Современные возможности лабораторной диагностики в …

Современные возможности

лабораторной диагностики в

тактике ведения пациента с ВИЧ

1

Семенов А. В., Останкова Ю.В.

ФБУН НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Санкт-Петербург, Россия

2

Актуальность проблемы ВИЧ-инфекции в РФ

По состоянию на 30 июня 2019 г.

- кумулятивное количество зарегистрированных случаев выявления ВИЧ-

инфекции в иммунном блоте среди граждан Российской Федерации

составило 1 376 907 человек (по предварительным данным).

- к концу первого полугодия 2019 г. стране проживало 1 041 040 россиян с

диагнозом ВИЧ-инфекция, исключая 335 867 умерших больных.

- в первом полугодии 2019 г. в Российской Федерации было сообщено,

по предварительным данным, о 47 971 случаях выявления ВИЧ-инфекции

в иммунном блоте.

Справка ВИЧ-инфекция в РФ 2019 г.

ФБУН ЦНИИЭ

- На диспансерном учете - 730 113 инфицированных ВИЧ россиян (69,2% от

числа живущих с диагнозом ВИЧ).

- Впервые взяты на на диспансерное наблюдение - 40 360 пациентов.

- Получали антиретровирусную терапию 472 533 пациента.

- Впервые взяты на АРВТ - 55 152 инфицированных ВИЧ.

- Прервали АРВТ - 18 043 больных.

- Охват лечением составил 44,8% от числа живших с диагнозом ВИЧ-инфекция

(64,7% от числа состоявших на диспансерном наблюдении).

- Вирусная нагрузка была подавлена у 267 177 пациентов (62,1% от числа

больных, прошедших обследование по ее определению).

Пораженность ВИЧ-инфекцией на 30 июня 2019 г.

На 100 тыс. населения

709,2

1904,4 1878,6

1793,9

1474,11426,1

1300,1 1294,1 1288,51237,8 1229,5

1157,9 1129,4

1052,1 1048,31004,6 988,9 976,5 950,7

Справка ВИЧ-инфекция в РФ

в первом полугодии 2019 г.

ФБУН ЦНИИЭ

4

Пути заражения среди впервые выявленных

ВИЧ-инфицированных лиц

58,90%

37,40%

2,60%

75%

Гетеросексуальный контакт

Гомосексуальный контакт

ПИН ПИН 2003

Справка ВИЧ-инфекция в РФ

в первом полугодии 2019 г.

ФБУН ЦНИИЭ

86,70%

26,30%

62,40%

1,10%

21,60%

0,80%

2000 г. 2016 г. 2019 г.

Возрастная структура ВИЧ-инфицированных пациентов в

2000, 2016 и 2019 годах.

Устойчивая

тенденция роста

Устойчивая тенденция

снижения

10,20% 8,10%2,10%

44,40%

21,30%

71,50%

2000 г. 2016 г. 2019 г.

Жизненный цикл ВИЧ

Основные этапы

• стадия слияния (проникновения).

• стадии обратной транскрипции.

• стадии интеграции.

• стадии созревания.

CD4 – клетки:

Т – лимфоциты, Макрофаги,

Дендритные клетки

Корецепторы: CCR5, CXCR4

6

Основные маркеры в лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции до появления

молекулярных методов

4-8 недель несколько лет 2-3 года смерть

антитела к Env ВИЧ

инфицирование

CD4-клетки

Основные маркеры в лабораторной

диагностике ВИЧ-инфекции после

появления молекулярных методов

РНК ВИЧ

ДНК ВИЧ

инфицирование

смерть4-8 недель латентный период 2-3 года

CD4-клетки

антитела к Env ВИЧ

8

Алгоритм скрининговой диагностики ВИЧ-

инфекции*Скрининговая лаборатория

ИФА

ИФА

ИФА

+

-

+

-/+

Референсная лаборатория

* САН ПИН «Профилактика ВИЧ-инфекции» от 11.01.2011г.

