scytalidium thermophilum katalaz-fenol oksidazının...
Post on 01-Sep-2019
5 Views
Preview:
TRANSCRIPT
Scytalidium thermophilum
Katalaz-Fenol Oksidazının
Fonksiyonel ve Yapısal Analizi
Yonca Yüzügüllü, Zümrüt B. Ögel, Michael J. McPherson, Chi H. Trinh,
Arwen R. Pearson, Mark A. Smith, Lucy Fairhust, Didem S. Kocabaş, Ufuk
Bölükbaşı, Simon Phillips
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Neden Katalaz??
Popüler
Aktivitesi kolay ölçülebilir
Substratı (H2O2) ucuz, rahat bulunabilir
Reaksiyon :
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
2 H2O2 → 2 H2O + O2 (1)
Enz (Por–FeIII) + H2O2 → Cpd I (Por+•–FeIV=O) + H2O (2)
Cpd I (Por+•–FeIV=O) + H2O2 → Enz (Por–FeIII) + H2O + O2 (3)
1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: 192–208 (2004)
2) Swatala J and Loewen PC. ABB, Arch. Biochem. Biophys. 401: 145-154 (2002)
Sınıflandırma
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Katalazlar
Monofonksiyonel katalazlar
Katalaz-peroksidazlar
Mn-içeren katalazlar
Diğer katalazlar
1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: 192–208 (2004)
2)Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Adv. Org. Chem. 51 (2001)
3)Swatala J and Loewen PC. ABB, Arch. Biochem. Biophys. 401: 145-154 (2002)
Monofonksiyonel Katalazlar (EC 1.11.1.6)
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
b yada d tipi hem grubu
Tetramer
Soret bant (406 nm)
Büyük alt birimli (75-84 kDa) ve küçük
alt birimli (55-69 kDa) katalazlar
Büyük alt birimli katalazlar, yüksek
sıcaklığa ve proteolize karşı daha
dayanıklılar
Hem b (A) Hem d (B)
1)Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: 192-208 (2004)
2)Loewen PC.Cold Spring Harbor Laboratory Pres: 273-308 (1997)
3)Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Adv. Org. Chem. 51 (2001)
Monofonksiyonel Katalazlar (EC 1.11.1.6)
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Aktif Bölge
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Neurospora crassa katalazı
Díaz, A., Horjales, E., Rudiño-Piñera, E., Arreola, R., Hansberg, W., 2004,
“Unusual Cys-Tyr Covalent Bond in a Large Catalase”, Journal of Molecular
Biology, 342: 971-985.
S.thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazı
(CATPO)
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Hidrojen peroksidi parçaladığı (katalaz aktivitesi) gibi H2O2 yokluğunda da
o-difenoliklerin oksidasyonunu (fenol oksidaz aktivitesi) gerçekleştirmekte
Oksidaz aktivitesi gösteren memeli katalazları literatürdeki tek benzer
örnektir
Penicillium katalazı (PVC)’na
benzemekte
PVC
1)Kocabas DS, Bakir U, Phillips SEV, McPherson MJ and. Ogel ZB. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79: 407–415 (2008)
2)Kocabas DS, Pearson AR, Phillips, SEV, Bakir U, Ogel ZB, McPherson, MJ and Trinh,CH. Acta Crystallog. F 65 (2009)
3)Ögel ZB, Yüzügüllü Y, Mete S, Bakir U, Kaptan Y, Sutay D, Demir AS. Appl Microbiol. Biotechnol. 71: 853-862 (2006)
4)Vetrano, AM, Heck, DE, Mariano, TM, Mishin, V, Laskin DL, Laskin JD. J. Biol. Chem. 280: 35372-35381 (2005
Amaç
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Enzimin üç boyutlu yapısının belirlenmesi
Kataliz mekanizmasının araştırılması
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Enzim, iyon değişimi
ve ardından jel
filtrasyon
kromatografi ile
saflaştırıldı
3-9 mg/ml saf enzim
Protein karakterizasyonu
SDS-PAGE
Protein kristalizasyonu
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
CATPO (2 mg/ml) kristalleri
PEG 2000,18oC
CATPO (2 mg/ml) kristalleri
PEG 2000, 0.1M BaCl2, 18oC
CATPO (7 mg/ml) kristalleri
PEG 2000, 0.1M BaCl2, 18oC
CATPO(Katalaz-Fenol Oksidaz)
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
2.7Å’da ışığın kırılma verileri
toplandı
Birim hücre : a= 185.4Ǻ,
b=216.3Ǻ, c=68.6Ǻ ve
α=β=γ=90o
Homotetramer (4 x 80 kDa =
320 kDa)
1 x hem (d tipi) / monomer
670 amino asit / monomer
21 NAG / tetramer
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
CATPO Monomer, 4AUE
(A zinciri) CATPO Monomer, 4AUE (gri)
PVC Monomer, 2IUF (magenta)
CATPO (Katalaz-Fenol Oksidaz)
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
!Problemler!
