spectroscopie rmn appliquée aux...
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08/10/2010
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Spectroscopie RMN appliquée aux protéines
Attribution et informations structurales
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RMN 1D�2D�3D�4D…
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De la 1D à la 2D
1D
ns foisns= nombre de scans
augmentation du rapport signal sur bruit (S/N) : S/N = k* √ns
on augmente le temps d’expérience d’un facteur 4 (ns*4) � S/N augmente d’un facteur 2
2D
x ns
permet le retour à l’équilibre de l’aimantation des noyaux
entre 2 scans
t2
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RMN 2D
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3
50
Temps de mélange (mixing time, en ms)
51
Principe d’une expérience 2D homonucléaire basée sur un transfert d’aimantation
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4
52
Spectroscopie de corrélation…
…scalaire (COSY, TOCSY) …dipolaire (NOESY, ROESY)
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COSY et TOCSY : couplages scalaires
� COSY : couplages homonucléaires 1H-1H
� 3J (3 liaisons chimiques)
� TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H
� 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)
O
NH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
NH2
α
β γ
δε
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54
COSY et TOCSY : couplages scalaires
� COSY : couplages homonucléaires 1H-1H
� 3J (3 liaisons chimiques)
� TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H
� 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)
α
β γ
δε
3J4J
5J6J
Couplages H N-Hαααα, HN-Hββββ, HN-Hγγγγ…
Couplages entre protons aliphatiques
1H
1H
O
NH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
NH2
55
O
NH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
NH2
COSY et TOCSY : couplages scalaires
� tables des valeurs δ HN, Hα, Hβ, Hγ, Hδ, Hε,… :
� peptides non structurés GGXGG
� moyennes de l’ensemble des protéines répertoriées dans la BioMagResBank (BRMB)
α
β γ
δε
Couplages H N-Hββββ, HN-Hγγγγ…TOCSY
COSY
Couplages H N-Hαααα
� identification d’un type de résidu
1H
1H
3J
4J 5J
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Nuclear Overhauser Effect spectroscopy : couplages dipolaires
� NOESY : pas adapté aux molécules de masse moléculaire de 800 – 1500 Da (NOE ≈ 0)
� ROESY : signaux moins intenses mais toujours ≠0
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NOESY/ROESY : couplages dipolaires
molécule MW 334 Da
• pics diagonaux : intensité < 0
• pics de corrélation : intensité > 0
phase des signaux avec une diagonale négative :
Icross : proportionnelle à 1/r 6 où r est la distance entre 2 noyaux
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Des couplages dipolaires à la structure tridimensionnelle
1H
1H
conformation étendue
attribution de toutes les résonances 1H
+ interprétation des distances 1H-1H
(contraintes NOEs)
ensemble de structures 3D
NOESY
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Des couplages dipolaires à la structure tridimensionnelle
Entrée: table des distances de ville à ville
Pour la RMNEntrée: Sortie:
table des distances interprotons s tructure de la molecule
Sortie : carte des Etats-Unis
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NOESY : couplages dipolaires
� NOESY : couplages homonucléaires 1H-1H
� protons proches dans l’espace (d< 5-6 Å)
� ne passent pas nécessairement par les liaisons chimiques
1H
1H
Couplages HN-HN
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Domaine WW : distances < 2 Å
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Domaine WW : distances < 5 Å
65
Interprétation du NOESY
1H
1H > 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å
� 10 000 contacts NOEs ?
environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour
une protéine de 40 aa!
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Interprétation du NOESY
ensemble de conformères possibles, répondant aux contraintes expérimentales
> 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å
� 10 000 contacts NOEs ?
environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour
une protéine de 40 aa!
trop peu de contacts NOEs pour établir une structure
unique
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Solvant
Rôle du solvant :
• solubilisation des composés / résolution des signaux
• lock et shim (deutération totale ou partielle)
� mais signaux intenses car [1H de H2O] = 111 M (1.11 M si 1% H2O)
� [protéine] = 10 µM – 1 mM
� éliminer les signaux du solvant qui peuvent gêner l’acquisition :
• signaux résiduels de solvant protoné quand on travaille en solvant deutéré
• signaux du solvant quand on travaille en solvant protoné (par ex. H2O pour l’étude des protéines)
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Largeur de raie de l’eau
� radiation damping : la forte magnétisation du signal de l’eau induit des courants dans la bobine du spectromètre RMN qui génèrent des champs magnétiques qui affectent la largeur des raies
� dépend de la quantité d’eau, de l’accord de la sonde, de la force du champ magnétique B0, …
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Spectres RMN d’une protéine-modèle, l’ubiquitine
H2O
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Spectres RMN d’une protéine-modèle, l’ubiquitine
‘irradiation’ du signal de l’eau
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Spectres RMN d’une protéine-modèle, l’ubiquitine
les protons échangeables ne sont plus visibles
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Suppression des signaux du solvant
Watergate
WET (rectangular pulses)
WET (shape pulses)
700 Hz soit 1.4 ppm @ 500 MHz
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Expérience 2D hétéronucléaire (1H-15N ou 1H-13C HSQC) avec détection en proton
détection en proton car le proton est le
noyau le plus sensible
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Corrélations hétéronucléaires 15N-1H (13C-1H) HSQC
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Qu’est-ce qu’une irradiation sélective ?