ИФА

Тест-система

производителя 2 -

ИФА

Тест-система

производителя 3

- Заключение об

отсутствие АТ/АГ

к ВИЧ

+ иммуноблот

+

Тест-система

производителя 1положительный

сомнительный

отрицательный

Заключение об

отсутствие АТ/АГ

к ВИЧ

ИФА – системы

АГАТ

9

ИФА тест - системы

• КомбиБест ВИЧ-1,2 АГ/АТ (Вектор-Бест)

• ДС-ИФА-ВИЧ-АТ/АГ-СПЕКТР (Диагностические системы)

• VironostikaHIV UniForm II Ag/AB (Organon Teknika)

• Genescreen Plus HIV Ag/Ab (Biorad)

• Murex HIV Ag/Ab combination (Abbott)

• Architect HIV Ag/Ab Combo (Abbott)

10

Иммуноблот (Вестерн-блот)Принцип метода – выявление антител к индивидуальным

антигенам.

GAG (p17,p24,p55)

ENV (gp41,gp120,gp160)

POL (p31,p51,p66)

Интерпретация результатов

согласно критериям ВОЗ1

Отрицательный - отсутствие полос

Положительный – 2ENV+-GAG+-Pol

Неопределенный – наличие полос, сочетание которых не

удовлетворяет положительному результату1 – Справочник заведующего КДЛ, 2009г.

11

Недостатки алгоритма скрининговой

диагностики ВИЧ-инфекции

1. Неэффективность диагностики в период т.н.

«серологического окна».

2. Выявление антител к ВИЧ у всех детей, рожденных от

ВИЧ-инфицированных матерей.

3. Ложноположительные результаты ИФА.

4. Сомнительные результаты иммуноблоттинга.

12

Как развивается

серологическая диагностика?• Определение Аг р24 (сокращение

серологического окна)

• Внедрение хемилюминисценции вместо

колориметрии (значительное повышение

чувствительности)

• Автоматизация анализа (скорость, точность,

специфичность)

13

Что стало с «серологическим окном»?

Murex

ICE HIV

+2

Ortho HIV Ab

Capture

Biotest HIV 1+2

Recombinant

Enzygnost

HIV 1/2 Plus

IMX HIV

1/2 III

Plus

Murex VK84/85

anti-HIV 1/2Innotest

HIV 1/2

Clonesystem

s HIV Detect

v1

Biotest HIV

Tetra

Murex

GE94/95 HIV

1.2.O

Abbott 3rd

Gen Plus

AxSym

HIV 1.2 gpO

Vitros Eci

anti-HIV 1/2

Ран

нее о

пр

ед

ел

ен

ие Р

НК

ВИ

ЧVironostika

HIV Uniform II

Ag/Ab

VIDAS

HIV DUO

Murex HIV

Ag/Ab

Biorad HIV

Plus Ag/Ab

Biorad HIV

Ultra Ag/Ab

Prism HIV

Ag/Ab

Enzygnost HIV

Integral

Access HIV

1/2 New

Biorad

Genscreen

HIV Plus v2

Architect HIV

Ag/Ab combo

AxSym HIV

Ag/Ab

Vironostika HIV

Uniform II plus

O

0 10 15 20

days

14

15

Чувствительность HIV ULTRA Ag/Ab tests

HIV p24 antigen test– Ultra HIV Ag.............. 3 pg/mL HIV p24Ag

HIV Ag-Ab тест и серологическое окно– 4 теста показали чувствительность <20 pg/ mL

– <3 дней разница с PCR HIV RNA• Architect HIV Ag/Ab-Abbott• Vidas HIV Duo ULTRA&Quick Biomerieux• Genscreen HIV Ag-Ab ULTRA-BioRad

Ly Е. et al., 2007

Возможности молекулярно-генетических методов в лабораторной диагностике ВИЧ-

инфекции

Детекция вируса Детекция компонентов

иммунной системы

Выявление РНК ВИЧ

(качественный и количественный

анализ)

Персонализация терапии

(непереносимость абакавира)

Выявление провирусной ДНК

(качественный анализ)

Прогноз скорости развития ВИЧ-

инфекции (защитные аллели)

Определение резистентности

ВИЧ к АРВП

Прогноз риска заражения ВИЧ

Генотипирование ВИЧ Прогноз АРВТ-ассоциированной

гепатотоксичности

16

Основные мишени молекулярной

диагностики вируса

• Выявление РНК ВИЧ (качественный и

количественный вариант)

• Выявление провирусной ДНК ВИЧ

17

Выявление РНК ВИЧ:

Скрининг донорской крови

Выявление ВИЧ-инфекции в период

«серологического окна»

18

На данный момент около 40 стран проводят скрининг

компонентов крови молекулярным тестированием

около 10 стран (в том числе и Россия) внедряют данную

технологию

В САН ПИН «Профилактика ВИЧ-инфекции» от

11.01.2011г.

