s c h l u s s b e r i c h t zum verbundprojektmöglichst hydrophil gemacht, anschließend der sand...
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S C H L U S S B E R I C H T
zum Verbundprojekt
"Reinigung von arsenhaltigen Wässern in bepflanzten Bodenfiltern."
Teilvorhaben:
Ermittlung der chemischen und mikrobiellen Struktur
immobilisierter Arsenphasen und ihrer spezifischen
Bindungsplätze im Filtersubstrat.
Förderkennzeichen: 02WT0450 Laufzeit: 01.01.2004 - 31.01.2007
Zuwendungsempfänger: Technische Universität Dresden
Institut für Werkstoffwissenschaft
Professur für Materialwissenschaft und Nanotechnik
Prof. Dr. W. Pompe, Dr. B. Schmidt-Brücken
Hallwachsstraße 3
01069 Dresden
Inhaltsverzeichnis I. Aufgabenstellung, Planung und Ablauf, Rahmenbedingungen, Projektpartner
1. Aufgabenstellung Seite 3
2. Planung und Ablauf Seite 3
3. Rahmenbedingungen Seite 4
4. Projekt-Partner Seite 6
II. Ergebnisse, Nutzen, Fortschritte, Publikationen
1. Darstellung der erzielten Ergebnisse Seite 6
2. Nutzen der Ergebnisse im Sinne einer Verwertung Seite 30
3. Fortschritte anderer Stellen Seite 31
4. Geplante und erfolgte Publikationen Seite 31
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I. Aufgabenstellung, Planung und Ablauf, Rahmenbedingungen, Partner 1. Aufgabenstellung
Die Aufgabenstellung des Teilvorhabens beinhaltet die analytische Betrachtung der Anla-
genstandorte in Thailand und Vietnam und der Modellsysteme und Anlagen im Institut für
Mikrobiologie der TU Dresden.
Von besonderem Interesse ist dabei die Aufklärung der chemischen und mikrobiellen Struk-
tur sich bildender immobilisierter Arsenphasen als Resultat stattfindender Biomineralisati-
onsprozesse. Das Wissen über ihre Zusammensetzung erlaubt Rückschlüsse auf die Wege
ihrer Entstehung und Abschätzungen darüber, wie stabil oder inert diese entstandenen Ar-
senphasen gegenüber zu erwartenden äußeren Einflüssen sind.
Weiterhin gilt es, die spezifischen Bindungsplätze für Arsen im Filtersubstrat zu ermitteln
sowie seine räumliche Verteilung im Gesamtsystem aus Pflanzen, Biofilm im Bereich der
Rhizosphäre und Filtersubstrat festzustellen. Eine genauere Lokalisierung des Arsens in den
Pflanzen und im Biofilm des Wurzelraumes kann Aufschluss über die Beteiligung und den
Mechanismus der Arsen-Immobilisierung geben.
Für die Umsetzung dieser Aufgaben wird eine Kombination verschiedener mikroskopischer
Verfahren und physikalischer Elementanalysen eingesetzt. Ergänzend werden chemische
Aufschluss- und Analyseverfahren, wie die ICP-Massenspektrometrie und Schnelltests, zur
groben Bestimmung der Arsengehalte angewendet.
2. Planung und Ablauf
Folgende Aspekte wurden bei der Planung und dem Ablauf der Arbeitsaufgaben besonders
berückscihtigt:
In detaillierter Absprache mit der AMykor GmbH erfolgte die Erstellung eines Plans für die
Beprobung des Standortes in Thailand. Es wurde dabei die Gesamtsituation vor Ort erfasst.
Dazu wurden Proben der Pflanzen und Substrate untersucht, die ein Bestandteil der
bepflanzten Filteranlage sind und in deren nahen Umgebung gefunden werden. Es sollten
auf diesem Wege Anreicherungen und Verteilungen des Arsens im Pflanzenfilter
nachgewiesen werden. Ganz besonders von Interesse sind aus dem Substrat isolierte
amorphe oder kristalline Arsen-Phasen, die durch biologische Prozesse entstehen.
Die Beprobung und Untersuchung des gewählten Standortes in Vietnam wurde in Absprache
mit dem Institut für Energetik und Umwelt durchgeführt. Hier sollten ebenfalls die Anreiche-
rung und Verteilung des Arsens im Pflanzenfilter beobachtet und vor allem im Substrat ent-
stehende amorphe oder kristalline Arsen-Phasen erfasst und analysiert werden.
Dritter Schwerpunkt waren Analysen von Proben aus den verschiedenen Modellsystemen
(Rhizobox, Hydroponiksysteme, Festbettreaktoren), die am Institut für Mikrobiologie der
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Technischen Universität Dresden und dem Umweltforschungszentrum Halle-Leipzig GmbH
betrieben wurden. Es wurden dabei reine Substrate, deren mikrobielle Besiedlung und der
Einfluss des Arsens auf die Besiedlung untersucht, ebenso verschiedene Adsorber-Materia-
lien, die für einen Einsatz als nachgeschalteter Sicherheitsfilter in Frage kommen. Die
Hauptmenge der Proben stammte aber aus bepflanzten Filtern, für die Anreicherung und
Verteilung des Arsens festgestellt werden sollten. Besonders das Auffinden und Analysieren
von Arsen-Phasen amorpher oder kristalliner Struktur in den Substraten ist dabei von großer
Bedeutung.
Nach den Vorstellungen des Instituts für Mikrobiologie wurde eine Rhizobox konstruiert und
angefertigt. Diese transparente Versuchsanlage soll im Kleinmaßstab einen bepflanzten Fil-
ter simulieren und ist mit zahlreichen Möglichkeiten zur Probennahme und Installation von
Sonden versehen, die die Gewinnung und Überprüfung zahlreicher Messparameter im biolo-
gischen System ermöglichen.
3. Rahmenbedingungen:
Innerhalb des Kooperationsprojekts hat das Institut für Werkstoffwissenschaft seine Kompe-
tenz und Erfahrung auf dem Gebiet der Materialanalyse im Mikro- und Nanometer-Bereich
sowie bei der Konstruktion und Adaption kleiner Apparaturen für Labor- oder Halbtechni-
kumsmaßstab eingebracht.
Durch den Zugang zu einer umfangreich ausgestatteten Werkstatt und die Beschäftigung ei-
nes Technikers im Projekt war es möglich, benötigte Apparaturen neu oder zu bereits
vorhandenen notwendige Adapter und erweiterndes Zubehör anzufertigen. So wurden im
Laufe des Projektes eine Rhizobox und ein Hydroponiksystem hergestellt. Außerdem wurden
verschiedene Körper und Träger zur Gewinnung von Proben aus den Modellsystemen
produziert.
Für die Aufklärung der im Projekt zu beantwortenden Fragestellungen wurden die etablierten
Methoden der Fluoreszenzmikroskopie, der konfokalen Laserrastermikroskopie (in Verbin-
dung mit Fluoreszenzmarkierungen), der Rasterelektronenmikroskopie und der Röntgenmi-
krobereichsanalyse genutzt. Bei diesen methodischen Schwerpunkten konnte auch auf die
Erfahrung anderer Forschergruppen am Max Bergmann Zentrum für Biomaterialien Dresden
(MBZ) aufgebaut werden.
Eine wichtige Methode zur Bearbeitung der Aufgabenstellung ist die Rasterelektronenmikro-
skopie (REM), die eine optische Auflösung bis in den Nanometer-Bereich gewährleistet und
damit das Auffinden kleinster relevanter Detailstrukturen und Objekte ermöglicht. Obwohl ur-
sprünglich für die Untersuchung klassischer Werkstoffe und Materialien entwickelt, findet sie
durch zwischenzeitliche Neuerungen und Weiterentwicklungen auch breite Anwendung in
der Biologie, Medizin und verwandten Disziplinen. Besonders unkompliziert ist die Untersu-
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chung kompakter und nicht wasserhaltiger Objekte. Aber auch wasserhaltige und biologische
Objekte lassen sich trotz des nötigen Hochvakuums untersuchen, nachdem sie vorher mit
geeigneten Verfahren stabilisiert und entwässert wurden. In vielen Fällen gelingt bei richtiger
Wahl und sorgfältiger Durchführung der Prozedur eine Fixierung und Trocknung ohne merk-
liche Artefakte.
