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Tierärztliche Hochschule Hannover
Chondrogene Differenzierung mesenchymaler
Knochenmarkstammzellen mittels bioaktiver
Poly-ε-caprolactone Scaffolds
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades
einer Doktorin der Veterinärmedizin
-Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Svenja Paul
Bad Oldesloe
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr, Klinik für
Heimtiere, Reptilien, Zier- und Wildvögel
Prof.Dr. med. Martin Russlies, Universitätsklinikum
Schleswig-Holstein, Campus Lübeck
1. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Michael Fehr
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Peter Stadler
Tag der mündlichen Prüfung: 10.03.2011
Schreiben ist leicht, man muss nur die
falschen Wörter weglassen.
Samuel Langhorne Clemens (1835-1910)
besser bekannt unter seinem Pseudonym
Mark Twain
Meiner Tochter Hannah
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ........................................................................................... 1
1.1 Hyaliner Gelenkknorpel ............................................................................. 1
1.2 Knorpeldefekte ........................................................................................... 4
1.2.1 Osteochondrosis dissecans beim Hund ................................................ 6
1.3 Therapieoptionen ....................................................................................... 7
1.4 Knorpel Tissue Engineering .................................................................... 10
1.4.1 Mesenchymale Stammzellen .............................................................. 10
1.4.2 Scaffolds ............................................................................................. 12
1.4.3 Poly-ε-caprolactone ............................................................................. 14
1.5 Schlussfolgerung und Aufgabenstellung .............................................. 18
2 Material und Methoden ................................................................... 20
2.1 Allgemeine Lösungen .............................................................................. 20
2.2 Primäre Zellkultur ..................................................................................... 21
2.2.1 Kulturmedien ....................................................................................... 21
2.2.2 Zellisolierung ....................................................................................... 23
2.2.3 Zellpassage ......................................................................................... 23
2.2.4 Zellzählung .......................................................................................... 24
2.2.5 Kryokonservierung .............................................................................. 24
2.3 Durchflusszytometrie ............................................................................... 24
2.4 Differenzierung primärer Zellen .............................................................. 26
2.4.1 Adipogene Differenzierung .................................................................. 27
2.4.2 Osteogene Differenzierung ................................................................. 27
2.4.3 Chondrogene Differenzierung ............................................................. 27
2.5 Histologie .................................................................................................. 27
2.5.1 Sudan III Färbung ............................................................................... 28
2.5.2 Alkalische Phosphatase ...................................................................... 28
2.5.3 Alzianblau Färbung ............................................................................. 29
2.5.4 Kollagen Typ II Färbung ...................................................................... 29
2.6 Genexpression ......................................................................................... 30
2.6.1 Isolierung von RNA ............................................................................. 30
2.6.2 Reverse Transkription ......................................................................... 31
2.6.3 Polymerase Kettenreaktion ................................................................. 32
2.6.4 Gelelektrophorese und Densitometrie ................................................. 34
2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds ................................................................ 35
2.7.1 Scaffoldherstellung .............................................................................. 35
2.7.2 Scaffoldaugmentation ......................................................................... 36
2.7.3 Scaffoldcharakterisierung .................................................................... 36
2.7.4 Zellversuch .......................................................................................... 38
2.7.5 Realtime PCR ..................................................................................... 40
2.7.6 DNA-Quantifizierung ........................................................................... 43
2.7.7 Statistische Auswertung ...................................................................... 45
3 Ergebnisse ....................................................................................... 45
3.1 Mesenchymale Stammzellen ................................................................... 45
3.1.1 Morphologie und Zellkultur .................................................................. 45
3.2 Differenzierung primärer Zellen .............................................................. 48
3.2.1 Histologischer Nachweis der Differenzierungsfähigkeit ....................... 48
3.2.2 Genexpression .................................................................................... 50
3.3 Poly-ε-caprolactone Scaffolds ................................................................ 53
3.3.1 Rasterelektronenmikroskopie .............................................................. 53
3.3.2 Migrationspotential .............................................................................. 54
3.3.3 Release von TGF-β 1 .......................................................................... 55
3.3.4 Histologie ............................................................................................ 56
3.3.5 DNA-Quantifizierung ........................................................................... 57
3.3.6 Realtime PCR ..................................................................................... 58
3.3.7 PCR .................................................................................................... 60
4 Diskussion ....................................................................................... 63
4.1 Mesenchymale Stammzellen ................................................................... 63
4.2 Poly-ε-caprolactone Scaffolds ................................................................ 64
4.3 Einfluss der Faserstärke .......................................................................... 65
4.4 Einfluss der Wachstumsfaktoren ............................................................ 66
4.4.1 Einfluss von TGF-β1 ........................................................................... 66
4.4.2 Einfluss von HA ................................................................................... 67
4.5 Integration der Wachstumsfaktoren ....................................................... 68
4.6 Expression osteogener Marker ............................................................... 69
4.7 Schlussfolgerung ..................................................................................... 70
5 Zusammenfassung .......................................................................... 72
6 Summary .......................................................................................... 75
7 Anhang ............................................................................................. 77
7.1 Verbrauchsmaterialien ............................................................................. 77
7.2 Geräte ........................................................................................................ 77
7.3 Software .................................................................................................... 79
7.4 Reagenzien ............................................................................................... 79
7.5 Kits ............................................................................................................ 83
8 Literaturverzeichnis ........................................................................ 84
Abkürzungen:
ACT autologe Chondrozytentransplantation
AK Antikörper
AP2/FABP fatty acid binding protein
BSA Bovines Serumalbumin
CCI characterised chondrocyte implantation
CD Cluster of differentiation
DAPI 4´,6-Diamidino-2-phenylindol
ddH2O Deionisiertes Wasser
DEPC-H2O RNase- und DNase freies Wasser
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
EDTA Ethylendiamintetraacetat
ELISA Enzym linked Assay
ESC embryonale Stammzelle
EZM Extrazelluläre Matrix
FACS Fluorescence activated cell sorting
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FKS Fetales Kälberserum
GAG Glycosaminoglycane
HA Hyaluronsäure
Kb Kilobase
LAP Latency-associated peptide
mAK monoklonaler Antikörper
MFX Mikrofrakturierung
MMB Micromassbody
MMP Metalloproteinase
MSC Mesenchymale Stammzelle
Mw Molekulargewicht
MW Mediumwechsel
OAT autologe osteochondrale Transplantation
OCD Osteochondrosis dissecans
PBS Phosphate Buffered Saline
PCL Poly-ε-caprolactone
PCR Polymerase Kettenreaktion
PDLLA Poly-D,L-lactic acid
PE Phycoerthrin
PG Proteoglycan
PGA Polyglycolic acid
PLA Poly lactic acid
PLGA Poly(D,L-lactic-co-glycolic-acid)
PLLA Poly-L-lactic acid
PPARγ Peroxisome proliferator-activated
receptor γ
REM Rasterelektronenmikroskop
Rpm Rounds per minute
RT Reverse Transkription
RTemp Raumtemperatur
Rt-PCR Realtime PCR
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TCP Tricalcium Phosphat
TGF Transforming Growth Factor
1
1 Einleitung
1.1 Hyaliner Gelenkknorpel
Es können drei verschiedene Arten von Knorpelgewebe unterschieden werden:
Faserknorpel, elastischer Knorpel und hyaliner Knorpel. Schwerpunkt der
vorliegenden Arbeit ist die Regeneration hyalinen Knorpels im Kontext der
gelenkerhaltenden Chirurgie, daher wird auf die anderen Knorpelarten nicht weiter
eingegangen.