включено использование молекулярного тестирования

для обследование на ВИЧ-инфекцию

Молекулярное тестирование для

скрининга крови

19

Обследование донорской крови

Выделение нуклеиновых кислот в 1 пробирке

Амплификация нуклеиновых кислот в 1 пробирке

Анализ

Green

HСV

Crimson

HIV-2

Red

BKOYellow

HIV-1

Пятиканальный мультипрайм

«АмплиСенс HCV/HBV/HIV-FL» первая в России тест-система

разработанная специально для лабораторий службы крови,

осуществляющих контроль вирусной безопасности донорской

крови.

Orange

HBV

вариант 1

вариант 2

20

МНОГООБРАЗИЕ ВАРИАНТОВ

ОРГАНИЗАЦИИ ПЦР-ЛАБОРАТОРИИ

Амплификатор

Автоматическая станция

пробоподготовки

Неавтоматизированные (ручные)

методы выделения нуклеиновых кислот

Автоматическая

станция

пулирования

Ручное

пулированиеАвтоматическая

станция

пулирования

Ручное

пулирование

21

Сравнение основных тест-систем,

применяющихся для скрининга донацийСравнение АмплиСенс

HCV/HBV/HIV-FL

Roche TaqScreen

MPX

Ultrio/TIGRIS

Амплификация Одновременная

амплификация РНК

HCV, HIV-1, HIV-2,

ДНК HBV

Одновременная

амплификация РНК

HCV, HIV-1, HIV-2,

ДНК HBV

Одновременная

амплификация

РНК HCV, HIV-1,

ДНК HBV

Детекция Раздельная

детекция по 4/5

каналам

Одновременная

детекция без

дифференциации

Одновременная

детекция без

дифференциации

Оборудование Различное

оборудование

Только закрытая

платформа

Только закрытая

платформа

Чувстви –

тельность

(1000 мл

плазмы)

HIV 35 МЕ/мл 49 МЕ/мл 34 МЕ/мл

HCV 10 МЕ/мл 11 МЕ/мл 9,6 МЕ/мл

HBV 5 МЕ/мл 3,8 МЕ/мл 18 МЕ/мл

Стоимость «Низкая» «Высокая» «Высокая»

22

Повышение чувствительности тест-систем в 10

раз при обнаружении РНК ВИЧ

1 мл

плазмы

крови

24.000 g

1 час, +2-80С

Удаление

супернатанта

Осадок

вирусных

частиц

Лизирующий

буфер

Стандартная

методика

выделения

23

Выявление провирусной ДНК ВИЧ*

• Скрининг детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей

• Ложноположительные результаты ИФА

• Сомнительные результаты иммуноблоттинга

*согласно СанПин от 3.1.5 2826-10 «Профилактика ВИЧ-инфекции»,

11.01.2011г.24

Время назначения тестов по выявлению

ДНК ВИЧ у новорожденных детей

1. До 48 часов жизни ребенка.

2. В возрасте 1-2 месяцев.

3. В возрасте 3-6 месяцев.

25

Результативность выявления ДНК ВИЧ у

ВИЧ-инфицированных детей

(согласно результатам метаанализа*)

Возраст Число детей Чувствительность

2 дня

271

29-46%

2 недели 76-97%

> 1 месяца ~ 100%

* Руководство по использованию антиретровирусных

препаратов у ВИЧ инфицированных детей /www.hivatis.org/

26

Эффективность качественного выявления РНК

и ДНК ВИЧ у пациентов

с установленным диагнозом ВИЧ-инфекция, не

получающих лечения

Ø Из 207 образцов крови от пациентов с ВИЧ-

инфекцией в 11 образцах (5,3%) концентрация

РНК ВИЧ была менее 200 копий/мл;

Ø ДНК ВИЧ была выявлена во всех 207

образцах !

