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Techniques dtudes
de la cellule
Dr. Roger OUROUDA
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PLANPLAN
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire (microscopie)(microscopie)
Isolement et culture des cellulesIsolement et culture des cellules
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Exploration molExploration molculaireculaire
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Imagerie cellulaireImagerie cellulaire (microscopie)(microscopie)
Isolement et culture des cellulesIsolement et culture des cellules
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Exploration molExploration molculaireculaire
PLANPLAN
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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directe/contraste de phasere directe/contraste de phase fluorescencefluorescence confocalconfocal fluorescencefluorescence
22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique transmission (MET)transmission (MET) balayage (MEB)balayage (MEB)
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire -- MicroscopieMicroscopie
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MicroscopesMicroscopes
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Limite de rLimite de rsolution:solution:
Oeil nu: 300m (10-6m)
Microscope optique: 200nm (10-9m)
Microscope lectronique: 100pm (10-12m)
microscopemicroscope lectroniquelectronique
PetitePetitemolmolculecule VirusVirus BactBactrierie
CelluleCelluleanimaleanimale
CelluleCellulevvggtaletale
Taille relative des cellules et de leurs composantsTaille relative des cellules et de leurs composants
microscope optiquemicroscope optique
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire MicroscopieMicroscopie
Pouvoir de rsolution
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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique
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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique
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Imagerie cellulaireImagerie cellulaire
--
MicroscopieMicroscopie
11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directe/contraste de phasere directe/contraste de phase fluorescencefluorescence confocalconfocal fluorescencefluorescence
22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique transmission (MET)transmission (MET) balayage (MEB)balayage (MEB)
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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique :: lumilumire directe/contraste de phasere directe/contraste de phase
Cellules vivantesCellules vivantes
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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directe/contraste de phasere directe/contraste de phase fluorescencefluorescence confocalconfocal fluorescencefluorescence
22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique transmission (MET)transmission (MET) balayage (MEB)balayage (MEB)
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire -- MicroscopieMicroscopie
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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique-- FluorescenceFluorescence
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FluorescenceFluorescence
- Elle peut avoir plusieurs origines :
naturelle : ex: chlorophylle
utilisation de substance fluorescente se fixantspcifiquement sur une structure (Ex: DAPI sur ADN ;bleu)
Cellules CHO
DAPI
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FluorescenceFluorescence utilisation de fluorescente substance non spcifiquenaturelle, comme la fluorescine ou la rhodamine, fixe un anticorps spcifique dun antigne. Spcificit due lanticorps
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Fluorescence (cellule vivante)Fluorescence (cellule vivante)
Protine chimre (ex: GFP) naturellement fluorescente
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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directere directe contraste de phasecontraste de phase fluorescencefluorescence
confocalconfocal fluorescencefluorescence
22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique balayage (MEB)balayage (MEB)
transmission (MET)transmission (MET)
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire -- MicroscopieMicroscopie
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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique-- microscopie confocalemicroscopie confocale
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SurfaceSurface
Profondeur du foyerProfondeur de lacollecte de la lumiere
Profondeur de lacollecte de la lumiere
Microscopie optique Microscopie confocal
Observationau microscope optique
Observationau microscope confocal
11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique-- microscopie confocalemicroscopie confocale
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Z1
Z2
Z3
Z4
Z1Z2
Z4Z3
Microscopie confocaleMicroscopie confocale
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Microscope confocalMicroscope confocal
Microscopie confocaleMicroscopie confocale MicroscopieMicroscopie fluorescencefluorescence
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11-- Microscopie optiqueMicroscopie optique -- Microscopie confocaleMicroscopie confocale fluorescencefluorescence
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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directere directe contraste de phasecontraste de phase fluorescencefluorescence
confocalconfocal fluorescencefluorescence22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique
transmission (MET)transmission (MET)
balayage (MEB)balayage (MEB)
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire -- MicroscopieMicroscopie
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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directere directe contraste de phasecontraste de phase fluorescencefluorescence
confocalconfocal fluorescencefluorescence22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique
transmission (MET)transmission (MET)
balayage (MEB)balayage (MEB)
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire -- MicroscopieMicroscopie
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11-- Microscope optiqueMicroscope optique lumilumire directere directe contraste de phasecontraste de phase fluorescencefluorescence
confocalconfocal fluorescencefluorescence22-- MicroscopeMicroscope lectroniquelectronique
transmission (MET)transmission (MET)
balayage (MEB)balayage (MEB)
Imagerie cellulaireImagerie cellulaire -- MicroscopieMicroscopie
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1- Microscopie lectronique
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http://www.mos.org/sln/SEM/mhead.html
www.allergybegone.com/newsletter-apr2005.html.