Morphologie und Metabolismus
Gesunder adulter hyaliner Knorpel besteht zu 60-70% aus Wasser und im Vergleich
zu parenchymatösen Organen nur zu ca. 30% aus extrazellulärer Matrix (EZM),
welche sich in etwa zu gleichen Teilen aus Kollagenen und Proteoglykanen (PG)
zusammensetzt. Chondrozyten tragen lediglich zu 1% der Knorpelmasse bei. Etwa
80% des Gesamtkollagens besteht aus Kollagen Typ II. In geringem Umfang
kommen auch Kollagen Typ IX, X und XI vor. Fibrilläres Kollagen Typ I kommt im
Gelenkknorpel nur unter pathobiologischen Bedingungen z.B. im Rahmen
degenerativer Gelenkerkrankungen vor. Die im hyalinen Knorpel enthaltenen
Molekülgruppen der PGs umfassen große aggregierende PGs, wie Aggrecan und
Versican, sowie kleine, leucinreiche PGs, wie Decorin, Biglycan, Fibromodulin und
Lumican. PGs erfüllen eine Vielzahl von biologischen Funktionen, wie
Matrixorganisation, Zelladhäsion, Lubrikation, Ionenfiltration, sowie Wachstum und
Wachstumsfaktorregulierung. Viele dieser Funktionen variieren in Abhängigkeit von
ihrer Lage und Struktur (anatomische Lage, Alter, biomechanischer Stress).
Innerhalb der Knorpelzonen variiert die Zusammensetzung, Organisation und
Funktion der PGs. Bereiche, die ständigem Druck ausgesetzt sind, beinhalten hohe
Aggrecankonzentrationen, während in Bereichen mit dynamischer Belastung weniger
Aggrecan zu finden ist (BUCKWALTER et al. 2005). PGs bestehen aus einem
zentralen Protein (Kernprotein), an das viele Glycosaminoglycan-Seitenketten
kovalent gebunden sind. Glycosaminoglykane (GAG) bestehen aus langen
unverzweigten Polysacchariden mit sich wiederholenden Disacchharideinheiten. Im
2 1 Einleitung
Gelenkknorpel kommen überwiegend Hyaluronsäure, Chondroitinsulfat,
Keratansulfat, Dermatansulfat und Heparansulfat vor. Die negative Ladung der
GAGs gewährleistet die Elastizität, Formstabilität und Nutrition des hyalinen
Knorpels, sowie die Regulation von Wassergehalt und Elektrolytkonzentration
(Donnan-Effekt) (SCHAGEMANN et al. 2008).
Hyaliner Knorpel kann histologisch in vier Zonen mit einer jeweils charakteristischen
Zellmorphologie und -Verteilung sowie EZM Zusammensetzung und -Orientierung
unterteilt werden, was maßgeblich Einfluss auf die biomechanischen und
metabolischen Eigenschaften hat. Die oberflächliche Tangentialzone ist dünn,
beinhaltet eine Vielzahl von Chondrozyten, die spindelförmig abgeflacht sind und
eine parallele Anordnung zur Gelenkfläche aufweisen. Die Kollagenfibrillen verlaufen
tangential zur Oberfläche und sind trajektoriell ausgerichtet. Der Gehalt an PGs ist,
abgesehen von der PG-reichen perizellulären Matrix, gering. In der darunter
liegenden Übergangszone liegen die hier eher sphärischen Chondrozyten nicht mehr
so dicht nebeneinander, und ihre Ausrichtung ist weniger streng. Auch die
Kollagenfibrillen sind eher zufällig angeordnet. In der dritten Zone, der sog.
Radialzone, ist die Zelldichte am geringsten und der Kollagenfibrillendurchmesser
am höchsten. Sowohl die Zellen als auch die Fibrillen sind radiär zur
Gelenkoberfläche ausgerichtet. Die vierte Zone ist die Übergangszone von
Gelenkknorpel zum subchondralen, trabekulären Knochen. Die Kollagenfibrillen sind
in dieser sog. Mineralisierungszone verankert. Zwischen Radialzone und
Mineralisierungszone liegt eine Grenzlinie, die als „tide mark“ bezeichnet wird
(STASHAK 2002; ERGGELET 2004).
1.1 Hyaliner Gelenkknorpel 3
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung der Zonengliederung von adultem hyalinem Knorpel. modifiziert nach (STASHAK 2002)
Adulter hyaliner Knorpel ist weder vaskularisiert noch innerviert oder lymphatisch
versorgt. Die Versorgung mit Nährstoffen und der Abtransport metabolischer
Endprodukte erfolgt über die Synovialflüssigkeit mittels Diffusion und
elektrostatischer Kräfte (Donnan-Effekt; s.o.). Im Gegensatz hierzu wird juveniler
Gelenkknorpel noch durch Blutgefäße des subchondralen Knochens versorgt, da
noch keine Abgrenzung durch die Mineralisierungszone vorhanden ist. Die Synthese,
aber v.a. die den biomechanischen Anforderungen angepassten, wenn auch
limitierten Umbauvorgänge der EZM, erfolgen durch die Chondrozyten, die eine hohe
Differenzierung sowie Spezialisierung auf die bradytrophen Bedingungen im
Knorpelgewebe aufweisen (FOSSUM 2007).
Biomechanische Eigenschaften
Die Zusammensetzung und Anordnung der EZM verleiht dem hyalinen Knorpel seine
einzigartigen biomechanischen Eigenschaften. Hyaliner Knorpel ist viskoelastisch
und formstabil. Beide Eigenschaften werden durch die negativ geladenen GAGs
4 1 Einleitung
vermittelt. Diese binden Wasser und erzeugen so eine gelartige Konsistenz. Wird
nun auf den Knorpel Druck ausgeübt, so wird das Gewebe zu einem gewissen Grad
komprimiert. Dabei nähern sich die Anionen einander an. Bei Entlastung kommt es
zur elektrostatischen Abstoßung der Anionen, und der Knorpel kehrt in seinen
Ausgangszustand zurück. Impulsartige Intervallbelastungen können hierbei besser
toleriert werden als Dauerbelastungen.
