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Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
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Expressatildeo e caracterizaccedilatildeo de α-amilase de Bacillus licheniformis DSM13
em levedura Pichia pastoris
Helber Abellini Astolpho1 Edson Juacutenior do Carmo2 Spartaco Astolfi-Filho3
Submetido 19062017 ndash Aceito 27072017 ndash Publicado on-line 30072017
Resumo
A manipulaccedilatildeo geneacutetica de micro-organismos permite a produccedilatildeo de enzimas com alto valor
biotecnoloacutegico com aplicaccedilatildeo em vaacuterios processos industriais A enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis eacute amplamente utilizada nas induacutestrias de aacutelcool accediluacutecar cerveja e panificaccedilatildeo para a
hidroacutelise do amido inicial clivando as ligaccedilotildees glicosiacutedicas α-(14) Deste modo sistemas de
expressatildeo de proteiacutenas heteroacutelogas tem sido utilizado com sucesso sendo um exemplo o sistema da
levedura metilotroacutefica Pichia pastoris O objetivo deste trabalho foi clonar e expressar o gene que
codifica a α-amilase de B licheniformis DSM13 na levedura metilotroacutefica P pastoris e apoacutes analisar a
proteiacutena recombinante secretada Desta forma o gene foi inserido no genoma da levedura utilizando o
vetor pPIC9 e a enzima foi entatildeo produzida e secretada A atividade enzimaacutetica maacutexima foi observada
no sobrenadante do clone B8 (3454 UmL) Houve variaccedilatildeo quanto ao peso molecular da enzima
entre os clones analisados por gel SDS-PAGE A enzima apresentou temperatura oacutetima de atividade
de 70 ordmC consideraacutevel estabilidade na presenccedila de caacutelcio pH oacutetimo de 70 e tambeacutem se manteve
estaacutevel por um periacuteodo de dois meses quando incubada a 4 ordmC Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
calculado para o extrato bruto do clone A7 foram de 1074 mgmL e 41666 UmL respectivamente
Palavras-Chave Expressatildeo heteroacuteloga enzima recombinante caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica etanol
Expression and characterization of α-amylase from Bacillus licheniformis DSM13 in
yeast Pichia pastoris Genetic manipulation of microorganisms allows the production of enzymes
with high biotechnological value with application in various industrial processes The enzyme α-
amylase from Bacillus licheniformis is widely used in industries to produce alcohol sugar and beer
and its activity involves hydrolysis of starch cleaving the glycosidic bonds α-(14) Thus heterologous
protein expression systems have been used successfully one example being the methylotrophic yeast
Pichia pastoris The porpouse of this study was to clone and to express the gene encoding α-amylase
from B licheniformis DSM13 in the methylotrophic yeast P pastoris and also to analyze the
recombinant protein secreted In this way the gene was inserted into the yeast genome using the
pPIC9 vector and the enzyme was then produced and secreted The maximum enzyme activity was
observed in the supernatant of the clone B8 (3454 UmL) Variations in molecular weight of the
enzymes among the clones were detected by SDS-PAGE gel analysis The enzyme showed optimum
activity at 70 ordmC pH optimum of 70 and its activity remained stable for a period of two months when
maintained at 4 degC The Km and Vmaacutex apparent values calculated for the crude extract clone A7 were
1074 mgmL and 41666 UmL respectively
Keywords Heterologous expression recombinant enzyme enzyme characterization ethanol
1 Bioacutelogo Doutor em Biotecnologia Programa Multi-Institucional de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Biotecnologia
Departamento Centro de Apoio Multidisciplinar - Av General Rodrigo Octaacutevio Jordatildeo Ramos 3000 Coroado
II Manaus Amazonas Brasil correspondecircncia hastolphogmailcom 2 Professor Adjunto Departamento de Ciecircncias FisioloacutegicasICB Universidade Federal do Amazonas Manaus
AM Brasil E-mail edsonjuniorbioyahoocombr 3 Professor Titular de Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas Diretor do Centro de Apoio
Multidisciplinar Universidade Federal do Amazonas Manaus AM Brasil E-mail spartacobiotecgmailcom
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1 Introduccedilatildeo Amilases satildeo enzimas responsaacuteveis pela
degradaccedilatildeo da moleacutecula de amido e estatildeo
amplamente distribuiacutedas na natureza Elas
apresentam grande importacircncia industrial
correspondendo a aproximadamente 25 da
produccedilatildeo de enzimas do mundo (YAN e WU
2017 LI et al 2012) A hidroacutelise do amido
gera diversos produtos incluindo dextrinas e
poliacutemeros menores compostos por unidades de
glicose Trecircs domiacutenios distintos caracterizam a
estrutura geral dessas enzimas que satildeo
divididas em grupos de acordo com suas
respectivas atividades cataliacuteticas (LI et al
2016 ASGHARI et al 2004) As α-amilases
clivam as ligaccedilotildees glicosiacutedicas α-(14)
presentes nas cadeias de amilose ou
amilopectina da moleacutecula de amido Estas
apresentam vasta aplicaccedilatildeo nas induacutestrias de
alimentos farmacecircuticas tecircxtil panificaccedilatildeo
bem como em processos envolvidos na
liquefaccedilatildeo do amido para a produccedilatildeo de
xaropes de frutose e na produccedilatildeo de etanol
combustiacutevel (MAGALHAtildeES e SOUZA 2010
ZHU et al 2017) Ao longo das uacuteltimas
deacutecadas pesquisas tecircm sido desenvolvidas
com α-amilases produzidas por uma grande
variedade de microrganismos (fungos
leveduras bacteacuterias e actinomicetos) A
principal vantagem eacute a capacidade de produccedilatildeo
econocircmica em massa e a faacutecil manipulaccedilatildeo
para obtenccedilatildeo de enzimas com caracteriacutesticas
desejaacuteveis (PANDEY et al 2000 SINDHU et
al 2017)
A α-amilase da bacteacuteria Bacillus
licheniformis eacute amplamente utilizada nas
induacutestrias de aacutelcool accediluacutecar e cerveja para a
hidroacutelise do amido Sua estrutura possui trecircs
domiacutenios o domiacutenio A eacute formado por uma
tiacutepica estrutura em barril (βα)8 o domiacutenio B
se estabelece como uma protrusatildeo a partir do
domiacutenio A e o domiacutenio C-terminal possui o
siacutetio ativo da enzima e conservados siacutetios de
ligaccedilatildeo para o caacutelcio (NAZMI et al 2006)
Devido muitos microrganismos secretar
quantidades limitadas de enzimas ou outras
proteiacutenas e peptiacutedeos a expressatildeo heteroacuteloga
em outras ceacutelulas hospedeiras tem sido
empregada para potencializar a obtenccedilatildeo
desses produtos de interesse biotecnoloacutegico
Neste sentido a levedura metilotroacutefica Pichia
pastoris eacute um modelo de sucesso para a
expressatildeo de produtos heteroacutelogos A produccedilatildeo
de proteiacutenas heteroacutelogas em altos niacuteveis as
modificaccedilotildees poacutes-traducionais como
glicosilaccedilatildeo formaccedilatildeo de pontes de dissulfeto
o processamento proteoliacutetico e a viabilidade do
sistema de expressatildeo como Kit comercialmente
disponiacutevel contribuiacuteram para o sucesso dessa
levedura como sistema de expressatildeo
(CEREGHINO e CREGG 2000 HUANG et
al 2017) Neste estudo expressamos o gene
que codifica a enzima α-amilase de B
licheniformis (linhagem DSM13) em P
pastoris e analisamos o produto recombinante
secretado
2 Material e Meacutetodos
21 Linhagens de micro-organismos e
vetores moleculares utilizados Microorganismos Escherichia coli
DH10Btrade (Invitrogen) genoacutetipo F- mcrA
Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara
leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG
Escherichia coli TOP10trade (Invitrogen)
genoacutetipo Fndash mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139
Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1
nupG Pichia pastoris GS115 (Invitrogenreg)
genoacutetipo his4 Vetores moleculares pPIC9
(InvitrogenTM) pCRreg21-TOPO
(InvitrogenTM)
22 Estrateacutegias de clonagem e
subclonagem O DNA genocircmico de B licheniformis
(DSM13) foi cedido pelo Instituto de Geneacutetica
da Universidade de Bayreuth-Alemanha O
gene correspondente a α-amilase foi
amplificado por PCR utilizando-se o par de
oligonucleotiacutedeos iniciadores Ramy e Famy
(Ramy 5rsquoCGGCGGCCGCCTATCTTTGAAC
ATAAATTGAAAC3rsquoFamy5rsquoCGGAATTCA
ATCTTAAAGGGACGCTGATG 3rsquo) Nas
extremidades 5rsquo destes foram inseridos as
sequencias correspondentes agraves enzimas de
restriccedilatildeo NotI e EcoRI (New England Biolabs)
respectivamente A termociclagem consistiu de
um ciclo de desnaturaccedilatildeo inicial a 94ordmC por 2
minutos seguido de 35 ciclos de 94ordmC por 35
segundos 60ordmC por 40 segundos e 58ordmC por
15 minutos A extensatildeo final foi de 58ordmC por
5 minutos O produto da PCR (amplicon) foi
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clonado no vetor pCRreg21-TOPOreg e inserido
por transformaccedilatildeo quiacutemica nas ceacutelulas
TOP10trade (Invitrogen) conforme
recomendaccedilotildees do fabricante A construccedilatildeo do
vetor de clonagem TOPO-amy foi confirmada
por PCR utilizando-se DNA plasmidial
extraiacutedo
Para a expressatildeo da enzima α-amilase na
levedura Pichia pastoris foi utilizado o vetor
pPIC9 (InvitrogenTM) 100 ng de DNA dos
vetores TOPO-amy e pPIC9 foram digeridos
com 1Uμg das enzimas EcoRI e NotI Apoacutes a
digestatildeo o inserto liberado e o vetor de
expressatildeo linearizado foram purificados em gel
de agarose (Illustra GFX PCR DNA and Gel
Band Purification - GE Healthcare) A reaccedilatildeo
de ligaccedilatildeo ocorreu em volume reacional final
de 15 μL contendo 260 ngμL de Inserto 500
ngμL do vetor T4 DNA ligase 400 Uμg
(New England Biolabs) e 15 uL de tampatildeo
10X O vetor de expressatildeo construiacutedo (pPIC-
amy) foi precipitado com acetato de amocircnia
75M 110 vv e etanol absoluto gelado 25 vv
sendo em seguida inserido em ceacutelulas
DH10Btrade (Invitrogen) por transformaccedilatildeo
eletrocompetente A construccedilatildeo do plasmiacutedeo
recombinante foi confirmada por anaacutelise de
restriccedilatildeo
23 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes A recombinaccedilatildeo homoacuteloga para
integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo no genoma
da hospedeira pode ocorrer no locus his4 ou no
locus AOX1 por eventos de crossing over entre
regiotildees do vetor e genoma Para que esse
processo ocorra eacute necessaacuterio a linearizaccedilatildeo do
plasmiacutedeo recombinante Deste modo o
plasmiacutedeo pPIC-amy foi linearizado utilizando
a endonuclease de restriccedilatildeo BglII (New
England Biolabs) O plasmiacutedeo precipitado
com acetato de amocircnia 75M 110 vv e etanol
100 gelado 25 vv foi inserido nas
leveduras GS115 por eletroporaccedilatildeo (1500 V)
As ceacutelulas transformadas foram semeadas no
meio de cultivo MD e incubadas a 30ordmC
durante trecircs dias Os clones recombinantes
foram selecionados no meio miacutenimo MD por
meio de seleccedilatildeo auxotroacutefica anti-histidina
24 Seleccedilatildeo dos clones produtores de α-
amilase A primeira etapa de seleccedilatildeo consistiu na
transferecircncia de 96 clones recombinantes do
meio de cultivo MD para o meio de cultivo
BMG-Y Esses clones foram incubados por
dois dias a 30 ordmC para o aumento do
crescimento celular Apoacutes essa etapa os clones
foram transferidos para o meio de cultivo
indutor BMM-Y Estes foram incubados por
mais trecircs dias na mesma temperatura Para
induzir a expressatildeo da enzima foi adicionado
metanol (concentraccedilatildeo de 05) nas tampas
das placas por trecircs dias a cada 24 horas A
uacuteltima etapa consistiu na seleccedilatildeo dos clones
produtores por meio da coloraccedilatildeo de vapor de
iodo Esta coloraccedilatildeo permite visualizar halos
transluacutecidos ao redor das colocircnias que tiveram
a α-amilase expressa Apoacutes a seleccedilatildeo foi
calculado o iacutendice de amiloacutelise (Ia) Este iacutendice
eacute o resultado da relaccedilatildeo entre o diacircmetro do
halo e o diacircmetro da colocircnia e foi calculado
pela foacutermula Ia = (dh2dc2) (dh = diacircmetro do
halo e dc = diacircmetro da colocircnia)
25 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido Nove clones recombinantes foram
selecionados para a produccedilatildeo da enzima α-
amilase em meio liacutequido Estes clones foram
transferidos para o meio BMG-Y (30 mL) e
incubados a 30 degC sob agitaccedilatildeo (200 rpmmin)
ateacute atingir uma transmitacircncia de λ600 de 06
medido em espectrofotocircmetro Em seguida os
meios foram centrifugados por 15 minutos a 4
ordmC (4000 rpm) O pellet de cada cultura foi
ressuspendido em 150 mL do meio indutor
BMM-Y em frascos de 1L A induccedilatildeo da
expressatildeo enzimaacutetica teve o iniacutecio com a
adiccedilatildeo de metanol 05 vv O tempo de
produccedilatildeo da enzima teve duraccedilatildeo de 120 horas
sendo adicionado metanol a cada 24 horas
Aliacutequotas de 1 mL foram retiradas em
triplicata nos tempos de 0 24 48 72 e 120
horas e armazenadas em microtubos de 15
mL Todas as aliacutequotas retiradas foram
centrifugadas a 12000 rpm a 4 degC e os
sobrenadantes foram recuperados e estocados a
-20 degC Estas aliacutequotas foram utilizadas para a
realizaccedilatildeo dos ensaios enzimaacuteticos anaacutelise da
expressatildeo proteica e para a construccedilatildeo da
curva de crescimento dos clones induzidos O
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crescimento celular obtido foi convertido para
gL utilizando a foacutermula (gL)=022 x DO