27

Набор реагентов

выявления ДНК ВИЧ в режиме реального времени

Выделение ДНК осуществляется либо в ручном

режиме, либо с использованием станции

NucliSENS easyMag.

Амплификация производится на приборах: Rotor-

Gene 3000/6000, BioRad iQ5, iCycler, Stratagene

Mx3000P, Mx3005, ДНК-технология ДТ-96.

Клинический материал – цельная кровь, сухие

пятна крови.

28

Преимущества сухих пятен крови перед

другими видами клинического материала

• Простота забора материала (минимальная

травматичность во время забора)

• Небольшое количество крови необходимое для

анализа (150-250 мкл)

• Легкость транспортировки (до 4-х недель при

комнатной температуре)

• Легкость хранения (до 6 месяцев при

температуре 2-8 градусов)

WHO/CDS/CSR/EDC/2001.16. Guidelines for using HIV technologies in Surveillance:

Selection, Evaluation, and Implementation - 2009 update

29

Аналитическая чувствительность

набора реагентов ДНК-ВИЧ-FL

Вид

клинического

материала

Комплект для

выделения ДНК

Объем

клинического

материала, мкл

Аналитическая

чувствительность,

ГЭ/мл ДНК ВИЧ-1

Цельная кровь«РИБО-преп»,

«ДНК-сорб-В»

250 100

100 250

Цельная кровьNucliSENS

easyMAG100 1x103

Сухая капля

крови«РИБО-преп»

-

(один круг, d=12 мм)1x103

30

Высокая вариабельность ВИЧ

Тип Вируса Субтип

ВИЧ-1 Группа M

ВИЧ-1 Группа O*

A, B, C, D, E, F, G, H, J

(9 субтипов);

5 субтипов*

ВИЧ-2** A, B, C, D, E, F, G (7 субтипов)**

ВИЧ-1 РекомбинантыB/F, A/F, G/A, B/D, F/B, A/D (URF),

D/A, AE (CRF)

Тест-системы должны выявлять все геноварианты

3131

Распространение генотипов ВИЧ-1 в мире

3232

Причины ложноотрицательных

результатов ПЦР при детекции ДНК

провируса ВИЧ

Неэффективное выявление ряда субтипов ВИЧ;

Низкая концентрация провирусной ДНК;

Лабораторные ошибки.

33

Определение концентрации РНК ВИЧ («вирусной нагрузки»): современные возможности и интерпретация данных

РНК ВИЧ

инфицирование

острая

инфекциялатентный

период

начало

терапии

CD4-клетки

34

Использование тест-систем для определения «вирусной нагрузки» ВИЧ

1. Прогноз ВИЧ-инфекции.

2. Мониторинг эффективности терапии.

35

Риск развития СПИДа в эпоху АРВТ

Результат анализа 13 когортных

исследований

Lancet. 2002 Jul 13;360(9327):119-2936

Показания к назначению

антиретровирусной терапии*

1. Клинические показания• определяются стадией и фазой заболевания

2. Лабораторные показания• количество CD4+ клеток

• Уровень РНК ВИЧ (вирусная нагрузка)

* - Методическое письмо «Показания к назначению лечения больных ВИЧ-инфекцией» от 29.12.2006 г.

37

Начало лечения АРВ препаратами

Абсолютные показания к назначению

антиретровирусной терапии

Клинические – стадия 2В, стадии 4Б и 4В в фазе прогрессирования

Лабораторные – снижение уровня CD4 лимфоцитов менее 0,2 млрд/л

(за исключением пациентов в ст. 2А, 2Б, у которых такой уровень CD4

лимфоцитов является относительным показанием к началу антиретровирусной

терапии).

Относительные показания к назначению

антиретровирусной терапии

Клинические – стадия 4А (независимо от фазы), стадии 4Б и 4В в фазе

ремиссии

Лабораторные –уровень CD4 лимфоцитов от 0,2 до 0,35 млрд/л, РНК ВИЧ

(вирусная нагрузка) более 100 000 копий/мл.

