passer heller ikke med de observerede masser. Der blev ikke brugt tid på at
karakterisere de dannede produkter yderligere.
I stedet blev hydrolysen forsøgt udført med 5M HCl i tetrahydrofuran (THF).
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
O
HCl
THF O
OAc
AcOAcO
NAc
OAc
AcOO
O O
N
1)
2)
O
+
O
19%22 23
Skema 17. syre-hydrolyse af oxaziridin 22.
Mekanismen for hydrolysen forløber på samme måde som med NH2OH i HCl, og ses i skema 18. Der
dannes dog et aldehyd (p-anisaldehyd) i stedet for en oxim.
NR
HR'
O
H-Cl NR
HR'
O
H NR
HR'
O
H NR
HR'
O
H
HO
H
NHR
HR'
OO
Protonskift
H H
R' H
O
R NHOH
-H
H2O
Skema 18. Mekanisme for hydrolyse af oxaziridin vha. syre.
Reaktionen blev først udført på lille skala (0.08g). MS viste en masse på m/z=341.1, der ikke passer
med massen af 23. I 1H-NMR ses der ikke aromatisk signaler, så 22 må være blevet hydrolyseret,
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 26 af 34
men på grund af tidsmæssige årsager, blev der ikke brugt tid på at karakterisere produktet yderligere.
Muligvis har udbyttet af reaktionen været så lavt, at det ønskede produkt var svært at oprense
ordentligt. I stedet blev reaktionen gentaget på større skala (0.74g), Denne gang viser MS en moltop
ved m/z= 470.1, hvilket passer fint med det ønskede produkt 23 (m/z=447.1+Na).
Der blev optaget 1H-NMR af produktet, men der er sket en fejl, så spektret ikke er blevet gemt på
computeren, og derfor er det ikke muligt at karakteriserer produktet vha. NMR, da alt stoffet blev
brugt i den næste reaktion. Ved højtopløseligt MS har stoffet m/z=470.1268 (litteratur: 470.1274), så
det passer meget godt med, at der er 23 der er blevet dannet. Udbyttet var på 19%.
7.6 Substitution af acetyl på C1 med azid
For få syntetiseret 1 mangler acetylen på C1 på 23 at blive udskiftet med et azid, der kan reduceres til
en amin. For at gøre dette reageres 23 med HBr efter en metode foreslået af Rye et al.42
. Først dannes
-isomeren på grund af nabogruppe effekten, men på grund af effekten er brom mere stabil i
position og udskiftes af en anden bromidion i opløsningen, så -isomeren dannes. Mekanismen er
som vist på skema 1, side 16.
O
OAc
AcOAcO
NAc
OAc
AcO
HBr, CH3COOH
DCM
O
OAc
AcOAcO
AcN BrAcO23
24
NaN3
TBAHS
DCM, NaHCO3, rt
O
OAc
AcOAcO
AcN
N3
AcO25 0%
Skema 19. Overordnet reaktionsskema for syntese af glycosyl azid 25.
23 opløses i tørt DCM og omrøres på isbad under nitrogen atmosfære. HBr i eddikesyre (33%)
tilsættes. Reaktionen får lov til at varme op til rt., mens reaktionen følges med TLC. Der tilsættes
løbende ekstra HBr (i alt 12 eq). Da TLC viser at alt udgangsstof er omdannet, oparbejdes reaktionen
hurtigt, da bromforbindelsen er ustabil, hvorefter produktet med det samme reageres videre med
natrium azid, efter proceduren tidligere anvendt30
(NaN3, TBAHS, NaHCO3). Efter 1 døgn
oparbejdes reaktionsblandingen og oprenses ved hjælp af søjlechromatografi.
MS viser, at det dannede produkt ikke er det ønskede glycosyl azid. Da glycosylbromidet er meget
ustabilt, kan det hydrolysere og danne –OH på C1, der kan efterfølgende kan acetyleres, ved at tage
en acetyl fra nitrogen, som vist i skema 20. Denne forbindelse 26 ses på MS (m/z=428.2 inkl. Na).