Eine zusätzliche Möglichkeit bietet das Environmental Scanning Electron Microscope, das
unter deutlich schwächeren Vakuumbedingungen arbeitet, durch Wasserdampf in der Pro-
benkammer eine Dehydratisierung der Objekte vermindert und keine Bedampfung der Ober-
flächen mit leitfähigen Deckschichten voraussetzt. Allerdings ist die Auflösung dieser Me-
thode gegenüber der konventionellen Rasterelektronenmikroskopie um den Faktor 102 - 103
schlechter, was ihre Anwendung einschränkt.
Einen ebenfalls sehr hohen Stellenwert für die analytischen Aufgaben innerhalb der Arbeiten
hat die Röntgenmikrobereichsanalyse (EDX), die in ähnlich hoher Auflösung wie die Raster-
elektronenmikroskopie eine simultane Multi-Elementanalyse ermöglicht und die mikroskopi-
schen Befunde ergänzt. Die Bedingungen für die Probennahme, -präparation und die Mes-
sungen sind nahezu identisch zur Rasterelektronenmikroskopie, so dass dieselben Prozedu-
ren zur Fixierung und Trocknung angewendet werden müssen. Vorteilhaft für die Analysen
ist, dass die Proben im Wesentlichen aus Elementen niedriger Ordnungszahl bestehen, was
das Auffinden des Arsens als Element mit höherer Ordnungszahl begünstigt. Zusätzlich lässt
sich die Energie der auf die Probe gestrahlten Elektronen hinsichtlich der Anregungsprozes-
se für das gesuchte Element optimieren. Die absolute Nachweisgrenze dieser Methode liegt
bei 10-15 g, was sie zu einem wichtigen Spurenanalyse-Verfahren für Feststoffproben macht.
Allerdings liegt die relative Nachweisempfindlichkeit bei ≥ 100 ppm. So resultiert bspw. für
ein Volumen von 10 µm3 mit einer Masse von etwa 10-11 g die relative Nachweisgrenze von
10-15 g/10-11 g = 10-4 = 0,01%. Die im Projekt relevanten biologischen Proben weisen oft
größere Hohlräume auf, was durch die geringe Dichte zu vergleichsweise geringen Massen
und damit erhöhten relativen Nachweisgrenzen führt. Trotzdem ist die Methode als qualitati-
ver Nachweis für Arsen, gekoppelt mit der Möglichkeit einer hohen lokalen Auflösung, unver-
zichtbar.
Für die hochauflösende Abbildung von mineralischen Abscheidungen auf Bakterienmembra-
nen wird die Transmissionselektronenmikroskopie als geeignete Methode eingesetzt. Das
sehr gute Auflösungsvermögen erlaubt es, selbst Nano-Partikel und -Kristalle sehr gut abzu-
bilden. Gleichzeitig besteht die Möglichkeit der Elementanalyse bei entsprechender Proben-
präparation.
Eine weitere Methode, die die Untersuchung von biologischen Objekten sehr geringer Grö-
ßen ermöglicht, ist die Atomkraft- oder Rasterkraftmikroskopie. Es sind sowohl Messungen
an Luft wie auch in Flüssigkeiten durchführbar. Es lassen sich feinste Strukturierungen und
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Objekte durch das Abrastern der Probenoberflächen abbilden. Innerhalb des Projektes
sollten damit die Oberflächen von Bakterien aus den Rhizosphären auf
Arsenausscheidungen hin untersucht werden.
Als weitere Methoden kommen die Fluoreszenzmikroskopie mit konventionellem Lichtmikros-
kop und konfokalem Laserrastermikroskop zur Anwendung. Mit Hilfe von Fluoreszenzmar-
kern werden Bauteile der Bakterien angefärbt, um ihre Quantität und Verteilung auf den
Pflanzenwurzeln so wie entstandene Biofilme zu dokumentieren. Dabei kann durch entspre-
chende Marker auch die Vitalität der Bakterien bestimmt werden. Die Laserrastermikroskopie
ermöglicht hierbei durch die Konfokalität eine hohe dreidimensionale Auflösung. Ein weiterer
Vorteil ist die Möglichkeit, einzelne Fluoreszenzprozesse selektiver anregen und störende,
simultan auftretende Emissionen (z.B. Eigenfluoreszenzen) besser eliminieren zu können.
4. Projekt-Partner:
Im Rahmen des Kooperationsprojektes erfolgte eine Zusammenarbeit mit folgenden Part-
nern:
• AMykor GmbH, Greppin (früher: MYCOSYM Environment GmbH, Bitterfeld).
• Institut für Energetik und Umwelt, Abteilung Umweltingenieurwesen und -technologie,
Leipzig.
• Technische Universität Dresden, Institut für Mikrobiologie, Dresden.
Im Rahmen des Kooperationsprojektes wurden bei folgenden Einrichtungen Untersuchungen
in Auftrag gegeben:
• Forschungszentrum Jülich GmbH, Zentralabteilung für Chemische Analysen, Jülich.
• Technische Universität Dresden, Institut für Allgemeine Ökologie und Umweltschutz,
Tharandt.
• Dendro-Institut Tharandt an der Technischen Universität Dresden, Institut für Forstnutz-
ung und Forsttechnik, Tharandt.
II. Ergebnisse, Nutzen, Fortschritte, Publikationen 1. Darstellung der erzielten Ergebnisse
Das Arbeitspaket 1 beinhaltet die Charakterisierung des Gefüges im Wurzelbereich der
Pflanzenfilter, das sich aus den Wurzeln, den Bakterien, dem gebildeten Biofilm und dem
Substrat zusammensetzt.
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Um Proben aus den Hydroponiksystemen zu gewinnen, die mit Sand als Substrat betrieben
wurden, sind Körper und Trägersysteme entwickelt worden, die das Gefüge bei der Ent-
nahme möglichst wenig stören bzw. die Entnahme zusammenhängender Biofilm-Flächen
ermöglichen. Um Proben entstandener bakterieller Biofilme aus den Modellsystemen isolie-
ren zu können, müssen die Proben-Träger folgende Bedingungen erfüllen: sie müssen eine
fest zusammenhängende Fläche aus Sand für die Besiedlung bieten, die übrigen verwen-
deten Materialien dürfen weder für die Pflanzen noch für Bakterien toxisch sein, müssen im
wässrigen Medium Bestand haben und die Träger müssen den mechanischen Belastungen
durch Einbringen, Positionieren und Entnahme standhalten. Letztlich erwiesen sich zwei Ty-
pen als geeignet. Zum einen wurde Sand in einer Zylinderform in Epoxidharz eingegossen
und nach dem Aushärten durch mechanische Bearbeitung in etwa 0,5 cm dünne Scheiben
zerteilt, die als Probenkörper dienen (Abb. 01: A). Vorteile dieses Typs sind eine gute Stabi-
lität auch über lange Zeitspannen und eine relativ ebene Oberfläche, was vor allem bei mik-
roskopischen Untersuchungsmethoden mit sehr hoher Tiefenschärfe (REM, LSM) die Arbei-
ten begünstigt. Ein potentieller Nachteil ist, dass das flüssige Epoxidharz vorhandene Poro-
sitäten verschließen kann, was sich negativ auf die Besiedlung durch Mikroorganismen aus-
wirken könnte. Für den zweiten Typ Probenträger wurde Sand durch Hydrolyse von Tetraal-
koxysilanen auf Glasflächen fixiert (Abb. 01: B). Dazu wurden die Glasoberflächen zunächst
möglichst hydrophil gemacht, anschließend der Sand aufgebracht, die Sandflächen mit den
Silizium-Solen getränkt, bei deren Lufttrocknung ein festes, poröses Siliziumdioxid-Gel ent-
steht. Das Tränken der Sandflächen mit anschließender Trocknung wurde einige Male wie-
derholt, um eine stabile Fixierung zu erzielen. Besonders vorteilhaft ist hierbei, dass die
Komponenten dieses Typs Probenträger keine Toxizitäten für die Bakterien aufweisen, das
entstehende Siliziumdioxid-Gel chemisch inert ist, eine poröse Struktur besitzt und eine dem
Sand sehr ähnliche elementare Zusammensetzung hat. Die Oberflächen sind bei Typ B
deutlich unebener als bei Typ A, was bei sich bei Untersuchungsmethoden mit hoher Tiefen-
schärfe nachteilig auswirken kann. In einzelnen Fällen kam es bei längerer Dauer der Expe-
rimente zur Ablösung komplett zusammenhängender Sandflächen vom Glas.