Durch die unterschiedliche Ausrichtung der Kollagenfibrillen ist eine hohe
Widerstandsfähigkeit gegenüber Zug- und Scherkräften vorhanden (KEMPSON et al.
1970; KUETTNER et al. 1989), die am höchsten ist, wenn die Fibrillen parallel zur
Zugrichtung angeordnet sind. Wird Druck auf die Gelenkoberfläche ausgeübt, wirken
die Zug- und Scherkräfte innerhalb der Knorpelzonen in unterschiedliche Richtungen.
Ein weiterer für die biomechanischen Funktionen des Gelenkknorpels wichtiger
Faktor ist die Knorpeldicke, bei der es innerhalb eines Gelenks, interindividuell und
artspezifisch, zu erheblichen Variationen kommen kann (FRANZ et al. 2001). Der
charakteristische Aufbau des Gelenkknorpels bleibt hierbei aber immer konstant
(FRITZ et al. 2003).
1.2 Knorpeldefekte
Die häufigsten Ursachen für Knorpeldefekte sind (Mikro)-Traumata,
Gelenkfehlstellungen und –instabilitäten, ein unphysiologisches Gelenkspiel i.S.e.
Teilkongruenz, was zu einer Punktbelastung führt, oder Ultrakongruenz, was zu
erhöhtem Abrieb führt, fokale aseptische Nekrosen, wie die Osteochondrosis
dissecans (OCD), degenerative Erkrankungen, wie die Arthrose,
Autoimmunerkrankungen, wie die rheumatoide Arthritis, metabolische Erkrankungen,
wie Gichtarthritis und Chondrocalcinose oder septische Arthritiden. Als Kofaktoren
sind Adipositas und chronische Fehl- und Überbelastung zu nennen. Die Rolle
genetischer Faktoren ist schlussendlich nicht geklärt (ERGGELET 2004).
Unterschieden werden akute von chronischen Läsionen. Zur Bestimmung des
Ausmaßes der Schädigung hat sich die Klassifikation nach Outerbridge
1.2 Knorpeldefekte 5
(OUTERBRIDGE 1961) etabliert und bewährt (siehe Abbildung 1.2). Auch wenn die
Klassifizierung aus der Humanmedizin stammt, kann sie auf die Tiermedizin
übertragen werden (UHL et al. 2005; BURGER et al. 2007; BADLANI et al. 2008).
Abbildung 1.2: schematische Darstellung der vier Schweregrade von Knorpelschäden, klassifiziert nach Outerbridge. (A) Knorpelödem, (B) Fibrillation, (C) Ulceration, (D) Knochenglatze. Modifiziert nach Menke (1997).
Die Fähigkeit, auf biomechanische Anforderungen mit Umbauvorgängen zu
reagieren, ist limitiert. So kann es im Rahmen einer übermäßigen Druckbelastung
zum Zerreißen des Kollagennetzwerkes kommen (FOSSUM 2007). Die
Knorpelmatrix wird brüchig und zugänglich für inflammatorische Zytokine und
Metalloproteinasen (MMP) (STASHAK 2002). Diese bauen die hyaline EZM
ungeordnet ab und setzen eine degenerative Kaskade in Gang, was schlussendlich
zur Folge hat, dass der Anteil an Kollagen Typ II, PGs und Wasser ab-, und der
Anteil an Kollagen Typ I zunimmt. Die intrinsischen Heilungsmechanismen sind
darüber hinaus insuffizient. Erkranktes oder verloren gegangenes Knorpelgewebe
wird allenfalls durch biomechanisch und metabolisch inkompetentes Narbengewebe
ersetzt. Neben Schmerzen und Einschränkungen der Mobilität prädisponiert ein
arrodierter Knorpel zur Entstehung einer verfrüht einsetzenden sekundären Arthrose
6 1 Einleitung
(FRISBIE et al. 2009). Dies macht deutlich, warum eine primäre Sanierung der
Läsion auch im Sinne einer präventiven Maßnahme absolut indiziert ist, wobei
weiterhin kontrovers diskutiert wird, ob nur symptomatische oder auch
asymptomatische Defekte, also Zufallsbefunde, behandelt werden müssen
(BHOSALE u. RICHARDSON 2008; SALZMANN et al. 2010).
1.2.1 Osteochondrosis dissecans beim Hund
Bei der OCD handelt es sich um einen pathologischen Prozess im wachsenden
Knorpel, der sich als Störung der enchondralen Ossifikation manifestiert. Die
Ätiologie ist ungeklärt. Als Ursache werden eine genetische Disposition (SLATER et
al. 1991; MONTGOMERY et al. 1994; WEINSTEIN et al. 1995), eine durch Haltung
und Fütterung (hoher Proteingehalt, Imbalanz der Versorgung mit Kalzium, Phosphat
und Vitamin D) induzierte Wachstumsintensität (ZENTEK u. NOLTE 1995;
RICHARDSON u. ZENTEK 1998), (Mikro-)Traumata (FOX u. WALKER 1993;
EKMAN u. CARLSON 1998) und eine hormonelle Imbalanz (FOX u. WALKER 1993)
diskutiert. Betroffen sind vor allem große, schnell wachsende Hunderassen
(LAFOND et al. 2002). Eine retrospektive Untersuchung an 108 Hunden zeigte, dass
die Schulter das am häufigsten betroffene Gelenk ist (59%), gefolgt von Ellbogen-
(18%), Sprung- (15%) und Kniegelenk (8%) (HORST 2000). Auch MONTGOMERY
et al. (1994) stellten eine Prävalenz von Schulter- (71%), Ellbogen- (11%), Sprung-
(9%) und Kniegelenk (4%) fest. Die Veränderungen können ein- oder beidseitig
auftreten, selten sind mehr als zwei Gelenke bei einem Tier betroffen. Rüden sind
häufiger betroffen als Hündinnen (SMITH 1991). Innerhalb der Gelenke gibt es eine
Prädisposition für stärker belastete Bereiche. Dies sind konvexe Gelenkflächen, auf
die besonders hohe Druckbelastung und Schiebebewegungen wirken (GRÜNBAUM
u. PAATSAMA 1986).
Bei der Pathogenese der OCD kommt es zu einer Verzögerung der enchondralen
Ossifikation aufgrund einer anormalen Maturierung der Chondrozyten. Das
Knorpelwachstum setzt sich fort und es kommt zu einer herdförmigen
Dickenzunahme des Gelenkknorpels. Wird eine kritische Schichtdicke überschritten,
kommt es zu einer Unterversorgung und somit zur Nekrose tieferliegender Zellen.