600 ηm (Nakano et al 2006)
A anaacutelise da proteiacutena recombinante
secretada pela levedura foi feita por meio de
eletroforese em gel desnaturante de
poliacrilamida (SDS-PAGE) conforme descrito
por Sambrook et al (1989) e as amostras
foram coradas com a soluccedilatildeo de Azul
Brilhante de Coomassie G250
26 Determinaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica A quantificaccedilatildeo das dextrinas liberadas
pela enzima α- amilase foi determinada de
acordo como descrito por Fuwa (1954) Os
nove clones tiveram sua atividade enzimaacutetica
dosada Para o caacutelculo dos valores da atividade
enzimaacutetica construiu-se a curva padratildeo de
amido A leitura das absorbacircncias das
diferentes concentraccedilotildees de amido (0025 a
1) gerou uma equaccedilatildeo da reta (R = 0993)
utilizada para fazer os caacutelculos da atividade
enzimaacutetica Uma unidade de atividade
dextrinizante foi definida como a quantidade
de enzima necessaacuteria para hidrolisar 01 mg de
amido por minuto
27 Ensaios enzimaacuteticos Os ensaios enzimaacuteticos para determinar
o pH oacutetimo temperatura oacutetima estabilidade
teacutermica e estabilidade em relaccedilatildeo ao tempo de
estocagem da enzima tambeacutem foram
realizados de acordo com o meacutetodo de Fuwa
(1954) Todos os ensaios foram realizados com
os extratos enzimaacuteticos dos clones A5 B8 e
D14 Para determinar o pH oacutetimo da enzima
foi preparada uma soluccedilatildeo de glicina 50 mM
aacutecido aceacutetico 50 mM e fosfato de soacutedio
dibaacutesico 50 mM que permitiu variar o pH entre
as faixas de 20 a 120 Para definir a
temperatura oacutetima os extratos enzimaacuteticos
foram analisados em diferentes temperaturas
(40 a 100 degC) Para avaliar a estabilidade
teacutermica da enzima em relaccedilatildeo agrave temperatura o
extrato do clone B8 foi preacute-incubado por 60
minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC no
pH oacutetimo preacute-estabelecido A cada 15 minutos
foram coletados uma aliacutequota para proceder agrave
dosagem da atividade enzimaacutetica Foram
acrescidos na reaccedilatildeo CaCl2 (5 mM) conforme
descrito por Hmidet et al 2008 A estabilidade
da enzima em relaccedilatildeo ao tempo de estocagem
tambeacutem foi medida A enzima foi estocada por
um periacuteodo de 60 dias a 4 ordmC e sua atividade
enzimaacutetica foi avaliada a cada 10 dias durante
este periacuteodo Os paracircmetros cineacuteticos aparentes
do extrato enzimaacutetico foram determinados nas
condiccedilotildees preacute-estabelecidas de pH e
temperatura oacutetima Para avaliar esses
paracircmetros o extrato foi incubado em
diferentes concentraccedilotildees de amido (5 a 90
mgmL) Os dados obtidos foram utilizados
para construir um graacutefico com os valores reais
de Km e Vmaacutex da enzima
3 Resultados
31 Construccedilatildeo dos vetores de clonagem
e expressatildeo O amplicon do gene α-amilase gerado
apoacutes a PCR foi de aproximadamente 1500
pares de bases Apoacutes a amplificaccedilatildeo foi
realizado a ligaccedilatildeo do gene no vetor de
clonagem pCRreg21-TOPOreg (39 kb) O vetor
construiacutedo (TOPO-amy) foi digerido com as
endonucleases EcoRI e NotI e o fragmento
liberado foi purificado do gel de agarose
(Figura 1)
Figura 1 - Figura-A perfil dos plasmiacutedeos
recombinantes TOPO-amy apoacutes restriccedilatildeo com
EcoRI e NotI Figura-B Perfil do gene α-amilase
purificado M ndash marcador de peso molecular 1 Kb
(Fermentas)
Na Figura 2 visualizamos a construccedilatildeo
do vetor de expressatildeo pPIC-amy A ligaccedilatildeo do
fragmento gecircnico foi realizada apoacutes a
sequecircncia promotora do gene AOX1 A
subclonagem foi confirmada por anaacutelise de
restriccedilatildeo
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Figure 2 - Figura-A ligaccedilatildeo do gene ao vetor de
expressatildeo Coluna 1 - sistema sem enzima ligase
Coluna 2 - Sistema contendo a enzima T4 DNA
ligase Figura-B Anaacutelise de restriccedilatildeo do vetor de
expressatildeo pPIC-amy (coluna 1 e 2) M - Marcador
de peso molecular 1Kb (Fermentas)
32 Expressatildeo de α-amilase em meio
soacutelido Apoacutes a transformaccedilatildeo das leveduras P
pastoris (GS115) noventa e seis
transformantes foram previamente
selecionados 802 dos clones foram
considerados produtores Os 96 clones foram
divididos em quatro placas e apoacutes o periacuteodo de
induccedilatildeo com metanol foi feito a anaacutelise da
expressatildeo proteica Na figura 3 observamos
uma placa de Petri contendo clones
considerados produtores de α-amilase
recombinante clones natildeo produtores e o
controle positivo de expressatildeo de α-amilase de
Bacillus subtilis
Figura 3 - Revelaccedilatildeo com vapor de iodo dos clones
produtores da enzima recombinante Visualizaccedilatildeo
dos halos formados apoacutes induccedilatildeo das leveduras P
pastoris
Foram escolhidos nove clones que
apresentaram os maiores iacutendices de amilolise
para a expressatildeo da enzima recombinante em
meio liacutequido Os iacutendices de amilolise dos nove
clones selecionados estatildeo apresentados na
Tabela 1
Tabela 1 - Iacutendice de amilolise dos nove clones
utilizados nos testes de cineacutetica enzimaacutetica e
produccedilatildeo da enzima em meio liacutequido
Clone Iacutendice de amilolise (dhsup2dcsup2)
A5 1075
A7 1004
B8 1267
B20 1198
C13 1079
C22 1007
D10 1036
D14 1174
D17 1181
Observamos que o maior iacutendice
apresentado foi correspondente ao clone B8
enquanto que o menor Ia foi aferido do clone
A7 Apoacutes o caacutelculo dos iacutendices de amiloacutelise os
nove clones selecionados foram entatildeo
utilizados na induccedilatildeo da enzima recombinante
em meio liacutequido
33 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido e cineacutetica de induccedilatildeo
Figura 4 - Cineacutetica de induccedilatildeo enzimaacutetica com os
nove clones produtores da enzima recombinante
Os dados obtidos apoacutes a induccedilatildeo da
enzima podem ser observados na Figura 4
Observamos um aumento progressivo da
atividade enzimaacutetica em relaccedilatildeo ao tempo de
induccedilatildeo dos nove clones A α-amilase
recombinante apresentou maior atividade
enzimaacutetica ao final das 120 horas de induccedilatildeo
poreacutem foi observada uma variaccedilatildeo da atividade
nos sobrenadantes dos clones testados De
acordo com os dados obtidos o clone B8 foi o
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que exibiu a maior atividade enzimaacutetica entre
os sobrenadantes testados (3454 UmL)
enquanto que o clone A7 obteve o menor valor
de atividade enzimaacutetica (2489 UmL) (Figura
4)
34 Anaacutelise em gel SDS-PAGE da
enzima recombinante secretada Foi possiacutevel visualizar duas bandas
correspondentes agrave enzima α-amilase (Figura 5-
A) O perfil de bandas dos clones analisados
no presente trabalho teve variaccedilotildees quanto ao
peso molecular Esta variaccedilatildeo foi de 65 a 74
kDa aproximadamente Os resultados da
cineacutetica de expressatildeo com o clone B8
mostraram a maacutexima expressatildeo de α-amilase
recombinante no tempo de 120 horas de
induccedilatildeo Observamos tambeacutem que o controle
negativo da expressatildeo (clone GS115)
apresentou vaacuterias bandas correspondentes agraves
proteiacutenas endoacutegenas da levedura P pastoris
Essas bandas natildeo satildeo visualizadas nos clones
recombinantes que passam a ter sua
maquinaria geneacutetica voltada para transcriccedilatildeo
da proteiacutena heteroacuteloga (Figura 5-B)
Figura 5 - A Perfil eletroforeacutetico em gel SDS-PAGE da enzima recombinante secretada pelos nove clones
Clone GS115 controle negativo da expressatildeo Setas indicam as bandas correspondentes agrave enzima secretada B
Cineacutetica de expressatildeo do clone B8 nos diferentes tempos de induccedilatildeo (24 48 72 96 e 120 horas) C- Controle
negativo da expressatildeo M ndash Marcador de massa molecular (10-200 kDa)
35 Caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica
Os dados mostram que a enzima
secretada apresentou melhor funcionalidade
em pH neutro mantendo alta atividade relativa
na faixa que vai de 70 a 80 e tendo o maacuteximo
de atividade enzimaacutetica em pH 70 para os 3
clones analisados (Figura 6)
A temperatura oacutetima em que a
enzima obteacutem a maacutexima atividade
hidrolisante foi de 70 ordmC No entanto
podemos observar que na temperatura de
80 ordmC a enzima reteve cerca de 80 de sua
atividade relativa para os clones A5 e D14
e 8974 para o clone B8 Na temperatura
de 90 ordmC sua atividade foi aferida em
aproximadamente 75 para os clones B8 e
D14 e 7197 para o clone A5 (Figura 7-
A)
Figura 6 - Efeito do pH sobre a atividade de α-
amilase produzida pelos clones A5 B8 e D14
A B
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Os testes de termoestabilidade com o
clone B8 demonstraram que na temperatura de
60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a
enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes
uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70
ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos
que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve
474 de sua atividade enquanto que na
presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua
atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a
presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua
atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de
incubaccedilatildeo (Figura 7-B)
Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-
amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio
A anaacutelise dos dados quanto a
estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC
demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de
estocagem a enzima teve apenas 5 de perda
da sua atividade cataliacutetica Essa perda se
iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A
atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo
dia de incubaccedilatildeo foi de 9583
36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima
recombinante (Km and Vmax)
Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
foram calculados a partir da construccedilatildeo de um
graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-
Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da
relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos
velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do
substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex
na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de
1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]
permitindo determinar com mais precisatildeo a
Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km
aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex
igual a 41666 UmL
4 Discussatildeo
O tamanho do amplicon gerado eacute
consistente com o apresentado por Ivanova e
colaboradores (1993) indicando que o gene da
α-amilase foi totalmente amplificado
A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo
permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da
levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo
escolhido referente agrave enzima BglII permitiu
uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou
substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou
duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e
do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de
dois fenoacutetipos diferentes da levedura P
pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand
e colaboradores (2017) a levedura
metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo
apresenta em seu material geneacutetico vetores
epissomais Com isso para que ocorra a
expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute
fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico
no seu genoma De acordo com Daly e Hearn
(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo
ocorre em locus especiacuteficos no genoma da
AB
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
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1 Introduccedilatildeo Amilases satildeo enzimas responsaacuteveis pela
degradaccedilatildeo da moleacutecula de amido e estatildeo
amplamente distribuiacutedas na natureza Elas
apresentam grande importacircncia industrial
correspondendo a aproximadamente 25 da
produccedilatildeo de enzimas do mundo (YAN e WU
2017 LI et al 2012) A hidroacutelise do amido
gera diversos produtos incluindo dextrinas e
poliacutemeros menores compostos por unidades de
glicose Trecircs domiacutenios distintos caracterizam a
estrutura geral dessas enzimas que satildeo
divididas em grupos de acordo com suas
respectivas atividades cataliacuteticas (LI et al
2016 ASGHARI et al 2004) As α-amilases
clivam as ligaccedilotildees glicosiacutedicas α-(14)
presentes nas cadeias de amilose ou
amilopectina da moleacutecula de amido Estas
apresentam vasta aplicaccedilatildeo nas induacutestrias de
alimentos farmacecircuticas tecircxtil panificaccedilatildeo
bem como em processos envolvidos na
liquefaccedilatildeo do amido para a produccedilatildeo de
xaropes de frutose e na produccedilatildeo de etanol
combustiacutevel (MAGALHAtildeES e SOUZA 2010
ZHU et al 2017) Ao longo das uacuteltimas
deacutecadas pesquisas tecircm sido desenvolvidas
com α-amilases produzidas por uma grande
variedade de microrganismos (fungos
leveduras bacteacuterias e actinomicetos) A
principal vantagem eacute a capacidade de produccedilatildeo
econocircmica em massa e a faacutecil manipulaccedilatildeo
para obtenccedilatildeo de enzimas com caracteriacutesticas
desejaacuteveis (PANDEY et al 2000 SINDHU et
al 2017)
A α-amilase da bacteacuteria Bacillus
