Šta je sve neophodno za ispitivanje jednog signalnog puta???

Odabrati model sistem (npr. Leydig-ove ćelije testisa pacova)

Odabrati signalni put od interesa i sakupiti dovoljno literaturnih podataka o njegovim komponentama

Koju ćemo osobinu i/ili funkciju odabranog model sistema da posmatramo pod uticajem datog signalnog puta (npr. uticaj NO-cGMP puta na biosintezu testosterona).

Krenuti od genske ekspresije datog signalnog puta (ako se geni za komponente nekog signalnog puta ekspresuju u odabranoj ćeliji, zasigurno imaju i FUNKCIJU... Koju?)

METODE: izolacija DNK i RNK RT-PCR RQ-PCR agarozna elektroforeza...

Ekspresija proteina (za komponente signalnog puta ILI proteine na koje dati signalni put eventualno ostvaruje svoj uticaj)

METODE: liza ćelija i izolacija proteinaBradfordova metoda imunoprecipitacija SDS-PAGE elektroforeza Western blotting

Ispitivanje nivoa sekrecije hormona ili sekundarnih glasnika, od strane ćelija gajenih u primarnoj kulturi

METODE:RIA za merenje nivoa hormona (T+DHT, PROG i

E2)ELISA komercijalni kit za odredjivanje nivoa

produkcije cAMP-a i cGMP-a

Priprema ogledaAutoklavirati sisteme za filtriranje medijuma i

boce za čuvanje medijumaNapraviti medijume po standardnoj recepturi i

profiltrirati ih kroz prethodno autoklavirane sisteme za filtriranje (sve se izvodi u strogo sterilnim uslovima, u vertikalnom laminaru (hood-u)). Do početka ogleda ovako sterilisane rastvore čuvati u frižideru, a pred početak ogleda izvaditi ih da se temperiraju na sobnoj temperaturi (kako se ćelije ne bi „stresirale“ od hladnoće).

U hood postaviti svo plastično posudje, mrežice i ostalo što nam je potrebno za sutrašnji eksperiment. Uključiti UV lampu u hood-u!

Uključiti UV lampu, koja steriliše čitavu prostoriju u kojoj će se izvoditi ogled.

DOPUNJAVANJE FALKONA OD 50ml MEDIJUMOM (ISPIRANJE)

CENTRIFUGIRANJERESUSPENDOVANJE TALOGA U MEDIJUMU BROJANJE PURIFIKOVANIH LC

SAĐENJE STIMULACIJA