O
OAc
AcOAcO
AcN BrAcO
24
O
OAc
AcOAcO
AcN OAcH
O HO
OAc
AcOAcO
AcN
O
OH
O
O
OAc
AcOAcO
AcN
HO
OAc
26
Skema 20. hydrolyse af glycosyl bromid og efterfølgende acetyl-overførsel.
Da der ikke var mere tid til at udføre flere forsøg stoppes projektet her, selvom projektets formål ikke
er nået og N-acetyl-N-hydroxy glucosylamin 1 ikke er blevet syntetiseret.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 27 af 34
8. Konklusion
For at kunne undersøge om den naturlige glycosyl amid binding mellem N-acetyl-N-hydroxy
glucosyl aminen og en thioester i vandige omgivelser kan dannes, skal den ønskede hydroxylamin
først syntetiseres.
Dette blev forsøgt på flere forskellige måder, men de i litteraturen fundne metoder var ikke alle lige
anvendelige til introduktion af hydroxyl gruppen på nitrogen atomet.
Først blev metoden angivet Detomaso et al. afprøvet til oxidation af amidfunktionaliteten på 10 ved
hjælp af methyl(trifluoromethyl)dioxiran, men der skete ingen reaktion. Dernæst blev metoden
angivet af Wittman et al. afprøvet, hvor 2,2-dimethyldioxiran i acetone skulle kunne oxidere en amin
til en hydroxylamin. I dette tilfælde blev der i stedet dannet en nitron.
En anden metode til syntese af en hydroxylamin, er først at danne en imin, og efterfølgende oxidere
denne med en peroxysyre til den tilsvarende oxaziridin, hvorefter denne kan hydrolyseres til
hydroxylaminen.
Syntesen af oxaziridinen blev først forsøgt ved at oxidere en imin med mCPBA, men med dårligt
udbytte. Tilsyneladende er den anvendte peroxysyre i mCPBA omdannet til syre, der hydrolysere den
dannede imin tilbage til aminen og aldehydet. Efterfølgende blev metoden afprøvet ved at anvende
mmpp til oxidationen og med bedre udbytte.
Den dannede oxaziridin blev forsøgt hydrolyseret med NH2OH i HCl, som beskrevet af Ito et al. men
denne fremgangsmåde gav ikke den ønskede hydroxylamin. I stedet lykkedes det at hydrolysere
oxaziridinen ved hjælp af HCl i THF, hvorefter den dannede hydroxylamin blev acetyleret. Uheldige
omstændigheder medførte, at karakteriseringen af den acetylerede hydroxylamin begrænsedes til MS.
For at danne den ønskede N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amin skulle den fremstillede hydroxylamin
modificeres, så der sad en amin i -positionen på C1. Dette forsøgtes udført ved først at reagere
glycosidet med HBr, men den dannede bromforbindelse var så ustabil, at den hydrolyserede,
hvorefter den blev acetyleret ved reaktion med en acetyl fra nitrogenatomet på C2.
Da der ikke var mere hydroxylamin tilbage, blev projektet stoppet her, da der ikke var mere tid til at
lave flere forsøg.
Det havde været meget interessant at afprøve om amidbindingen kunne være blevet dannet, men det
var desværre ikke muligt, da det ikke lykkedes at syntetiseret N-acetyl-N-hydroxy glucosyl amin.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 28 af 34
9. Experimental
9.1 General synthetic methodologies
All bought chemicals were used without any purification. Organic solvents were concentrated under
vacuum with temperature at 40 °C. Reactions were followed with TLC. The TLC’s were developed
by supplying CeMol-developer (cerium (IV) sulphate (0,2%) and ammonium molybdat (5%) in 10 %
sulphuric acid) or potassium permanganate (KMNO4 0,5% in 1 M NaOH) and applying heat until
visible spots appeared. Columns for flash columns chromatography were packed with silica gel 60
(230-400 mesh) as the stationary phase and distilled solvents as eluents.
9.2 Apparatus
1H and
13C NMR experiments were carried out at a Varian Germini 400 spectrometer.