Düşük çözünürlük
324 solvent / tetramer
Aktif bölgede solvent yok
Katalitik merkez hakkında
yeterli bilgi sağlanmadı
Rekombinant CATPO…
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Sentetik catpo geni pET28 vektörüne aktarıldı ve Escherichia coli BL21 star
(DE3) hücrelerinde üretildi
Protein üretimi optimize edildi
Aktif bölgedeki korunmuş amino asitler mutasyona uğratıldı
Elde edilen CATPO varyantları afinite kromatografisi ile saflaştırıldı
Protein kristalleri %12 PEG400, 0.2M KCl, 0.01M CaCl2 ve 0.05M Sodyum
kakodilat (pH 5.0-5.6) içeren ortamda elde edildi
Kristaller sıvı nitrogenle donduruldu
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
1.4 Å!!
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Sonuçlar…
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Katalaz-fenol oksidazı enzimi(CATPO), mantarlarda tanımlanmış çift aktivite gösteren ilk enzimdir
Spektreskopik çalışmalar, CATPO enziminin d tipi hem grubu içerdiğini göstermektedir
CATPO’nun üç boyutlu yapısı 2.7Å’da belirlenmiş olup enzimin birbiriyle ilişkili dört monomerden
meydana geldiği ve korunmuş bir ‘hem’ merkezi içerdiği gözlendi
Enzimin aktif bölgesi hakkında detaylı bilgi edinmek amacıyla rekombinant ekspreyon sistemi
geliştirildi ve mutasyon çalışmaları gerçekleştirildi
Rekombinant CATPO’nun üç boyutlu yapısı 1.4Å’da belirlendi
CATPO varyantlarından H82N, N155A, V123C ve V123T’in üç boyutlu yapıları sırayla 1.5, 2.25, 1.9 ve
1.7-Å da belirlendi
Protein yapıları karşılaştırıldığında H82N ve V123C mutantlarında d yerine b tipi heme grubu görüldü
Tüm varyantlarda korunmuş olarak iki su molekülünün (W1 ve W2) varlığı keşfedildi
V123C mutantında histidin (His82) ve sistein (Cys123) arasında yeni bir kovalent bağın varlığı
bulundu
Enzim aktivite analizleri histidin (His82) ve asparajin (Asn155) kalıntılarının aktivite için önemli
olduğunu ve ayrıca histidinin hem b nin d ye dönüşümünde önemli rol oynadığını göstermektedir
Her iki aktivitenin (katalaz ve fenol oksidaz) aynı aktif bölgede gerçekleştiği önerilmektedir
Hedefler…
21.Ulusal Biyoloji Kongresi 2012 -Ege Üniversitesi
Oksidatif substratların aktif bölgeye nasıl ulaştığını
gözlemek amacıyla fenolik maddeyle inkübe edilmiş
CATPO kristallerinden üç boyutlu yapı eldesi
Aktif bölgede mutasyon çalışmalarının devamı
Teşekkürler…
Fen-Edebiyat Fakültesi
Biyoloji Bölümü
Doktora Sonrası Yurt
Dışı Destek
Programı
2219
School of Molecular
and Cellular Biology
ODTÜ
BAP-08-11-
DPT2002K120510
Kongre Düzenleme
Kurulu
Diamond Light Source
top related