sintesis de pÉptidos en proteómica dirigida
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SINTESIS DE PÉPTIDOSen proteómica dirigida
Servicio de Proteómica - Centro Nacional de Biotecnología
SpHPP
Manuel Lombardía Uría
Síntesis de péptidos para estudios de proteómica dirigida
Selección y diseño de los péptidos para cada proteina de interés:
- proceso esencial para el éxito de los experimentos SRM/MRM
- selección basada en criterios empíricos y teóricos
- obtención de péptidos proteotípicos óptimos
Síntesis química
Validación experimental de los péptidos :
- previa a la síntesis de los péptidos pesados
Fases:
Selección de péptidos
Proteínas de interés
Known Unknown
ProteinAccession
numberName Protein
Accession number
Name
P02795 MT2_HUMAN Metallothionein-2 Q96M29 TEKT5_HUMAN Tektin-5Q58EX7 PKHG4_HUMAN Puratrophin-1 Q96MC5 CP045_HUMAN Uncharacterized protein C16orf45
Q01726 MSHR_HUMANMelanocyte-stimulating hormone receptor
Q14028 CNGB1_HUMANCyclic nucleotide-gated cation channel beta-1
Q14764 MVP_HUMAN Major vault protein P23975 SC6A2_HUMANSodium-dependent noradrenaline transporter
Q0VD83 APOBR_HUMAN Apolipoprotein B receptor Q8NC67 NETO2_HUMAN Neuropilin and tolloid-like protein 2
Q6EMK4 VASN_HUMAN Vasorin Q8IZ96 CKLF1_HUMANCKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing protein 1
O14983 AT2A1_HUMANSarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1
P33527 MRP1_HUMANMultidrug resistance-associated protein 1
P22695 QCR2_HUMANCytochrome b-c1 complex subunit 2, mitochondrial
P60510 PP4C_HUMANSerine/threonine-protein phosphatase 4 catalytic subunit
P55287 CAD11_HUMAN Cadherin-11 Q49A26 GLYR1_HUMAN Putative oxidoreductase GLYR1 Q4KMP7 TB10B_HUMAN TBC1 domain family member 10B Q14019 COTL1_HUMAN Coactosin-like protein
Q9NXV2 KCTD5_HUMANBTB/POZ domain-containing protein KCTD5
Q9Y221 NIP7_HUMAN60S ribosome subunit biogenesis protein NIP7 homolog
P55259 GP2_HUMANPancreatic secretory granule membrane major glycoprotein GP2
O75150 BRE1B_HUMAN E3 ubiquitin-protein ligase BRE1B
Q2VPK5 CTU2_HUMANCytoplasmic tRNA 2-thiolation protein 2
Q8N9N5 BANP_HUMAN Protein BANP
Proteínas asignadas
Selección de péptidos
Proteínas de interés
Evidencia experimental
Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio
Predicción de PTP
Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”
Selección de péptidos
Proteínas de interés
Evidencia experimental
Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio
Predicción de PTP
Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”
Selección de péptidos
Criterios de selección de péptidos
• Únicos para una proteína particular: Búsqueda en Uniprot/Swiss prot (BLAST)
• 3 a 4 péptidos por proteína
• No missed cleavages
• Longitud entre 6 y 20 aa
• Baja hidrofobicidad: valor de 10 a 40 según algoritmo SSRCalc (sequence specific retention calculator)
• Evitar aa susceptibles de modificación química
- M y W son fácilmente oxidables
- N seguida de G ó P tiende a desamidarse
- Q y E en N term suelen transformarse en piroglutámico
- C en N term tiende a ciclarse si está carbamidometilada
- N en N term es dificil de liberar durante la síntesis del péptido
- D junto con G, P ó S favorece la rúptura de la cadena a pH bajo
- AA ácido en posición P2 ó P2’ promueven missed cleavage
Selección de péptidos
Proteínas de interés
Evidencia experimental
Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio
Predicción de PTP
Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”