1H NMR was
carried out at 400 MHz and 13
C NMR at 100 MHz. MS experiments were carried out as electrospray
experiments on a Micromass LC-TOF spectrometer.
9.3 Synthesis
O
OAc
AcOAcO
HNCl
O9 Synthesis of 2-Acetamido-2-Deoxy-3,4,6-Tri-O-Acetyl--D-Glucopyranosyl Chloride30 (9)
N-Acetyl D-glucosamine 8 (5.00 g, 22.6 mmol) was added to stirring acetyl chloride (10.0 mL) and
the resulting suspension was stirred magnetically under nitrogen atmosphere for 3 days at rt. DCM
(40 mL) was then added and the resulting solution was poured into ice (40,0 g) and water (10,0 mL)
with stirring. The organic layer was immediately separated and run into saturated aqueous NaHCO3
(40.0 mL) and ice with stirring, the neutralisation being completed in a separating funnel. The organic
layer was then separated and dried with MgSO4. The organic layer was then filtered with suction and
the residue washed thoroughly with DCM. The resulting solution was concentrated under vacuum.
The crude product was purified by flash chromatography over silica (eluent gradually changed from
1:2 EtOAc:pentane =>EtOAc) to afford the product (6.445 g, yield 78 %, the -anomer) as a white-
yellow crystalline solid.
Anomer: 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 1.98 (3H, s, CH3CO), 2.04 (6H, s, 2xCH3CO), 2.09 (3H,
s, CH3CO), 4.30-4.10 (3H, m, H-6a, H-6b, H-5), 4.53 (1H, ddd, JH2-H1=3.6 Hz, JH2-NH=8.8 Hz, JH2-
H3=12.4 Hz, H-2), 5.20 (1H, dd, JH4-H3=9.6 Hz, JH4-H5=12.0 Hz, H-4), 5.31 (1H, dd, JH3-H4=9.6 Hz,
JH3-H2=10.8 Hz, H-3), 5.83 (1H, d, JNH-H2=8.8 Hz, N-H), 6.18 (1H, d, JH1-H2=4.0 Hz, H-1).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): =20.8, 20.9 (2C), 23.3, 53.7, 61.4, 67.2, 70.4, 71.1, 93.9, 169.3,
170.3, 170.8, 171.7.
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 29 af 34
O
OAc
AcOAcO
HN
O
N3
10
Synthesis of 2-Acetamido-2-Deoxy-3,4,6-Tri-O-Acetyl--D-Glucopyranosyl Azide30 (10)
To a solution of the glycosyl chloride 9 (6.372 g, 17.4 mmol) in DCM (65.0 mL), TBAHS (5.962 g,
17.5 mmol) and saturated aqueous NaHCO3 (65.0 mL) was added followed by sodium azide (3.406 g,
52.1 mmol). The resulting biphasic solution was stirred vigorously at rt. for 2 h. The solution was
poured into a separation funnel and extracted with EtOAc (3x100 mL), the organic layer was
separated and washed with saturated aqueous NaHCO3 (2x60 mL), water (2x60mL) and brine
(1x60mL). The organic phase was then dried over Na2SO4 and the solvent removed under vacuum.
The crude was purified flash chromatography over silica (eluent: 1:2 pentane:EtOAc) to afford the
product (5.598 g, 86%).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 1.98 (3H, s, CH3CO), 2.03 (3H, s, CH3CO), 2.04 (3H, s, CH3CO),
2.10 (3H, s, CH3CO), 3.78 (1H, ddd, JH5-H6a=2.4Hz, JH5-H6b=4.8Hz, JH5-H4=10Hz, H5), 3.91 (1H, dt,
JH2-H3=10.8Hz, JH2-H1=9,2Hz, H-2), 4.14 (1H, dd, JH6a-H5=2.4Hz, JH6a-H6b=12.4 Hz, H-6a), 4.27 (1H,
dd, JH6b-H5=4.8 Hz, JH6b-H6a=12.8 Hz, H-6b), 4.75 (1H, d, JH1-H2=9.2Hz, H-1), 5.10 (1H, t, Jt=10.0 Hz,
H-4), 5.24 (1H, t, Jt=10.0 Hz, H-3 ), 5.56 (1H, d, Jd=8.8 Hz, N-H).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.7, 20.8, 20.9, 23.3, 54.2, 62.1, 68.5, 72.4, 74.0, 88.5, 169.5, 170.9
(2C), 171.0.