Um Wurzeln ohne gravierende mechanische Belastungen und mit ihrem umgebenden
Substrat als Gesamtgefüge aus den bepflanzten Filtersäulen des Hydroponiksystems isolie-
ren zu können, müssen die Probenkörper verschiedene Voraussetzungen erfüllen. Sie müs-
sen den Zusammenhalt des Gefüges sichern, müssen aber soweit offen konstruiert sein,
dass ein ungehindertes Wurzelwachstum darin möglich ist und auch die Diffusions- und Aus-
tauschprozesse mit der Umgebung uneingeschränkt gewährleistet sind. Außerdem dürfen
sie genauso wie die Träger für den Biofilmbewuchs keine für die Pflanzen und Bakterien
toxischen Substanzen enthalten und keine Fremdstoffe ins System einbringen, die einen stö-
renden Einfluss auf die Arseneliminierung haben. Es wurden PVC-Kanäle mit viereckigem
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Querschnitt benutzt (Abb. 01: C). Um den Stoff-Austausch des Gefüges im Probenkörper mit
der Umgebung möglichst wenig einzuschränken, wurden die Kanäle teilweise geöffnet und
an diesen Stellen mit feinmaschigen Netzen versehen.
Abb. 01: Probenträger und -körper zur Verwendung in bepflanzten Hydroponiksystemen.
Die durchgeführten Fluoreszenzmarkierungen und anschließenden Analysen mittels konven-
tionellem Licht- und konfokalem Laserrastermikroskop dienten vor allem dazu, Aufschluss
über die Besiedlung der Wurzeloberflächen und der auf Trägern fixierten Sandoberflächen
aus dem umgebenden Substrat durch Bakterien zu geben. Die Pflanzen wurden mit oder
ohne Substrat kultiviert. Verwendet wurde ein Live/Dead-Kit, das aus zwei simultan anwend-
baren, DNA-bindenden Fluoreszenzmarkern besteht. Diese werden besonders zur Unter-
scheidung von Bakterien nach lebend (intakte Zellhülle) und tot (geschädigte oder zerstörte
Zellhülle) eingesetzt. Beispielhaft werden hier Ergebnisse aus einer Untersuchung der Wur-
zeln von Cyperus alternifolius mittels konfokaler Laserraster-Mikroskopie dargestellt (Abb. 02). Wie die Abbildung zeigt, werden durch den grün fluoreszierenden Farbstoff SYTO 9
auch die Wurzeln teilweise markiert. Allerdings ist das Ausmaß nicht weiter störend für die
Untersuchungen und ihre Auswertung. SYTO 9 zeigt eine Affinität für die Zellwände der
Wurzelzellen und das im Zentralzylinder der Wurzel befindliche Leitgewebe. In der Abbildung
erkennt man die schraubenförmigen Tracheiden, die als Bestandteil des Xylems für den
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Transport des Wasser und darin gelöster Nährsalze und Stoffe von der Wurzel in den Spross
und die Blätter von Cyperus alternifolius verantwortlich sind. Die punktförmigen, in diesem
Falle überwiegend roten und wenigen grünen Emissionen stammen von Bakterien, die die
Oberfläche der Wurzel besiedeln. Das rot fluoreszierende Propidiumiodid zeigt an, dass die
Zellmembran der betroffenen Bakterien nicht vollständig intakt ist, denn nur dann kann der
Marker ins Innere der Zelle vordringen. In den meisten Untersuchungen an Wurzeln wurde
eine gute bis starke Besiedlung der Oberflächen festgestellt, unabhängig davon, ob die
Pflanzen mit oder ohne Substrat kultiviert wurden. In wie weit sich durch die gewählte Art der
Kultivierung Unterschiede in der Spezieszusammensetzung der Populationen bemerkbar
machen, war nicht Gegenstand der Analysen.
Abb. 02: Wurzeln von Cyperus alternifolius, Fluoreszenzmarkierung mit SYTO 9 (grün)/Pro-
pidiumiodid (rot). Laserrastermikroskopie.
Auch die in der Rhizosphäre ins Substrat eingebrachten Probenträger zeigten bei der Unter-
suchung durch Fluoreszenzmarkierung, dass sich nach wenigen Tagen Verweilzeit im Wur-
zelbereich der Pflanzen erste Bakterien auf dem Sand ansiedeln.
Alle im Verlauf des Projektes untersuchten Wurzelproben von den Standorten in Thailand
und Vietnam und von den eingesetzten Pflanzen aus den Hydroponiksystemen zeigen
ebenfalls eine deutliche Besiedlung der Oberflächen durch Mikroorganismen.
Es ist also davon auszugehen, dass sich in jedem Fall stabile Populationen von Mikroorga-
nismen ausbilden, die die Aufnahme des Arsens in die Pflanzen beeinflussen, die von den
Pflanzen in den Wurzelbereich abgegebenen Arsenspezies verändern oder völlig eigenstän-
dig das Arsen umwandeln können.
Es wurden vergleichende Untersuchungen zwischen konventioneller Rasterelektronenmikro-
skopie und Environmental Rasterelektronenmikroskopie an Wurzelproben der Pflanzen vor-
genommen, um beurteilen zu können, in wie weit die methodischen Vorteile für die Untersu-
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chungen des Pflanzen- und Bodenproben nutzbar sind. Diese bestehen gegenüber der kon-
ventionellen Methodik darin, dass Proben ohne vorheriges Entwässern und Bedampfen mit
einer leitfähigen Schicht betrachtet werden können. Allerdings verlieren die Proben während
der Messungen nach und nach Wasser, so dass nur in einem begrenzten Zeitfenster Auf-
nahmen ohne Artefakte möglich sind, die durch den Wasserverlust verursacht werden. Bei
den großvolumigen und flüssigkeitsgefüllten Wurzelzellen treten diese Artefakte ebenso auf,
wie bei den stark wasserhaltigen Biofilmen und den darin enthaltenen Bakterien auf den
Wurzeloberflächen. Der Nachteil des begrenzten Zeitfensters lässt sich durch die große
Menge verfügbaren Probenmaterials kompensieren. Problematischer ist die im Vergleich mit
der konventionellen Methodik schlechtere Auflösung, bedingt durch die Wasser-Moleküle in
der Gasphase der Probenkammer, an denen die Elektronen vielfach gestreut werden. Bei
den Untersuchungen muss ein besonderes Augenmerk auf Objekte im Größenbereich weni-
ger Mikrometer oder noch darunter gerichtet werden, um Bakterien und ihre Oberflächen in
den Biofilmen oder erste Nanokristalle als Ausgangspunkt für Biomineralisationsprozesse
genau betrachten zu können. Dafür reicht bei den anzuwendenden Geräteparametern das
Auflösungsvermögen nicht aus. Um also beginnende Biomineralisation im Substrat, in Bio-
filmen oder auf den Wurzeln oder Nanokristalle auf Bakterienoberflächen zu dokumentieren,
ist die Methodik der Environmental Rasterelektronenmikroskopie in diesem Verfahrensmo-
dus nicht geeignet. Die genannte Problematik lässt sich allerdings durch Kryo-Technik in
Kombination mit klassischer Rasterelektronenmikroskopie umgehen.