licheniformis eacute amplamente utilizada nas
induacutestrias de aacutelcool accediluacutecar e cerveja para a
hidroacutelise do amido Sua estrutura possui trecircs
domiacutenios o domiacutenio A eacute formado por uma
tiacutepica estrutura em barril (βα)8 o domiacutenio B
se estabelece como uma protrusatildeo a partir do
domiacutenio A e o domiacutenio C-terminal possui o
siacutetio ativo da enzima e conservados siacutetios de
ligaccedilatildeo para o caacutelcio (NAZMI et al 2006)
Devido muitos microrganismos secretar
quantidades limitadas de enzimas ou outras
proteiacutenas e peptiacutedeos a expressatildeo heteroacuteloga
em outras ceacutelulas hospedeiras tem sido
empregada para potencializar a obtenccedilatildeo
desses produtos de interesse biotecnoloacutegico
Neste sentido a levedura metilotroacutefica Pichia
pastoris eacute um modelo de sucesso para a
expressatildeo de produtos heteroacutelogos A produccedilatildeo
de proteiacutenas heteroacutelogas em altos niacuteveis as
modificaccedilotildees poacutes-traducionais como
glicosilaccedilatildeo formaccedilatildeo de pontes de dissulfeto
o processamento proteoliacutetico e a viabilidade do
sistema de expressatildeo como Kit comercialmente
disponiacutevel contribuiacuteram para o sucesso dessa
levedura como sistema de expressatildeo
(CEREGHINO e CREGG 2000 HUANG et
al 2017) Neste estudo expressamos o gene
que codifica a enzima α-amilase de B
licheniformis (linhagem DSM13) em P
pastoris e analisamos o produto recombinante
secretado
2 Material e Meacutetodos
21 Linhagens de micro-organismos e
vetores moleculares utilizados Microorganismos Escherichia coli
DH10Btrade (Invitrogen) genoacutetipo F- mcrA
Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara
leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG
Escherichia coli TOP10trade (Invitrogen)
genoacutetipo Fndash mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)
Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139
Δ(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1
nupG Pichia pastoris GS115 (Invitrogenreg)
genoacutetipo his4 Vetores moleculares pPIC9
(InvitrogenTM) pCRreg21-TOPO
(InvitrogenTM)
22 Estrateacutegias de clonagem e
subclonagem O DNA genocircmico de B licheniformis
(DSM13) foi cedido pelo Instituto de Geneacutetica
da Universidade de Bayreuth-Alemanha O
gene correspondente a α-amilase foi
amplificado por PCR utilizando-se o par de
oligonucleotiacutedeos iniciadores Ramy e Famy
(Ramy 5rsquoCGGCGGCCGCCTATCTTTGAAC
ATAAATTGAAAC3rsquoFamy5rsquoCGGAATTCA
ATCTTAAAGGGACGCTGATG 3rsquo) Nas
extremidades 5rsquo destes foram inseridos as
sequencias correspondentes agraves enzimas de
restriccedilatildeo NotI e EcoRI (New England Biolabs)
respectivamente A termociclagem consistiu de
um ciclo de desnaturaccedilatildeo inicial a 94ordmC por 2
minutos seguido de 35 ciclos de 94ordmC por 35
segundos 60ordmC por 40 segundos e 58ordmC por
15 minutos A extensatildeo final foi de 58ordmC por
5 minutos O produto da PCR (amplicon) foi
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clonado no vetor pCRreg21-TOPOreg e inserido
por transformaccedilatildeo quiacutemica nas ceacutelulas
TOP10trade (Invitrogen) conforme
recomendaccedilotildees do fabricante A construccedilatildeo do
vetor de clonagem TOPO-amy foi confirmada
por PCR utilizando-se DNA plasmidial
extraiacutedo
Para a expressatildeo da enzima α-amilase na
levedura Pichia pastoris foi utilizado o vetor
pPIC9 (InvitrogenTM) 100 ng de DNA dos
vetores TOPO-amy e pPIC9 foram digeridos
com 1Uμg das enzimas EcoRI e NotI Apoacutes a
digestatildeo o inserto liberado e o vetor de
expressatildeo linearizado foram purificados em gel
de agarose (Illustra GFX PCR DNA and Gel
Band Purification - GE Healthcare) A reaccedilatildeo
de ligaccedilatildeo ocorreu em volume reacional final
de 15 μL contendo 260 ngμL de Inserto 500
ngμL do vetor T4 DNA ligase 400 Uμg
(New England Biolabs) e 15 uL de tampatildeo
10X O vetor de expressatildeo construiacutedo (pPIC-
amy) foi precipitado com acetato de amocircnia
75M 110 vv e etanol absoluto gelado 25 vv
sendo em seguida inserido em ceacutelulas
DH10Btrade (Invitrogen) por transformaccedilatildeo
eletrocompetente A construccedilatildeo do plasmiacutedeo
recombinante foi confirmada por anaacutelise de
restriccedilatildeo
23 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes A recombinaccedilatildeo homoacuteloga para
integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo no genoma
da hospedeira pode ocorrer no locus his4 ou no
locus AOX1 por eventos de crossing over entre
regiotildees do vetor e genoma Para que esse
processo ocorra eacute necessaacuterio a linearizaccedilatildeo do
plasmiacutedeo recombinante Deste modo o
plasmiacutedeo pPIC-amy foi linearizado utilizando
a endonuclease de restriccedilatildeo BglII (New
England Biolabs) O plasmiacutedeo precipitado
com acetato de amocircnia 75M 110 vv e etanol
100 gelado 25 vv foi inserido nas
leveduras GS115 por eletroporaccedilatildeo (1500 V)
As ceacutelulas transformadas foram semeadas no
meio de cultivo MD e incubadas a 30ordmC
durante trecircs dias Os clones recombinantes
foram selecionados no meio miacutenimo MD por
meio de seleccedilatildeo auxotroacutefica anti-histidina
24 Seleccedilatildeo dos clones produtores de α-
amilase A primeira etapa de seleccedilatildeo consistiu na
transferecircncia de 96 clones recombinantes do
meio de cultivo MD para o meio de cultivo
BMG-Y Esses clones foram incubados por
dois dias a 30 ordmC para o aumento do
crescimento celular Apoacutes essa etapa os clones
foram transferidos para o meio de cultivo
indutor BMM-Y Estes foram incubados por
mais trecircs dias na mesma temperatura Para
induzir a expressatildeo da enzima foi adicionado
metanol (concentraccedilatildeo de 05) nas tampas
das placas por trecircs dias a cada 24 horas A
uacuteltima etapa consistiu na seleccedilatildeo dos clones
produtores por meio da coloraccedilatildeo de vapor de
iodo Esta coloraccedilatildeo permite visualizar halos
transluacutecidos ao redor das colocircnias que tiveram
a α-amilase expressa Apoacutes a seleccedilatildeo foi
calculado o iacutendice de amiloacutelise (Ia) Este iacutendice
eacute o resultado da relaccedilatildeo entre o diacircmetro do
halo e o diacircmetro da colocircnia e foi calculado
pela foacutermula Ia = (dh2dc2) (dh = diacircmetro do
halo e dc = diacircmetro da colocircnia)
25 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido Nove clones recombinantes foram
selecionados para a produccedilatildeo da enzima α-
amilase em meio liacutequido Estes clones foram
transferidos para o meio BMG-Y (30 mL) e
incubados a 30 degC sob agitaccedilatildeo (200 rpmmin)
ateacute atingir uma transmitacircncia de λ600 de 06
medido em espectrofotocircmetro Em seguida os
meios foram centrifugados por 15 minutos a 4
ordmC (4000 rpm) O pellet de cada cultura foi
ressuspendido em 150 mL do meio indutor
BMM-Y em frascos de 1L A induccedilatildeo da
expressatildeo enzimaacutetica teve o iniacutecio com a
adiccedilatildeo de metanol 05 vv O tempo de
produccedilatildeo da enzima teve duraccedilatildeo de 120 horas
sendo adicionado metanol a cada 24 horas
Aliacutequotas de 1 mL foram retiradas em
triplicata nos tempos de 0 24 48 72 e 120
horas e armazenadas em microtubos de 15
mL Todas as aliacutequotas retiradas foram
centrifugadas a 12000 rpm a 4 degC e os
sobrenadantes foram recuperados e estocados a
-20 degC Estas aliacutequotas foram utilizadas para a
realizaccedilatildeo dos ensaios enzimaacuteticos anaacutelise da
expressatildeo proteica e para a construccedilatildeo da
curva de crescimento dos clones induzidos O
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crescimento celular obtido foi convertido para
gL utilizando a foacutermula (gL)=022 x DO
600 ηm (Nakano et al 2006)
A anaacutelise da proteiacutena recombinante
secretada pela levedura foi feita por meio de
eletroforese em gel desnaturante de
poliacrilamida (SDS-PAGE) conforme descrito
por Sambrook et al (1989) e as amostras
foram coradas com a soluccedilatildeo de Azul
Brilhante de Coomassie G250
26 Determinaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica A quantificaccedilatildeo das dextrinas liberadas
pela enzima α- amilase foi determinada de
acordo como descrito por Fuwa (1954) Os
nove clones tiveram sua atividade enzimaacutetica
dosada Para o caacutelculo dos valores da atividade
enzimaacutetica construiu-se a curva padratildeo de
amido A leitura das absorbacircncias das
diferentes concentraccedilotildees de amido (0025 a
1) gerou uma equaccedilatildeo da reta (R = 0993)
utilizada para fazer os caacutelculos da atividade
enzimaacutetica Uma unidade de atividade
dextrinizante foi definida como a quantidade
de enzima necessaacuteria para hidrolisar 01 mg de
amido por minuto
27 Ensaios enzimaacuteticos Os ensaios enzimaacuteticos para determinar
o pH oacutetimo temperatura oacutetima estabilidade
teacutermica e estabilidade em relaccedilatildeo ao tempo de
estocagem da enzima tambeacutem foram
realizados de acordo com o meacutetodo de Fuwa
(1954) Todos os ensaios foram realizados com
os extratos enzimaacuteticos dos clones A5 B8 e
D14 Para determinar o pH oacutetimo da enzima
foi preparada uma soluccedilatildeo de glicina 50 mM
aacutecido aceacutetico 50 mM e fosfato de soacutedio
dibaacutesico 50 mM que permitiu variar o pH entre
as faixas de 20 a 120 Para definir a
temperatura oacutetima os extratos enzimaacuteticos
foram analisados em diferentes temperaturas
(40 a 100 degC) Para avaliar a estabilidade
teacutermica da enzima em relaccedilatildeo agrave temperatura o
extrato do clone B8 foi preacute-incubado por 60
minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC no
pH oacutetimo preacute-estabelecido A cada 15 minutos
foram coletados uma aliacutequota para proceder agrave
dosagem da atividade enzimaacutetica Foram
acrescidos na reaccedilatildeo CaCl2 (5 mM) conforme
descrito por Hmidet et al 2008 A estabilidade
da enzima em relaccedilatildeo ao tempo de estocagem
tambeacutem foi medida A enzima foi estocada por
um periacuteodo de 60 dias a 4 ordmC e sua atividade
enzimaacutetica foi avaliada a cada 10 dias durante
este periacuteodo Os paracircmetros cineacuteticos aparentes
do extrato enzimaacutetico foram determinados nas
condiccedilotildees preacute-estabelecidas de pH e
temperatura oacutetima Para avaliar esses
paracircmetros o extrato foi incubado em
diferentes concentraccedilotildees de amido (5 a 90
mgmL) Os dados obtidos foram utilizados
para construir um graacutefico com os valores reais
de Km e Vmaacutex da enzima
3 Resultados
31 Construccedilatildeo dos vetores de clonagem
e expressatildeo O amplicon do gene α-amilase gerado
apoacutes a PCR foi de aproximadamente 1500
pares de bases Apoacutes a amplificaccedilatildeo foi
realizado a ligaccedilatildeo do gene no vetor de
clonagem pCRreg21-TOPOreg (39 kb) O vetor
construiacutedo (TOPO-amy) foi digerido com as
endonucleases EcoRI e NotI e o fragmento
liberado foi purificado do gel de agarose
(Figura 1)
Figura 1 - Figura-A perfil dos plasmiacutedeos
recombinantes TOPO-amy apoacutes restriccedilatildeo com
EcoRI e NotI Figura-B Perfil do gene α-amilase
purificado M ndash marcador de peso molecular 1 Kb
(Fermentas)
Na Figura 2 visualizamos a construccedilatildeo
do vetor de expressatildeo pPIC-amy A ligaccedilatildeo do
fragmento gecircnico foi realizada apoacutes a
sequecircncia promotora do gene AOX1 A
subclonagem foi confirmada por anaacutelise de
restriccedilatildeo
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Figure 2 - Figura-A ligaccedilatildeo do gene ao vetor de
expressatildeo Coluna 1 - sistema sem enzima ligase
Coluna 2 - Sistema contendo a enzima T4 DNA
ligase Figura-B Anaacutelise de restriccedilatildeo do vetor de
expressatildeo pPIC-amy (coluna 1 e 2) M - Marcador
de peso molecular 1Kb (Fermentas)
32 Expressatildeo de α-amilase em meio
soacutelido Apoacutes a transformaccedilatildeo das leveduras P
pastoris (GS115) noventa e seis
transformantes foram previamente
selecionados 802 dos clones foram
considerados produtores Os 96 clones foram
divididos em quatro placas e apoacutes o periacuteodo de
induccedilatildeo com metanol foi feito a anaacutelise da
expressatildeo proteica Na figura 3 observamos
uma placa de Petri contendo clones
considerados produtores de α-amilase
recombinante clones natildeo produtores e o
controle positivo de expressatildeo de α-amilase de
Bacillus subtilis
Figura 3 - Revelaccedilatildeo com vapor de iodo dos clones
produtores da enzima recombinante Visualizaccedilatildeo
dos halos formados apoacutes induccedilatildeo das leveduras P
pastoris
Foram escolhidos nove clones que
apresentaram os maiores iacutendices de amilolise
para a expressatildeo da enzima recombinante em
meio liacutequido Os iacutendices de amilolise dos nove
clones selecionados estatildeo apresentados na
Tabela 1
Tabela 1 - Iacutendice de amilolise dos nove clones
utilizados nos testes de cineacutetica enzimaacutetica e
produccedilatildeo da enzima em meio liacutequido
Clone Iacutendice de amilolise (dhsup2dcsup2)
A5 1075
A7 1004
B8 1267
B20 1198
C13 1079
C22 1007
D10 1036
D14 1174
D17 1181
Observamos que o maior iacutendice
apresentado foi correspondente ao clone B8
enquanto que o menor Ia foi aferido do clone
A7 Apoacutes o caacutelculo dos iacutendices de amiloacutelise os
nove clones selecionados foram entatildeo
utilizados na induccedilatildeo da enzima recombinante
em meio liacutequido
33 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido e cineacutetica de induccedilatildeo
Figura 4 - Cineacutetica de induccedilatildeo enzimaacutetica com os