O
OH
HOHO
NOH
O16
Synthesis of 2-deoxy-2-(p-methoxybenzylidene(amino))-D-glucopyranose35 (16)
To a solution of D-glucosamine hydrochloride 15 (12.5 g, 58.0 mmol) in a freshly prepared aqueous
solution of 1 M NaOH (60.0 mL) under stirring was added p-anisaldehyde (8.5 mL, 70.0 mmol).
After a short time crystallisation began. Then the mixture was refrigerated and after 2 days the
precipitated product was filtered off and washed with cold water, followed by a mixture of 1:1
EtOH:Et2O. The resulting product was dried in an excicator for 1 day, and used without any
characterisation. (Yield: 12,686 g, 71 %)
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 30 af 34
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
17
Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-(p-methoxybenzylidene(amino))--D-
glucopyranose35 (17)
Sugar 16 (12.686g, 42.6 mmol) was added sequentially to a cooled (ice-water) mixture of pyridine
(67.5 mL) and Ac2O (37.5 mL). The mixture was stirred in ice-bath for 1 h and at rt. for 3 days. The
yellow solution was poured into 250 mL of ice-water. The precipitated white product was filtered and
washed with cold water. The crystals were added toluene, which was removed under vacuum. (Yield:
17.076 g, 86%)
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): .87 (3H, s, CH3CO), 2.00 (3H, s, CH3CO), 2.02 (3H, s, CH3CO),
2.08 (3H, s, CH3CO), 3.43 (1H, m, H-2), 3.83 (3H, s, OCH3), 3.96 (1H, ddd, JH5-H6b=2.0 Hz, JH5-
H6a=4.4 Hz, JH5-H4=10.0 Hz, H-5), 4.12 (1H, dd, JH6b-H5=2.0 Hz, JH6b-H6a=12.4 Hz, H-6b), 4.36 (1H,
dd, JH6a-H5=4.4Hz, JH6a-H6b=12.4 Hz, H-6a), 5.13 (1H, t, Jt=9.6 Hz, H-4), 5.41 (1H, t, Jt=9.6 Hz, H-3 ),
5.93 (1H, d, JH1-H2=8.0 Hz, H1), 6.90 (2H, d, Jd=8.8 Hz, Ar-H), 7.64 (2H, d, Jd=8.4 Hz, Ar-H), 8.14
(1H, s, N=CH).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.7, 20.9, 21.0 (2C), 55.6, 62.1, 68.3, 73.0, 73.2, 73.5, 93.4, 114.3
(2C), 128.5, 130.5 (2C), 162. 5, 164.5, 169.0, 170.0, 170.1, 170.9
O
OAc
AcOAcO
NH2
OAc
HCl18
Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl--D-glucosamine hydrochloride35 (18)
Sugar 17 (16.968g, 36.5 mmol) was dissolved in warm acetone (150 mL) and then HCl (5 M, 7.5 mL)
was added with immediate formation of a precipitate (blue colour appeared). The mixture was cooled
in ice-bath, and after addition of Et2O (150 mL) it was stirred for 2 h and refrigerated for 3 days. The
precipitated product was filtered, washed with Et2O and dried on vacuum to give a white powder.
(Yield: 12.852 g, 92%)
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): (6H,s, 2xCH3CO), 2.09 (3H,s, CH3CO), 2.18 (3H,s, CH3CO),
3.64 (1H,dd, JH2-H1=8.8Hz, JH2-H3=10.4Hz, H2), 4.02 (1H, ddd, JH5-H6b=2.4Hz, JH5-H6a=4.8Hz, JH5-
H4=10.0, H-5), 4.12 (1H, dd, JH6b-H5=2.0 Hz, JH6b-H6a=12.4 Hz, H-6b), 4.30 (1H,dd, JH6a-H5=4.8 Hz,
JH6a-H6b=12.8 Hz, H-6a), 5.09 (1H, dd, JH4-H3=9.2Hz, JH4-H5=10.0, H-4), 5.35 (1H, dd, JH3-H4=9.4Hz,
JH3-H2=10.4Hz, H-3), 5.86 (1H, d, JH1-H2=8.8Hz, H-1).