Die klassische Rasterelektronenmikroskopie ist von der notwendigen Präparation zwar deut-
lich zeitaufwändiger, bringt aber sehr gute Ergebnisse mit Auflösung bis in den Submikro-
meter-Bereich. Um Pflanzen- und Bakterienproben möglichst unbeeinflusst in ihrer Form zu
erhalten, müssen die Zellen stabilisiert werden, um bei der Entwässerung merkliche Schrum-
pfungen zu verhindern. Von den verschiedenen getesteten Verfahren zeigen zwei Wege gu-
te Ergebnisse: Zum einen das Schockfrosten in flüssigem Stickstoff mit anschließender Ge-
friertrocknung. Dieses Verfahren ist besonders gut für die vergleichsweise großen Pflanzen-
proben geeignet und lässt sich zusätzlich mit der vorherigen Fixierung des Materials mit
Glutardialdehyd- oder Formaldehyd-Lösungen koppeln. Aber das Verfahren funktioniert
grundsätzlich auch ohne vorherige Fixierung. Das ist vorteilhaft z.B. für die Blätter von
Phragmites australis, die von einer Wachsschicht überzogen sind und sich deswegen nicht
mit den genannten wässrigen Fixierlösungen behandeln lassen. Der andere Weg ist eine
Fixierung, anschließende schrittweise Entwässerung mit aufsteigender Acetonreihe und ab-
schließender Kritisch-Punkt-Trocknung. Dieses Verfahren zeigte sich unter anderem bei der
Untersuchung der Biofilme auf den Wurzeln als gut geeignet.
Lose Proben aus dem Substrat der Modellsysteme und den Filteranlagen an den Standorten,
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die aus Sand oder Erden bestehen, wurden soweit möglich mit Fixierlösungen behandelt
undanschließend luftgetrocknet.
Es wurden zahlreiche Querschnittproben der Pflanzenwurzeln, -Stängel und -Blätter aus den
Modellsystemen (Phragmites australis, Juncus effusus, Cyperus alternifolius) und vom
Standort der Pilotanlage in Thailand (Phragmites australis, Canna sp.) untersucht. In keiner
der mikroskopierten Proben konnten Hinweise darauf entdeckt werden, dass es innerhalb
der Pflanzen zur Einlagerung und Anreicherung kristalliner oder amorpher Arsenprodukte
kommt. Beispielhaft sind Querschnittsbilder von Stängel und Blatt von Cyperus alternifolius
(Abb. 3 und 4) und der Wurzel von Canna sp. (Abb. 5) abgebildet. Darauf lässt sich gut der
jeweilige zelluläre Aufbau der Pflanzenteile erkennen, ein Indiz für eine gut gelungene Pro-
benpräparation.
Abb. 03: Querschnitt-Ansicht eines Stängels von Cyperus alternifolius, Rasterelektronenmi-
kroskopie.
Auf den Außenseiten der Wurzeln interessieren im Besonderen zwei Dinge: Zum einen der
sich bildende Biofilm, zum anderen eventuell auftretende Nano- oder Mikrokristalle als Re-
sultat von Biomineralisationsprozessen. Wie Abb. 06 belegt, bilden sich auf den Wurzel-
oberflächen verschieden intensiv ausgeprägte und ausgedehnte Biofilme, die vor allem aus
Bakterien und von ihnen abgesonderten extrazellulären polymeren Stoffen (EPS) bestehen.
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Abb. 04: Querschnitt-Ansicht eines Blatts von Cyperus alternifolius, Rasterelektronenmikro-
skopie.
Abb. 05: Querschnitt-Ansicht einer Wurzel von Canna sp., Rasterelektronenmikroskopie.
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Abb. 06: Biofilme auf der Wurzeloberfläche von Phragmites australis, Rasterelektronenmikroskopie.
Besonders deutlich ist die EPS als fadenartiges Netz auf dem Bild rechts oben in Abb. 06 zu
erkennen. Außerdem finden sich verschiedene Arten von Kieselalgen und amorphe Ablage-
rungen, bei denen es sich um restliche Anhaftungen vom jeweiligen Substrat handelt, das
nicht vollständig abgespült werden kann, um nicht gleichzeitig große Teile des Biofilms von
der Wurzeloberfläche abzulösen. Kristallines Material konnte in den Biofilmen und auf den
Wurzeloberflächen nicht gefunden werden.
Das abgeänderte Arbeitspaket 2 hatte die Aufgabe zu klären, wie die scheinbar wider-
sprüchlichen Aussagen der Röntgenmikrobereichsanalysen (EDX) und der ICP-Mas-
senspektrometrie (ICP-MS) im Arbeitspaket 3 zu erklären sind. Da nicht eindeutig klar wurde,
warum das in den Pflanzen mittels ICP-MS nachgewiesene Arsen nicht auch durch die EDX-
Analysen detektierbar war, wurde ein experimenteller Weg gesucht, der diese Ergebnisse
erklären kann. Der fast durchgängig fehlgeschlagene Arsennachweis kann durch einen oder
mehrere der folgenden Faktoren verursacht werden:
a) die von den Pflanzen aufgenommene Menge Arsen liegt unterhalb der relativen Nach-
weisgrenze,
b) die gewählte Präparationsmethode führt zur Verringerung des Arsengehaltes,
c) die Verteilung des Arsens in der Probe ist ungünstig,
d) die Geräteparameter sind für die Analyse nicht optimal.
Element Blatt (Referenz)
Wurzel (Referenz)
Blatt, jung Blatt, alt Wurzel
As 61,7 8,1 5429,4 380,4 236,7
Mg 9260,8 3653,0 4909,4 8862,9 1507,7
P 4111,3 2738,2 13764,0 3894,8 1233,1
K 34491,7 4867,2 96208,8 49768,8 1981,3
Ca 68681,4 41209,6 9650,4 40166,9 20852,6
Mn 198,1 658,4 138,1 380,7 306,4
Fe < NWG 10865,5 < NWG 558,2 5380,4
Cu < NWG 50,7 < NWG < NWG 26,7
Zn 107,2 431,6 188,3 73,9 133,5
Tabelle 01: Ergebnisse der Elementanalysen mit ICP-MS für Pteris vittata in [mg/kg].