nove clones produtores da enzima recombinante
Os dados obtidos apoacutes a induccedilatildeo da
enzima podem ser observados na Figura 4
Observamos um aumento progressivo da
atividade enzimaacutetica em relaccedilatildeo ao tempo de
induccedilatildeo dos nove clones A α-amilase
recombinante apresentou maior atividade
enzimaacutetica ao final das 120 horas de induccedilatildeo
poreacutem foi observada uma variaccedilatildeo da atividade
nos sobrenadantes dos clones testados De
acordo com os dados obtidos o clone B8 foi o
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que exibiu a maior atividade enzimaacutetica entre
os sobrenadantes testados (3454 UmL)
enquanto que o clone A7 obteve o menor valor
de atividade enzimaacutetica (2489 UmL) (Figura
4)
34 Anaacutelise em gel SDS-PAGE da
enzima recombinante secretada Foi possiacutevel visualizar duas bandas
correspondentes agrave enzima α-amilase (Figura 5-
A) O perfil de bandas dos clones analisados
no presente trabalho teve variaccedilotildees quanto ao
peso molecular Esta variaccedilatildeo foi de 65 a 74
kDa aproximadamente Os resultados da
cineacutetica de expressatildeo com o clone B8
mostraram a maacutexima expressatildeo de α-amilase
recombinante no tempo de 120 horas de
induccedilatildeo Observamos tambeacutem que o controle
negativo da expressatildeo (clone GS115)
apresentou vaacuterias bandas correspondentes agraves
proteiacutenas endoacutegenas da levedura P pastoris
Essas bandas natildeo satildeo visualizadas nos clones
recombinantes que passam a ter sua
maquinaria geneacutetica voltada para transcriccedilatildeo
da proteiacutena heteroacuteloga (Figura 5-B)
Figura 5 - A Perfil eletroforeacutetico em gel SDS-PAGE da enzima recombinante secretada pelos nove clones
Clone GS115 controle negativo da expressatildeo Setas indicam as bandas correspondentes agrave enzima secretada B
Cineacutetica de expressatildeo do clone B8 nos diferentes tempos de induccedilatildeo (24 48 72 96 e 120 horas) C- Controle
negativo da expressatildeo M ndash Marcador de massa molecular (10-200 kDa)
35 Caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica
Os dados mostram que a enzima
secretada apresentou melhor funcionalidade
em pH neutro mantendo alta atividade relativa
na faixa que vai de 70 a 80 e tendo o maacuteximo
de atividade enzimaacutetica em pH 70 para os 3
clones analisados (Figura 6)
A temperatura oacutetima em que a
enzima obteacutem a maacutexima atividade
hidrolisante foi de 70 ordmC No entanto
podemos observar que na temperatura de
80 ordmC a enzima reteve cerca de 80 de sua
atividade relativa para os clones A5 e D14
e 8974 para o clone B8 Na temperatura
de 90 ordmC sua atividade foi aferida em
aproximadamente 75 para os clones B8 e
D14 e 7197 para o clone A5 (Figura 7-
A)
Figura 6 - Efeito do pH sobre a atividade de α-
amilase produzida pelos clones A5 B8 e D14
A B
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Os testes de termoestabilidade com o
clone B8 demonstraram que na temperatura de
60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a
enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes
uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70
ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos
que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve
474 de sua atividade enquanto que na
presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua
atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a
presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua
atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de
incubaccedilatildeo (Figura 7-B)
Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-
amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio
A anaacutelise dos dados quanto a
estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC
demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de
estocagem a enzima teve apenas 5 de perda
da sua atividade cataliacutetica Essa perda se
iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A
atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo
dia de incubaccedilatildeo foi de 9583
36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima
recombinante (Km and Vmax)
Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
foram calculados a partir da construccedilatildeo de um
graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-
Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da
relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos
velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do
substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex
na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de
1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]
permitindo determinar com mais precisatildeo a
Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km
aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex
igual a 41666 UmL
4 Discussatildeo
O tamanho do amplicon gerado eacute
consistente com o apresentado por Ivanova e
colaboradores (1993) indicando que o gene da
α-amilase foi totalmente amplificado
A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo
permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da
levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo
escolhido referente agrave enzima BglII permitiu
uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou
substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou
duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e
do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de
dois fenoacutetipos diferentes da levedura P
pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand
e colaboradores (2017) a levedura
metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo
apresenta em seu material geneacutetico vetores
epissomais Com isso para que ocorra a
expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute
fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico
no seu genoma De acordo com Daly e Hearn
(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo
ocorre em locus especiacuteficos no genoma da
AB
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
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clonado no vetor pCRreg21-TOPOreg e inserido
por transformaccedilatildeo quiacutemica nas ceacutelulas
TOP10trade (Invitrogen) conforme
recomendaccedilotildees do fabricante A construccedilatildeo do
vetor de clonagem TOPO-amy foi confirmada
por PCR utilizando-se DNA plasmidial
extraiacutedo
Para a expressatildeo da enzima α-amilase na
levedura Pichia pastoris foi utilizado o vetor
pPIC9 (InvitrogenTM) 100 ng de DNA dos
vetores TOPO-amy e pPIC9 foram digeridos
com 1Uμg das enzimas EcoRI e NotI Apoacutes a
digestatildeo o inserto liberado e o vetor de
expressatildeo linearizado foram purificados em gel
de agarose (Illustra GFX PCR DNA and Gel
Band Purification - GE Healthcare) A reaccedilatildeo
de ligaccedilatildeo ocorreu em volume reacional final
de 15 μL contendo 260 ngμL de Inserto 500
ngμL do vetor T4 DNA ligase 400 Uμg
(New England Biolabs) e 15 uL de tampatildeo
10X O vetor de expressatildeo construiacutedo (pPIC-
amy) foi precipitado com acetato de amocircnia
75M 110 vv e etanol absoluto gelado 25 vv
sendo em seguida inserido em ceacutelulas
DH10Btrade (Invitrogen) por transformaccedilatildeo
eletrocompetente A construccedilatildeo do plasmiacutedeo
recombinante foi confirmada por anaacutelise de
restriccedilatildeo
23 Seleccedilatildeo dos clones recombinantes A recombinaccedilatildeo homoacuteloga para
integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo no genoma
da hospedeira pode ocorrer no locus his4 ou no
locus AOX1 por eventos de crossing over entre
regiotildees do vetor e genoma Para que esse
processo ocorra eacute necessaacuterio a linearizaccedilatildeo do
plasmiacutedeo recombinante Deste modo o
plasmiacutedeo pPIC-amy foi linearizado utilizando
a endonuclease de restriccedilatildeo BglII (New
England Biolabs) O plasmiacutedeo precipitado
com acetato de amocircnia 75M 110 vv e etanol
100 gelado 25 vv foi inserido nas
leveduras GS115 por eletroporaccedilatildeo (1500 V)
As ceacutelulas transformadas foram semeadas no
meio de cultivo MD e incubadas a 30ordmC
durante trecircs dias Os clones recombinantes
foram selecionados no meio miacutenimo MD por
meio de seleccedilatildeo auxotroacutefica anti-histidina
24 Seleccedilatildeo dos clones produtores de α-
amilase A primeira etapa de seleccedilatildeo consistiu na
transferecircncia de 96 clones recombinantes do
meio de cultivo MD para o meio de cultivo
BMG-Y Esses clones foram incubados por
dois dias a 30 ordmC para o aumento do
crescimento celular Apoacutes essa etapa os clones
foram transferidos para o meio de cultivo
indutor BMM-Y Estes foram incubados por
mais trecircs dias na mesma temperatura Para
induzir a expressatildeo da enzima foi adicionado
metanol (concentraccedilatildeo de 05) nas tampas
das placas por trecircs dias a cada 24 horas A
uacuteltima etapa consistiu na seleccedilatildeo dos clones
produtores por meio da coloraccedilatildeo de vapor de
iodo Esta coloraccedilatildeo permite visualizar halos
transluacutecidos ao redor das colocircnias que tiveram
a α-amilase expressa Apoacutes a seleccedilatildeo foi
calculado o iacutendice de amiloacutelise (Ia) Este iacutendice
eacute o resultado da relaccedilatildeo entre o diacircmetro do
halo e o diacircmetro da colocircnia e foi calculado
pela foacutermula Ia = (dh2dc2) (dh = diacircmetro do
halo e dc = diacircmetro da colocircnia)
25 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido Nove clones recombinantes foram
selecionados para a produccedilatildeo da enzima α-
amilase em meio liacutequido Estes clones foram
transferidos para o meio BMG-Y (30 mL) e
incubados a 30 degC sob agitaccedilatildeo (200 rpmmin)
ateacute atingir uma transmitacircncia de λ600 de 06
medido em espectrofotocircmetro Em seguida os
meios foram centrifugados por 15 minutos a 4
ordmC (4000 rpm) O pellet de cada cultura foi
ressuspendido em 150 mL do meio indutor
BMM-Y em frascos de 1L A induccedilatildeo da
expressatildeo enzimaacutetica teve o iniacutecio com a
adiccedilatildeo de metanol 05 vv O tempo de
produccedilatildeo da enzima teve duraccedilatildeo de 120 horas
sendo adicionado metanol a cada 24 horas
Aliacutequotas de 1 mL foram retiradas em
triplicata nos tempos de 0 24 48 72 e 120
horas e armazenadas em microtubos de 15
mL Todas as aliacutequotas retiradas foram
centrifugadas a 12000 rpm a 4 degC e os
sobrenadantes foram recuperados e estocados a
-20 degC Estas aliacutequotas foram utilizadas para a
realizaccedilatildeo dos ensaios enzimaacuteticos anaacutelise da
expressatildeo proteica e para a construccedilatildeo da
curva de crescimento dos clones induzidos O
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crescimento celular obtido foi convertido para
gL utilizando a foacutermula (gL)=022 x DO
600 ηm (Nakano et al 2006)
A anaacutelise da proteiacutena recombinante
secretada pela levedura foi feita por meio de
eletroforese em gel desnaturante de
poliacrilamida (SDS-PAGE) conforme descrito
por Sambrook et al (1989) e as amostras
foram coradas com a soluccedilatildeo de Azul
Brilhante de Coomassie G250
26 Determinaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica A quantificaccedilatildeo das dextrinas liberadas
pela enzima α- amilase foi determinada de
acordo como descrito por Fuwa (1954) Os
nove clones tiveram sua atividade enzimaacutetica
dosada Para o caacutelculo dos valores da atividade
enzimaacutetica construiu-se a curva padratildeo de
amido A leitura das absorbacircncias das
diferentes concentraccedilotildees de amido (0025 a
1) gerou uma equaccedilatildeo da reta (R = 0993)
utilizada para fazer os caacutelculos da atividade
enzimaacutetica Uma unidade de atividade
dextrinizante foi definida como a quantidade
de enzima necessaacuteria para hidrolisar 01 mg de
amido por minuto
27 Ensaios enzimaacuteticos Os ensaios enzimaacuteticos para determinar
o pH oacutetimo temperatura oacutetima estabilidade
teacutermica e estabilidade em relaccedilatildeo ao tempo de
estocagem da enzima tambeacutem foram
realizados de acordo com o meacutetodo de Fuwa
(1954) Todos os ensaios foram realizados com
os extratos enzimaacuteticos dos clones A5 B8 e
D14 Para determinar o pH oacutetimo da enzima
foi preparada uma soluccedilatildeo de glicina 50 mM
aacutecido aceacutetico 50 mM e fosfato de soacutedio
dibaacutesico 50 mM que permitiu variar o pH entre
as faixas de 20 a 120 Para definir a
temperatura oacutetima os extratos enzimaacuteticos
foram analisados em diferentes temperaturas
(40 a 100 degC) Para avaliar a estabilidade
teacutermica da enzima em relaccedilatildeo agrave temperatura o
extrato do clone B8 foi preacute-incubado por 60
minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC no
pH oacutetimo preacute-estabelecido A cada 15 minutos
foram coletados uma aliacutequota para proceder agrave
dosagem da atividade enzimaacutetica Foram
acrescidos na reaccedilatildeo CaCl2 (5 mM) conforme
descrito por Hmidet et al 2008 A estabilidade
da enzima em relaccedilatildeo ao tempo de estocagem
tambeacutem foi medida A enzima foi estocada por
um periacuteodo de 60 dias a 4 ordmC e sua atividade
enzimaacutetica foi avaliada a cada 10 dias durante
este periacuteodo Os paracircmetros cineacuteticos aparentes
do extrato enzimaacutetico foram determinados nas
condiccedilotildees preacute-estabelecidas de pH e
temperatura oacutetima Para avaliar esses
paracircmetros o extrato foi incubado em
diferentes concentraccedilotildees de amido (5 a 90
mgmL) Os dados obtidos foram utilizados
para construir um graacutefico com os valores reais