1.3 Therapieoptionen 7
Die verdickten Bereiche sind mechanisch weniger stark belastbar und es kann zu
Degeneration und Nekrose kommen. Unter Belastung können sich Risse unter den
verdickten Knorpelbezirken bilden und es kommt zu einer Ablösung der
Knorpelschuppe (NIEMAND 2006). Durch die Risse tritt die Synovia in Kontakt mit
dem subchondralen Knochen und es entsteht eine entzündliche Reaktion, die mit
Schmerzen einhergeht (FOX u. WALKER 1993). Löst sich die Knorpelschuppe
vollständig, entsteht ein freier Gelenkkörper (Corpus liberum), der in der Regel zu
einer Lahmheit führt.
1.3 Therapieoptionen
Entscheidend für die Wahl des Therapieverfahrens ist die exakte Klassifizierung der
Läsion. Maßgeblich sind Defektlokalisation, Ausdehnung und Tiefe, sowie der Erhalt
einer Defektschulter. Darüber hinaus müssen die Ätiologie und das Alter des
Defekts, sowie das anvisierte Therapieziel des zu behandelnden Individuums mit in
die Indikationsstellung einbezogen werden. Zudem müssen Begleitschäden, wie eine
Gelenkinstabilität oder mechanische Fehlstellung, zuvor oder in gleicher Sitzung
saniert werden. Es folgt entsprechend des Arbeitskontextes eine kurze Darstellung
derzeit angewandter regenerativer Therapieoptionen zur Behandlung akuter, fokaler
Gelenkknorpeldefekte, die zum Ziel haben, den Defekt (i) zu glätten und zu
stabilisieren (palliativ), (ii) mit einem Ersatzgewebe (reparativ) oder (iii) hyalinartigem
Knorpel (regenerativ) aufzufüllen (COLE et al. 2009). Kontrovers wird diskutiert, ob
auch Läsionen als Folge degenerativer oder entzündlicher Erkrankungen für
reparative und regenerative Techniken zugänglich sind. Konservative Maßnahmen,
wie Physiotherapie inkl. Stoßwellentherapie, Elektrotherapie, pulsierende
Signaltherapie, Ultraschall und Magnetfeldtherapie, orthopädische Hilfsmittel (z.B.
Spezialbeschlag bei Pferden), topische oder oral applizierte Analgesie und
Antiphlogese mit NSAIDs, intraartikuläre Injektionen von Glycocorticoiden oder
Viskosupplementen (Hyaluronsäure), deren Wirkungsnachweis teilweise nicht belegt
ist (Nahrungsergänzungsmittel), haben ihren Platz in der symptomatisch supportiven
sowie palliativen Therapie. Osteochondrale Transplantate und nicht resorbierbare
8 1 Einleitung
Implantate fallen aus dem Fokus der vorliegenden Arbeit. Innovative Strategien
umfassen z.B. eine Therapie mit autologem konditioniertem Serum zur Reduzierung
des Entzündungsfaktors Interleukin-1 (FRISBIE et al. 2007).
Débridement und Lavage
Débridement und Lavage können Teil einer der anderen chirurgischen Maßnahmen
sein, oder als alleinige Therapie bei Knorpeldefekten Grad I-II nach Outerbridge bzw.
palliativ zum Einsatz kommen. Arthroskopisch werden instabile oder freie
Knorpelfragmente entfernt und die Knorpeloberfläche stabilisiert und geglättet.
Anschließend erfolgt eine Lavage, bei der Debris und inflammatorische Mediatoren
aus dem Gelenk entfernt werden (COLE et al. 2009).
Mikrofrakturierung
Die Mikrofrakturierung (MFX) ist eine knochenmarkstimulierende Technik, die zur
Behandlung kleiner (< 4 cm²) Gelenkknorpeldefekte Grad III-IV nach Outerbridge
beim Mensch als auch bei Wirbeltieren geeignet ist. Zunächst wird der Defekt bis auf
den subchondralen Knochen kürettiert, welcher anschließend punktuell
durchbrochen wird. Durch die auf diese Weise erzeugte Blutung werden pluripotente
Vorläuferzellen aus dem Knochenmark in den Defekt geschwemmt und durch das
sich bildende Blutgerinnsel lokal gebunden. Auch wenn sich weitläufig der Terminus
„hyalinartig“ durchgesetzt hat kommt es lediglich zur Ausbildung eines Faserknorpels
bzw. Narbengewebes von minderwertiger Qualität. Obgleich in vitro gezeigt werden
konnte, dass die eingeschwemmten Zellen zu Chondrozyten differenzieren können
(KRAMER et al. 2006), bestehen weiter Unklarheiten darüber, ob diese auch in vivo
am Heilungsprozess teilnehmen (GRANDE et al. 1999). KNUTSEN et al. (2007)
zeigten jedoch in ihrer prospektiven, randomisiert kontrollierten Studie, dass die MFX
nach vier Jahren keineswegs der autologen Chondrozytentransplantation (ACT) bzgl.
klinischem Outcome und histologischem Ergebnis unterlegen ist. Zudem ist die MFX
eine one step procedure mit deutlich geringerer intraoperativer Komorbidität und
postoperativer Komplikationsrate (ZANTOP u. PETERSEN 2009; GILLE et al. 2010).
Die MFX, wie auch die ACT, kann mit unterschiedlichen Matrizes aus z.B. tierischem
Kollagen, Hyaluronsäure oder synthetischen Polymeren kombiniert werden, die eine
1.3 Therapieoptionen 9
mechanische Stabilisierung, eine dreidimensionale Zellanordnung und
Immobilisierung sowie eine chondrogene Differenzierung einwandernder Zellen
bewirken sollen, was die Anwendbarkeit potentiell auch auf größere und instabile
Defekte ausdehnt (STEINWACHS et al. 2008).
Autologe Chondrozytentransplantation
Die ACT kann primär zur Behandlung ausgedehnter (> 4 cm²) Gelenkknorpeldefekte
Grad III-IV nach Outerbridge oder als Reserveverfahren nach Versagen anderer
vorheriger Therapiemaßnahmen durchgeführt werden (COLE et al. 2009). Es sind
zwei chirurgische Eingriffe notwendig. Zuerst erfolgt eine arthroskopische
Klassifizierung, in deren Rahmen auch eine Knorpelbiopsie aus einem nicht
belasteten Gelenkareal entnommen wird. Im Labor werden die gewonnenen
Chondrozyten aus der EZM isoliert, in vitro amplifiziert und ggf. charakterisiert
(Characterized Chondrocyte Implantation). Bei dem zweiten Eingriff, ca. sechs
Wochen später, werden die Zellen in den wie für die MFX präparierten und entweder
mit einem autologen Periostlappen (1. Generation) oder einer künstlichen Membran
(2. und 3. Generation) gedeckten Defekt injiziert. Vorteil der neueren Generation der
ACT ist, dass das Auftreten von mit der periostgedeckten ACT assoziierten
Komplikationen wie Arthrofibrose, Periosthyperthrophie und Lappendelamination
deutlich reduziert zu sein scheint (BEHRENS et al. 2006). Die ACT der 4. Generation
inkapsuliert die Chondrozyten in gelartigen Implantaten oder verwendet anstatt
isolierter Zellen ganze Knorpelgewebsfragmente. Auch bzgl. der ACT besteht
weiterhin Uneinigkeit darüber, ob die implantierten autologen Chondrozyten de facto
am Heilungsprozess teilnehmen, oder ob Chondrozyten aus dem umgebenden
gesunden Knorpel und /oder pluripotente Vorläuferzellen aus dem Knochenmark und
Periostlappen einwandern. Dennoch deuten einige Publikationen an, dass den
implantierten Chondrozyten, deren Charakterisierung und Entnahmestelle durchaus
eine wichtige Rolle zukommt (SCHAGEMANN et al. 2009). Auch wenn die ACT die
Entstehung eines hyalinartigen Ersatzgewebes begünstigt, so wird diese Technik
doch durch die Komorbidität an Periost- und Knorpelentnahmestelle, die
Notwendigkeit von zwei Eingriffen, die teils fragwürdige Qualitätssicherung der
10 1 Einleitung
Zellkultur, das protrahierte Rehabilitationsprotokoll und nicht zuletzt durch die hohen
Kosten limitiert.