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 31 af 34
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.2, 20.3 (2C), 20.4, 52.5, 61.6, 68.2, 71.0, 72.3, 90.5, 171.4, 172.8,
173.2, 173.7
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
O20A
O
OAc
AcOAcO
N
OAc
O20B
Synthesis of 1,3,4,6-Tetra-O-acetyl-2-deoxy-N-(propan-2-ylidene)--D-glucopyranose-2- amine
oxide34,39 (Nitrone) (20A+20B)
A 100 mL three-necked round bottom flask fitted with a dry ice/acetone condenser, containing a
mixture of 18 (0.5034 g, 1.31 mmol, 1 eq), water (5.0 mL), acetone (10.0 mL, 104 eq), MeCN (5.0
mL), NaHCO3 (0.8850g, 10.54 mmol) and a magnetic stirring bar was cooled to 0 oC in an ice bath.
Oxone (1.602 g, 2.61 mmol, 2 eq) was added sequentially, and the mixture was stirred for ~1 h. DCM
and water was added, and the organic layer was separated in a separating funnel, dried with MgSO4
and concentrated under vacuum. 1H-NMR and MS identify the product as a nitrone.
MS: m/z=426.2 (nitrone+Na).
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): s, N=C-CH3), 1.32 (1.8H, s, N=C-CH’3), 1.50 (1.2H, s,
N=C-CH’3), 1.54 (1.8H, s, N=C-CH3), 1.96-2.18 (12 H, 4xs, 4xCH3CO), 2.82 (0.4H, dd, Jd=8.0,
Jd=10.0, H2), 2.89 (0.6H, dd, Jd=8.4, Jd=9.6 , H2’), 3.88 (1H, ddd, Jd=2.4, Jd=4.8, Jd=10.2, H5), 4.02-
4.08 (1H, m, H6a), 4.28 (1H, dt, Jt=4.4, Jd=12.4, H6b), 5.08-5.02 (1 H, m, H4), 5.42 (0.4H, t, Jt=9.6,
H3), 5.53 (0.6H, t, Jt=9.6, H3’), 5.78 (0.6H, d, Jd=8.4, H1’), 5.97 (0.4H, d, Jd=8.0, H1).
O
OAc
AcOAcO
N
O
OAc
O
22
Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-((4-methoxyphenyl)-1,2-oxaziridine)--D-
glucopyranose with mCPBA40 (22)
Na2CO3 (0.177 g, 1.67 mmol, 1.4 eq) and 3-chloroperoxybenzoic acid (mCPBA, content ca. 57%,
0.384 g, 1.27 mmol, 1.2 eq) were added to a stirred solution of 17 (0.506g, 1.09 mmol) in 1,2-
dichlorethane (25mL) at 0 oC and then the reaction mixture was stirred at the same temperature for 1h
and at rt over night. After adding water (30 mL) and extracting the mixture with DCM, the combined
organic layer was washed with brine, dried over MgSO4 and concentrated under reduced pressure.
The crude was purified by flash chromatography over silica (eluent 1:10 EtOAt:DCM) to give the
required oxaziridine 22. (Yield: 0.052g, 10%)
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 32 af 34
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): s, CH3CO), 2.06 (3H, s, CH3CO), 2.07 (3H, s, CH3CO),
2.15 (3H, s, CH3CO), 2.55 (1H. m, H2), 3.74 (3H, s, OCH3), 3.81 (1H, ddd, Jd=2.4, Jd=4.8, Jd=10.0,
H5), 4.04 (1H, dd, Jd=2.4, Jd=12.4, H6a), 4.25 (1H, dd, Jd=4.8, Jd=12.4, H6b), 4.51 (1H, s, N-C-H),
5.06 (0.33H, t, Jt=9.6, H4), 5.10 (0.67H, Jt=9.6, H4’), 5.42 (0.33H, t, Jt=9.2, H3), 5.64 (0.67H, t,
Jt=9.6, H3’), 5.79 (0.67H, d, Jd=8.8, H1’), 6.05 (0.33, d. Jd=8.4, H1), 6.86 (1H, d, Jd=8.4, Ar-H), 7.25
(1H, d, Jd=8.4, Ar-H).