de Km e Vmaacutex da enzima
3 Resultados
31 Construccedilatildeo dos vetores de clonagem
e expressatildeo O amplicon do gene α-amilase gerado
apoacutes a PCR foi de aproximadamente 1500
pares de bases Apoacutes a amplificaccedilatildeo foi
realizado a ligaccedilatildeo do gene no vetor de
clonagem pCRreg21-TOPOreg (39 kb) O vetor
construiacutedo (TOPO-amy) foi digerido com as
endonucleases EcoRI e NotI e o fragmento
liberado foi purificado do gel de agarose
(Figura 1)
Figura 1 - Figura-A perfil dos plasmiacutedeos
recombinantes TOPO-amy apoacutes restriccedilatildeo com
EcoRI e NotI Figura-B Perfil do gene α-amilase
purificado M ndash marcador de peso molecular 1 Kb
(Fermentas)
Na Figura 2 visualizamos a construccedilatildeo
do vetor de expressatildeo pPIC-amy A ligaccedilatildeo do
fragmento gecircnico foi realizada apoacutes a
sequecircncia promotora do gene AOX1 A
subclonagem foi confirmada por anaacutelise de
restriccedilatildeo
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Figure 2 - Figura-A ligaccedilatildeo do gene ao vetor de
expressatildeo Coluna 1 - sistema sem enzima ligase
Coluna 2 - Sistema contendo a enzima T4 DNA
ligase Figura-B Anaacutelise de restriccedilatildeo do vetor de
expressatildeo pPIC-amy (coluna 1 e 2) M - Marcador
de peso molecular 1Kb (Fermentas)
32 Expressatildeo de α-amilase em meio
soacutelido Apoacutes a transformaccedilatildeo das leveduras P
pastoris (GS115) noventa e seis
transformantes foram previamente
selecionados 802 dos clones foram
considerados produtores Os 96 clones foram
divididos em quatro placas e apoacutes o periacuteodo de
induccedilatildeo com metanol foi feito a anaacutelise da
expressatildeo proteica Na figura 3 observamos
uma placa de Petri contendo clones
considerados produtores de α-amilase
recombinante clones natildeo produtores e o
controle positivo de expressatildeo de α-amilase de
Bacillus subtilis
Figura 3 - Revelaccedilatildeo com vapor de iodo dos clones
produtores da enzima recombinante Visualizaccedilatildeo
dos halos formados apoacutes induccedilatildeo das leveduras P
pastoris
Foram escolhidos nove clones que
apresentaram os maiores iacutendices de amilolise
para a expressatildeo da enzima recombinante em
meio liacutequido Os iacutendices de amilolise dos nove
clones selecionados estatildeo apresentados na
Tabela 1
Tabela 1 - Iacutendice de amilolise dos nove clones
utilizados nos testes de cineacutetica enzimaacutetica e
produccedilatildeo da enzima em meio liacutequido
Clone Iacutendice de amilolise (dhsup2dcsup2)
A5 1075
A7 1004
B8 1267
B20 1198
C13 1079
C22 1007
D10 1036
D14 1174
D17 1181
Observamos que o maior iacutendice
apresentado foi correspondente ao clone B8
enquanto que o menor Ia foi aferido do clone
A7 Apoacutes o caacutelculo dos iacutendices de amiloacutelise os
nove clones selecionados foram entatildeo
utilizados na induccedilatildeo da enzima recombinante
em meio liacutequido
33 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido e cineacutetica de induccedilatildeo
Figura 4 - Cineacutetica de induccedilatildeo enzimaacutetica com os
nove clones produtores da enzima recombinante
Os dados obtidos apoacutes a induccedilatildeo da
enzima podem ser observados na Figura 4
Observamos um aumento progressivo da
atividade enzimaacutetica em relaccedilatildeo ao tempo de
induccedilatildeo dos nove clones A α-amilase
recombinante apresentou maior atividade
enzimaacutetica ao final das 120 horas de induccedilatildeo
poreacutem foi observada uma variaccedilatildeo da atividade
nos sobrenadantes dos clones testados De
acordo com os dados obtidos o clone B8 foi o
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que exibiu a maior atividade enzimaacutetica entre
os sobrenadantes testados (3454 UmL)
enquanto que o clone A7 obteve o menor valor
de atividade enzimaacutetica (2489 UmL) (Figura
4)
34 Anaacutelise em gel SDS-PAGE da
enzima recombinante secretada Foi possiacutevel visualizar duas bandas
correspondentes agrave enzima α-amilase (Figura 5-
A) O perfil de bandas dos clones analisados
no presente trabalho teve variaccedilotildees quanto ao
peso molecular Esta variaccedilatildeo foi de 65 a 74
kDa aproximadamente Os resultados da
cineacutetica de expressatildeo com o clone B8
mostraram a maacutexima expressatildeo de α-amilase
recombinante no tempo de 120 horas de
induccedilatildeo Observamos tambeacutem que o controle
negativo da expressatildeo (clone GS115)
apresentou vaacuterias bandas correspondentes agraves
proteiacutenas endoacutegenas da levedura P pastoris
Essas bandas natildeo satildeo visualizadas nos clones
recombinantes que passam a ter sua
maquinaria geneacutetica voltada para transcriccedilatildeo
da proteiacutena heteroacuteloga (Figura 5-B)
Figura 5 - A Perfil eletroforeacutetico em gel SDS-PAGE da enzima recombinante secretada pelos nove clones
Clone GS115 controle negativo da expressatildeo Setas indicam as bandas correspondentes agrave enzima secretada B
Cineacutetica de expressatildeo do clone B8 nos diferentes tempos de induccedilatildeo (24 48 72 96 e 120 horas) C- Controle
negativo da expressatildeo M ndash Marcador de massa molecular (10-200 kDa)
35 Caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica
Os dados mostram que a enzima
secretada apresentou melhor funcionalidade
em pH neutro mantendo alta atividade relativa
na faixa que vai de 70 a 80 e tendo o maacuteximo
de atividade enzimaacutetica em pH 70 para os 3
clones analisados (Figura 6)
A temperatura oacutetima em que a
enzima obteacutem a maacutexima atividade
hidrolisante foi de 70 ordmC No entanto
podemos observar que na temperatura de
80 ordmC a enzima reteve cerca de 80 de sua
atividade relativa para os clones A5 e D14
e 8974 para o clone B8 Na temperatura
de 90 ordmC sua atividade foi aferida em
aproximadamente 75 para os clones B8 e
D14 e 7197 para o clone A5 (Figura 7-
A)
Figura 6 - Efeito do pH sobre a atividade de α-
amilase produzida pelos clones A5 B8 e D14
A B
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Os testes de termoestabilidade com o
clone B8 demonstraram que na temperatura de
60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a
enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes
uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70
ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos
que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve
474 de sua atividade enquanto que na
presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua
atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a
presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua
atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de
incubaccedilatildeo (Figura 7-B)
Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-
amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio
A anaacutelise dos dados quanto a
estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC
demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de
estocagem a enzima teve apenas 5 de perda
da sua atividade cataliacutetica Essa perda se
iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A
atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo
dia de incubaccedilatildeo foi de 9583
36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima
recombinante (Km and Vmax)
Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
foram calculados a partir da construccedilatildeo de um
graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-
Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da
relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos
velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do
substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex
na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de
1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]
permitindo determinar com mais precisatildeo a
Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km
aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex
igual a 41666 UmL
4 Discussatildeo
O tamanho do amplicon gerado eacute
consistente com o apresentado por Ivanova e
colaboradores (1993) indicando que o gene da
α-amilase foi totalmente amplificado
A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo
permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da
levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo
escolhido referente agrave enzima BglII permitiu
uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou
substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou
duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e
do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de
dois fenoacutetipos diferentes da levedura P
pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand
e colaboradores (2017) a levedura
metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo
apresenta em seu material geneacutetico vetores
epissomais Com isso para que ocorra a
expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute
fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico
no seu genoma De acordo com Daly e Hearn
(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo
ocorre em locus especiacuteficos no genoma da
AB
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
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crescimento celular obtido foi convertido para
gL utilizando a foacutermula (gL)=022 x DO
600 ηm (Nakano et al 2006)
A anaacutelise da proteiacutena recombinante
secretada pela levedura foi feita por meio de
eletroforese em gel desnaturante de
poliacrilamida (SDS-PAGE) conforme descrito
por Sambrook et al (1989) e as amostras
foram coradas com a soluccedilatildeo de Azul
Brilhante de Coomassie G250
26 Determinaccedilatildeo da atividade
enzimaacutetica A quantificaccedilatildeo das dextrinas liberadas
pela enzima α- amilase foi determinada de
acordo como descrito por Fuwa (1954) Os
nove clones tiveram sua atividade enzimaacutetica
dosada Para o caacutelculo dos valores da atividade
enzimaacutetica construiu-se a curva padratildeo de
amido A leitura das absorbacircncias das
diferentes concentraccedilotildees de amido (0025 a
1) gerou uma equaccedilatildeo da reta (R = 0993)
utilizada para fazer os caacutelculos da atividade
enzimaacutetica Uma unidade de atividade
dextrinizante foi definida como a quantidade
de enzima necessaacuteria para hidrolisar 01 mg de
amido por minuto
27 Ensaios enzimaacuteticos Os ensaios enzimaacuteticos para determinar
o pH oacutetimo temperatura oacutetima estabilidade
teacutermica e estabilidade em relaccedilatildeo ao tempo de
estocagem da enzima tambeacutem foram
realizados de acordo com o meacutetodo de Fuwa
(1954) Todos os ensaios foram realizados com
os extratos enzimaacuteticos dos clones A5 B8 e
D14 Para determinar o pH oacutetimo da enzima
foi preparada uma soluccedilatildeo de glicina 50 mM
aacutecido aceacutetico 50 mM e fosfato de soacutedio
dibaacutesico 50 mM que permitiu variar o pH entre
as faixas de 20 a 120 Para definir a
temperatura oacutetima os extratos enzimaacuteticos
foram analisados em diferentes temperaturas
(40 a 100 degC) Para avaliar a estabilidade
teacutermica da enzima em relaccedilatildeo agrave temperatura o
extrato do clone B8 foi preacute-incubado por 60
minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC no
pH oacutetimo preacute-estabelecido A cada 15 minutos
foram coletados uma aliacutequota para proceder agrave
dosagem da atividade enzimaacutetica Foram
acrescidos na reaccedilatildeo CaCl2 (5 mM) conforme
descrito por Hmidet et al 2008 A estabilidade
da enzima em relaccedilatildeo ao tempo de estocagem
tambeacutem foi medida A enzima foi estocada por
um periacuteodo de 60 dias a 4 ordmC e sua atividade
enzimaacutetica foi avaliada a cada 10 dias durante
este periacuteodo Os paracircmetros cineacuteticos aparentes
do extrato enzimaacutetico foram determinados nas
condiccedilotildees preacute-estabelecidas de pH e
temperatura oacutetima Para avaliar esses
paracircmetros o extrato foi incubado em
diferentes concentraccedilotildees de amido (5 a 90
mgmL) Os dados obtidos foram utilizados
para construir um graacutefico com os valores reais
de Km e Vmaacutex da enzima
3 Resultados
31 Construccedilatildeo dos vetores de clonagem
e expressatildeo O amplicon do gene α-amilase gerado
apoacutes a PCR foi de aproximadamente 1500
pares de bases Apoacutes a amplificaccedilatildeo foi
realizado a ligaccedilatildeo do gene no vetor de
clonagem pCRreg21-TOPOreg (39 kb) O vetor
construiacutedo (TOPO-amy) foi digerido com as
endonucleases EcoRI e NotI e o fragmento
liberado foi purificado do gel de agarose
(Figura 1)
Figura 1 - Figura-A perfil dos plasmiacutedeos
recombinantes TOPO-amy apoacutes restriccedilatildeo com
EcoRI e NotI Figura-B Perfil do gene α-amilase
purificado M ndash marcador de peso molecular 1 Kb
(Fermentas)
Na Figura 2 visualizamos a construccedilatildeo
do vetor de expressatildeo pPIC-amy A ligaccedilatildeo do
fragmento gecircnico foi realizada apoacutes a
sequecircncia promotora do gene AOX1 A
subclonagem foi confirmada por anaacutelise de
restriccedilatildeo
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Figure 2 - Figura-A ligaccedilatildeo do gene ao vetor de
expressatildeo Coluna 1 - sistema sem enzima ligase
Coluna 2 - Sistema contendo a enzima T4 DNA
ligase Figura-B Anaacutelise de restriccedilatildeo do vetor de
expressatildeo pPIC-amy (coluna 1 e 2) M - Marcador
de peso molecular 1Kb (Fermentas)
32 Expressatildeo de α-amilase em meio
soacutelido Apoacutes a transformaccedilatildeo das leveduras P
pastoris (GS115) noventa e seis
transformantes foram previamente
selecionados 802 dos clones foram
considerados produtores Os 96 clones foram