38

Показания к назначению тестов на

«вирусную нагрузку» ВИЧ

1. До начала АРВ терапии каждые 3-4 месяца до момента принятия

решения о начале лечения (в зависимости от стадии заболевания и

количества CD4+ клеток ).

2. После принятия решения о начале АРВ терапии вирусную нагрузку

необходимо определять

перед началом лечения,

через 1 месяц после начала лечения,

затем каждые 3-4 месяца.

3. У беременных ВИЧ-инфицированных женщин за 4 недели до

предполагаемых родов для принятия решения о проведении кесарева

сечения.

39

Наборы реагентов для определения вирусной

нагрузки ВИЧ, представленные в России

Название Формат Производитель

АмплиСенс ВИЧ-Монитор ПЦР +ГИФА ЦНИИ Эпидемиологии

Versant HIV-1 Assay bDNA Bayer

АмплиСенс ВИЧ-Монитор-FRT

Real-Time ПЦР

ЦНИИ Эпидемиологии

АмплиСенс ВИЧ-Монитор-М-FL

ЦНИИ Эпидемиологии

Abbott RealTime HIV-1 Abbott

ВИЧ-ген количественный ДНК-технология

РеалБест РНК ВИЧ Вектор-Бест

40

Цель антиретровирусной терапии максимальное и стойкое подавление репликации вируса

РНК ВИЧ

(копии/мл)

в плазмы

Время (годы), прошедшие с начала АРВ терапии

0 2 4 6 8 10

• Восстановление и сохранение функций иммунной системы

• Повышение качества жизни пациента

•Уменьшение частоты летальных исходов, вызванных ВИЧ-

инфекцией

50 копий/мл

41

p55

p17

LTR LTR

gag

pol

vif

vpr

vpu

env

nef

tat

p24 p7 p6 протеаза

gp160

gp120 gp41ревертаза интеграза

протеины, гликопротеины

Вирусная РНК9 kb

rev

1 2 3 4 5 6 7 8

Гены

Схема строения генома ВИЧ

42

Мишени терапии – регионы для поиска

потенциальных мутаций лекарственной устойчивости

Выборка устойчивых квазиобразцов

Неэффективная АРВ терапия

Неполная вирусная супрессия:

•Несоответственная дозировка

препаратов

• Перерывы в АРВ терапии

• Предсуществующая устойчивость

Ви

русн

ая

нагр

узка

Время

Лекарственно-чувствительные

квазивиды

Лекарственно-устойчивые

квазивиды

Начало лечения

При применении АРВ терапии вирусная нагрузка меньше, чем у человека, не получающего

лечение, даже при наличии резистентности -- АРВ терапия поддерживает остаточную

активность

1000 копий/мл

43

1. возникновение устойчивости ВИЧ к лекарственным

препаратам;

2. низкая активность препарата;

3. неправильный прием препаратов;

4. индивидуальные особенности в фармакокинетике.

Практически во всех случаях неэффективности терапии

развивается устойчивость вируса к применяемым

лекарственным препаратам, являясь либо причиной

либо следствием низкого терапевтического

эффекта.

Причины неэффективности терапии

44

Показания к назначению тестов на

резистентность ВИЧ

Перед началом АРВ терапии

В период острой инфекции, если заражение ВИЧ произошло от

партнера с неэффективной АРВ-терапией.

В остальных случаях острой инфекции проведение исследования до

начала АРВ-терапии не рекомендуется до тех пор, пока уровень

первичной резистентности в регионе не достигнет 5%.

В процессе АРВ терапии

в случае неэффективности АРВ терапии, если нет других явных

причин неэффективности терапии (нарушение приема АРВ

препаратов, нарушение всасывания препарата).

45

Противопоказания к назначению теста на

резистентность ВИЧ

• Показатель вирусной нагрузки меньше

чувствительности используемого теста по определению

резистентности (~1000 копий/мл).

• После отмены препарата, т.к. штаммы

обуславливающие резистентность могут стать

минорными и поэтому не будут выявляться

существующими тестами.