13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 20.7, 20.8, 20.9, 21.0, 55.5, 61.7, 67.7, 71.4, 73.1, 73.2, 79.1, 91.2,
114.3 (2C), 125.5, 129.2 (2C), 161.6, 168.3, 169.8, 170.2, 170.7. MS m/z=504,2 (481,2+Na)
Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-((4-methoxyphenyl)-1,2-oxaziridine)--D-
glucopyranose with mmpp41 (22)
17 (0.203g, 0.44 mmol), dry Et2O (15 mL) and EtOH (99.9%, 8 mL) were stirred at ice bath under
nitrogen atmosphere. Monoperoxyphathalic acid magnesium salt (0.259g, 1.05 mmol, 2.4 eq) was
added and the resulting mixture was stirred for 2.5 h at 0 oC. mmpp was added once more (0.260 g,
0.526 mmol, 1.2 eq) and the mixture was stirred at rt overnight. After adding DCM and saturated
aqueous NaHCO3, the organic layer was separated and washed saturated aqueous NaCl. The organic
phase was then dried over Na2SO4 and the solvent removed under vacuum. The crude was purified by
flash chromatography over silica (eluent 1:10 EtOAc DCM) to give the oxaziridine 22 (0.080 g, Yield
38% )
O
OAc
AcOAcO
NAc
OAc
AcO23 Synthesis of 1,3,4,6-tetra-O-acetyl-2-deoxy-2-(N-acetoxyacetamido)--D-glucopyranose (23)
Oxaziridin 22 (0.742 g, 1.54 mmol) was dissolved in THF( 20 mL). HCl (5 M, 1,5 mL, 5 eq) was
added sequentially over 2 h while the reaction was followed by TLC (eluent 1:5 EtOAc:pentan). The
mixture was stirred magnetically for 2 days at rt. The resulting mixture was concentrated under
reduced pressure. Water (40 mL) and Et2O (40 mL) was added. The water phase was separated and
extracted with Et2O. The water phase was then added toluene and concentrated under reduced
pressure. Pyridine (15.0 mL) and Ac2O (15.0 mL) was added and the resulting mixture was stirred in
ice-bath for 1 h and at rt. for 2 days. The reaction was poured into an ice-water mixture and extracted
twice with EtOAc. The combined organic phases were washed with 0.1 M HCl, saturated NaHCO3,
brine, dried over MgSO4 and concentrated under reduced pressure. The crude was purified by flash
chromatography over silica (eluent 1:1 EtOAc: pentane). (Product 0.129 g, Yield 19%). MS
m/z=470,1268 (literature: 447.1377+Na). Rf(23)=0.29. (1:2 pentane:EtOAc)
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 33 af 34
10. Referencer
1 http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/staudinger-reaction.shtm
2 Raju, B; Mortell, K; Anandan, S; O’Dowd, H; Gao, H; Gomez, M; Hackbarth, C, Wu, C; Wang, W; Yuan, Z,
White, R; Trias, J, Patel, D.V; Bioorg. Med. Chem. Lett., 2003, 13, 2413-2418
3 Canne, L.E; Bark, S.J; Kent, S.B.H; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5891-5896
4 Yang, Y; Ficht, S; Brik, A; Wong, C; J. Am. Soc., 2007, Published on web 05/25/2007
5 Berg, J. M; Tymoczko, J. L: Stryer, L; Biochemisty; W.H.Freeman and Company, 5. edition, side 307
6 Davis, B.G.; Fairbanks, A.J., Carbohydrate Chemistry; Oxford chemistry primers, side 81-83
7 Pratt, M.R; Bertozzi, C. R; Chem. Soc. Rev, 2005, 34, 58-68
8 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 597-598)