Um bei der aufgenommenen Arsenmenge möglichst sicher über der relativen Nachweis-
grenze der Röntgenmikrobereichsanalyse zu liegen, wurde für diese Experimente mit dem
Farn Pteris vittata ein Arsen-Hyperakkumulator ausgewählt. Zwei Exemplare wurden in ge-
trennten Pflanzgefäßen mit gleichartigem Boden gepflanzt und im selben Rhythmus mit glei-
chen Mengen Wasser gegossen. Dem Gießwasser der einen Pflanze wurden 500 mg/L Ar-
sen zugesetzt. Am Ende der Versuchsdauer wurden von beiden Pflanzen Blätter- und Wur-
zelproben genommen und untersucht. Der genaue Arsengehalt in jungen und alten Blättern
sowie Wurzeln der untersuchten Pflanze wurde nach Lufttrocknung durch ICP-MS gemessen
(Tabelle 01). Als Referenz wurden außerdem eine Blatt- und eine Wurzelprobe der nicht
kontaminierten Pflanze analysiert. Zusätzlich wurden die Gehalte ausgewählter Makronähr-
stoffe und Spurenelemente bestimmt, um auf zusätzliche Hilfen bei der Beurteilung der EDX-
Spektren zurückgreifen zu können. Die älteren Blätter der Farnpflanze, die auf kontaminier-
tem Boden wuchs, zeigte durch Nekrose braun verfärbte Ränder, ein Befund, der auch von
LI et al. (siehe unter: 3. Fortschritte anderer Stellen) beschrieben wird. Wie aus Tabelle 01
hervorgeht, liegen die bestimmten Arsengehalte oberhalb 100 ppm, was für einen erfolgrei-
chen Nachweis mittels EDX ausreicht, wenn nicht ein anderer Faktor das verhindert. Die Ge-
räteparameter, insbesondere die Beschleunigungsspannung der Elektronen, wurden so an-
gepasst, dass eine möglichst große Quantenausbeute angeregter Röntgenemissionen für
das nachzuweisende Arsen erzielbar ist. Damit werden Elemente, deren Anregungsenergien
deutlich von der des Arsens abweichen, nicht mit maximal möglicher Quantenausbeute
detektiert. Wurzel- und Blatt-Proben wurden nach folgenden Präparationswegen für die Un-
tersuchungen vorbereitet: reine Lufttrocknung, Schockfrosten mit flüssigem Stickstoff mit
anschließender Gefriertrocknung, Fixierung durch Glutardialdehydlösung mit sich anschlie-
ßender Entwässerung über Aceton-Reihe und abschließender Kritisch-Punkt-Trocknung. Der
Vergleich der EDX-Spektren von Proben aus den verschiedenen Präparationswegen zeigt
keine deutlichen Unterschiede. Zumindest für Pteris vittata ist die Art der Probenvorbereitung
also nicht ursächlich für ein Fehlschlagen des Arsen-Nachweises. Für die folgenden Erklä-
rungen werden exemplarisch die Resultate verwendet, die im Anschluss an eine Schock-
frostung durch flüssigen Stickstoff gefriergetrocknet wurden. In Einklang mit den Ergebnissen
der ICP-MS-Analysen zeigen die EDX-Spektren der Referenzpflanze (Abb. 07 und 08) keine
Emissionssignale, die den K- oder L-Linien des Arsens zuzuordnen sind. Ebenso verhält es
sich mit Eisen, dessen Signale in der Blattprobe nirgends detektiert werden, während es in
der Wurzelprobe an einigen Stellen gefunden wird. In der Gesamtheit der aufgenommenen
Spektren lassen sich auch die Relationen der Elemente Magnesium, Phosphor, Kalium und
Calcium untereinander und im Vergleich zwischen Blatt- und Wurzelprobe, wie sie mittels
ICP-MS-Analyse bestimmt wurden, wiederfinden. Allerdings zeigen die teilweise stark
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differierenden Ergebnisse einzelner Mikrobereichsanalysen deutlich, dass die Elemente nicht
völlig gleichmäßig über das gesamte Probenvolumen verteilt sind.
Abb. 07: EDX-Spektrum von Pteris vittata, Blatt, Referenz ohne Arsen-Kontamination.
Von der arsenbelasteten Pflanze wurden alte und junge Blätter getrennt sowie Wurzeln un-
tersucht, um die enthaltenen Elemente zu bestimmen und zu testen, ob der Nachweis für
enthaltenes Arsen positiv ausfällt (Abb. 09 bis 11). Auch bei den Proben der kontaminierten
Pflanze stehen die Ergebnisse der ICP-MS- und der Röntgenmikrobereichsanalysen in gu-
tem Einklang. So wird beispielsweise Eisen nur in den Wurzeln durch emittierte Röntgen-
quanten nachgewiesen. Und auch nur in den Wurzeln wird durch die ICP-MS-Analyse ein
entsprechend hoher Eisengehalt bestätigt. Auch für die Elemente Magnesium, Phosphor,
Kalium und Calcium entsprechen die innerhalb der einzelnen Proben ermittelten relativen
Intensitäten den durch die ICP-MS-Untersuchungen festgestellten Relationen der Element-
gehalte. In den jungen Blättern des Farns wurden durch die nasschemische Analyse Arsen-
gehalte > 5000 mg/kg ermittelt. Durch die Röntgenmikrobereichsanalyse ließ sich das Arsen
zweifelsfrei nachweisen. So wurden nicht nur die Emissionssignale der drei Lα-Linien (1,282
keV, 1,317 keV und 1,388 keV) detektiert, die sich zu einem Peak überlagern, sondern es
wurde zusätzlich ein Peak bei etwa 10,5 keV Emissionsenergie ermittelt, der aus der Überla-
gerung der beiden Kα-Emissionen resultiert (Abb. 09). Der Peak bei etwa 1,29 keV enthält
sicherlich auch einen Anteil aus den Kα/β-Emissionen des ebenfalls in hohen Konzentrationen
vorliegenden Magnesiums (Kα = 1,254 keV, Kβ = 1,302 keV). Für alte Blätter und die Wurzeln
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Abb. 08: EDX-Spektrum von Pteris vittata, Wurzel, Referenz ohne Arsen-Kontamination.
ergab die nasschemische Analyse einen Arsengehalt, der um Faktoren zwischen 10 und 25
kleiner ist, als in den jungen Blättern. In den entsprechenden Röntgenmikrobereichsanalysen
lassen sich keine Signale der Kα-Emissionen des Arsens detektieren, die einen absolut
zweifelsfreien Nachweis des Elements erlauben. Im Falle des alten Blattes wird eine sehr
hohe Konzentration Magnesium durch die ICP-MS-Analyse ermittelt, so dass ein durch die L-
Linien des Arsens erzeugtes Emissionssignal sehr geringer Intensität vom intensiven Signal
der K-Linien des Magnesium überlagert wird (Abb. 10). Dadurch ist keine eindeutige Zuord-
nung möglich. Bei den Untersuchungen der Wurzeln ist der Magnesium-Gehalt ebenfalls
deutlich größer als der des Arsens und auch hier wird ein möglicherweise vorhandenes, sehr
intensitätsschwaches Signal der L-Linien des Arsens durch das intensivere Emissionssignal
der K-Linien des Magnesiums überdeckt (Abb. 11).
Die für Pteris vittata durchgeführten Untersuchungen lassen sich wie folgt zusammenfassen:
Es konnten keine Auswirkungen verschiedener Präparationswege auf die Arsengehalte in
den Proben nachgewiesen werden. Es ist aber letztlich nicht klar, ob diese Aussage auch für
die anderen im Projekt verwendeten Pflanzen Gültigkeit hat. Bei 20 kV Beschleunigungs-
spannung erreicht man sehr gute Parameter für die Anregung der Röntgenemissionen des
Arsens ohne dabei gleichzeitig die Emissionen der übrigen vorhandenen Elemente in ihrer
Intensität zu sehr zu schwächen. Bei Arsengehalten < 1000 mg/kg ist ein sicherer und zwei-
felsfreier Elementnachweis durch die L-Linien nur dann möglich, wenn die Probe nicht
gleichzeitig hohe Gehalte an Magnesium aufweist (abhängig bspw. von der jeweiligen
17
Abb. 09: EDX-Spektrum von Pteris vittata, Blatt jung, nach Arsen-Kontamination.
Abb. 10: EDX-Spektrum von Pteris vittata, Blatt alt, nach Arsen-Kontamination.
18
Abb. 11: EDX-Spektrum von Pteris vittata, Wurzel, nach Arsen-Kontamination.
Pflanze, dem untersuchten Pflanzenteil), was zur Überlagerung der Emissionssignale des
Arsens führt. Arsengehalte ab etwa 5000 mg/kg reichen in jedem Falle für einen zweifels-
freien Nachweis mittels Röntgenmikrobereichsanalyse aus, da dann bereits die Kα-Linien im
Spektrum auftreten, die von keinem der übrigen enthaltenen Elemente überlagert werden
können. Dies ist die wichtigste Erkenntnis aus den Experimenten mit Pteris vittata, denn sie
ist ohne Einschränkung auch auf Proben anderer Pflanzen übertragbar.
Für das Arbeitspaket 3 war vorgesehen, die sich in den bepflanzten Filtern bildenden im-
mobilisierten mineralischen Arsenphasen hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung
und Kristallstruktur zu untersuchen. Dazu wurden die Röntgenmikrobereichsanalyse und die
Röntgendiffraktometrie/-kristallstrukturanalyse eingesetzt. Außerdem sollten durch die An-
wendung der Inductively Coupled Plasma Ionization Massenspektrometrie auch geringste
Mengen im Wurzelbereich gebundenen und in die Pflanzen aufgenommenen Arsens nach-
gewiesen werden.