46

Методы определения резистентности ВИЧ к

АРВ препаратам

• Генотипический

Выявляет присутствие мутаций, для которых описана связь с развитием резистентности

Секвенирование Гибридизация

(Abbott) -на мембране (Innogenetics)

(ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии) -на биочипах (Affimetrix)

• Фенотипический

Определяет количество препарата, необходимое для ингибирования роста вируса на культуре клеток

47

Тест-системы для выявления

мутаций резистентности ВИЧ к АРВТ

(на основе метода секвенирования)

Название Фирма Анализируемые гены

Trugene HIV1 genotyping kit

and open gene sequencing

system

SiemensОбратная транскриптаза,

протеаза

Viroseq HIV-1

Genotyping SystemAbbott

Обратная транскриптаза,

протеаза

«АмплиСенс-HIV-resist-Seq»ЦНИИ

эпидемиологии

Обратная транскриптаза,

протеаза,

интеграза,

V3-петля гена белка

оболочки

48

Экстракция РНКОбратная

транскрипция

1-й этап ПЦР (с «внешними» праймерами)

2-й этап ПЦР (с «внутренними»

праймерами)

Оценка ПЦР (чистота и концентрация фрагментов)

Очищение продуктов ПЦР

Секвенирующаяреакция

Очищение продуктов секвенирующей

реакции

Секвенирование«Сборка»

отсеквенированныхфрагментов

Анализ полученных нуклеотидных

последовательностей

Основные этапы анализа на резистентность

ВИЧ к антиретровирусным препаратам

50

51

Полный отчет

52

NCBI Genotyping

Генотипирование (оценка рекомбинации) в

онлайн-инструментах

REGA HIV Subtiping tool

Новый класс АРВ-препаратов –

ингибиторы CCR5

• Препятствуют присоединению вирусной частицы

к клетке путем блокирования CCR5-корецептора

• Эффективны только против CCR5-тропных

вариантов ВИЧ

• Не должны назначаться пациентам с CXCR4-

тропными вариантами ВИЧ или вирусами,

имеющими двойную тропность (R5X4)

54

Определение тропизма ВИЧ

• V3 петля является основным фактором, определяющим

тропизм ВИЧ

• Длина V3 петли обычно около 35 аминокислот

• Для определения тропизма необходим анализ

нуклеотидной последовательности в интернете

(www.geno2pheno.org)

• Результаты анализа показывают какой тип корецептора

использует исследуемый вариант ВИЧ

55

56

Определение тропизма ВИЧ

Only the CCR5-coreceptor can be

used. CCR5-antagonists like Maraviroc

(Celsentri/Selzentry) could work.

The CXCR4-coreceptor can be used.

CCR5-antagonists like Maraviroc

(Celsentri/Selzentry) should not be

administered!

Возможности молекулярно-биологических методов в лабораторной диагностике ВИЧ-инфекции

Детекция вируса Детекция компонентов

иммунной системы

Выявление РНК ВИЧ

(качественный и количественный

анализ)

Персонализация терапии

(непереносимость абакавира)

Выявление провирусной ДНК

(качественный анализ)

Прогноз прогрессирования ВИЧ-

инфекции (защитные аллели)

Определение резистентности

ВИЧ к АРВП

Прогноз риска заражения ВИЧ

Генотипирование ВИЧ Прогноз АРВТ-ассоциированной

гепатотоксичности

Персонализация противовирусной терапии: Абакавир и аллель HLA-В*5701

• У 5-8% пациентов, получающих лечение

абакавиром, развивается аллергическая реакция

гиперчувствительности в течение 6 недель после

начала терапии

• Установлена значимую ассоциацию аллели 5701

гена В главного комплекса гистосовместимости 1

класса (HLA B) и РГЧ (Mallal et al, Lancet, 2002)

• Исследования на Т-клетках показали, что аллель

HLA-В*5701 является не только генетическим

маркером, ассоциированным с непереносимостью

препарата, а также фактором причинности

аллергической гиперчувствительности (Chessman,

Immunity, 2008)58

США (афроаме-

риканцы) ~2.5%

Индия 5-20%

Япония 0%

Китай 0%(2.5% CВ-

регионы)

Великобритания

~8%

Ближний Восток 1-2%

(5-7% Ashkenazi Jews)

Австралия ~8%

США (белые)

~8%

США

(азиаты)

~1%

Западная Европа 5-7%

Таиланд 4-10%*

*THAILAND B*57 carriage:

Urban Bangkok 3.6%

Thai Dai Lue (NE Thai)

~11%

Southern Thai Muslim 3%

Средиземноморье 1-

2%

Южная

Америка

(белые)

5-7%

США

(мексиканцы)

~2%Африка к югу от

Сахары

<1%

Распространенность аллели HLA-B*5701 в мире…

Nolan et al, J HIV Ther 2003; 8(2):36-4159

Подбор стратегии: простота vs специфичность

Вариант

Число

дискриминирую

щих позиций

Число ПЦР-

амплиф-ий

(пробирок)

на пробу

Отсекается

аллелей

Выявляется

совместно с

В*5701

1 2 основных 1 109211 (в т.ч. 2 не

В*57 группы)*

2 3 основных 2 1095 8

33 основных + 2

дополнительных3 1099 4

n3 основных + 5

дополнительных7 1103 0

Экзон 2 Экзон 3

Позиции, отличающие В*5701 от других аллелей

* - низкая распространенность 60

Результаты тестирования панели с образцами ДНК,

содержащая аллели: 08**, 0801, 15**, 1502, 25**, 27**, 3701, 40**,

4001, 4201, 44**, 4403, 51**, 5101, 5301, 55**, 5701, 5703, 5704, 5801,

61**.

Интерпретация результатов

• Дизайн и условия реакции реализованы таким образом, чтобы интерпретация была однозначной:

– Есть флуоресцентная кривая – присутствует В*5701 (или одна

из редких аллелей, не дифференцируемых методом)

– Нет кривой – отсутствует В*5701 61

• В исследовании участвовало 1956 ВИЧ-

инфицированных пациентов.

Выявлено, что 109 из 1956 (5,6%) – носители аллели

B*5701.

• Реакция гиперчувствительности обнаружена в:

1,4% в группе, подвергшейся скринингу,

7,8% в контрольной группе.

Результат клинического применения теста в PREDICT-1 study

(Mallal et al, N Engl J Med, 2008)

62

Ген Продукт Экспрессия Лиганды Функция

CCR 5 CC-

хемокинов

ый

рецептор

CCR5

дендритные клетки,

макрофаги, Th1-клетки,

T-клетки памяти,

активированных Т

лимфоцитах, в

эндотелиальных клетках,

гладкомышечных клетках

сосудов, фибробластах

RANTES,

MIP-1α,

MIP-1β

Активация

хемотаксиса

лимфоцитов

к источнику

лиганда

Рецептор CCR5

Мембрана клеткиРецептор CCR5

63

Прогноз риска заражения ВИЧ

Дополнительная функция CCR5 –проникновение ВИЧ в клетку

•CCR5 (как и CXCR4) является

ко-рецептором ВИЧ-1.

•Функция – усиление связи

вируса с плазматической

мембраной CD4+ T клеток.

•Взаимодействие

поверхностного гликопротеина

вируса gp120 и рецептора ССR5

необходимо для проникновения

вируса в клетку.

64

Мутация CCR5del32

Резистентность к ВИЧ-инфекции связана с полиморфизмом

CCR5∆32 (rs333, частота минорного аллеля 0,09) – делецией

32 пар оснований в гене CCR5.

Эффект мутации:

1. сдвиг рамки считывания белка;

2. преждевременное терминирование трансляции;

3. отсутствие трех из семи трансмембранных доменов и

участка связывания G-белка;

4. потеря мембранной локализации, невозможность

участвовать в слиянии мембран и в сигнальной трансдукции

65

Клинические проявления CCR5del32

• Аллель CCR5∆32 приводит к полной или частичной

резистентности к ВИЧ-инфекции.

• Среди европеоидов, инфицированных ВИЧ-1, не

обнаружено гомозигот по мутантному аллелю

CCR5∆32, а частота гетерозигот на 35% ниже, чем в

здоровой популяции.

• Частота гетерозиготного генотипа значительно

повышена в подгруппе пациентов, живущих более 10

лет с момента инфицирования.

• Прогрессия заболевания происходит значительно

медленнее у носителей гетерозиготного генотипа по

сравнению с носителями гомозиготного генотипа по

нормальному аллелю.