divididos em quatro placas e apoacutes o periacuteodo de
induccedilatildeo com metanol foi feito a anaacutelise da
expressatildeo proteica Na figura 3 observamos
uma placa de Petri contendo clones
considerados produtores de α-amilase
recombinante clones natildeo produtores e o
controle positivo de expressatildeo de α-amilase de
Bacillus subtilis
Figura 3 - Revelaccedilatildeo com vapor de iodo dos clones
produtores da enzima recombinante Visualizaccedilatildeo
dos halos formados apoacutes induccedilatildeo das leveduras P
pastoris
Foram escolhidos nove clones que
apresentaram os maiores iacutendices de amilolise
para a expressatildeo da enzima recombinante em
meio liacutequido Os iacutendices de amilolise dos nove
clones selecionados estatildeo apresentados na
Tabela 1
Tabela 1 - Iacutendice de amilolise dos nove clones
utilizados nos testes de cineacutetica enzimaacutetica e
produccedilatildeo da enzima em meio liacutequido
Clone Iacutendice de amilolise (dhsup2dcsup2)
A5 1075
A7 1004
B8 1267
B20 1198
C13 1079
C22 1007
D10 1036
D14 1174
D17 1181
Observamos que o maior iacutendice
apresentado foi correspondente ao clone B8
enquanto que o menor Ia foi aferido do clone
A7 Apoacutes o caacutelculo dos iacutendices de amiloacutelise os
nove clones selecionados foram entatildeo
utilizados na induccedilatildeo da enzima recombinante
em meio liacutequido
33 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido e cineacutetica de induccedilatildeo
Figura 4 - Cineacutetica de induccedilatildeo enzimaacutetica com os
nove clones produtores da enzima recombinante
Os dados obtidos apoacutes a induccedilatildeo da
enzima podem ser observados na Figura 4
Observamos um aumento progressivo da
atividade enzimaacutetica em relaccedilatildeo ao tempo de
induccedilatildeo dos nove clones A α-amilase
recombinante apresentou maior atividade
enzimaacutetica ao final das 120 horas de induccedilatildeo
poreacutem foi observada uma variaccedilatildeo da atividade
nos sobrenadantes dos clones testados De
acordo com os dados obtidos o clone B8 foi o
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que exibiu a maior atividade enzimaacutetica entre
os sobrenadantes testados (3454 UmL)
enquanto que o clone A7 obteve o menor valor
de atividade enzimaacutetica (2489 UmL) (Figura
4)
34 Anaacutelise em gel SDS-PAGE da
enzima recombinante secretada Foi possiacutevel visualizar duas bandas
correspondentes agrave enzima α-amilase (Figura 5-
A) O perfil de bandas dos clones analisados
no presente trabalho teve variaccedilotildees quanto ao
peso molecular Esta variaccedilatildeo foi de 65 a 74
kDa aproximadamente Os resultados da
cineacutetica de expressatildeo com o clone B8
mostraram a maacutexima expressatildeo de α-amilase
recombinante no tempo de 120 horas de
induccedilatildeo Observamos tambeacutem que o controle
negativo da expressatildeo (clone GS115)
apresentou vaacuterias bandas correspondentes agraves
proteiacutenas endoacutegenas da levedura P pastoris
Essas bandas natildeo satildeo visualizadas nos clones
recombinantes que passam a ter sua
maquinaria geneacutetica voltada para transcriccedilatildeo
da proteiacutena heteroacuteloga (Figura 5-B)
Figura 5 - A Perfil eletroforeacutetico em gel SDS-PAGE da enzima recombinante secretada pelos nove clones
Clone GS115 controle negativo da expressatildeo Setas indicam as bandas correspondentes agrave enzima secretada B
Cineacutetica de expressatildeo do clone B8 nos diferentes tempos de induccedilatildeo (24 48 72 96 e 120 horas) C- Controle
negativo da expressatildeo M ndash Marcador de massa molecular (10-200 kDa)
35 Caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica
Os dados mostram que a enzima
secretada apresentou melhor funcionalidade
em pH neutro mantendo alta atividade relativa
na faixa que vai de 70 a 80 e tendo o maacuteximo
de atividade enzimaacutetica em pH 70 para os 3
clones analisados (Figura 6)
A temperatura oacutetima em que a
enzima obteacutem a maacutexima atividade
hidrolisante foi de 70 ordmC No entanto
podemos observar que na temperatura de
80 ordmC a enzima reteve cerca de 80 de sua
atividade relativa para os clones A5 e D14
e 8974 para o clone B8 Na temperatura
de 90 ordmC sua atividade foi aferida em
aproximadamente 75 para os clones B8 e
D14 e 7197 para o clone A5 (Figura 7-
A)
Figura 6 - Efeito do pH sobre a atividade de α-
amilase produzida pelos clones A5 B8 e D14
A B
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Os testes de termoestabilidade com o
clone B8 demonstraram que na temperatura de
60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a
enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes
uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70
ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos
que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve
474 de sua atividade enquanto que na
presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua
atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a
presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua
atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de
incubaccedilatildeo (Figura 7-B)
Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-
amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio
A anaacutelise dos dados quanto a
estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC
demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de
estocagem a enzima teve apenas 5 de perda
da sua atividade cataliacutetica Essa perda se
iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A
atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo
dia de incubaccedilatildeo foi de 9583
36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima
recombinante (Km and Vmax)
Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
foram calculados a partir da construccedilatildeo de um
graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-
Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da
relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos
velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do
substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex
na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de
1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]
permitindo determinar com mais precisatildeo a
Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km
aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex
igual a 41666 UmL
4 Discussatildeo
O tamanho do amplicon gerado eacute
consistente com o apresentado por Ivanova e
colaboradores (1993) indicando que o gene da
α-amilase foi totalmente amplificado
A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo
permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da
levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo
escolhido referente agrave enzima BglII permitiu
uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou
substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou
duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e
do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de
dois fenoacutetipos diferentes da levedura P
pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand
e colaboradores (2017) a levedura
metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo
apresenta em seu material geneacutetico vetores
epissomais Com isso para que ocorra a
expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute
fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico
no seu genoma De acordo com Daly e Hearn
(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo
ocorre em locus especiacuteficos no genoma da
AB
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
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Figure 2 - Figura-A ligaccedilatildeo do gene ao vetor de
expressatildeo Coluna 1 - sistema sem enzima ligase
Coluna 2 - Sistema contendo a enzima T4 DNA
ligase Figura-B Anaacutelise de restriccedilatildeo do vetor de
expressatildeo pPIC-amy (coluna 1 e 2) M - Marcador
de peso molecular 1Kb (Fermentas)
32 Expressatildeo de α-amilase em meio
soacutelido Apoacutes a transformaccedilatildeo das leveduras P
pastoris (GS115) noventa e seis
transformantes foram previamente
selecionados 802 dos clones foram
considerados produtores Os 96 clones foram
divididos em quatro placas e apoacutes o periacuteodo de
induccedilatildeo com metanol foi feito a anaacutelise da
expressatildeo proteica Na figura 3 observamos
uma placa de Petri contendo clones
considerados produtores de α-amilase
recombinante clones natildeo produtores e o
controle positivo de expressatildeo de α-amilase de
Bacillus subtilis
Figura 3 - Revelaccedilatildeo com vapor de iodo dos clones
produtores da enzima recombinante Visualizaccedilatildeo
dos halos formados apoacutes induccedilatildeo das leveduras P
pastoris
Foram escolhidos nove clones que
apresentaram os maiores iacutendices de amilolise
para a expressatildeo da enzima recombinante em
meio liacutequido Os iacutendices de amilolise dos nove
clones selecionados estatildeo apresentados na
Tabela 1
Tabela 1 - Iacutendice de amilolise dos nove clones
utilizados nos testes de cineacutetica enzimaacutetica e
produccedilatildeo da enzima em meio liacutequido
Clone Iacutendice de amilolise (dhsup2dcsup2)
A5 1075
A7 1004
B8 1267
B20 1198
C13 1079
C22 1007
D10 1036
D14 1174
D17 1181
Observamos que o maior iacutendice
apresentado foi correspondente ao clone B8
enquanto que o menor Ia foi aferido do clone
A7 Apoacutes o caacutelculo dos iacutendices de amiloacutelise os
nove clones selecionados foram entatildeo
utilizados na induccedilatildeo da enzima recombinante
em meio liacutequido
33 Produccedilatildeo de α-amilase em meio
liacutequido e cineacutetica de induccedilatildeo
Figura 4 - Cineacutetica de induccedilatildeo enzimaacutetica com os
nove clones produtores da enzima recombinante
Os dados obtidos apoacutes a induccedilatildeo da
enzima podem ser observados na Figura 4
Observamos um aumento progressivo da
atividade enzimaacutetica em relaccedilatildeo ao tempo de
induccedilatildeo dos nove clones A α-amilase
recombinante apresentou maior atividade
enzimaacutetica ao final das 120 horas de induccedilatildeo
poreacutem foi observada uma variaccedilatildeo da atividade
nos sobrenadantes dos clones testados De
acordo com os dados obtidos o clone B8 foi o
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que exibiu a maior atividade enzimaacutetica entre
os sobrenadantes testados (3454 UmL)
enquanto que o clone A7 obteve o menor valor
de atividade enzimaacutetica (2489 UmL) (Figura
4)
34 Anaacutelise em gel SDS-PAGE da
enzima recombinante secretada Foi possiacutevel visualizar duas bandas
correspondentes agrave enzima α-amilase (Figura 5-
A) O perfil de bandas dos clones analisados
no presente trabalho teve variaccedilotildees quanto ao
peso molecular Esta variaccedilatildeo foi de 65 a 74
kDa aproximadamente Os resultados da
cineacutetica de expressatildeo com o clone B8
mostraram a maacutexima expressatildeo de α-amilase
recombinante no tempo de 120 horas de
induccedilatildeo Observamos tambeacutem que o controle
negativo da expressatildeo (clone GS115)
apresentou vaacuterias bandas correspondentes agraves
proteiacutenas endoacutegenas da levedura P pastoris
Essas bandas natildeo satildeo visualizadas nos clones
recombinantes que passam a ter sua
maquinaria geneacutetica voltada para transcriccedilatildeo
da proteiacutena heteroacuteloga (Figura 5-B)
Figura 5 - A Perfil eletroforeacutetico em gel SDS-PAGE da enzima recombinante secretada pelos nove clones
Clone GS115 controle negativo da expressatildeo Setas indicam as bandas correspondentes agrave enzima secretada B
Cineacutetica de expressatildeo do clone B8 nos diferentes tempos de induccedilatildeo (24 48 72 96 e 120 horas) C- Controle
negativo da expressatildeo M ndash Marcador de massa molecular (10-200 kDa)
35 Caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica
Os dados mostram que a enzima
secretada apresentou melhor funcionalidade
em pH neutro mantendo alta atividade relativa
na faixa que vai de 70 a 80 e tendo o maacuteximo
de atividade enzimaacutetica em pH 70 para os 3
clones analisados (Figura 6)
A temperatura oacutetima em que a
enzima obteacutem a maacutexima atividade
hidrolisante foi de 70 ordmC No entanto
podemos observar que na temperatura de
80 ordmC a enzima reteve cerca de 80 de sua
atividade relativa para os clones A5 e D14
e 8974 para o clone B8 Na temperatura
de 90 ordmC sua atividade foi aferida em
aproximadamente 75 para os clones B8 e
D14 e 7197 para o clone A5 (Figura 7-
A)
Figura 6 - Efeito do pH sobre a atividade de α-
amilase produzida pelos clones A5 B8 e D14
A B
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Os testes de termoestabilidade com o
clone B8 demonstraram que na temperatura de
60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a
enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes
uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70
ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos
que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve
474 de sua atividade enquanto que na
presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua
atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a
presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua
atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de
incubaccedilatildeo (Figura 7-B)
Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-
amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio
A anaacutelise dos dados quanto a
estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC
demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de