In dem Maße so nicht vorhersehbar, stellte sich das Auffinden und Isolieren immobilisierter
Mineralphasen als problematisch heraus. Es gelang nur selten, anhand deutlicher lokaler
Verfärbungen im Sand der Hydroponiksysteme oder Reaktoren gebildete Ablagerungen auf-
zufinden. Während der laufenden Versuche konnte der Substratbereich nicht detailliert und
19
in allen Tiefen abgesucht werden, um den Versuchsablauf nicht zu gefährden. Diese Mög-
lichkeit bestand bei der Entleerung kompletter Säulen oder Reaktoren, wo farblich markante,
lokal stark begrenzte Zonen entdeckt wurden.
Abb. 12: Sand mit orange-braunem Belag aus Rhizobox, EDX-Spektrum.
Beispielhaft werden die Ergebnisse der Röntgenmikrobereichsanalyse farblicher markanter
Ablagerungen dokumentiert, die beim Entleeren der Rhizobox isoliert wurden. Im als Sub-
strat verwendeten Sand der Rhizobox wurden kleine Bereiche mit auffallend orange-brau-
nem Belag entdeckt und einer Elementanalyse unterzogen (Abb. 12). Dabei handelt es sich
allerdings nicht um Arsenphasen, sondern um amorphe Eisenoxid-Ablagerungen. Diese ent-
halten nur an einzelnen Stellen gleichzeitig nachweisbare Mengen Arsen, die als Copräzipi-
tat ebenfalls in Form eines Oxids oder als Eisenarsenoxid vorliegen. Sulfide sind in diesem
Falle auszuschließen, da kein Schwefel detektiert wird.
Es wurden fortlaufend Proben der im Hydroponiksystem und in den Reaktoren eingesetzten
Pflanzen auf ihre Kontamination mit Arsen untersucht. Weder bei Phragmites australis noch
bei Cyperus alternifolius oder Juncus effusus konnte hierbei eine Arsen-Kontamination in
Blatt, Stängel oder Wurzeln durch Röntgenmikrobereichsanalyse nachgewiesen werden.
Weiterhin wurden Proben von Phragmites australis und Canna sp. untersucht, die an den
Standorten in Vietnam und Thailand entnommen wurden. Auch hier konnte in den Pflanzen
selbst kein Arsen nachgewiesen werden. Bei Wurzeln, deren Oberfläche sich oft nicht voll-
20
ständig von anhaftender Erde befreien ließ, wurde genau in diesen Anhaftungen des öfteren
Arsen durch Röntgenemissionssignale nachgewiesen. Allerdings handelte es sich hierbei
lediglich um lokal erhöhte Adsorption von Arsenationen, nicht um abgeschiedene amorphe
oder kristalline Arsen-Phasen.
Interessante Ergebnisse lieferten Analysen, die aus verschiedenen Experimenten mit Bakte-
rienkulturen stammen.
Zunächst wurden Schüttelversuche mit verschiedenen Reinkulturen (Pseudomonas corru-
gata, Arthrobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia, Variovorax sp., Ralstonia sp., Rhodo-
coccus sp.) ausgewertet, die mit Arsenlösung inkubiert worden waren. Nach Erhalt der Sus-
pensionen wurden die Bakterien durch Einsatz von Paraformaldehyd- oder Glutardialdehyd-
Lösungen fixiert, anschließend mehrmals gewaschen und kleine Volumina (20µl) der letztlich
erhaltenen Suspensionen auf Glasträger getropft, eingetrocknet und anschließend unter-
sucht. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt einen flächendeckenden Belag der jeweiligen
Bakterien, aber in keinem Falle wiesen die Bakterien und das übrige amorphe Material einen
durch die Röntgenmikrobereichsanalyse detektierbaren Arsengehalt auf. Auch ein Experi-
ment, bei dem ein nicht pathogener Stamm Escherichia coli auf Platten mit Nährmedium und
Arsen inkubiert wurde, zeigte weder kristalline Anhaftungen auf der Bakterienoberfläche,
noch sonst einen positiven Arsen-Nachweis bei der Elemantanalyse.
Ein anderes Bild ergeben Experimente mit bakteriellen Mischkulturen aus den verschiedenen
Modellsystemen (Hydroponiksystem, Pflanzenreaktor). Die jeweiligen Isolate wurden in
Nährmedien mit Arsen-Lösung versetzt und kultiviert. Zur Kultur eines Versuches wurde an-
schließend Natriumsulfid gegeben, um Aufschluss zu erhalten, in wie weit das Arsen von den
Bakterien aufgenommen oder anderweitig fest gebunden wurde. Es bildeten sich gelbliche
Präzipitate, deren Zusammensetzung anhand der Röntgenmikrobereichsanalyse bestimmt
wurde. Wie Abb. 13 bestätigt handelt es sich um Arsensulfid.
Also ist davon auszugehen, dass das Arsen von den Bakterien entweder überhaupt nicht
aufgenommen oder wieder an die Lösung abgegeben wird, wo es dann durch die Sulfid-Zu-
gabe präzipitiert werden kann. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass Biomineralisationspro-
zesse im Substrat möglich sind. In weiteren Experimenten wurden aus bepflanzten Säulen
des Hydroponiksystems und bepflanzten und unbepflanzten Festbett-Reaktoren verschie-
dene anaerobe Bakterien-Mischkulturen isoliert und mit Arsen-Lösungen kontaminiert. Dabei
wurde die Bildung gelblicher und schwarzer Präzipitate beobachtet, die mit Rasterelektro-
nenmikroskopie und Röntgenmikrobereichsanalyse auf ihre Zusammensetzung hin unter
21
Abb. 13: EDX-Spektrum von amorphem gelblichem Präzipitat aus Fällung mit Sulfid.
sucht wurden. Die verschiedenen amorphen Phasen zeigen stark differierende Zusammen-
setzungen. Diese werden durch die unterschiedliche oder fehlende Bepflanzung hervorge-
rufen, die differierende Bakterien-Gemeinschaften erzeugen. Bei den schwarzen Präzipitaten
handelt es sich um Eisensulfid (Abb. 14), bei den gelblichen um arsenhaltige Phasen ver-
schiedener Morphologie und Zusammensetzung.
Im Spektrum der Probe aus einem unbepflanzten Reaktor (Abb. 15) wird deutlich Arsen
nachgewiesen. Auffallend im Vergleich mit Spektren von Mischkulturen aus bepflanzten
Säulen und Reaktoren ist, dass kein Schwefel detektiert werden kann, dafür aber bedeu-
tende Mengen Phosphor, ebenso Calcium und Eisen. Bei den Präzipitaten handelt es dem-
nach aller Wahrscheinlichkeit nach um Phosphate von Calcium und Eisen, das Arsen wird
anstelle von Phosphat in Form von Arsenat copräzipitiert. Die Analysen der Mischkulturen
aus den bepflanzten Reaktoren dagegen zeigen zum einen bedeutend weniger Phosphor,
Calcium und Eisen, dafür aber ein deutliches Emissionssignal des Schwefels (Abb. 16) und
dazu Arsen in einer Intensität, die eindeutig für Arsen(III)sulfid spricht. Vielfach dominieren
die Signale für Arsen und Schwefel sogar die Spektren (Abb. 17), was eine hohe lokale An-
reicherung des Arsensulfides an der untersuchten Stelle bedeutet.
22
Abb. 14: EDX-Spektrum von amorphem schwarzem Präzipitat.
Abb. 15: EDX-Spektrum von amorphem gelblichem Präzipitat aus einem unbepflanzten
Reaktor.
23
Abb. 16: EDX-Spektrum von amorphem gelblichem Präzipitat aus einem bepflanzten
Reaktor.
Abb. 17: EDX-Spektrum von amorphem gelblichem Präzipitat aus einem bepflanzten
Reaktor.
24
In einzelnen Fällen wurden bei isolierten anaeroben Mischkulturen mit dem Rasterelektro-
nenmikroskop Kristalle vorgefunden, deren Röntgenmikrobereichsanalyse als Ergebnis ele-
mentares kristallines Arsen ergibt (Abb. 18). Es handelt sich dabei aber nur um einzelne
oder in kleinen Gruppen vorliegende Kristalle, die maximal wenige Mikrometer groß sind. Die
Emissionssignale der übrigen Elemente rühren in diesem Falle entweder von Anhaftungen
auf der Kristalloberfläche her oder werden aus der unmittelbaren Umgebung der Kristalle
emittiert und gelangen ebenfalls in den Detektor.
