td noyau, chromatine, chromosome, caryotype (s. … · pollard td, earnshaw wc, ... cellule...
Post on 16-Sep-2018
228 Views
Preview:
TRANSCRIPT
NOYAU
Caractéristique des cellules eucaryotes +++
- Limité par l’enveloppe nucléaire (2 membranes: interne et externe)
- Contient presque la totalité de l’information génétique (le génome nucléaire)
L’ enveloppe nucléaire: délimite le noyau
Pollard TD, Earnshaw WC, Biologie Cellulaire , Ed Elsevier Microscopie électronique: 1ères études ∼1950
chromatine
L’enveloppe nucléaire
Description:
Enveloppe constituée de 2 membranes :- membrane externe: en continuité avec le RER- membrane interne- espace périnucléaire Membrane
externe
Membrane interne
Enveloppe nucléaire Réticulum
Endoplasmique
Lumière du RE
Espace périnucléaire
Lamina nucléaire
Pore nucléaire
ribosome
L’espace périnucléaire
Espace en continuité avec la lumière du RE:- contenu similaire- stockage du calcium
Percée par les pores nucléaires
Interface entre le cytosquelette (cytosol) et le nucléosquelette (nucléoplasme)
Transport nucléo-cytoplasmique:
Via les pores nucléaires
- Pores nucléaires: seule voie de communication entre le noyau et le cytoplasme
- Passage dans les 2 sens; notion de sélectivité
- Passage de petites molécules, ions
Protéines
ARNm, ARNt, ARNr
ribonucléoprotéines, particules ribosomales…
- Protéines constituant le pore nucléaire: les Nucléoporines (Nup)
Nucléoporines (Nup) : ~ 30 connues~ 450 protéines en tout (par pore)
Molécules de taille variable!
Remarque: Pore nucléaire → Asymétrique, déformable
Les pores nucléaires
16 bras radiaires (2x8)
16 filaments (8 cytosoliques et 8 filaments de cage)
Fahrenkrog and Aebi; Nat Rev Mol Cell Biol 2003, 4: 757
Structure 3D des pores nucléaires
Microscopie electronique, cryofracture
8 unités répétées
Les éléments du transport nucléo-cytoplasmique
- Signaux d’adressage sur la protéine (cargo) à transporter (NLS, NES, NRS)
- Importines, exportines: Récepteurs de transport
-Les Nucléoporines:
-Système Ran GTP / GDP → orientation du transport à travers le pore
Transport à travers le pore nucléaire dans les 2 sensÉlément transporté = cargo
Nucléoporines contenant des séquences répétées riches en phénylalanine / gly (30%):
Domaine FG ( Ex: motif FXFG)
Séquences de reconnaissance pour les Importines / ExportinesInterviennent dans le transport à travers le pore nucléaire → sélectivité du pore!
Signaux d’adressage: se comportent de manière auton ome!-NLS « classique » (Nuclear Localisation Signal), riche en aa basiques (K, R)-NES (Nuclear Exportation Signal)-NRS (Nuclear Retention Signal)
Translocation des protéines cargo sous forme repliées (≠≠≠≠ mitochondrie / peroxysome)
Masquage/démasquage des signaux d’adressage par par tenaires d’interaction
REM: 40% des protéines nucléaires n’ont pas de NLS classique
Les signaux d’adressage nucléaires
GEF
GTPGDP
PiGAP
GDPGTP
RanRan
GAP: GTPase-Activating Protéin
GEF: Guanine –nucleotide
Exchange Factor
Le système Ran → orientation du transport NC
Ran = GTPase
Echange
Hydrolyse
• Disposition asymétrique des régulateurs GEF et GAP de part et d’autre de la membrane nucléaire:
GEF / GAP
noyau / cytosol
• Existence d’un gradient Ran.GTP / Ran. GDP entre le noyau et le cytoplasme
Le système Ran
Ran GDP Cytosol
Ran GTP
NoyauRan GDP
Ran GTP
Extrémité amino-terminale de la nucléoporine Nup 153
Extrémité C-terminale de la nucléoporine Nup 153 contenant le domaine FG
Fahrenkrog and Aebi (october 2003) 4: 757
Les Nucléoporines avec domaine FG: exemple de Nup 1 53
Extrémité flexible
Fixe importines / exportine
QCM 3
Méthodologies:
production de protéines «recombinantes »
Bactérie
Cellule eucaryote
purifiée
ADN
Protéine rec.