http://www.mos.org/sln/SEM/mhead.html
www.allergybegone.com/newsletter-apr2005.html.
en.wikipedia.org/wiki/Immune_system .
1- Microscopie lectronique
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MicroscopieMicroscopie
RRsumsum
Microscopie optiqueMicroscopie optique MicroscopieMicroscopie lectroniquelectronique
Faisceau de lumiFaisceau de lumirere FaisceauFaisceau lectroniquelectronique
Lentilles optiquesLentilles optiques LentillesLentilles lectromagnlectromagntiquestiques
RRsolution 0,2solution 0,2mm RRsolution 0,2nmsolution 0,2nm
Traditionnel Fluorescencelectronique balayage
(MEB)
lectronique transmission
(MET)
Cellules non vivantesCellules non vivantes
Cellules vivantesCellules vivantes
ou non vivantesou non vivantes Protinesfluorescentes
CellulesCellulesvivantesvivantes
CellulesCellulesnon vivantesnon vivantes
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Imagerie cellulaireImagerie cellulaire (microscopie)(microscopie)
Isolement et culture des cellulesIsolement et culture des cellules
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Exploration molExploration molculaireculaire
PLANPLAN
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IsolementIsolement partir dpartir dun tissuun tissu
IsolementIsolement partir de sangpartir de sang
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Exploration molExploration molculaireculaire
ISOLEMENT ET CULTUREISOLEMENT ET CULTURE
DES CELLULESDES CELLULES
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Culture cellulaireCulture cellulaire
Fragment
tissulaire
Suspension de cellules
Les cellules sont mises dans
un flacon rempli de milieu nutritif
CULTURE PRIMAIRECULTURE PRIMAIRE
CULTURE SECONDAIRECULTURE SECONDAIRE
Prolifration des cellulesjusqu conf luence
Cellu les rcoltes ettransfres dans un nouveau flacon
Passage
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Collag nase H Tampon cordon Cordon ombilical
Canules
HUVECs Passage 0 (P0):culture primaire
HUVECs Passage 1 (P1): culture secondaire)
Cellules endoth liales
1. Isolement et culture cellulaire1. Isolement et culture cellulaire
partir dpartir dun tissuun tissu
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www.microscopyu.com
Contraste de phase
Cellules HeLaCellules HeLa (Henrietta Lacks)(cellules immortalis(cellules immortalises des drivrives de cellules des de cellules d un cancer cervical)un cancer cervical)
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IsolementIsolement partir dpartir dun tissuun tissu
IsolementIsolement partir de sangpartir de sang
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Exploration molExploration molculaireculaire
ISOLEMENT ET CULTUREISOLEMENT ET CULTURE
DES CELLULESDES CELLULES
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IsolementIsolement partir de sangpartir de sang
Sang hparin
Centrifugation
Surnageant = plasma
Culot = cellules
Remise en suspension
Sparation
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Imagerie cellulaireImagerie cellulaire (microscopie)(microscopie)
Isolement et culture des cellulesIsolement et culture des cellules
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Exploration molExploration molculaireculaire
PLANPLAN
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Cytomtrie en flux (taille, granulosit)
Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)
Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux (taille, granulosit(taille, granulosit))
Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)
Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
BD biosciences
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C tC t t i flt i fl
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
C tC tomt i fltrie en fl
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
biology.berkeley.edu
Detecteur
Forwardscatter
(FS)
Detecteur Side scatter(SC)
Detecteur Side scatter(SC)
SourceSourcede lumide lumirere
Forward Scatter (FS) est proportionnel la taille de la cellule
Side Scatter (SC) est proportionnel la complexit de la cellule (granulosit)
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
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LymphocytesLymphocytes
NeutrophilesNeutrophiles
MonocytesMonocytes
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Sang total lysSang total lys
(F
S)
(SC)
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Cytomtrie en flux (taille, granulosit)
CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux (taille, granulosit(taille, granulosit, fluorescence), fluorescence)
Trieur de cellules par Cytofluorimtrie en flux(Fluorescence-activated cell sorter, FACS)