66

Определение CCR5del32

• Метод – пиросеквенирование

• Прибор – Pyromark Q24 (Qiagen)

wt/wt

del32/wt

del32/del32

67

Влияние носительства CCR5del32 на развитие ВИЧ-инфекции

• Снижение риска инфицирования

ВИЧ (в т.ч. в дискордантных

парах) от 25 до 50% (Mulherin S

et al., 2003; Klein R.S., 2008 et al.)

• Снижение скорости

прогрессирования ВИЧ-

инфекции в СПИД (30% - Hutter

G. et al., 2013)

• Замедление прогрессирования

терминальной стадии СПИД

(40% - Kulkarni H. et al., 2008) 68

Что еще может замедлить развитие ВИЧ-инфекции?

• Аллели CCR2 64I, CCR5∆32 и SDF1-3'А, VDR

снижают вероятность развития и интенсивность

прогрессии СПИДа у ВИЧ-инфицированных.

• У инфицированных пациентов без проявления

СПИДа через 16 лет после инфицирования ВИЧ-1

аллель CCR2 64I или мутантный CCR5∆32

присутствуют в 28-29% случаев.

• Доля лиц, несущих хотя бы один из трех

протективных аллелей, составяет 28% для удмуртов,

23% для татар, 15% для тувинцев и 40% для русских.

69

CCR2 64I – перспективный маркер

замедленного развития ВИЧ-инфекции

CCR2 преимущественно отвечает за специфический

хемотаксис моноцитов под влиянием MCP-1 (CCL2). Рецептор

представлен димером молекул CCR2, сопряжённых с

гетеротримерным G-протеином. CCR2 задействован в

проникновении моноцитов в очаг воспаления.

Выявлено несколько

генетических вариантов гена CCR2.

Мутация CCR2-64I

представляет собой замену валина

на изолейцин в положении 64

первого трансмембранного домена

рецептора. Она является ВИЧ-

протективной, так как уменьшает

шанс проникновения ВИЧ в клетку и

приводит к задержке развития СПИД

71

VDR – перспективный маркер

За счет повышенной реакции на витамин D3

рецептора VDR при мутации rs1544410_AA

приводит к замедлению прогрессирования СПИДа

и повышает устойчивость к заражению ВИЧ.

RS11568820 (VDR)

RS11574143 (VDR)

RS1540339 (VDR)

RS1544410 (VDR)

RS2107301 (VDR)

RS2228570 (VDR)

RS2238136 (VDR)

RS2239182 (VDR)

RS2239185 (VDR)

RS2239186 (VDR)

RS3782905 (VDR)

RS3819545 (VDR)

RS4516035 (VDR)

RS7041 (VDR)

RS731236 (VDR)

RS757343 (VDR)

RS7975232 (VDR)

Показана ассоциация аллеля VDR rs2228570 Т с

более низкой картиной прогрессирования СПИДа

у ВИЧ-инфицированных пациентов, не

получавших АРВТ (OR = 0,75; p = 0,009).

Генотип rs11568820 СС связан с

иммунологической недостаточностью у ВИЧ-

инфицированных пациентов с АРВТ.

72

Прогноз АРВТ-гепатотоксичности?

Сочетание GSTM1_0/0 GSTT1_0/0 ассоциировано с риском

развития гепатотоксичности с прогрессирующей стадией (CD4 <200)

ВИЧ-инфекции у ВИЧ-инфицированных (P = 0,004, OR = 2,67).

Описана ассоциация генотипа GSTM1_0/0 с развитием синдрома Стивенса-

Джонсона и токсического эпидермального некролиза у ВИЧ-инфицированных

лиц при использовании невирапина (OR = 2,94, P = 0,027).

Ciccacci C. et al, 2017

Расширяя горизонты

Уже сейчас возможно, применяя тест-системы и

оборудование зарегистрированные в РФ:

1. Спрогнозировать риск передачи ВИЧ в дискордантных

парах.

2. Оценить скорость прогрессирования заболевания у

носителей защитных аллелей.

3. Провести доказательное молекулярно-

эпидемиологическое расследование с выявлением

источника заражения.

74

Спасибо за внимание!

nwaids@pasteurorg.ru