estocagem a enzima teve apenas 5 de perda
da sua atividade cataliacutetica Essa perda se
iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A
atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo
dia de incubaccedilatildeo foi de 9583
36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima
recombinante (Km and Vmax)
Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
foram calculados a partir da construccedilatildeo de um
graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-
Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da
relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos
velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do
substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex
na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de
1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]
permitindo determinar com mais precisatildeo a
Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km
aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex
igual a 41666 UmL
4 Discussatildeo
O tamanho do amplicon gerado eacute
consistente com o apresentado por Ivanova e
colaboradores (1993) indicando que o gene da
α-amilase foi totalmente amplificado
A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo
permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da
levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo
escolhido referente agrave enzima BglII permitiu
uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou
substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou
duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e
do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de
dois fenoacutetipos diferentes da levedura P
pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand
e colaboradores (2017) a levedura
metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo
apresenta em seu material geneacutetico vetores
epissomais Com isso para que ocorra a
expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute
fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico
no seu genoma De acordo com Daly e Hearn
(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo
ocorre em locus especiacuteficos no genoma da
AB
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
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que exibiu a maior atividade enzimaacutetica entre
os sobrenadantes testados (3454 UmL)
enquanto que o clone A7 obteve o menor valor
de atividade enzimaacutetica (2489 UmL) (Figura
4)
34 Anaacutelise em gel SDS-PAGE da
enzima recombinante secretada Foi possiacutevel visualizar duas bandas
correspondentes agrave enzima α-amilase (Figura 5-
A) O perfil de bandas dos clones analisados
no presente trabalho teve variaccedilotildees quanto ao
peso molecular Esta variaccedilatildeo foi de 65 a 74
kDa aproximadamente Os resultados da
cineacutetica de expressatildeo com o clone B8
mostraram a maacutexima expressatildeo de α-amilase
recombinante no tempo de 120 horas de
induccedilatildeo Observamos tambeacutem que o controle
negativo da expressatildeo (clone GS115)
apresentou vaacuterias bandas correspondentes agraves
proteiacutenas endoacutegenas da levedura P pastoris
Essas bandas natildeo satildeo visualizadas nos clones
recombinantes que passam a ter sua
maquinaria geneacutetica voltada para transcriccedilatildeo
da proteiacutena heteroacuteloga (Figura 5-B)
Figura 5 - A Perfil eletroforeacutetico em gel SDS-PAGE da enzima recombinante secretada pelos nove clones
Clone GS115 controle negativo da expressatildeo Setas indicam as bandas correspondentes agrave enzima secretada B
Cineacutetica de expressatildeo do clone B8 nos diferentes tempos de induccedilatildeo (24 48 72 96 e 120 horas) C- Controle
negativo da expressatildeo M ndash Marcador de massa molecular (10-200 kDa)
35 Caracterizaccedilatildeo enzimaacutetica
Os dados mostram que a enzima
secretada apresentou melhor funcionalidade
em pH neutro mantendo alta atividade relativa
na faixa que vai de 70 a 80 e tendo o maacuteximo
de atividade enzimaacutetica em pH 70 para os 3
clones analisados (Figura 6)
A temperatura oacutetima em que a
enzima obteacutem a maacutexima atividade
hidrolisante foi de 70 ordmC No entanto
podemos observar que na temperatura de
80 ordmC a enzima reteve cerca de 80 de sua
atividade relativa para os clones A5 e D14
e 8974 para o clone B8 Na temperatura
de 90 ordmC sua atividade foi aferida em
aproximadamente 75 para os clones B8 e
D14 e 7197 para o clone A5 (Figura 7-
A)
Figura 6 - Efeito do pH sobre a atividade de α-
amilase produzida pelos clones A5 B8 e D14
A B
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Os testes de termoestabilidade com o
clone B8 demonstraram que na temperatura de
60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a
enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes
uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70
ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos
que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve
474 de sua atividade enquanto que na
presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua
atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a
presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua
atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de
incubaccedilatildeo (Figura 7-B)
Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-
amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio
A anaacutelise dos dados quanto a
estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC
demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de
estocagem a enzima teve apenas 5 de perda
da sua atividade cataliacutetica Essa perda se
iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A
atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo
dia de incubaccedilatildeo foi de 9583
36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima
recombinante (Km and Vmax)
Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
foram calculados a partir da construccedilatildeo de um
graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-
Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da
relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos
velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do
substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex
na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de
1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]
permitindo determinar com mais precisatildeo a
Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km
aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex
igual a 41666 UmL
4 Discussatildeo
O tamanho do amplicon gerado eacute
consistente com o apresentado por Ivanova e
colaboradores (1993) indicando que o gene da
α-amilase foi totalmente amplificado
A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo
permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da
levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo
escolhido referente agrave enzima BglII permitiu
uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou
substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou
duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e
do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de
dois fenoacutetipos diferentes da levedura P
pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand
e colaboradores (2017) a levedura
metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo
apresenta em seu material geneacutetico vetores
epissomais Com isso para que ocorra a
expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute
fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico
no seu genoma De acordo com Daly e Hearn
(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo
ocorre em locus especiacuteficos no genoma da
AB
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
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Os testes de termoestabilidade com o
clone B8 demonstraram que na temperatura de
60 ordmC com a presenccedila de 5 mM de CaCl2 a
enzima manteve 100 de sua atividade apoacutes
uma hora de incubaccedilatildeo Na temperatura de 70
ordmC apoacutes os 60 minutos de incubaccedilatildeo notamos
que sem a presenccedila de caacutelcio a enzima reteve
474 de sua atividade enquanto que na
presenccedila do iacuteon a enzima reteve 818 de sua
atividade Jaacute na temperatura de 80 ordmC com a
presenccedila do iacuteon a enzima teve 426 de sua
atividade relativa retida apoacutes o periacuteodo de
incubaccedilatildeo (Figura 7-B)
Figura 7 - A - Efeito da temperatura sob a atividade relativa da α-amilase B - Termoestabilidade da enzima α-
amilase incubada por 60 minutos nas temperaturas de 60 70 e 80 ordmC com presenccedila ou ausecircncia do iacuteon caacutelcio
A anaacutelise dos dados quanto a
estabilidade da enzima na temperatura de 4 ordmC
demonstrou que apoacutes um periacuteodo de 60 dias de
estocagem a enzima teve apenas 5 de perda
da sua atividade cataliacutetica Essa perda se
iniciou a partir dos 30 dias de armazenagem A
atividade relativa maacutexima medida no uacuteltimo
dia de incubaccedilatildeo foi de 9583
36 Paracircmetros cineacuteticos da enzima
recombinante (Km and Vmax)
Os valores de Km e Vmaacutex aparentes
foram calculados a partir da construccedilatildeo de um
graacutefico do duplo-reciacuteproco de Lineweaver-
Burk Esse tipo de graacutefico eacute resultado da
relaccedilatildeo dos valores inversos dos eixos
velocidade inicial (V0) e concentraccedilatildeo do
substrato [S] A linha teraacute inclinaccedilatildeo KmVmaacutex
na qual a intercepccedilatildeo seraacute 1Vmaacutex no eixo de
1V0 e intercepccedilatildeo de -1Km no eixo de 1[S]
permitindo determinar com mais precisatildeo a
Vmaacutex O sobrenadante avaliado apresentou Km
aparente no valor de 1074 mgmL e Vmaacutex
igual a 41666 UmL
4 Discussatildeo
O tamanho do amplicon gerado eacute
consistente com o apresentado por Ivanova e
colaboradores (1993) indicando que o gene da
α-amilase foi totalmente amplificado
A linearizaccedilatildeo do vetor de expressatildeo
permitiu a sua integraccedilatildeo no genoma da
levedura Pichia pastoris O siacutetio de restriccedilatildeo
escolhido referente agrave enzima BglII permitiu
uma estrateacutegia de integraccedilatildeo por adiccedilatildeo ou
substituiccedilatildeo gecircnica por eventos de simples ou
duplo crossing-over entre as regiotildees do vetor e
do genoma Isto pode resultar na obtenccedilatildeo de
dois fenoacutetipos diferentes da levedura P
pastoris (Mut+ ou MutS) Segundo Roohvand
e colaboradores (2017) a levedura
metilotroacutefica P pastoris linhagem GS115 natildeo
apresenta em seu material geneacutetico vetores
epissomais Com isso para que ocorra a
expressatildeo de genes exoacutegenos na levedura eacute
fundamental a integraccedilatildeo do material geneacutetico
no seu genoma De acordo com Daly e Hearn
(2005) a integraccedilatildeo do cassete de expressatildeo
ocorre em locus especiacuteficos no genoma da
AB
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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115
A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
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levedura o que gera transformantes
geneticamente estaacuteveis
De acordo com Astolfi-Filho e
colaboradores (1986) a α-amilase produzida
tem a capacidade de clivar o amido que ao ser
corado com vapor de iodo revela a formaccedilatildeo
de halos transluacutecidos ao redor das colocircnias em
meio de cultivo soacutelido As regiotildees circundantes
dos clones que natildeo produzem a enzima coram-
se de roxo A pequena diferenccedila no tamanho
dos halos apresentados na figura 3 pode estar
relacionada com a variaccedilatildeo do nuacutemero de
coacutepias do cassete de expressatildeo contendo o
gene da α-amilase integrado por adiccedilatildeo no
cromossomo da levedura o que gera tambeacutem
diferenccedilas nos iacutendices de amilolise que foram
apresentados na Tabela 1 (KATO et al 2001)
Os resultados da atividade enzimaacutetica
dextrinizante obtido com o clone B8 (3454
UmL) (Figura 4) satildeo superiores aos
demonstrados por autores que utilizaram
outros micro-organismos para a expressatildeo da
enzima α-amilase utilizando cultura em
frascos com agitaccedilatildeo Zhang e colaboradores
(2001) expressaram α-amilase em
Saccharomyces cerevisiae utilizando o
promotor SUC2 A atividade relativa maacutexima
obtida em 35 horas de produccedilatildeo foi de 118
UmL Outros trabalhos tambeacutem
contextualizam a menor atividade obtida em
relaccedilatildeo ao presente estudo Os autores Hmidet
et al (2008) clonaram expressaram e
purificaram a enzima α-amilase de Bacillus
licheniformis na hospederia Ecoli obtendo
uma atividade maacutexima de 1785 Umg apoacutes sua
purificaccedilatildeo
Em outros estudos tambeacutem podemos
observar agrave anaacutelise das atividades relativas e
especiacuteficas da enzima recombinante A
atividade da α-amilase de Pyrococcus furiosus
expressa em Ecoli teve sua atividade
especiacutefica relatada a 39 U mg-1 a 98 ordmC
(DONG et al 1997) Shiina e colaboradores
(2007) relataram a expressatildeo da α-amilase de
Bacillus stearothermophilus em Ecoli
transformada com o vetor pHI301A Segundo
esses autores a maior atividade enzimaacutetica
obtida foi de 82 UmL em 13 horas de
induccedilatildeo Os autores Shahhoseini e Ghaemi
(2003) analisaram a atividade da α-amilase de
Bacillus licheniformis transformando E coli
BL21 com o vetor de expressatildeo pMSH320
Apoacutes 15 horas de induccedilatildeo foi descrito uma
atividade especiacutefica de 235 μmol min-1 mg-1
de proteiacutena no sobrenadante e 431 μmol min-1
