riconoscimento dell’antigene -...

Riconoscimento dell’antigene

Risposta immune adattativa

• La risposta immune innata è molto efficiente ma non sempre riesce ad impedire il diffondersi dell’infezione

• È essenziale quindi che subentri la risposta adattativa specifica per il patogeno che sta attaccando in quel momento il nostro organismo

BCR (B-cell receptor) ed anticorpi

• BCR: espresso sulla superficie dei linfociti B • Anticorpo: secreto dalle plasmacellule

• Le due molecole hanno la stessa struttura, gli

anticorpi sono la forma secreta del BCR

• Ci sono diversi tipi di anticorpi (classi), struttura di base simile

Struttura degli anticorpi • Forma a Y, 3 porzioni grossolanamente uguali per dimensioni • Regioni Variabili: coinvolte nel riconoscimento dell’antigene • Regione Costante: interagisce con effettori cellulari e

molecolari della risposta anticorpale • 5 classi di anticorpi: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, diversi nelle loro

regioni costanti • Esempio struttura IgG: 150kd, composta da 4 molecole

• Due catene pesanti (heavy chain), di 50kDa, legate tra solo da ponti disolfuro

• Due catene leggere (light chain), di 25kDa, legate alla catena pesante da un ponte disolfuro

• Due tipi di catene leggere: κ and λ, con funzione equivalente

• Una IgG possiede due siti leganti l’antigene per molecola, il che aumenta la forza totale dell’interazione antigene-anticorpo (avidità)

• Il BCR è identico come struttura ma la regione c-terminale della catena pesante (regione costante) contiene una sequenza idrofobica che lo ancora alla membrana

IgG

Il dominio Ig • Lungo circa 110 aa • Catene leggere: composte da due domini Ig • Catene pesanti: composte da quattro domini

Ig • Il primo dominio amino-terminale di

entrambe le catene è caratterizzato da grande variabilità in funzione dell’anticorpo, gli altri domini sono conservati per ciascuna classe di anticorpo

• VH e VL • CL e CH1-3

Frammenti proteolitici degli anticorpi

• Varie proteasi possono digerire in maniera limitata le molecole di anticorpi generando frammenti che contengono porzioni diverse della molecola

• Fab (fragment antigen binding); Fc (fragment crystallizable) • F(ab’)2: le due braccia leganti l’antigene restano unite tramite il ponte disolfuro

• Gli anticorpi sono molecole estremamente flessibili, il che consente variabilità nella formazione del complesso antigene-anticorpo

Interazione antigene-anticorpo

• La variabilità delle regioni variabili si concentra in alcune zone dette regioni ipervariabili (HV1-3)

• Le HV si intervallano con le regioni “framework” (FR1-4) meno variabili, più importanti nel folding vero e proprio

• Le sei regioni ipervariabili formano il sito di legame per l’antigene, e sono dette anche “complementarity-determining regions” (CDRs), perchè sono complementari alla superficie dell’antigene

• Poichè le CDR sono formate dalle due catene, la specificità anticorpale può essere influenzata anche dalla combinazione delle due diverse catene

Struttura del legame antigene-anticorpo

• La superficie legante l’antigene comprende le CDR delle due catene (H ed L) • Un piccolo antigene (gli antigeni di piccole dimensioni vengono chiamati apteni e ne parleremo

più avanti) di solito interagisce con una superficie (un “solco”) che si genera fra le due catene • Molecole più grosse (regioni di proteine) possono avere multiple superfici di interazione molto

più estese • Il tipo di legame non è sempre “a tasca”, ci possono essere anche delle protrusioni

dell’anticorpo che entrano all’interno di cavità presenti nell’antigene • La regione dell’antigene riconosciuta dall’anticorpo viene detta epitopo

• Lineare • Conformazionale

Riconoscimento dell’antigene dalle cellule T

• Le cellule T riconoscono gli antigeni solo nel contesto della superficie cellulare “self” – L’antigene deve essere “presentato” da cellule

dello stesso individuo – La presentazione avviene ad opera di speciali

glicoproteine che si associano all’antigene –le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità -MHC

Il recettore delle cellule T (T cell receptor)

• Composto da due subunità dette TCRα e TCRβ, unite da un ponte S-S – Una piccola parte delle cellule T ha un TCR

formato da due diverse subunità, la funzione di questo subset di cellule non è chiara e non ce ne occuperemo

• Il TCR ricorda come struttura il frammento Fab degli anticorpi

TCR

• Regione variabile • Regione costante • Linker contenente il ponte S-S • Regione transmembrana+ • Coda citoplasmatica