Selección de péptidos
Búsqueda de evidencias en BD
No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas
Selección de péptidos
Proteínas de interés
Evidencia experimental
Observación de péptidos trípticos en análisis por LC-MS/MS de las muestras biológicas objeto de estudio
Predicción de PTP
Obtención de péptidos candidatos a péptido proteotípicos por digestión “in silico”
Selección de péptidos
SINTESIS DE PEPTIDOS
Búsqueda de evidencias en BD
No todos los péptidos posibles son observados experimentalmente. Seleccionar péptidos más frecuentemente observados en repositorios del tipo GPMDB ó peptide (SRM) atlas
Síntesis de péptidos
• Aparato: Sintetizador automatizado Multipep de Intavis AG
• Método: Síntesis en fase sólida (SPPS) sobre resinas de polímeros mediante química FMOC (grupo protector del amino)
• Formatos: placas 96 minicolumnas con filtro con capacidad para 1-10 µmol
• Purificación de los péptidos crudos por HPLC semipreparativo
• Uso de resinas unidas a Lys ó Arg pesadas (13C y 15N) para péptidos pesados
• Cuantificación de péptidos pesados purificados por análisis de aa ó por
espectroscopía fluorescencia (kit comercial)
Péptidos sintetizados crudos ó purificados
Validación mediante experimentos LC-MS/MS y SRM/MRM
Péptidos proteotípicos óptimos
SINTESIS DE PEPTIDOS PESADOS
Verificación del péptido por MALDI-TOF MS
Validación de péptidos
699.0 960.8 1222.6 1484.4 1746.2 2008.0
Mass (m/z)
2.7E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 858.5, 26857]
858.
4847
880.
4660
902.
4490
829.
4712
1515
.771
0
706.
2161
730.
4156
801.
4609
1031
.568
8
758.
3929
957.
5526
986.
5452
862.
4854
929.
5261
1054
.324
1
1741
.975
2
1259
.652
6
1537
.746
6
1614
.829
1
699.0 960.8 1222.6 1484.4 1746.2 2008.0
Mass (m/z)
3.3E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100%
Inte
nsity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 858.5, 33418]
858.
4755
880.
4547
920.
3995
986.
5338
812.
4637
730.
4085
706.
2107
959.
5228
1212
.636
2
844.
4619
872.
4819
1059
.433
1
773.
3882
1029
.507
8
1151
.416
0
1098
.571
7
Péptido 1 crudo
Péptido 1 purificado
699.0 960.8 1222.6 1484.4 1746.2 2008.0
Mass (m/z)
4.3E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 1102.6, 43366]11
02.5
967
1201
.668
6
1146
.574
6
1124
.574
3
1084
.590
3
1058
.605
8
1247
.651
0
1173
.632
0
1349
.627
6
987.
5719
1455
.668
0
1015
.564
5
1274
.628
9
1323
.666
1
872.
4329
1223
.645
3
1614
.776
9
706.
2114
1426
.883
1
728.
2209
1719
.802
5
1913
.779
5
1670
.836
9
812.
2496
916.
4207
1860
.945
8
834.
2737
1805
.833
9
1745
.913
1
699.0 960.8 1222.6 1484.4 1746.2 2008.0
Mass (m/z)
1.6E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 1102.6, 16056]
1102
.580
7
1124
.558
7
1084
.570
8
1158
.636
1
987.
5428
1106
.577
4
1217
.606
2
1288
.659
5
1189
.609
4
1324
.645
0
858.
4717
706.
2123
782.
3582
1134
.574
1
890.
4286
1058
.583
5
1239
.588
6
747.
4033
916.
4717
1009
.516
9
805.
3074
1349
.614
3
836.
3185
1031
.495
2
1082
.557
1
1812
.853
8
938.
4106
1668
.903
0
1261
.586
7
1376
.623
2
1555
.827
8
1416
.669
6
1707
.794
3
1458
.743
8
Péptido 1 crudo
Péptido 1 purificado
699.0 960.8 1222.6 1484.4 1746.2 2008.0
Mass (m/z)
1.9E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 974.5, 19491]
974.
4683
996.
4519
1012
.424
610
18.4
344
1056
.388
7
706.
1810
732.
1826
957.
4786
811.
3411
917.
4496
1078
.368
0
867.
3831
1016
.441
2
787.
1931
994.
4355
756.
1943
836.
2180
1103
.541
9
891.