LysatWestern blot
IP…
Protéine rec.
Méthodologies: Interactions Antigène-Anticorps
- Western-blot
Gel d’électrophorèse
+
- Immuno-précipitation Billes de résine
Lysat
(protéines)
TAGprotéineAnticorps anti-TAG
- TAG TAG = FLAG, Histidine6, GST…
Lysat
(protéines)
Anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt
Méthodologies: Interactions protéine-protéine
- « Pull –down » → Protéines purifiées ou domaines protéiques
- Immuno-précipitation → Protéines produites dans la cellule
Importine αFLAG
FLAG
Importine αFLAG
FLAG
lysat
CP
Histidine6 (His)
Bactérie Cellules HEK293
purifiée
Billes de résine
Figure 2A
CP
His
Anti-Histag
Importine α (1 ou 2 ou 3 ou 4)
FLAG
FLAG
Cellules HEK293
lysat
?CP
Imp αααα
Western-blot anti FLAG
Western blot anti-Histag /
Western-blot anti FLAG
Figure 2A
Billes de résine
CP
Billes de résine
Billes de résine
Imp αααα
Pull downFLAG-imp αααα + CP
Le recyclage des importines :
cytosol
nucléoplasme
RanGTP
exportine
Imp. αααα
RanGTP
exportine
Imp. αααα
RanGAP
RanGDP
exportine
Imp. αααα
! Imp. αααα a un signal NES
≠ export direct de l’importine ββββ – Ran GTP sans exportine
Hydrolyse du GTP → libération de imp. αααα
QCM 4
Billes de résine
CP
GFP
Importine α4
FLAGlysat
Billes de résine
IgG contrôle
Cellules HEK293= co-expression
Western blot anti GFP
Western-blot anti FLAG
(WB anti-GFP)
Anticorps anti-FLAG
Billes de résine IP
Figure 2B
Immunoprécipitation
Importine α4FLAG
FLAGAnticorps anti-FLAG
Billes de résine
Anticorps anti-FLAG
Billes de résine
CP
GFP
Importine α4
FLAG
Importine α4FLAG
Billes de résine
lysat
Western blot anti GFP
Figure 2B - Piste 4
cytosol
nucléoplasme
RanGTP
NES
exportine
RanGTP
exportine
NES
RanGTP
exportine
NES
RanGAP
RanGDP
exportine
NES
exportine
Leptomycine
(LMB)
L’exportation :
CRM1
QCM 6
CP
Histidine6
GST
CRM1(exportine)
Billes de résine
Billes de résine
GST
CRM1(exportine)
+
Western blot anti His
Western blot anti GST
GST
Billes de résine
Figure 3C
CP
Histidine6
?
(146 kDa)
GST(26 kDa)
Piste 2 Piste 3 Piste 4
Pull-down
Piste 1
Figures 3C
Pull-down
GST
CRM1(exportine)
CP
Histidine6
Billes de résine
CP
CRM1(exportine)
NES
QCM 7
CP (30 kDa)
(protéine de capside du virus Chikungunya)
NLSNH2 COOH
NESIm
pα 4
Exportine
(CR
M1)
ConclusionQCM 7
cytosol
nucléoplasme
exportine
CP
CP
Imp
α α α α 4
Imp
ββ ββ
CP
Imp
α α α α 4
Imp
ββ ββ
Ran
GT
P
RanGTP
exportine
CP
RanGTP
Accumulation de cellules
Synchronisation / blocage
Culture cellulaire: cellules somatiques
Prométaphase ou métaphase
Solution hypotonique
Obtention d’un caryotype
Dispersion chromosomique
Fixation, coloration
Division cellulaire
Colchicine
lymphocytes, cellules foetales (amniocentèse, biopsies trophoblaste)(Cellules tumorales)
Répétition 5’ TTAGGG 3’
sur 5-10 kpb
Se raccourcit à chaque division
Structure d’un chromosome métaphasique
Observation après coloration
Classement des chromosomes ?