• Il riconoscimento dell’antigene dal TCR è diverso da

quello effettuato dagli anticorpi • Le cellule T rispondono a corte sequenze

peptidiche che appartengono a regioni diverse di una determinata proteina

• A volte queste sequenze sono all’interno della proteina

• Necessità del “processing” della proteina • La corta sequenza peptidica che deriva dalla

proteina “estranea” viene riconosciuta solo quando legata ad una molecola di classe MHC

Due classi di molecole MHC

Classe I

Classe II

MHC di classe I • Due catene

• Alpha (tre regioni, 1-3) • Beta2-microglobulina

• Alpha1-2 formano la superficie legante il peptide da presentare

• Molecole polimorfiche (centinaia di alleli, ne parliamo dopo), e questo influenza la natura del peptide presentato

• La ß2-microglobulina non è polimorfica MHC di classe II • Due catene (alpha e beta, entrambe sono

transmembrana) • La tasca per il peptide si forma fra catene alpha e

beta • Molecole polimorfiche

Il legame MHC-peptide antigenico

• Le molecole di classe MHC devono essere in grado di interagire con peptidi derivati da una grande varietà di proteine diverse

• Una caratteristica del legame MHC-peptide è che le molecole MHC sono più stabili conformazionalmente dopo l’interazione con il peptide

• I peptidi che legano a MHC di classe I sono corti (8-10aa), ad MHC di classe II sono più lunghi anche se di solito rientrano fra 13-17aa

Il legame MHC-peptide antigenico

Il legame TCR-MHC-peptide

• Il TCR stabilisce contatti sia con il peptide, che con la molecola di MHC • Da cinetiche di binding si può ipotizzare che in una prima fase MHC-TCR sia

l’interazione predominante, per poi passare ad una seconda fase di più fine interazione con il peptide antigenico

Il ruolo dei co-recettori CD4 e CD8

• CD4: presente sui linfociti T helper • CD8: presente sui linfociti T citotossici • CD4-CD8 si associano con I TCR e

interagiscono con regioni invarianti delle molecole MHC

• Il legame con CD4-CD8 è essenziale per le cellule T, altrimenti non si verifica una risposta efficace in seguito all’interazione con l’antigene

CD4 e CD8

• CD4 è un’unica catena, che interagisce con MHC di classe II, lontano dal sito di legame con il TCR in modo da permettere il legame simultaneo con il complesso

• Porzione intracitoplasmatica di CD4 lega la chinasi Lck • CD8 è omo- o eter-dimerico, interagisce con MHC di classe I, in modo simile a CD4-MHC II

Espressione di MHC

• MHC di classe I presentano peptidi patogeni (specie virus) a linfociti T citotossici – Tutte le cellule nucleate esprimono MHC I, anche se in

quantità differente • MHC di classe II sono legati a linfociti T helper,

che devono assistere altre cellule del sistema immune – Espress quindi specie su cellule B, macrofagi e cellule

dendritiche • Espressione di MHC è regolata da citochine

(specialmente gli interferoni)

La generazione dei recettori x antigeni

Il repertoire anticorpale

• Il numero totale di anticorpi disponibili per ogni individuo è altissimo: almeno 100 miliardi di molecole diverse, e forse molte di più

• Questa diversità è solo minimamente garantita da diversità nella linea germinale, mentre è principalmente generata da riarrangiamenti genici nelle cellule somatiche che producono I recettori antigenici

I geni per le Ig sono riarrangiati nelle cellule B

Analisi per “Southern blot” di una digestione con enzimi di restrizione di DNA genomico da cellule non-linfoidi (a sinistra) e linfociti B. I probe corrispondono a frammenti della regione C e della regione V.

Le regioni variabili sono generate a partire da diversi segmenti genici

• Regioni variabili delle catene pesanti e leggere sono generate dalla ricombinazione somatica di diversi segmenti genici

• Catene leggere: – Due segmenti:

• Segmento V (I primi 100 aa circa) • Segmento J (altri 13 aa)

• Catene pesanti: – Tra I segmenti V e J c’è il segmento D

• Produzione di una catena leggera completa di IgG – Congiunzione dei segmenti V-J x riarrangiamento genico – Questo porta VJ >> vicino alla regione C, quindi il trascritto che si forma genera

la catena leggera per RNA splicing • Produzione di una catena pesante di Ig

– Produzione di DJ per riarrangiamento – Produzione di VDJ per riarrangiamento – Catena completa come per quella leggera (x splicing)