2199
1126
.489
5
1249
.555
7
1516
.651
0
699.0 960.8 1222.6 1484.4 1746.2 2008.0
Mass (m/z)
9.7E+3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100%
Inte
nsity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 841.1, 9657]
841.
0693
825.
0958
857.
0419
996.
4968
974.
5068
1012
.468
2
706.
2087
815.
6487
873.
6938
757.
6083
931.
7352
989.
7773
1129
.778
4
1085
.747
7
730.
2114
1217
.826
3
1261
.855
3
1041
.726
1
1173
.805
5
953.
6709
1305
.880
7
909.
6452
1349
.913
0
1393
.934
7
845.
0809
787.
2258
1437
.964
2
1481
.985
6
1014
.138
9
1063
.791
3
1526
.011
2
1570
.038
7
1614
.072
9
1658
.097
8
1702
.108
4
1746
.133
9
Péptido 3 crudo
Péptido 3 purificado
799.0 1040.8 1282.6 1524.4 1766.2 2008.0
Mass (m/z)
1.9E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 1608.8, 19123]
1608
.782
7
1630
.765
916
46.7
395
1652
.744
8
877.
0210
1690
.698
0
813.
2155
1591
.838
5
836.
2330
1613
.802
6
908.
9665
1712
.679
9
1564
.779
4
935.
2369
1054
.296
1
1206
.584
0
958.
2523
986.
5162
1502
.693
7
1025
.499
3
1737
.812
6
1360
.631
6
1098
.300
2
1127
.510
9
1077
.285
2
1780
.814
3
1529
.728
3
1174
.319
8
1279
.629
4
1759
.809
0
1153
.326
2
1410
.692
6
1238
.569
2
1801
.820
6
799.0 1040.8 1282.6 1524.4 1766.2 2008.0
Mass (m/z)
1.0E+4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% In
tens
ity
4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 1571.8, 10217]
1571
.781
4
1630
.813
4
1587
.759
5
1646
.786
9
1608
.821
4
1549
.783
1
1591
.825
8
1726
.799
2
1668
.761
6
1612
.819
8
1704
.801
6
1553
.790
6
814.
3799
851.
4317
1296
.618
7
1072
.552
6
1532
.809
8
1442
.703
7
1643
.826
0
1094
.549
9
980.
4749
1760
.860
4
882.
4309
1502
.739
0
913.
4525
1127
.546
1
1355
.659
2
1022
.486
8
1044
.472
5
1403
.698
7
1473
.728
4
1803
.983
9
948.
4916
1887
.006
7
1155
.561
6
1381
.691
9
1001
.436
0
1226
.607
7
1865
.012
8
1264
.617
9
1827
.958
1
1324
.625
0
1190
.572
6
Péptido 4 crudo
Péptido 4 purificado
Péptidos sintetizados
AN Peptide sequence MW mg Yield (%) Quality
ACGGPTQELSALR 1302,4 6 46,1 +
DIAPSEEAINDR 1329,3 0,6 22,6 +
EAQSLVHFQLR 1327,5 1,4 52,7 +
VDGLLHQLTLQSNQR 1721,9 4,1 23,8 +
YISIFYALR 1145,3 2,5 21,8 +
YHSIVTLPR 1085,2 1,2 55,3 +
ACQHAQGIAR 1054,1 0,5 23,7 +
ALQPLEEGEDEEK 1486,6 1,4 47,1 +
ELPPGVEELLNK 1337,6 1,4 52,3 +
HYCTVANPVSR 1246,3 1,4 56,2 +
LFSVPDFVGDACK 1397,6 5,8 41,5 +
CGDYHPEGEAPR 1330,4 1,8 67,6 +