C t fl iC t fl i t i flt i fl
-
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CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux
Antignes
Anticorps spcifiques
FITCFITCPEPE
CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux
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Histogramme 2 Paramtres
FITC FLFITC FL
PopulationPopulation
NNgativegative PopulationPopulationpositive (FITC+)positive (FITC+)
PopulationPopulationpositivepositive
(PE+)(PE+)
PopulationPopulationdoublementdoublement
positivepositive
((FITC+FITC+,, PE+PE+))PE
FL
PE
FL
CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux
+ +
+ -- -
- +
0
CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux --ApplicationApplication
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Etude du cycle cellulaireEtude du cycle cellulaire
https://reader009.{domain}/reader009/html5/0320/5ab05a6eb
Iodide de propidium sintercale entre lespaires de bases et se lie lADN double brin
Contenu en ADN
2n
4n
G1S G2+M
G1
G1
G2
M
S
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Cytomtrie en flux (taille, granulosit)
Cytofluorimtrie en flux (taille, granulosit, fluorescence)
Trieur de cellules par CytofluorimTrieur de cellules par Cytofluorimtrie en fluxtrie en flux(Fluorescence(Fluorescence--activated cell sorter, FACS)activated cell sorter, FACS)
Tri cellulaire parTri cellulaire par
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Tri cellulaire parTri cellulaire par
CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
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CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
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Tri cellulaire parTri cellulaire par
cytofluorimcytofluorimtrie en fluxtrie en flux
Tri cellulaire parTri cellulaire parC t fl iC t fl i t i flt i fl
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CytofluorimCytofluorimtrie en fluxtrie en flux
Domaines utilisant la cytomDomaines utilisant la cytomtrie en fluxtrie en flux
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RechercheRecherche CliniqueClinique
IndustrieIndustriePharmacologiePharmacologie
yy
- Fonction immune- Cancer- Biologie molculaire
- Diagnostic in vitro- Transplantation/Transfusion- Qualit contrle pour thrapie cellulaire
- Identification et validation de composs- Etude de safety de mdicaments- Dcouverte de biomarqueurs
- Environnement-Agriculture
PLANPLAN
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Imagerie cellulaireImagerie cellulaire (microscopie)(microscopie)
Isolement et culture des cellulesIsolement et culture des cellules
CytomCytomtrie en fluxtrie en flux
Exploration molExploration molculaireculaire
PLANPLAN
E ploration molExploration molc laireculaire
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Exploration molExploration molculaireculaire
Fractionnement subcellulaireFractionnement subcellulaire
Techniques dTechniques danalyse de lanalyse de l ADN, des ARNADN, des ARN
et des protet des protinesines
Cellule eucaryotiqueCellule eucaryotique
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y qy q
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SSparation des organitesparation des organites
Par centrifugation diffPar centrifugation diffrentiellerentielle
Par gradient de densitPar gradient de densit
SSparation des organites:paration des organites: Centrifugation diffCentrifugation diffrentiellerentielle
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SSparation des organitesparation des organites
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Gradient de densitGradient de densit
Exploration molExploration molculaireculaire
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Exploration molExploration molculaireculaire
Fractionnement subcellulaireFractionnement subcellulaire
Techniques dTechniques danalyse de lanalyse de l ADN, des ARNADN, des ARN
et des protet des protinesines
La chromatographie d'exclusion ou fi ltration sur gel
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1 : Dpt d'un mlange de deux molcules2 : Les petites molcules3 : Les grosses molcules4 : Les petites molcules sont lues
La chromatographie d'affinit
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g p
Prsence de groupements d'atomes
formant des sites particuliers : Ac-Ag, Enz-substrat
La chromatographie de paires d'ions
La chromatographie : Types
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Charge lectrique
changeuse danions(+)
Ex: Amine tertiaire,DEAE (dithylaminothyle)
changeuse de cations(-)
Ex : Carboxyle coo-,Phosphate Po4-
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