Le regioni variabili sono generate a partire da diversi segmenti genici

I diversi segmenti genici della regione V sono presenti in multiple copie

• Esistono multipli segmenti genici • Molti sono pseudogeni non funzionali (scarsa

pressione genica vista la ridondanza, che favorisce la variabilità e mutazioni)

• Per ogni catena immunoglobulinica (H e L, questa ultima divisa in κ e λ) c’è un distinto locus genico

• Importante : il locus per la regione C della catena pesante è organizzato in modo da contenere diverse regioni C che corrispondono alla diversa classe anticorpale

L’organizzazione germinale dei loci per le varie catene delle Ig

Come è regolata la ricombinazione?

• I complessi riarrangiamenti genici necessari devono avvenire correttamente nello spazio e nel tempo

• Sequenze conservate: “recombination signal sequences” (RSS), blocchi di 7 nucleotidi +spacer+9 nucleotidi che si trovano in adiacenza dei vari segmenti genici

• La lunghezza degli spacer determina l’accoppiamento dei vari segmenti

Come è regolata la ricombinazione?

Enzimi necessari per la ricombinazione • Nella maggior parte dei casi, I due segmenti che vanno incontro

a riarrangiamento sono nello stesso orientamento sul DNA, il risultato della ricombinazione è un circolo di DNA extracromosomale che contiene la regione escissa

• Gli enzimi che effettuano la ricombinazione sono chiamati V(D)J ricombinasi

• Specifici per I linfociti: RAG-1 e RAG-2 • Quando sono espressi artificialmente in cellule non

linfocitarie le rendono in grado di fare riarrangiamenti

• Protein coinvolte normalmente nel processo di riparo del DNA

• DNA –PK • Artemis • DNA ligase IV

• Il ruolo di questi enzimi è stato stabilito studiando le loro mutazioni

• Nell’uomo la sindrome di Omenn è causata da mutazioni di RAG1 o RAG2, con assenza di linfociti B circolanti e problemi ai linfociti T, mutazioni in geni del DNA repair causano altri tipi di malattie complesse

• Nel topo mutazioni nei geni della ricombinazione danno origine ai topi SCID (severe combined immuno deficiency)

Differenze nella ricombinazione fra regioni geniche con simile vs opposto orientamento trascrizionale

Nel caso di regioni con orientamento opposto, c’è un rimodellamento topologico più complesso del DNA, il risultato finale è che c’è inversione ed integrazione del DNA frapposto alle due regioni V e J che devono essere “cucite” fra loro

Dettagli molecolari della ricombinazione

Come si genera la diversità del repertoire anticorpale?

• Meccanismo combinatorio – Riarrangiamento di segmenti diversi – Utilizzo di catene diverse – Insieme I due meccanismi garantiscono circa 2,000,000 di

combinazioni diverse • Meccanismo di riarrangiamento impreciso

– Alcuni nucleotidi possono venire aggiunti o sottratti dagli enzimi ricombinativi nel sito di giunzione, generando cambi di sequenza proteica

• Meccanismo di ipermutazione somatica (lo spieghiamo dopo)

• Tutti insieme questi processi garantiscono > 1011 diversità anticorpale

Come si genera la diversità del repertoire anticorpale?

• Meccanismo combinatorio – Riarrangiamento di segmenti diversi – Utilizzo di catene diverse – Insieme I due meccanismi garantiscono circa 2,000,000 di

combinazioni diverse • Meccanismo di riarrangiamento impreciso

– Alcuni nucleotidi possono venire aggiunti o sottratti dagli enzimi ricombinativi nel sito di giunzione, generando cambi di sequenza proteica

• Meccanismo di ipermutazione somatica (lo spieghiamo dopo)

• Tutti insieme questi processi garantiscono > 1011 diversità anticorpale

Introduzione di nucleotidi P ed N alle giunzioni dei segmenti D e J

durante la ricombinazione

Meccanismi di riarrangiamento del TCR

• Il riarrangiamento avviene nel timo • Alpha locus: segmenti V e J • Beta locus: segmenti V, D e J • Simile nella struttura ai loci per le Ig

Meccanismi di riarrangiamento del TCR

• Meccanismo simile a quello delle Ig • Sono coinvolti gli stessi enzimi • Dal momento che la C-region delle IgG svolge > funzioni effettrici, c’è maggiore

variabilità nella C region delle Ig rispetto ai TCR, che contengono solo 1 segmento genico per C-alpha e due segmenti genici per C-beta