- Taille
- Position du centromère
Ic= p/(p+q)
- Bandes (G, R…)
Classement en 7 groupes (A à G)
Caryotypes:
A B
C
D E
F G C G
métacentriques
submétacentriques
acrocentriques
Classement d’après la longueur et l’index centromér ique :7 groupes de A–>G
acrocentriques
13 14 15
21 22
Obtention d’un caryotype
Coloration des chromosomes au Giemsa
Nombre de bandes variable selon le degré de condensation de la chromatine
- Bandes G: sombres, digestion enzymatique ménagée + Giemsa
- Bandes R: sombres, digestion thermique ménagée + Giemsa
• Bandes:
→ Caractéristiques d’une paire chromosomique
→ Reproductible d’une mitose à l’autre
→ Caractéristique d’une espèce donnée
• Métaphase: 200 – 500 bandes
• Caryotype standard = 400-550 bandes (résolution 5-10 Mpb)
FISH: Hybridation In Situ Fluorescente
Hybridation moléculaire (sondes ADN/ARN)
+Ne nécessite pas de cellules en division (noyaux en métaphase ou interphase)
Bonne résolution
Outil de recherche
-Etude ciblée (sonde spécifique)
Les différents types de sonde
- Constitutionnelle (l'ensemble de l'individu porte la même anomalie) ou acquise
- Équilibrée (il n'y a ni perte ni gain de matériel génétique) ou déséquilibrée
- Homogène (toutes les cellules ) ou en mosaïque (certaines cellules)
• Anomalies du degré de ploïdie Ex: 69, XXX
• Anomalies de nombre : 2n +/- 1,2,3
Exemple: 47, XY, +21
Les anomalies chromosomiques
Figure 1 : Caryotype classique (bandes G) de la mère (A) et du patient (B)
Exercice 2
der(11)t(1; 11)(q41; p15.5)
Régions NORQCM 8
NOR = - Coloration spéciale (nitrate d’argent)
- Constrictions secondaires au niveau des chromosomes acrocentriques
- Centre fibrillaire des nucléoles
Constrictions secondaires
Région NOR
N = 5 chromosomes acrocentriques x 2 = 10 régions NOR
Réparties sur plusieurs nucléoles
QCM 8
Possibilité de translocations
robertsoniennes:fusion centrique des
chromosomes acrocentriques
ADNr ADNr ADNr ADNr
Organisation des gènes en tandem (environ 20 copies)
ARNr 45S
Grande sous-unité ribosomale (60S)
Petite sous-unité ribosomale (40S)
Clivage / maturation de l’ARN
(Polymérase III)
NOR (organisateur nucléolaire)
ARN Polymérase I
Cf cours sur la transcription (UE1)
Régions NOR - Le nucléole
+ protéines = Grande particule RNP
QCM 8
En Microscopie électronique (MET)
- Centre fibrillaire (1 ou pls) Localisation des NOR
- Composant fibrillaire dense (grande particule RNP)
- Région périphérique granulaire (pré-ribosomes)
QCM 8
Exercice 2
Figure 2Hybridation Génomique Comparative
CGH : Comparative Genomic Hybridization
Préparation de l’ADN
Hybridation sur support contenant les sondes (« puce »)
Acquisition des signaux d’hybridation
Analyse quantitative des données
1 point = 1 sonde
→ Plus résolutif qu’un caryotype classique : cf nombre de sondes sur le support
Mais on ne voit pas les chromosomes
Anomalie équilibrée ?
Hybridation Génomique ComparativeCGH : Comparative Genomic Hybridization
Figure 2 : analyse par hybridation génomique compara tive ( array CGH ) des chromosomes 1 (A) et 11 (B)
Position approximative des centromères et de la région 11p11?
centromère
centromère
11p11
Numérotation des bandes
QCM 9
Figure 3 : Analyses par hybridation in situ (FISH) .
A : sondes 1q43 (rouge) et 1p13.2 (vert). B : sondes 11p15.5 (rouge) et 11p11.11-11p11.12 (vert).
L’ADN est visualisé à l’aide de DAPI (bleu).
QCM 10-11
Figure 2 : analyse par hybridation génomique compara tive ( array CGH ) des chromosomes 1 et 11
centromère
centromère
11p11
NB: Position approximative des centromères et de la région 11p11
Sondes utilisées pour la figure 3A (rouge) et 3B (b leu)
sonde 1p13.2 Sonde 1q43
Sonde 11p15.5Sonde 11p11.11
QCM 10-11
Chromosome 1
Chromosome 11
1q
11p
Mère
Translocation réciproque entre les chromosomes 1 et 11: t(1; 11)(q41; p15.5)
Conclusion
top related