strukturális genomika
Post on 02-Jan-2016
37 Views
Preview:
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Strukturális genomikaStrukturális genomikaGyakorlati feladatok
SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk
SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk
SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk
SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk
SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk
SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk
SNP-k és vizsgálatukSNP-k és vizsgálatuk
Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA
(wt)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA
(m)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC
TGA
Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA
(wt)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC
TGA
(m)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC
TGA
Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA
(wt)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC
TGA
(m)◦ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC
TGA
Tervezzünk primerpárt!
Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA
(wt)◦
5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’
(m)◦
5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’
Hány primerre lesz szükségünk?
Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA
(wt)◦
5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’
(m)◦
5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’
Hány primerre lesz szükségünk?
3
Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA
(wt)
◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’
(m)
◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .………… ATA CAT GCA TCG ACT5’
Allél specifikus amplifikáció - ASAAllél specifikus amplifikáció - ASA
(wt)
◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAT ……………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATA .…………….. ATA CAT GCA TCG ACT5’
(m)
◦5’ CGT AGT CCT TGA AGC TAC ………… TAT GTA CGT AGC TGA3’
◦ 3’GCA TCA GGA ACT TCG ATG .………… ATA CAT GCA TCG ACT5’
Primer tervezés programmalPrimer tervezés programmal
FAST PCR
Ellenőrzés: MultAlin◦ www.multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html
Reverz primer ellenőrzéséhez◦ www.bioinformatics.org/SMS/rev_comp.html
Emésztés RE-velEmésztés RE-vel
(wt) CGT AAT GAA TTC AGT TGC
EcoRI akcióban
SNP van az RE helyenSNP van az RE helyen
(m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC
EcoRI akcióban
Emésztés RE-velEmésztés RE-vel
(m) CGT AAT GAA CTC AGT TGC
EcoRI akcióban
GélelektroforézisGélelektroforézis
GélelektroforézisGélelektroforézis
m wt
ESE ESE
Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben
Exon 1Exon 2
Exon 3
ESE ESE
Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben
Mi történik az RNS érés során? És mi történne, ha nem lenne mutáció?
Exon 1Exon 2
Exon 3
ESE ESE
Mutáció az MLH1 gén 3. exon 5’ végén az ESE-ben
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Exon 1 Exon 2 Exon 3
Kromoszóma séta PCR-ralKromoszóma séta PCR-ral
5 tagú DNS könyvtár (mi a DNS könyvtár?)
Állítsuk sorba a tagjait (mi a módszer alapja?)
◦AGT TGA ………GCT CGT GAA◦GTA CGT AGT ….CGT TGC CGT◦GTG AAT…..CGT AGT ◦TAG TAG CTT…..CTG TAC GTA◦CGT ATG ….TGA AGT
1 2 3 4 5 6
2.: ligálás plazmid vektorba1.: emésztés restrikciós endonukleázzal
1
2 53 4 6
1
2 5
3
4
6
Genomkönyvtár készítésGenomkönyvtár készítés
Genomkönyvtár készítésGenomkönyvtár készítés
3.: transzformáció Escherichia coli-ba
3
1
2
4
5
6
3
1
2
4
5
6
2.: ligálás plazmid vektorba
Sanger-módszerSanger-módszer
Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról?Melyik DNS band melyik szekvenciával
azonosítható?
n A C G T10987654321
GGCCAGGCCATCGTTGA
GGCGGCCGGCCATC
GGCCATCGGGCCATCGTTG
GGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTT
Sanger-módszerSanger-módszer
Milyen sorrend olvasható le a gélfotóról?Melyik DNS band melyik szekvenciával
azonosítható?
n A C G T10987654321
GGCCAGGCCATCGTTGA
GGCGGCCGGCCATC
GGCCATCGGGCCATCGTTG
GGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTT
A3’GTTGCTACC5’
Sanger-módszerSanger-módszer
A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje?
n A C G TA3’GTTGCTACC5’
10987654321
A leolvasott szekvencia alapján mi a templát DNS bázissorrendje?
GGTAGCAACT
Sanger-módszerSanger-módszer
n A C G TA3’GTTGCTACC5’
10987654321
PiroszekvenálásPiroszekvenálás
A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok?
Mi a templát DNS bázissorrendje?
PiroszekvenálásPiroszekvenálás
A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A
Mi a templát DNS bázissorrendje?
PiroszekvenálásPiroszekvenálás
A pirogram alapján milyen sorrendben követték egymást a nukleotidok? G C T A
Mi a templát DNS bázissorrendje?CGTCCGGA
KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással
KRAS onkogén 12p12
RAS család tagja, GTPáz
21kD-s fehérjét kódol (p21ras, vagy K-Ras)
K-Ras funkció: molekuláris kapcsoló
◦intracelluláris jelutak szabályozása◦pl: EGFR közvetítette jelátvitel során „downstream” jelátviteli
affektor.
KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással
A KRAS gén
BIOMARKERJelzi, hogy hogyan fognak reagálni a
betegek a kezelésreSzabályozza egyes fehérjék működését
befolyásolja a sejt túlélését, a daganat érképzését, az áttétképződési folyamatot.
KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással
KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással
• Mutáció a KRAS génben -> folyamatosan aktív K-Ras protein -> szabályozatlan sejtosztódás -> számos rák alapja • Leggyakoribb mutációk:12., 13., 61. kodon
KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással
KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással
KRASKRAS gén analízis gén analízis piroszekvenálássalpiroszekvenálással
top related