différences entre les spectres avec et sans
irradiation
spectre de(s) fréquence(s) excitée(s)
impulsion sélective : durée longue, puissance faible
≠ impulsion 90°(large gamme de fréquences excitées) : impu lsion courte, forte puissance
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Découplage
HC-(CH2CH3)3
HC-(CH2CH3)3HC-(CH2CH3)3
HC-(CH2CH3)3
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RMN 13C : découplage proton
CH3I
quadruplet : 1 3 3 1
découplage
singulet : 1+3+3+1=8
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Corrélations hétéronucléaires 15N-1H (13C-1H) HSQC
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Corrélations hétéronucléaires 15N-1H (13C-1H) HSQC
découplage de X durant le temps d’acquisition de A
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découplage de X durant le temps d’acquisition de A
découplage de A durant le temps d’évolution
Corrélations hétéronucléaires 15N-1H (13C-1H) HSQC
pic de corrélation (δA, δX)
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Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 15N-1H HSQC
1H (ppm)
15N (ppm)
� The 1H-15N HSQC� 2D proton-nitrogen correlation spectrum
� One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
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Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 15N-1H HSQC
1H (ppm)
15N (ppm)
� The 1H-15N HSQC� 2D proton-nitrogen correlation spectrum
� One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
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Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 15N-1H HSQC
1H (ppm)
15N (ppm)
� The 1H-15N HSQC� 2D proton-nitrogen correlation spectrum
� One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
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Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 15N-1H HSQC
1H (ppm)
15N (ppm)
� The 1H-15N HSQC� 2D proton-nitrogen correlation spectrum
� One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
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Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 15N-1H HSQC
1H (ppm)
15N (ppm)
� The 1H-15N HSQC� 2D proton-nitrogen correlation spectrum
� One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
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Expériences 3D : 15N-HSQC-NOESY (1H-1H) et 15N-HSQC-TOCSY (1H-1H) ou HNCA (1H/15N/13C)
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RMN des protéines
� RMN 2D : 2e dimension = 1H ou 15N ou 13C
� enrichissement des protéines en 15N et/ou 13C : isotopes stables, non radioactifs!
� par exemple : détection des couples 15N-1H dans les protéines (tous les NH du squelette + ceux présents dans les chaînes latérales)
� deux 1H qui auraient la même fréquence de résonance proton peuvent avoir deux fréquences de résonances 15N différentes
% 1H 99,9885
% 2H 0,0115
% 3H 0
% 12C 98,93
% 13C 1,07
% 14C 0
% 14N 99,632
% 15N 0,368
ν 1H1H
15N
ν (1H)
ν1 (15N)
ν2 (15N)
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1H
15N
ν (1H)
ν1 (15N)
ν2 (15N)
1H
15N
15N-1H HSQC : identification de tous couples 15N-1H d’une protéine
NH
O
R
NH
O
R
NH
O
RH H
H
ii+1
RMN des protéines
89
Attribution des spectres RMN
1H
15N
attribution = identifier à quel atome correspond quel signal
NH
O
R
NH
O
R
NH
O
RH H
H
ii+1
?
?
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RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
1H13C
15N
plan HSQC
. . .. .. .. . ...
. ...
.. ..
. ...
15N
91
1H
15N
RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
15N
i-1 i
extraction d’un plan 13C-1H
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1H
15N
13C
RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
15N
extraction d’un plan 13C-1H
1H
13C
� signaux intenses : Cα , Cβ du résidu i
� signaux moins intenses : Cα , Cβ du résidu i-1
HNCACB
i-1 i
2009 Structures des protéines – MO293
RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
1H
15N
13C
Cα (i)
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cβ (i)
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RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
(Cα i, Cβ i) � i = Gln (Q)
(Cα i-1, Cβ i-1) � i-1 = Ser (S)
� paire Ser-Gln (SQ)
� séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq 33werpsgns
1H
13C
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Q
S
Cα (i)
Cβ (i)
Q33
95
RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
1H
15N
13C
Cα (i)
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cβ (i)
Q33
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96
RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
(Cα i, Cβ i) � i = Gln (Q)
(Cα i-1, Cβ i-1) � i-1 = Ser (S)
� paire Ser-Gln (SQ)
� séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq 33werpsgns
1H
13C
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cα (i)
Cβ (i)
Q
S
A
Cα (i)
Cβ (i)
Q33 S32
2009 Structures des protéines – MO297
Cα (i-1)
Cβ (i)
Cα (i)
Cβ (i-1)
S32
RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine
1H
15N
13C
Q33
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