Abb. 18: EDX-Spektrum von kristalliner Arsenphase in amorphem gelblichem Präzipitat.
Ausgedehnte kristalline Mineralphasen, die als Resultat einer Biomineralisierung entstehen,
wurden über die gesamte Zeitspanne des Projektes weder auf den Wurzeloberflächen der
Pflanzen noch in den Substraten des Hydroponiksystems, der Pflanzenreaktoren oder den
Proben von den Anlagenstandorten in Thailand und Vietnam vorgefunden.
Um die erwartete Aufnahme von Arsen in die Pflanzen, die Verteilung zwischen den Pflan-
zenteilen und die eventuelle Anreicherung zu erfassen, wurden ICP-MS-Messungen durch-
geführt. Für Phragmites australis wurde festgestellt, dass die Hauptmenge Arsen in den
Wurzeln zu finden ist. Deutlich geringere Konzentrationen zeigen Blätter und Rhizome. Im
Spross der Pflanzen ist die gemessene Konzentration am niedrigsten. Zwei Probenserien,
die im Abstand von 6 Monaten genommen wurden, zeigen, dass die Verteilung des Arsens
25
innerhalb der Pflanze dieselbe bleibt und dass sich die aufgenommene Menge Arsen nur in
geringem Maße erhöht. Die höchsten ermittelten Arsenkonzentrationen liegen aber deutlich
unterhalb von 50 mg/kg, es findet also keine nennenswerte Akkumulation von Arsen in den
Pflanzen statt. Auch für Cyperus alternifolius wurden Messungen durchgeführt, die folgende
Resultate erbrachten: Wie schon bei Phragmites australis werden die höchsten Arsenkon-
zentrationen in den Wurzeln gemessen. In Blättern und Sprossen sind die Gehalte an Arsen
deutlich niedriger als in den Wurzeln, liegen aber untereinander auf ähnlichem Niveau. Die
gemessenen Arsengehalte in den Wurzeln von Cyperus alternifolius sind zwar deutlich höher
als die für Phragmites australis, liegen aber trotzdem noch unter 100 ppm [mg/kg]. Es kommt
also auch hier zu keiner nennenswerten Akkumulation des Arsens in der Pflanze.
Im Arbeitspaket 4 wurde nach Ideen und Wünschen des Instituts für Mikrobiologie an der
Technischen Universität Dresden eine Rhizobox konstruiert (Abb. 19). Sie sollte die genaue
Beobachtung und intensive Überwachung und Beprobung einer Rhizosphäre, bestehend aus
Pflanzenwurzeln, Biofilmen, Substrat und darin abgelagerter mineralischer Phasen, ermögli-
chen. Da in der Rhizosphäre mit lokalen Unterschieden einzelner oder mehrerer Systempa-
rameter wie pH-Wert, Sauerstoffgehalt, Leitfähigkeit, Redoxpotentialen oder enthaltener
Stoffe (z.B. durch Anreicherung, Ausfällung, Kristallisation, Biomineralisation) zu rechnen ist,
Abb. 19: Rhizobox zur Beobachtung und Beprobung einer Rhizosphäre.
26
sind Vorrichtungen zum Einbringen von Sensoren und zur Entnahme flüssiger oder fester
Proben in verschiedenen Bereichen der Rhizobox eingebaut. Es sollte damit ein möglichst
genaues Bild des Gesamtsystems und seiner lokal auftretenden Unterschiede erfasst wer-
den.
In einem zusätzlichen Arbeitspaket 5 wurde die Eignung des Adsorber-Granulates Hedulit
für einen Einsatz in einem dem bepflanzten Filtersystem nachgeschalteten Sicherheitsfilter
getestet. Zunächst wurden umfangreiche Vorexperimente durchgeführt, um Parameter wie
eine mögliche Veränderung des pH-Wertes nach Kontakt mit dem Adsorber, die Beeinflus-
sung der Adsorptionsleistung durch Fremdionen (insbesondere Phosphat und Eisen) oder
bei veränderlichem pH-Wert zu überprüfen. Dabei konnten keine nachteiligen Auswirkungen
auf die Adsorptionsleistung des Hedulit durch einen der untersuchten Faktoren festgestellt
werden. Abschließend wurde mit einem maßstabsreduzierten Modellsystem (Abb. 20) ein
Langzeitversuch durchgeführt, der möglichst viele Aspekte des Betriebsregimes der Pilot-
anlage in Thailand berücksichtigt. Dort sollen pro Tag 1,5 m3 des durch den Pflanzenfilter
vorgereinigten, gering arsenbelasteten Wasser durch den Sicherheitsfilter fließen.
Abb. 20: Maßstabreduziertes Modellsystem eines Sicherheitsfilters. A = Nadelventil zur
Regelung der CO2-Zufuhr, B = Zuleitung für CO2 und Entnahmeleitung der Arsenlösung, C =
Peristaltikpumpe, D = Sicherheitsfilter mit Hedulit, E = nachgeschaltete Adsorber-Säule mit
FerroSorp. 27
Damit soll die Arsenkonzentration, die bis dorthin auf etwa 100 µg/L reduziert wurde, sicher
auf Werte unterhalb des von der WHO festgelegten Grenzwertes von 10 µg/L Arsen für
Trinkwasser gebracht werden. Entsprechend der geplanten Betriebsweise der Pilotanlage,
wird auch im Modellversuch das Gesamtvolumen Arsenlösung pro Tag in drei Schwällen
über den Filter geleitet. Die Konzentration der Arsenlösung beträgt im Zulauf 100 µg/L, der
pH-Wert wird durch Einleiten von Kohlendioxid im Bereich 5,8 bis 6,0 stabilisiert (Kohlen-
säure/Hydrogencarbonat-Puffer). Die für die Pilotanlage bestehende Relation zwischen der
Masse Hedulit und dem Tagesvolumen arsenkontaminiertem Wasser wurde, auf geeignete
Laborgröße reduziert, beibehalten. Im Experiment wurde der Sicherheitsfilter mit insgesamt
60 Liter Arsen-Lösung kontaminiert. Für die Pilotanlage entspricht das einem Zeitraum von
60 Tagen mit einem täglichen Durchsatz von etwas mehr als 1,5 m3 Wasser. Die Arsenkon-
zentration im Ablauf des Sicherheitsfilters wird durch einen halbquantitativen Fertigtest mit
Analysenstäbchen (Arsen-Test hoch-sensitiv Merckoquant®, Nachweisgrenze 5 µg/L) über-
wacht. Zusätzlich wurde während des ersten Drittels der Experimentdauer von jedem durch-
gesetzten Schwall eine Probe entnommen und mittels ICP-MS die exakte Arsen-Konzentra-
tion ermittelt (Diagramm 01). Die Ergebnisse zeigen, dass nach einer Phase des Anfahrens
die Konzentrationen stabil bei Werten ≤ 2 µg/L einpendeln. Der einzige ermittelte Wert ober-
halb des WHO-Grenzwertes resultiert aus einer durch fehlerhafte Probennahme verursach-
ten Fremdkontamination, das Ergebnis des halbquantitativen Fertigtests vom selben Zeit-
punkt zeigt keine Farbreaktion, was eine gemessene Konzentration von weniger als 5 µg/L
Arsen bedeutet. Auch beim Abschluss des Experimentes lag der Arsengehalt noch unterhalb
der Erfassungsgrenze des Fertigtests von 5 µg/L und betrug damit weniger als 50% des er-
laubten Grenzwertes. Das Diagramm zeigt keine Auffälligkeiten, die aus der diskontinuierli-
chen Betriebsweise des Sicherheitsfilters resultieren.
Unter den verwendeten Parametern ist Hedulit demnach sehr gut für den Einsatz in einem
der Pflanzenfilteranlage nachgeschalteten Sicherheitsfilter geeignet.
