sinónimos: manipulación genética clonaje génico tecnología
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Es una revolución metodológica que ha puesto a nuestra disposición gran número de técnicas procedentes de diversos campos de la ciencia con un objetivo común muy importante: el acceso directo al gen
Sinónimos:•Manipulación genética•Clonaje génico•Tecnología del DNA recombinante
INGENIERÍA GENÉTICA
Ingeniería genética: avances importantes1953 Watson y Crick: estructura en doble hélice del DNA1957 Kornberg: DNA polimerasa1961 Marmur y Doty: renaturalización e hibridación del DNA1962 Arber, Nathans y H.Smith: enzimas de restricción1966 Niremberg, Ochoa, Khorana: código genético1967 Gellert: DNA ligasa1972-73 Boyer, Cohen y Berg: clonaje del DNA1975 Southern: hibridación a partir de geles1975-77 Sanger, Barrel, Maxam y Gilbert: secuenciación del DNA1981-82 Palmiter y Brinster: ratones transgénicos1985 Mullis: reacción en cadena de la polimerasa1990 Varios: Hibridación in situ fluorescente (FISH)1998 Varios: Paneles génicos2001 Venter y Collins: proyecto genoma humano
ANÁLISIS MOLECULAR
DNA
RNA
PROTEINAS
mRNA inmaduro
mRNA
gDNAunidad de transcripción
proteina
GENOMA
PROTEOMA
TRANSCRIPTOMA
transcripción
Procesamiento (montaje, splicing)
traducción
(exoma)
CLONACIÓN DE GENES
CLON
Aislamiento
Inserción en vector
Incorporación al hospedante
Amplificación
Purificacióndel inserto
3) Enzimas de restricción
4) Obtención de cDNA
1) Métodos físicos• Agitación• Sonicación
2) Síntesis química• Oligonucleótidos pequeños
AISLAMIENTO DE GENES
Endonucleasas de restricción
Ligasas
EcoR I Hind III Hpa I
Enzimarestricción
Acopla-miento
Ligacióncovalente
ENZIMAS
VECTORES GÉNICOS
Vector Capacidad (kb) HospedantePlásmido 8-9 E.Coli
Fago Inserción: 12Deleción-sustitución: 22
E.Coli
Cósmidos 45 E.ColiFago P1 70-100 E.Coli
PAC 130-150 E.ColiBAC 120-300 E.ColiYAC 250-400 Levadura
RECUPERACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES
Métodoclásico
TetSAmpRTetSAmpR
TetRAmpR
TetRAmpR
E
E E
Plásmidorecombinante
Amp
Tet
Amp
TetX
X X
ColoniasrecombinantesAmp
Plásmidos portadores del gen lacZ
Plásmidorecombinante
Coloniasrecombinantes
(blanco)lacZ-AmpR
lacZ+AmpR
Plásmido norecombinante
Colonias norecombinantes
(azul)
IPTGX-gal
ampicilina
RECUPERACIÓN DE COLONIAS RECOMBINANTES
NEURONA LINFOCITO
gen A gen BDNA
TRANSCRIPCION
TRADUCCION
RNA RNA
Todas las células de un organismo contienen el mismo genoma pero en tejidos distintos se transcriben genes diferentes
RECORDAR
CONSTRUCCIÓN DE UNA LIBRERÍA gDNA
Obtención de cDNA
LIBRERÍASDNA genómico (gDNA)
DNA complementario (cDNA)
clonaje
mRNART
cDNA
clonaje
STS (sequence taged sites)
Librería cDNAEST (expresed sequence tags)
Librería DNA genómico
Clones de DNA genómico y cDNA derivados de la misma región del DNA
CLONACIÓN IN VITRO: PCR
1) Desnaturalización
2) Hibridacióniniciadores
3) Polimerización(Taq polimerasa)
94ºC 1 min.
72ºC 1 min.
58ºC 1 min.
http://www.uv.es/patobio/pcr/index.html
CLONACIÓN IN VITRO: PCR
DNA
apertura de cadenas hibridación de primers
Síntesis DNA
PRIMER CICLO2 DNA doble cadena
SEGUNDO CICLO4 DNA doble cadena
TERCER CICLO8 DNA doble cadena
etc
etc
etc
etc
etc
etc
etc
etc
PCR
2) Elevada sensibilidadTeóricamente, es posible amplificar fragmentos de DNA a partir de una sola molécula de doble cadena.En cualquier caso, basta una cantidad de muestra muy pequeña (unas pocas células)
Si se eligen bien los primers, solo se amplifica el fragmento deseado
3) Elevada especificidad
Se realiza en poco tiempoUtiliza reactivos no muy caros
4) Poco costosa
1) Hay que conocer previamente la secuencia que se quiere amplificar
APLICACIONESTEJIDOSCÉLULAS
GENCLONADO
ESTRUCTURAGÉNICA
Secuenciación de nucleótidos
Secuencia de aminoácidos
ESTRUCTURAPROTÉICA
SONDAMOLECULAR
DIAGNÓSTICO
INDUSTRIAFARMACÉUTICA
Obtención del producto génico
TERAPIA GÉNICA
TRANSGÉNICOS
KNOCK OUT
Introducción en células adecuadas
Hibridación in situ fluorescente (FISH)
GFP (green fluorescent protein)
El gen que codifica la GFP puede unirse a un extremo del gen que codifica una proteína de interés y permite observar la distribución de éste por el organismo o rastrear el movimiento de una proteína de interés en organismos vivos
Mario R. Capecchi Martin J. Evans Olivier Smithies
PREMIO NOBEL DE MEDICINA Y FISIOLOGIA2007
"for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells"
Ratón knock-out sin algunas neuronas olfativasPierde la sensación de peligro
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