1.4 Knorpel Tissue Engineering
Tissue Engineering ist eine zentrale Technologie der regenerativen Medizin. Hierbei
wird versucht, durch Zell- und Gewebekultur in vitro oder in vivo Gewebeverbände
und/oder vollständige Organe herzustellen, um diese dann autolog, allogen oder
xenogen zwecks Defektrekonstruktion zu transplantieren. Knorpel Tissue
Engineering bedient sich üblicherweise vier wesentlicher Elemente:
ein Scaffold als dreidimensionales strukturelles Gerüst
vitale Zellen, wobei sich je nach Anwendung pluripotente Vorläuferzellen,
ausdifferenzierte primäre Zellen oder Gewebe eignen.
ein Kulturmedium oder –organismus
und bei Bedarf der Induktion mittels Wachstumsfaktoren oder Komponenten
der genuinen EZM
1.4.1 Mesenchymale Stammzellen
Neben ausdifferenzierten, primären Chondrozyten kommen für das Tissue
Engineering auch pluripotente Vorläuferzellen mesenchymaler Zelllinien in Betracht,
die u.a. im Knochenmark zu finden sind. Diese pluripotenten Vorläuferzellen wurden
bereits in der Arbeitsgruppe um FRIEDENSTEIN et al. (1970; 1976) Anfang der
1970er als adhärent wachsende Zellen mit der Fähigkeit zur Differenzierung in
verschiedene mesenchymale Zelllinien beschrieben. Anfang der neunziger Jahre
prägte CAPLAN (1991) den Begriff der mesenchymalen Stammzelle (MSC). Diese
fibroblastoiden Zellen mit einem pluripotenten Differenzierungspotenzial kommen in
verschiedenen Geweben, wie z.B. Knochenmark (CAPLAN 1991; PITTENGER et al.
1999; JIANG et al. 2002a), Fettgewebe (ZUK et al. 2001; JEON et al. 2008),
Nabelschnurblut (BIEBACK et al. 2004; J. W. KIM et al. 2004), peripherem Blut
(KUZNETSOV et al. 2001), Muskulatur (ALESSANDRI et al. 2004), Haut (LERMEN
1.4 Knorpel Tissue Engineering 11
et al. 2010) und Skelettmuskel (JIANG et al. 2002b) vor. Bisherige Untersuchungen
zeigen, dass die Anreicherung von MSCs aus verschiedenen Gewebetypen sehr
heterogene Ergebnisse liefert und diese bezüglich ihres Stammzellpotentials
erheblichen Schwankungen unterliegen (WAGNER u. HO 2007). Daher sind
Bezeichnungen wie mesenchymale Stromazellen, multipotente mesenchymale
Stromazellen oder mesenchymale Progenitorzellen u.a. üblich. Alle Bezeichnungen
beziehen sich auf dieselbe Population plastikadhärenter Zellen.
Als minimales Charakteristikum für MSCs wird Plastikadhärenz, die
Zelldifferenzierung entlang adipogener, osteogener und chondrogener Zelllinien
(siehe Abbildung 1.1) unter in vitro Bedingungen sowie Präsenz und Absenz
spezifischer Oberflächenantikörper beschrieben (DOMINICI et al. 2006). Laut
CAPLAN (1994) ist auch eine Differenzierung in andere mesenchymale Zellen, wie
z.B. Muskeln, Sehnen und Bänder, Markstroma und Nervengewebe möglich.
Abbildung 1.3: Differenzierungspotential pluripotenter Vorläuferzellen (MSC) (modifiziert nach http://www.sigmaaldrich.com/life-science/stem-cell-biology/mesenchymal-stem-cells.html, 15.04.2010)
Die Expression bestimmter Oberflächenmarker ist spezifisch für jede Spezies und Art
(DOMINICI et al. 2006). Da es sich bei unseren Spenderzellen um humane Zellen
12 1 Einleitung
handelt wurden hierfür spezifische Oberflächenmarker untersucht (PITTENGER et al.
1999).
MSCs wurden bereits aus zahlreichen Tierarten isoliert und klassifiziert, wie u.a.
Maus (JIANG et al. 2002b), Ratte (M. S. KIM et al. 2006; ISHIKAWA et al. 2007),
Kaninchen (GRIGOLO et al. 2009), Schwein (ZENG et al. 2006) und Schaf
(MCCARTY et al. 2009) sowie Rind (BOSNAKOVSKI et al. 2006), Ziege
(VERTENTEN et al. 2009), Hund (S. J. KIM et al. 2009) und Pferd (HEGEWALD et
al. 2004; VIDAL et al. 2008).
Die Vorteile der Verwendung von MSCs liegen in einer reduzierten Immunreaktion
(HORWITZ et al. 1999; AGGARWAL u. PITTENGER 2005), einer Resistenz
gegenüber niedrigen Sauerstoffkonzentrationen (GRIFFITH u. NAUGHTON 2002),
schneller Proliferation und einem hohen Differenzierungspotential unter dem Einfluss
von Wachstumsfaktoren (MEHLHORN et al. 2007; BASMANAV et al. 2008). Es liegt
auch keine Limitierung der Gesamtzellzahl vor, wie dies der Fall bei Chondrozyten
wäre, bedingt durch das begrenzte Entnahme- und Expansionsvermögen (CHAO et
al. 2007). Ein weiterer wichtiger Vorteil ist die Notwendigkeit von nur einem
chirurgischen Eingriff, sowie die Schonung des intakten Knorpelgewebes.
Ein weiterer potentieller Zelltyp für das Knorpel Tissue Engineering sind embryonale
Stammzellen (ESCs), die jedoch momentan keine klinische Relevanz besitzen.