GNTQEDAADGEQR 1390,4 2 71,9 +
IVEEEAQEDLEGLR 1629,7 8,4 51,5 +
TEEAAESQTAGR 1249,3 0,9 36,0 +
ESHVTLASPEETR 1455,5 1,6 55,0 +
SLTLGIEPVSPTSLR 1570 3,3 21,0 +
VPLEPGPK 836 0,4 23,9 +
YGLNELPAEEGK 1319,6 1,1 41,7 +
GAPEGVIDR 913,1 1,2 65,7 +
VDQSILTGESVSVIK 1574,7 0,6 19,1 -
VGEATETALTTLVEK 1561,8 2 12,8 -
O14983
Q58EX7
Q01726
Q14764
Q0VD83
Q6EMK4
AN Peptide sequence MW mg Yield (%) Quality
DGAFAEFLR 1025,3 1,1 53,6 +
ENILFGCQLEEPYYR 1874,2 1,6 42,7 +
HIFENVIGPK 1153,4 0,5 21,7 +
TQFEDCTVLTIAHR 1633,8 3,6 22,0 +
DPDAANSPIR 1055,2 0,4 19,0 +
DTNRPLEPPSEFIVK 1741,9 1,2 34,4 +
LHSDIDSGDGNIK 1370,7 1,4 51,1 +
VEAANVHIDPK 1192,3 1,6 67,1 +/-
CQNILQGNFKPDFYLK 1928,2 3,5 18,2 +
DLVLGPSGVLQGIRPGK 1706,3 3 87,9 +
TSFFLGEVGNAAK 1340,7 1,3 48,5 +
VEQLKPYHAHK 1349,5 1,6 59,3 +
ALAAGADSPK 900,2 1,5 83,3 +
ELLEQNPGK 1027,2 1,4 68,1 +
VALVLLR 783 4,5 57,5 +
DLAEEGVLEEAEFYNITSLIK 2383,6 - 0,0 -
LCQADPDLDSDK 1319,5 0,9 34,1 +
LNVGGTYFLTTR 1341,7 1,3 48,4 +/-
TSQVPVK 757,8 0,4 4,4 +
LAANISGDK 888,2 1,1 61,9 +
LVSLGTCFGK 1024,2 2,3 22,5 +
VYYVSEK 887 0,7 39,5 +
YIGENLQLLVDRPDGTYCFR 2372,6 4,2 17,7 +/-
DPNCSSILQTEER 1491,6 0,1 3,4 +/-
NTLSLVNDFIIR 1404,6 0,1 3,6 +/-
SEVPAIDLAR 1070,3 0,8 37,4 +
STENSAGSQGCDK 1283,4 1,3 50,6 +
P55287
P33527
Q49A26
Q4KMP7
Q9NXV2
Q9Y221
P55259
AN Peptide sequence MW mg Yield (%) Quality
ETGEYR 753,8 0,5 33,2 +
GLLLATK 714,9 2,4 33,6 +
ISLEYSELQDK 1324,6 1,1 41,5 +
VTSAETK 734,8 0,9 61,2 +
AGDAFCR 738,9 1 67,7 +
DCLIEDSDDEAGQS 1496,6 - 0,0 -
EVAFYNR 898,0 1 55,7 +
IPCLLAPSVFK 1187,5 4 33,7 +
LDLVTNK 802,0 1,2 74,8 +
LDSIEAK 646,8 1,2 92,8 +
LQALEATCK 976,1 1 51,2 +
SCCSCCPVGCAK 1159,4 0,2 8,6 -
CAQGCICK 824,3 0,4 24,3 +/-
ATAAPAGAPPQPQDLEFTK 1909,0 1,7 44,5 +
NALANPLYCPDYR 1508,7 1,1 36,5 +
GSNTTSHLHQAVAK 1449,7 1,9 65,5 +
TIAQGNLSNTDVQAAK 1629,8 0,8 24,5 +/-
EILVEESNVQR 1314,7 1,1 41,8 +
CGNVAAILELDEHLQK 1752,9 - -
DFIIFEAAPQETR 1535,8 1,4 45,6 +
VDSPVTVCGDIHGQFYDLK 2092,0 1,7 40,6 +
DAQGLVLFDVTGQVR 1616,9 0,7 21,6 +
LAQDPFPLYPGEVLEK 1814,9 2,2 60,6 +
LFSVPDFVGDACK 1396,7 1,4 50,1 +
IEGEGSVLQAK 1129,6 1,2 53,1 +
Q2VPK5
Q8N9N5
O75150
P02795
P22695
P60510
Q14764
Conclusión
Podemos concluir de estos resultados que nuestro método de síntesis es
apropiado para la producción de un gran número de péptidos en
cantidad y calidad aceptable para su uso en proteómica dirigida.
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