mg-1 de proteiacutena na fraccedilatildeo intracelular
A variaccedilatildeo no perfil da atividade
enzimaacutetica obtida nos sobrenadantes dos nove
clones do presente estudo pode ser explicada
por diversos fatores que estatildeo relacionados
com a produccedilatildeo de proteiacutenas pelo sistema de
expressatildeo heteroacutelogo assim como pela simples
composiccedilatildeo do meio de cultivo fisiologia e
viabilidade geneacutetica das ceacutelulas Dentre estes
tambeacutem podemos citar a sequencia sinal que eacute
responsaacutevel pela secreccedilatildeo do produto expresso
(PAIFER et al 1994)
O peso molecular da enzima
recombinante de B licheniformis observado no
presente estudo difere de trabalhos reportados
com a mesma enzima Kim e colaboradores
(1992) isolaram e clonaram o gene
correspondente a mesma enzima no vetor
pBR322 e expressaram em E coli eles
reportaram que o peso molecular da α-amilase
foi de 64 kDa Hmidet e colaboradores (2008)
tambeacutem expressaram o gene que codifica para
enzima α-amilase de B licheniformis linhagem
NH1 na hospedeira Ecoli BL21 Eles
reportaram um peso molecular de 58 kDa da
enzima purificada No presente estudo a
diferenccedila observada nos pesos moleculares das
bandas dos clones analisados (65 a 74 kDa)
pode ser explicada pela glicosilaccedilatildeo efetuada
pela levedura durante o amadurecimento
proteico (Figura 5-A) A glicosilaccedilatildeo eacute a
modificaccedilatildeo poacutes-traducional mais comum que
precede a secreccedilatildeo de proteiacutenas e ocorre no
luacutemen do retiacuteculo endoplasmaacutetico A levedura
P pastoris eacute capaz de realizar ambos os tipos
de glicosilaccedilatildeo (O- e N-Linked) (DALY e
HEARN 2004 ROOHVAND et al 2017)
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
116
industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
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A variaccedilatildeo de pH oacutetimo para a atividade
relativa da enzima α-amilase de B
licheniformis tem sido citado na literatura
Morgan e Priest (1981) caracterizaram uma α-
amilase termoestaacutevel da cepa de B
Licheniformis NCIB 6346 e verificaram que a
sua atividade era estaacutevel entre o pH 70 e 100
tendo seu pH oacutetimo em 70 Hmidet e
colaboradores (2008) ralataram que a α-
amilase do mesmo microrganismo expressa em
E Coli teve seu pH oacutetimo aferido em 65
Outros estudos realizados com a caracterizaccedilatildeo
da α-amilase de duas linhagens de B
Licheniformis sendo uma mutante e outra
selvagem revelaram um pH oacutetimo para a
atividade enzimaacutetica igual a 60 (LEE et al
2006) No presente estudo a enzima tambeacutem
mostrou-se ativa em pHs alcalinos nos trecircs
clones analisados retendo cerca de mais de
80 de sua atividade nos pHs 90 e 100
(Figura 6) Em algumas induacutestrias como por
exemplo a de dertergentes α-amilases com
atividade em pHs alcalinos satildeo muito
utilizadas (GUPTA 2003)
Alguns trabalhos relatados na literatura
mostram diferentes temperaturas em que a
enzima α-amilase de B licheniformis age no
substrato sendo que algumas destas satildeo
caracterizadas como termoresistentes Tomazic
e Klibanov (1988) demonstram que uma α-
amilase caracterizada teve sua temperatura
oacutetima em 90 ordmC Hmidet e colaboradores
(2008) relataram a temperatura oacutetima de 90 ordmC
para enzima Morgan e Priest (1981) relataram
que a enzima da cepa NCIB 6346 obteve a
maacutexima atividade na temperatura de 70 ordmC
assim como a temperatura descrita no presente
trabalho como eacute mostrado na (Figura 7-A)
Satildeo reportados tambeacutem trabalhos
relacionados com a termoestabilidade da
enzima α-amilase Ivanova e colaboradores
(1993) incubaram a enzima na presenccedila de 10
mM e 50 mM do iacuteon Ca2+ Segundo os
autores os dados para a atividade residual apoacutes
a incubaccedilatildeo da enzima a 85 degC em tampotildees
contendo diferentes concentraccedilotildees de CaCl2
mostraram que o caacutelcio eacute um estabilizador da
enzima Como se observa nos resultados do
presente trabalho (Figura 7-B) a variaccedilatildeo da
atividade relativa em diferentes temperaturas
ou a estabilidade teacutermica da enzima
recombinante tambeacutem estaacute relacionada com a
presenccedila do iacuteon Ca2+
O valor da constante de Michaelis-
Menten (Km) eacute muito importante na
caracterizaccedilatildeo da cineacutetica enzimaacutetica
indicando a quantidade necessaacuteria de substrato
para saturar a enzima Muumlller (2008)
caracterizando alfa-amilase de Bacillus subtilis
produzida em P pastoris observou diferentes
valores de Km para enzima quando presente no
sobrenadante Para o extrato bruto do clone S2
os valores de Km foi de 102 mgmL e a
velocidade maacutexima foi de 5263 UmL
Ivanova e colaboradores (2003) analisaram um
Km de 09 mgmL e um Vmaacutex de 625 UmL
para a enzima alfa-amilase de B licheniformis
5 Conclusotildees
Os experimentos demonstraram que o
fragmento codificante da α- amilase de B
licheniformis foi isolado e clonado
eficientemente nos vetores de clonagem e
expressatildeo e os clones recombinantes de P
pastoris foram capazes de expressar e secretar
a enzima α-amilase ativa sendo que sua maior
produccedilatildeo foi observada apoacutes 120 horas de
induccedilatildeo com a maior atividade da proteiacutena em
pH neutro A enzima recombinante apresentou
consideraacutevel estabilidade em sua temperatura
oacutetima e aumentou sua estabilidade na presenccedila
do iacuteon caacutelcio A enzima tambeacutem se manteve
estaacutevel por dois meses quando armazenada a 4
ordmC
Os resultados obtidos com a cineacutetica
enzimaacutetica neste estudo indicam que o
sobrenadante do extrato bruto se apresenta
como uma boa alternativa para utilizaccedilatildeo na
hidroacutelise do amido reduzindo os custos de
produccedilatildeo e possibilitando a flexibilidade nas
condiccedilotildees de uso para determinados processos
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industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
116
industriais Aleacutem disto estudos como este
proporcionam avanccedilos nas pesquisas nacionais
de caraacuteter biotecnoloacutegico
Agradecimentos
A Petrobraacutes pelo financiamento deste trabalho
ao CNPq pela concessatildeo da bolsa de estudos
ao Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazocircnia (INPA) pelo apoio institucional e ao
Centro de Apoio Multidisciplinar da
Universidade Federal do Amazonas por toda
estrutura fiacutesica e suporte teacutecnico laboratorial
Divulgaccedilatildeo
Este artigo eacute ineacutedito Os autores e revisores
natildeo relataram qualquer conflito de interesse
durante a sua avaliaccedilatildeo Logo a revista
Scientia Amazonia deteacutem os direitos autorais
tem a aprovaccedilatildeo e a permissatildeo dos autores para
divulgaccedilatildeo deste artigo por meio eletrocircnico
Referecircncias
ASGHARI MS KHAJEH K MORADIAN F
RANJBAR B NADERI-MANESH H Acid-induced conformational changes in Bacillus amyloliquefaciens α-amylase appearance of a molten globule like state Enzyme and
microbial Technology v 35 p 51-57
2004 doiorg101016jenzmictec200403006
ASTOLFI-FILHO S GALEMBECK EV FARIA JB SCHEMBERG ACF Stable yeast
transformants that secrete functional α-amylase encoded by cloned mouse pancreatic
cdna Nature Biotechnology v4 p311-
315 1986 doi101038nbt0486-311
CEREGHINO GPL CREGG JM
Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris FEMS
Microbiology Reviews v24 p 45-66 2000
doiorg101111j1574-69762000tb00532x
CREGG JM VEDVICK TS RASCHKE WC
Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris BioTechnology
v11 p 905-910 1993 doi101038nbt0893-905
DALY R HEARN MTW Expression of
heterologous proteinsin Pichia pastoris a useful experimental tool in protein engineering
and production Journal of Molecular Recognition v18 p 119-138 2005
doi 101002jmr687
DONG G VIEILLE C SAVCHENKA A ZEIKUS GJ Cloning Sequencing and
Expression of the Gene Encoding Extracellular a-Amylase from Pyrococcus furiosus and
Biochemical Characterization of the
Recombinant Enzyme Applied and Environmental Microbiology v63 p
3569ndash3576 1997
FUWA HA A new method for
microdetermination of amylase activity by the use of amilose as the substrate Journal of
Biochemistry v41 p 583-603 1954
GUPTA R GIGRAS P MOHAPATRA H GOSWAMI VK CHAUHAN B Microbial a-
amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry v38 p 1599ndash1616
2003
HMIDET N BAYOUDH A BERRIN GJ KANOUN S et al Purification and biochemical
characterization of a novel a-amylase from Bacillus licheniformis NH1 Cloning nucleotide
sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli Process Biochemistry v43
p 499ndash510 2008
doi101016jprocbio200801017
HUANG M GAO Y ZHOU X ZHANG Y
CAI M Regulating unfolded protein response activator HAC1p for production of thermostable
raw-starch hydrolyzing α-amylase in Pichia
pastoris Bioprocess Biosyst Eng v40 n3 p341-350 2017 doi 101007s00449-016-
1701-y
VANOVA NV DOBREVA EP EMANUILOVA
EI Purification and characterization of a
thermostable alpha-amylase from Bacillus licheniformis Journal of Biotechnology v
28 p 277-289 1993 doi1010160168-1656(93)90176-N
KATO S ISHIBASHI M TATSUDA D et al Efficient expression purification and
characterization of mouse salivary a-amylase
secreted from methylotrophic yeast Pichia pastoris Yeast v18 p 643ndash655 2001
doi101002yea714
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
117
KIM IC CHA JH KIM JR et al Catalytic
properties of the cloned amylase from Bacillus licheniformis J Biol Chem v267 p
22108ndash22114 1992
LEE S ONEDA H MINODA M et al
Comparison of Starch Hydrolysis Activity and
Thermal Stability of Two Bacillus licheniformis a-Amylases and Insights into Engineering a-
Amylase Variants Active under Acidic Conditions J Biochem v139 p 997ndash1005
2006 doi 101093jbmvj113
LI S YANG X YANG S et al Technology Prospecting on Enzymes Application
Marketing and Engineering Computational and Structural Biotechnology Journal
2e201209017 2012 doi105936csbj201209017
LI Z DUAN X WU J Improving the
thermostability and enhancing the Ca(2+) binding of the maltohexaose-forming α-
amylase from Bacillus stearothermophilus J Biotechnol v 20 n222 p 65-72 2016
doi 101016jjbiotec201602013
MAGALHAtildeES OP SOUZA MP Application of Microbial Amylase in Industry ndash A Review
Brazilian Journal of Microbiology v41 p 850-861 2010 doiorg101590S1517-
83822010000400004
MORGAN FJ PRIEST FG Characterization
of a Thermostable α-Amylase from Bacillus licheniformis NCIB 6346 Journal of Applied Microbiology v50 p 107ndash114 1981
doi 101111j1365-26721981tb00875x
MULLER G Clonagem e Expressatildeo do gene da
α-amilase de Bacillus subtilis variedade D2 na
levedura Pichia pastoris Dissertaccedilatildeo de Mestrado Universidade Federal do
Amazonas Manaus Amazonas 2008 110pp
NAKANO A LEE CY YOSHIDA A
MATSUMOTO T et al Effects of methanol
feeding methods on chimeric alpha-amylase expression in continuous culture of Pichia pastoris Journal of Bioscience and Bioengineering v 101 p 227-231 2006
doi101263jbb101227
NAZMI AR REINISCH T HINZ JH Ca-
binding to Bacillus licheniformis α-amylase
(BLA) Archives of Biochemistry and Biophysics v453 p 18ndash25 2006
doiorg101016jabb200604004
PAIFER E MARGOLLES E CREMATA J et
al Efficient expression and secretion of recombinant alpha amylase in Pichia pastoris using two different signal sequences Yeast v10 p 1415ndash1419 1994
doi101002yea320101104
PANDEY A NIGAMI P SOCCOL CRA et al Advances in microbial amylases
Biotechnol Appl Biochem v31 p 135ndash152 2000 doiorg101042BA19990073
ROOHVAND F SHOKRI M ABDOLLAHPOUR-
ALITAPPEH M EHSANI P Biomedical applications of yeast- a patent view part one
yeasts as workhorses for the production of therapeutics and vaccines Expert Opinion
on Therapeutic Patents v27 n8 p 929-951 2017 doi
1010801354377620171339789
SAMBROOK J FRITSCH EF MANIATIS T Molecular Cloning a laboratory manual
2nd ed NY Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989
1659pp
SHAHHOSEINI M ZIAEE A GHAEMI N Expression and secretion of an a-amylase gene
from a native strain of Bacillus licheniformis in Escherichia coli by T7 promoter and putative
signal peptide of the gene Journal of Applied Microbiology v95 p 1250ndash1254
2003 doi101046j1365-2672200302082x
SHIINA S OHSHIMA T SATO M Extracellular production of a-amylase during
fed-batch cultivation of recombinant Escherichia coli using pulsed electric field
Journal of Electrostatics v65 p 30ndash36
2007 doi 101016jelstat200503093
SINDHU R BINOD P MADHAVAN A
BEEVI US MATHEW AK ABRAHAM A PANDEY A KUMAR V Molecular
improvements in microbial α-amylases for
enhanced stability and catalytic efficiency Bioresource Technology v17 p1-40
2017 doi101016jbiortech201704098
TOMAZIC JS KLIBANOV MA Why Is One
Bacillus a-Amylase More Resistant against Irreversible Thermoinactivation Than Another
The journal of Biological Chemistry v7
n263 p 3092-3096 1988
YAN S WU G Bottleneck in secretion of α-
amylase in Bacillus subtilis Microbial Cell
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
Scientia Amazonia v 6 n3 107-118 2017
Revista on-line httpwwwscientia-amazoniaorg ISSN22381910
118
Factories v 16 p 124-132 2017 doi
101186s12934-017-0738-1
ZHANG X ZHAOJIE X ZHAO B CEN P
Enhancement of production of cloned α-amylase by lactic acid feeding from
recombinant Saccharomyces cerevisiae using a
SUC2 promoter Biotechnology Letters
v23 p 259ndash262 2001
doi101023A1005641926474
ZHU H REYNOLDS LB MENASSA R A
hyper-thermostable α-amylase from Pyrococcus furiosus accumulates in Nicotiana tabacum as functional aggregates BMC
Biotechnol v17 n53 p 1-11 2017 doiorg101186s12896-017-0372-3
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