28
Diagramm 01: Analysenergebnisse gen der As-Konzentration im Ablauf des Sicherheitsfilters. der ICP-MS-Bestimmun
Miniaturisierter Polizeifilter (Hedulit)
0
2
4
6
8
10
12
14
320
960
1600
2240
2880
3520
4160
4800
5440
6080
6720
7360
8000
8640
9280
9920
1056
011
200
1184
012
480
1312
013
760
1440
015
040
1568
016
320
1696
017
600
1824
018
800
Durchsatz As-Lösung [ml]
c(As)c(As) [µg/L]
WHO-Grenzwert
2. Nutzen der Ergebnisse im Sinne einer Verwertung
Für eine weitergehende Verwertung lassen sich folgende Ergebnisse nutzen, die im Rahmen
des Vorhabens erzielt wurden:
• Die entwickelten Probenträger mit fixiertem Sand als Substrat lassen sich für be-
liebige feuchte oder wässrige Versuchsumgebungen benutzen, bei denen Infor-
mationen über enthaltene Bakterien, von ihnen gebildete Biofilme oder spezifischere
Erkenntnisse, wie Vitalität, Gramfärbung, charakteristische Stoffwechseleigenheiten
oder Vorhandensein bestimmter Gene gewonnen werden sollen. Die aufgewach-
senen Bakterien und Biofilme können hierzu mit kommerziell verfügbaren Fluores-
zenz-Markern gekennzeichnet und untersucht werden. Auch eine Fixierung und Ent-
wässerung der Proben ist möglich, was eine unproblematische Präparation für
Untersuchungen mit Rasterelekronenmikroskopie, Röntgenmikrobereichsanalyse
oder Röntgenfluoreszenzanalyse erlaubt. Dafür wurden verschiedene Präparations-
techniken benutzt, die auf bewährte Methoden zurückgehen und auf die speziellen
Gegebenheiten angepasst wurden. Sie lassen sich als methodische Basis für Präpa-
rationen von Biofilm- und Bakterienaufwüchsen auf denselben oder ähnlichen Pro-
benträgern verwenden.
• Die Probenkörper, die eine Entnahme des losen Gefüges aus Sand, Mikroorga-
nismen und Wurzeln aus dem Gesamtsystem erlauben, lassen sich auch bei anderen
Modellsystemen benutzen, wo die Rhizosphäre von Pflanzen Gegenstand genauerer
Untersuchungen ist. Dabei können sowohl Sand als auch Erden als Substrate ver-
wendet werden. Die so gewonnenen Proben können in Abhängigkeit von ihrer Zu-
sammensetzung und den daraus resultierenden Beschränkungen für die jeweiligen
Untersuchungsmethoden vorbereitet werden.
• Die nach Wünschen und in Zusammenarbeit mit dem Institut für Mikrobiologie der TU
Dresden entwickelte Rhizobox bietet vielfältige Möglichkeiten für einen erfolgreichen
Einsatz bei Untersuchungen, die eine visuelle Beobachtung der Wurzelentwicklung
und eine variable Beprobung eines Wurzelraumes und der darin gebildeten Biofilme,
Bakterien- und Pilzpopulationen sowie im Substrat entstehender Ablagerungsproduk-
te (z.B. durch Biomineralisation) gestatten. Außerdem können durch eine Vielzahl
von nutzbaren Öffnungen Sonden eingebracht werden, die relevante Systempara-
meter wie Sauerstoffgehalte, Redoxpotentiale oder den pH-Wert permanent über-
wachen.
3. Fortschritte anderer Stellen
Es erschienen interessante Publikationen, die einzelne der im Projekt angewendeten Nach-
weis-Methoden beinhalten und sich mit Arsenaufnahme und Auswirkungen auf Pflanzenzel-
len beschäftigen. Diese Sachverhalte können für andere analytische Ansätze und zur Be-
wertung bepflanzter Filtersysteme verwendet werden.
In LI, W.-X., CHEN, T.-B., HUANG, Z.-Ch., LEI, M., LIAO, X.-Y., 2006, "Effect of arsenic on chlo-
roplast ultrastructure and calcium distribution in arsenic hyperaccumulator Pteris vittata L.",
Chemosphere 62, 803-809, werden interessante Ergebnisse veröffentlicht, die elektronen-
mikroskopisch belegbare Veränderungen in der Ultrastruktur der Chloroplasten ausgewach-
sener Blätter des Farns Pteris vittata dokumentieren und neue Ansatzpunkte zum indirekten
Nachweis von Arsen beinhalten.
Bei voll entwickelten Fiederblättern wird infolge der Einwirkung geringer Mengen Arsen bei
einem kleinen Teil der Membranen der Chloroplasten ein Anschwellen beobachtet. Bei ho-
hen Arsenbelastungen verändern die Chloroplasten ihre Form (linsenförmig bei jungen Fie-
derblättern und alten Fiederblättern unter geringer Arsenbelastung) hin zur Kugel. Zusätzlich
zeigen die Membranen schwere Schädigungen oder sie fehlen ganz, was Plasmolyse und
Nekrose zur Folge hat. Durch hohe Arsenbelastungen ändert sich auch das Muster der Cal-
cium-Verteilung in den voll entwickelten Fiederblättern, deren Zellen bereits durch die Plas-
molyse beeinflusst werden. Man beobachtet größere Mengen des ausgefällten Calciums
außerhalb der Membranen, ebenso wie größere Partikel im Zytoplasma. Bei Zellen unbe-
lasteter Proben hingegen findet sich der überwiegende Anteil der Calcium-Präzipitate an der
inneren Membran der Vakuolen und nur geringe Mengen außerhalb der Zellwände.
Wie für Pteris vittata belegt, sind auch für andere Pflanzen Veränderungen oder Schäden
durch Arsenbelastung in den zellulären Ultrastrukturen denkbar, die Hinweise auf genauere
Verteilung des Schadstoffes innerhalb der Pflanzen und ihrer Zellen geben können. Eine
Detektion dieser Veränderungen ist mittels Transmissionselektronenmikroskopie möglich.
Auch eine Beeinflussung der Konzentration und Verteilung von Calcium oder anderer phy-
siologisch relevanter Metallionen als Reaktion auf die Arsenbelastung ist sehr gut möglich
und eröffnet sowohl über Methoden der Mikroelementanalyse (z.B. Röntgenmikrobereichs-
analyse, Röntgenfluoreszenzanalyse) oder über Fluoreszenzmarkierung der Metallionen
eine Erfassung von Einflüssen des Arsens auf die Pflanzen.
4. Geplante und erfolgte Publikationen
A) Anfertigung, Bearbeitung und Bereitstellung von Aufnahmen mit dem Rasterelektronenmi-
kroskop und Elementanalysen mit der Röntgenmikrobereichsanalyse für:
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1) R. Haufe: Untersuchung der Struktur und des Leistungsvermögens der mikrobiellen
Biozönose in Sandfiltersäulen unter Belastung mit arsenhaltigem Wasser, Diplomarbeit,
Institut für Mikrobiologie, TU Dresden, 2004.
2) M. Paulmann: Charakterisierung der mikrobiellen Biozönose in bepflanztem und unbe-
pflanztem Bodenfilter unter Arsenbelastung, Diplomarbeit, Institut für Mikrobiologie, TU
Dresden, 2007.
B) Posterbeitrag beim durch das BMBF und BMWA organisierten "German Water Day" in
Vietnam im Rahmen der Messen H2O und EPM, 11.-14.10.2005, Ho Chi Minh City, Viet-
nam.
C) Vortrag zur Vorstellung des Teilprojektes in Zusammenarbeit mit dem Institut für Mirkobio-
logie anlässlich der Übergabe der Pilotanlage, Dezember 2006, Mahidol Universität
Bangkok, Thailand.
Das diesem Bericht zugrunde liegende Vorhaben wurde mit Mitteln des Bundesministeriums
für Bildung und Forschung (BMBF) unter dem Förderkennzeichen 02WT0450 gefördert. Die
Verantwortung für den Inhalt dieser Veröffentlichung liegt beim Autor.
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