1.4.2 Scaffolds
Scaffolds bieten den Zellen ein dreidimensionales Milieu, welches idealerweise der
der genuinen Knorpelmatrix ähnelt (biomimetische Scaffolds) und chondrogenes und
chondroinduktives Potential besitzt (bioaktive Scaffolds). Scaffolds sollten nicht nur
Zelladhärenz, sondern auch deren Rekrutierung ermöglichen (GETGOOD et al.
2009). So müssen Scaffolds biokompatibel und biodegradierbar sein, wobei die
Zersetzungskinetik des Materials und die Geweberegeneration idealerweise
synchronisiert sind. Grundsätzlich können die in Tabelle 1.1 beschriebenen
Materialien unterschieden werden.
1.4 Knorpel Tissue Engineering 13
Tabelle 1.1: Für Knorpel Tissue Engineering verwendete Materialien.
Scaffoldmaterialien Beispiele
Natürliche Polymere tierischen oder
pflanzlichen Ursprungs
Kollagen, Fibrin, Alginat, Chitosan
Resorbierbare oder stabile synthetische
Polymere
poly-α-hydroxyester wie PLA, PGA und
PLGA, polyethylenglycol (PEG), poly-ε-
caprolactone (PCL)
Resorbierbare oder stabile anorganische
Substanzen
Metall, Keramik
Kompositmaterialien aus natürlichen und
/oder synthetischen Polymeren
PCL/Hyaluronsäure, PCL/Collagen
Die strukturelle Beschaffenheit des Scaffolds entscheidet maßgeblich über die
Qualität des einwachsenden Gewebes. Sowohl Geometrie, Porengröße,
Faserstärke, Oberflächenstruktur, Elastizität und Härte können Adhäsion,
Differenzierung und Matrixexpression beeinflussen (ENGLER et al. 2006; O'SHEA u.
MIAO 2008). Hierbei spielen die Verbindungen der Zelle zur EZM bzw. artifiziellen
Scaffoldstruktur, die u.a. durch transmembrane Integrine vermittelt werden, eine
wichtige Rolle. Sie dienen nicht nur der Zelladhäsion, sondern fungieren auch als
Signalüberträger zwischen Zelle und EZM und beeinflussen auf diese Weise die
zelluläre Aktivität (RIVELINE et al. 2001; CAVALCANTI-ADAM et al. 2007; EVANS u.
CALDERWOOD 2007). So steht die EZM in direktem Kontakt mit dem Zytoskelett
(CHASTAIN et al. 2006).
Während der Zellverteilung und Bewegung ist die Aktinpolymerisation für die
Ausbildung von frühen Zellkontakten zur EZM verantwortlich (POLLARD u. BORISY
2003). Auf die Chondrogenese haben Integrine einen entscheidenden Einfluss
14 1 Einleitung
(IVKOVIC et al. 2003). Es konnte gezeigt werden, dass Chondrozyten an Kollagen
Typ I und IV, sowie Thrombospondin, Vitronectin, Fibronectin, Laminin und
Fibrinogen mittels RGD-Sequenz adhärieren (KORTESMAA et al. 2000).
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Scaffolds ist die Möglichkeit
Wachstumsfaktoren gezielt einzusetzen zur Förderung der Differenzierung.
1.4.3 Poly-ε-caprolactone
Poly-ε-caprolactone (PCL) ist ein semikristalliner, synthetischer biokompatibler und
biologisch abbaubarer poly-α-hydroxy Polyester (CAUSA et al. 2006) mit einem
Molekulargewicht von 80,000 Mw, einer Glasumwandlungstemperatur von -60 °C und
einem Schmelzpunkt bei 58-60 °C (SHOR et al. 2007).
1.4: Sekundärstruktur des Poly-ε-caprolactone
PCL erfüllt die für erfolgreiches Knorpel Tissue Engineering im Bereich
osteochondraler Defekte geforderten Materialeigenschaften, wie Biokompatibilität,
Biodegradierbarkeit, strukturelle Stabilität, Osteo- und Chondroinduktion, sowie
Sterilisierbarkeit und Lagerbarkeit (CAO et al. 2003). Studien haben mehrfach die
Kompatibilität von PCL-Scaffolds unterschiedlicher Zusammensetzung, Struktur und
Geometrie mit Chondrozyten, MSCs sowie Kokulturen gezeigt und weisen in
Kombination mit entsprechenden Wachtsumsfaktoren und Nährmedien eine
potentielle Osteo- und Chondroinduktivität nach (CAO et al. 2003; ENDRES et al.
2003; LI et al. 2003; LI et al. 2005b). Die Verbindung zwischen Zellen und PCL wird
u.a. durch die Integrine Vitronectin und Fibronectin vermittelt (CHASTAIN et al.
1.4 Knorpel Tissue Engineering 15
2006). PCL wird in vivo, aber auch in vitro, langsamer mittels Hydrolyse abgebaut als
andere poly(α-hydroxy-ester), wie z.B. poly-L-lactic acid (PLLA) und polyglycolic acid
(PGA) (ENGELBERG u. KOHN 1991) und kommt so z.B. auch für die Regeneration
instabiler Läsionen, ossärer Defekte wie auch für eine Langzeit-Medikamenten-
Zufuhr in Frage (ENDRES et al. 2003; LI et al. 2003).
PCL-Scaffolds sind trotz initial hoher struktureller Integrität elastischer als z.B.
Scaffolds aus PLGA, so dass auch der Kontraktion, die fibroblastoide Zellen, zu
denen die MSCs zählen, ausüben, standgehalten werden kann. Zudem können PCL-
Scaffolds mit Wachstumsfaktoren und/oder Makromolekülen der hyalinen EZM
kombiniert werden, wodurch Zellrekrutierung, -adhärenz, -differenzierung wie ebenso
eine gewebespezifische Matrixsynthese optimiert und gesteigert werden kann. Ein
weiterer Vorteil ist die gute Verfügbarkeit und der Preisvorteil gegenüber anderen
Polymeren (WILLIAMS et al. 2005).
Verarbeitungstechniken
Mit Hilfe verschiedener Techniken wie z.B. Rapid Prototyping, Fused Deposition
Modeling oder Elektrospinning ist es möglich eine fast unbegrenzte, individuelle
Form- und Strukturvariabilität der Scaffolds zu erzeugen.