9 Jensen, H. H; Lecture Notes on Peptide Synthesis, Bioorganic Chemistry, 2007
10 Dawson, P.E; Muir, T.W; Clark-Lewis, I; Kent, S.B.H; Science, 1994, 5186, 776-779
11 Brik, A; Wong, C; Chem. Eur. J.; 2007, 13, 5670-5675
12 Macmillan, D; Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 7668-7672
13 Yang, Y; Ficht, S; Brik, A; Wong, C; J. Am. Soc., 2007, 129, 7690-7701
14 Marcaurelle, L.M; Bertozzi, C.R; Glycobiology, 2002, 12, 69R-77R
15 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 605)
16 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 606)
17 Berg, J. M; Tymoczko, J. L: Stryer, L; Biochemisty; W.H.Freeman and Company, 5. edition, side 306-307
18 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 614)
19 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 618)
20 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 620)
21 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 621)
22 Grogan, M.J; Pratt, M.R; Marcaurelle, L.A; Bertozzi, C.R; Annu. Rev. Biochem, 2002, 71, 593-634 (side 623)
23 Kuijpers, B.H.M; Groothuys, S; Keereweer, B.R; Quaedflieg, P.L.M; Blaauw, R.H; Delft, F.L.V; Rutjes, F.P.J.T;
Org.Lett., 2004, 6, 3123-3126
24 Boons, G; Hale, K.J; Organic Synthsis with carbohydrates, 2000, Sheffield Academic Press, s.10-14
25 Davis, B.G.; Fairbanks, A.J., Carbohydrate Chemistry; Oxford chemistry primers, side 15
26 Anslyn, E.V., Dougherth, D.A.; Modern Physical Organic Chemistry; University Science Books: 2006; s. 640
27 Detomaso, A; Curci, R; Tetrahedron Letters; 2001, 42, 755-758
28 Anslyn, E.V., Dougherth, D.A.; Modern Physical Organic Chemistry; University Science Books: 2006; s. 600
29 Davis, B.G.; Fairbanks, A.J., Carbohydrate Chemistry; Oxford chemistry primers, side 10, 14, 32-33
30 Macmillian, D; Daines, A.M; Bayrhuber, M; Flitsch, S.L; Org.Lett., 2002, 4, 1467-1470
31 Anslyn, E.V., Dougherth, D.A.; Modern Physical Organic Chemistry; University Science Books: 2006; s. 507
32 Bols, M; Hazell, R.G; Thomsen, I.B; Chem. Eur. J., 1997, 3, 940-947
33 Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 992
34 Wittman, D.M; Halcomb, R.L; Danishefsky, S.J; J. Org. Chem., 1990, 55, 1981-1983
35 Myszka, H; Bednarczyk, D; Najdar, M; Kaca, W; Carbohydrate Research, 2003, 338, 133-141
36 Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 349
37 Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 350
Bachelorprojekt forår 2007
Århus Universitet
Helle Christensen
Årskort: 20041209
Side 34 af 34
38
Clayden, J; Greeves, N; Warren, S; Wothers, P; Organic chemistry, Oxford University Press, 2001, s. 282
39 Murray, R.W; Jeyaraman, R; J. Org. Chem, 1985, 50, 2847-2853
40 Ito, M; Okui, H; Nakagawa, H; Mio, S; Kinoshita, A; Obayashi, T; Miura, T; Nagai, J; Yokoi, S; Ichinose, R;
Tanaka, K; Kodama, S; Iwasaki, T; Miyaka, T; Takashio, M; Iwabuchi, J; Bioorg. Med. Chem, 2003, 11, 761-768
41 Gould, S.J; Shyhchen, J; J.Am.Chem.Soc, 1992, 114, 10166-10172
42 Rye, C.S; Withers, S.G; J.AM.Chem.Soc., 2002, 124, 9756-9767
top related