Variazione strutturale nella regione costante delle Ig

• La cellula B naïve sfrutta solo I segmenti genici per due regioni C (Cµ e Cδ, localizzate in vicinanza della regione V)

• Questo porta all’espressione di IgM ed IgD • Durante l’attivazione delle cellule B avviene il

cosiddetto “class switching”, ed abbiamo la produzione di altre Ig con differenti funzioni

• La regione costante è importantissima per molte funzioni effettrici degli anticorpi – Legame a recettori cellulari – Legame al complemento – Trasporto (p.es. latte, secrezioni come saliva e lacrime…)

I diversi isotipi di Ig

Organizzazione genica della regione C

• La produzione di IgM o IgD avviene mediante la trascrizione di un lunga molecola che viene poi sottoposta a splicing per generare la Ig matura

Espressione di IgM ed IgD

Produzione della forma di membrana vs la forma solubile per uso di trascritti alternativi

Forme polimeriche di Ig • IgM: come pentameri • IgA: come dimeri (nelle secrezioni) • Le regioni C di queste Ig contengono una coda di 18aa

essenziale per la polimerizzazione che contiene un residuo di cisteina

• Una catena di 15kda chiamata catena J (niente a che fare con il segmento genico J!) promuove la polimerizzazione legandosi alla cisteina della coda delle regioni C

• La polimerizzazione potrebbe essere utile per il legame delle Ig ad epitopi ripetitivi come quelli presenti sulle superfici batteriche

• Inoltre l’aumento del numero di siti/molecola (10 per IgM) porta ad un legame molto >>> con l’antigene (maggiore avidità)

Struttura delle forme polimeriche di Ig

La diversificazione del repertoire anticorpale dopo l’attivazione

• I meccanismi di diversificazione discussi finora –riarrangiamenti genici- avvengono durante la maturazione delle cellule B

• Quando la cellula B riconosce l’antigene va incontro ad attivazione, inducendo nuovi meccanismi di diversificazione – Tentativo di ottimizzazione della risposta anticorpale

• Mutazione ipersomatica • “class switch” • Conversione genica

La risposta secondaria

AID e mutazione ipersomatica

• Mutazione ipersomatica: iniziata dall’enzima AID (Activation-induced cytidine deaminase), espressa solo nelle cellule B (e non T) attivate

• Malattia da deficit di enzima: I malati producono solo IgM e non aumentano tramite mutazione ipersomatica l’affinità delle Ig per l’antigene

• AID agisce da citidina-deaminasi sul DNA – Quando agisce nei segmenti variabili dei geni per le Ig,

inizia la fase di mutazione ipersomatica – Quando agisce nei segmenti di “switch” inizia lo

switch di classe di Ig

L’attività di AID • AID induce lesioni del DNA il cui

riparo porta alla risposta secondaria • Il meccanismo di riparo utilizzato

determina il tipo di evento ricombinativo

• Mutazioni -> mutazione ipersomatica

• ssDNA break -> conversione genica

• dsDNA break -> class switch

Conseguenze delle mutazioni ipersomatiche

• Le cellule B attivate sono indotte da cellule T – Mutazione ipersomatica avviene nei centri

germinativi • Centri germinativi: competizione di cloni di

cellule B – Le mutazioni ipersomatiche distruttive portano

all’eliminazione della cellula B corrispondente – Le mutazioni ipersomatiche che migliorano

l’affinità dell’Ab per l’antigene sono selezionate • Maturazione dell’anticorpo

Maturazione anticorpale e clustering delle mutazioni nelle CDR

Che cosa succede nelle cellule T?

• La diversità nei TCR è generata durante il riarrangiamento genico

• Non avviene mutazione ipersomatica – Probabilmente la mutazione ipersomatica è stata

selezionata nelle cellule B per permettere la produzione di anticorpi secreti ad altissima affinità, mentre le cellule T non secernendo anticorpi hanno sufficiente diversità/affinità senza ricorrere alla mutazione ipersomatica

“Class switch”

• Le cellule B esprimono IgM ed IgD • Dopo che sono state attivate dall’antigene,

avviene lo switch di classe…

Lo switch di classe

• Switch da catena “mu” a catena “epsilon”

• Rilevanza di trascrizione per generare aree di ssDNA che fungono da substrati per le varie attività enzimatiche

• Formazione di ssDNA break e poi di dsDNA break

• Attivazione della machinery di riparo del DNA, che congiungono le due regioni switch ed eliminano il DNA che si frappone ad esse