Das Elektrospinning ermöglicht die Herstellung einer nicht gewebten, zufällig
angeordneten, dreidimensionalen Matrix mit einem Faserdurchmesser im Nano- und
Mikrometerbereich. Eine flüssige Polymerlösung, z.B. PCL, befindet sich in einer
Glasspritze und wird durch eine Metallkanüle kontinuierlich und mit einer bestimmten
Flussrate, bis sich ein Polymertropfen bildet, extrudiert. Die Metallkanüle und somit
auch das Polymer wird dann einer modifizierbaren elektrischen Spannung
ausgesetzt. Übersteigt die elektrische Spannung die Oberflächenspannung des
Tropfens, so formt sich ein feiner Strahl aus Polymerfasern, die auf einer ebenfalls
geladenen Kollektionsplatte aufgefangen werden. Durch Modulation der Flussrate,
der Polymerzusammensetzung und der angelegten Spannung kann der
Faserdurchmesser variiert werden. Durch e.g. Veränderungen der Variablen nimmt
die Oberflächenspannung des Strahls entweder zu oder ab, was zu einer Verengung
16 1 Einleitung
oder Erweiterung des Strahls und somit Formierung von Nano- oder Mikrofasern
führt.
Abbildung 1.5: Schematische Darstellung des Elektrospinnings. (A) Glasspritze mit PCL-Lösung, (B) Stromversorgung, (C) Nanofaserstrahl, (D) Copper Kollektionsplatte. Modifiziert nach Li et al. (2002).
Faserstärke
Die Herstellung von Fasern unterschiedlicher Stärke im Nano- bis Mikrometerbereich
ist insofern relevant, als dass es Ziel des Scaffoldings ist, ein biomimetisches, als ein
der genuinen Struktur ähnelndes, Konstrukt zu erzeugen, da gezeigt werden konnte,
dass Zellen grundsätzlich die Interaktion mit Nanostrukturen präferieren
(CAVALCANTI-ADAM et al. 2007; CHRISTENSON et al. 2007). So lassen sich mit
dem Elektrospinning Nanofasern herstellen, die einen Durchmesser haben, der
vergleichbar mit dem der Kollagen Typ II Fasern des hyalinen Knorpels ist (LI et al.
2002). Nanofasern haben eine erhöhte Anzahl an Atomen und Kristallen an ihrer
Oberfläche und weisen eine höhere Proteinadsorption aus z.B. Körperflüssigkeiten
auf (CHRISTENSON et al. 2007). Das Verhältnis zwischen Fläche und Volumen ist
größer als bei vergleichbaren Mikrobiomaterialien. So konnten LI et al. (2002; 2006b)
konsequenterweise zeigen, dass nanofibröse Scaffolds chondroprotektiv und
zelladhäsiv wirken und die Expression knorpelspezifischer Moleküle begünstigen,
1.4 Knorpel Tissue Engineering 17
wohingegen mikrofibröse Scaffolds zu einer Dedifferenzierung von Chondrozyten
führten.
Wachstumsfaktoren
Wachstumsfaktoren im Allgemeinen werden mit Scaffolds kombiniert, um Einfluss
auf Zellrekrutierung, -adhäsion und –differenzierung sowie deren gewebespezifische
Matrixsynthese zu nehmen. Dies ist insbesondere im Falle synthetischer Scaffolds
notwendig, da diese in der Regel, im Gegensatz zu Scaffolds aus Polymeren
natürlichen Ursprungs, keine intrinsische Bioaktivität aufweisen. Geeignete
Kandidaten zur Optimierung der chondrogenen Eigenschaften synthetischer
Scaffolds sind u.a. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) und Hyaluronsäure (HA).
TGF-β1 ist die häufigste Isoform des TGF-β und ubiquitär im Gelenkknorpel
vorhanden (GETGOOD et al. 2009). TGF-β1 wird in einer inaktiven Form sezerniert
und ist initial an ein latency-associated peptide (LAP) gebunden. Bevor es an seinen
Zielrezeptor binden und seine Wirkung entfalten kann, muss es vom LAP
dissoziieren. TGF-β1 kommt eine wichtige Rolle im Wachstum und der
Differenzierung von hyalinem Knorpel zu. Es reguliert zeit- und
konzentrationsabhängig u.a. die Zellproliferation und -differenzierung von
Chondroblasten und MSCs, sowie den EZM Metabolismus (LEE et al. 2004b;
DEFAIL et al. 2006). Darüber hinaus wurde ein inhibierender Effekt auf MMPs
beschrieben (ULRICH-VINTHER et al. 2005). Negative Effekte, wie Fibrose und
Entstehung von Osteophyten, treten erst bei höheren Dosierungen auf (GETGOOD
et al. 2009).
Innerhalb des hyalinen Knorpels ist die Hyaluronsäure (HA) das zentrale
Glycosaminoglycan (GAG). Im Gegensatz zu den anderen GAGs beinhaltet es keine
Sulfatgruppe und scheint nicht kovalent an Proteine zu binden. Trotz der fehlenden
kovalenten Bindung zu Proteinen ist es essentiell für aggregierende Proteoglykane
(PG) wie Aggrecan (SCHAGEMANN et al. 2008). HA bindet u.a. an den Zell-
Oberflächenrezeptor CD44 und unterstützt somit Zelldifferenzierung, -metabolismus
und -matrixsynthese (KNUDSON u. KNUDSON 2001; SCHAGEMANN et al. 2008).
Sie hat einen chondroprotektiven Effekt und wirkt unterstützend auf die chondrogene
18 1 Einleitung
Differenzierung von MSCs (MORELAND 2003; ERGGELET et al. 2007). Wie bereits
TGF-β1 wird auch HA ein inhibierender Effekt auf MMPs zugeschrieben (SASAKI et
al. 2004).
1.5 Schlussfolgerung und Aufgabenstellung
Fokale Gelenkknorpeldefekte heilen nicht und werden durch ein morphologisch,
metabolisch und biomechanisch inkompetentes Narbengewebe ersetzt. Dies führt
initial zu chronischen Schmerzen, Lahmheit und Einbußen bzgl. Leistungsfähigkeit
von z.B. Sportpferden. Zudem prädisponieren unbehandelte Knorpeldefekte zu
einem frühzeitig einsetzenden Verschleiß, der in letzter Konsequenz sogar die
Euthanasie des betroffenen Tieres zur Folge haben kann. Konservative Maßnahmen
haben allenfalls symptomatischen Charakter. Aber auch die etablierten regenerativen
Behandlungsstrategien, wie die MFX und ACT samt Modifikationen mit den
unterschiedlichsten Matrices, ermöglichen allenfalls die Regeneration eines
hyalinartigen Ersatzgewebes mit ungewisser Haltbarkeit und Funktion. Dennoch gibt
es Hinweise darauf, dass den MSCs, die per knochenmarkstimulierender Technik,
wie z.B. der MFX, in den Defekt eingeschwemmt werden, eine wesentliche Rolle im
Rahmen des Regenerationsprozesses zukommt (KNUTSEN et al. 2007; GILLE et al.
2010). Die größte Hürde stellt jedoch die gezielte Zellrekrutierung und -
Immobilisierung im Defekt, sowie je nach Lage im Defekt die chondrogene oder
osteogene Differenzierung samt gewebespezifischer Matrixsynthese dar.
Vor diesem Hintergrund war es Ziel der vorliegenden Arbeit, ein biomimetisches und
bioaktives Scaffold zu entwickeln, zu charakterisieren und zu erproben, welches
durch seine ultrastrukturelle Beschaffenheit, sowie molekulare Zusammensetzung in
der Lage ist, Vorläuferzellen zu rekrutieren und sie zur Adhäsion, chondrogenen
Differenzierung und knorpelspezifischen Matrixsynthese anzuregen. Dies würde die
dauerhafte Applikation externer chemischer (Wachstumsfaktoren) und/oder
biomechanischer Stimuli, wie üblicherweise propagiert und praktiziert, überflüssig
und die Initiierung knorpelspezifischer Regenerationsprozesse möglich machen.
1.5 Schlussfolgerung und Aufgabenstellung 19
Die Herstellung biomimetischer, also nano- und mikrofibröser Scaffolds aus PCL
erfolgte per Elektrospinning. Da synthetische Materialien per se keine intrinsische
Bioaktivität aufweisen, wurden die Scaffolds mit HA oder HA und TGF-β1
augmentiert. Die Charakterisierung der unterschiedlichen Scaffolds erfolgte mittels
REM und Lichtmikroskopie. Zudem wurde die chemotaktische Wirkung der
Wachstumsfaktoren (Migrationsassay) sowie deren Release (ELISA) untersucht. Die
Scaffolds wurden dann mit MSCs aus humanem Knochenmark besiedelt und unter
Standardbedingungen und ohne Zugabe weiterer Induktionsfaktoren in vitro kultiviert.
Die potentiell durch die Scaffolds induzierte Differenzierung und Proliferationsrate der
Zellen wurde per PCR, rtPCR und Picogreen Assay analysiert.
20 2 Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Allgemeine Lösungen
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10x Lösung (steril), pH 7,2
Folgende Substanzen wurden in deionisiertem Wasser (ddH2O) gelöst:
1,37 M NaCl
26,9 mM KaCl
0,1 M Na2HPO4 x 2H2O
17,6 mM KH2PO4
Einzelansätze wurden auf die 1x Konzentration in ddH2O verdünnt und anschließend
autoklaviert.
TRIS-Borat-EDTA-Puffer (TBE) 10x Lösung, pH 8,3
Folgende Substanzen wurden in Aqua dest. Gelöst:
1 M TRIS Ultra Pure
864 mM Borsäure
20 mM EDTA
Einzelansätze wurden auf die 1x Konzentration in ddH2O verdünnt.
FACS-Puffer (fluorescence activated cell sorting)
Folgende Substanzen wurden in PBS gelöst:
1% Bovines Serum Albumin
0,1% NaN3
Alzianblau Färbelösung
Folgende Substanzen wurden in 3% Essigsäure gelöst:
NaCl 4,5 g
MgCl2 6x H2O 6,4 g
Alcianblau 8 GX 0,25 g
Den Ansatz auf einen pH von 1,5 einstellen, filtrieren und dunkel lagern.
2.2 Primäre Zellkultur 21
Sudan III Färbelösung
0,03 g Sudan III
10 ml 70% Ethanol
BJ-Puffer (5x)
15% Ficoll
1% Bromphenolblau
4 M LiCl
500 mM EDTA
Die Substanzen wurden in ddH2O gelöst und anschließend steril filtriert.
2.2 Primäre Zellkultur
Zur Zellamplifizierung und -kultivierung wurden die Zelllinien sowie die
Differenzierungsansätze grundsätzlich in Brutschränken unter Standardbedingungen
bei 37°C, 100% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 inkubiert. Alle verwendeten Materialien,
Medien und Reagenzien wurden vor dem Einsatz sterilisiert, autoklaviert oder
sterilfiltriert. Arbeiten mit Zellen und Zelllinien erfolgten unter einer sterilen Werkbank.
Die Zellen wurden auf Gewebekulturplastik- oder Glasoberflächen kultiviert. Der
Mediumwechsel (MW) fand alle 3-4 Tage statt.
2.2.1 Kulturmedien
Für die Zellkultur und spezifische Differenzierungen wurden die folgenden Medien
verwendet.
Kultivierungsmedium
Das humane Knochenmark wurde bei Raumtemperatur (RTemp) in 20 ml sterilem
PBS mit 5000 IE Heparin transportiert. Kultiviert wurden die MSCs in Dulbeccos
Modified Eagles Medium mit 4500 ml/l D-Glucose (DMEM high glucose) mit
folgenden Additiven:
10% FKS
22 2 Material und Methoden
1% MEM Nicht-essentielle Aminosäuren
1% L-Glutamin
1% Penicillin/Streptomycin
1% Sodium Pyruvat
300 µM Vitamin C (steril filtriert)
adipogenes Induktionsmedium
Dem Kultivierungsmedium wurden folgende Zusätze beigefügt:
2 µM Insulin
500 µM IBMX
1 µM Dexamethason
200 µM Indomethacin
adipogenes Erhaltungsmedium
Dem Kultivierungsmedium wurden folgende Zusätze beigefügt:
10 µM Insulin
osteogenes Induktionsmedium
Dem Kultivierungsmedium wurden folgende Zusätze beigefügt:
0.1 µM Dexamethason
10 M β-Glycerophosphat
chondrogenes Induktionsmedium
DMEM high Glucose wurde ergänzt durch:
1% L-Glutamin
1% Penicillin/Streptomycin
1% Sodium-Pyruvat
1% MEM Nicht-essentielle Aminosäuren
1% ITS+ Premix
0.1 µM Dexamethason
1 mM L-Prolin
2.2 Primäre Zellkultur 23
300 µM Vitamin C
10 ng/ml TGF-β 1
2.2.2 Zellisolierung
Knochenmark wurde aus dem Hüftkopf sowie dem proximalen Femur im Rahmen
von Totalendoprothese-Operationen in der Klinik für Chirurgie des Stütz- und
Bewegungsapparates, Sektion für Orthopädie (Direktor Prof. Russlies) des UK S-H
Campus Lübeck gewonnen. Dabei wurden die von der Universität zu Lübeck
geforderten wissenschaftlichen und ethischen Richtlinien zur Anzeige von
Organentnahmen und Gewebematerial zu wissenschaftlichen Zwecken
(Aktenzeichen: 08-085) beachtet und gewahrt.
Das Probenmaterial wurde in Behältnisse mit 20 ml PBS und 5000 IE Heparin steril
überführt. Anschließend wurde das Material im Labor bei RTemp aufgearbeitet und
ausplattiert. Hierbei wurde darauf geachtet, dass nicht mehr als 2 h zwischen
Probengewinnung und Ausplattierung lagen. Gröbere Proben wurden auf 6 cm
Gewebekulturplastikschalen ausplattiert und mit Kultivierungsmedium bedeckt. Der
Überstand wurde in ein 50 ml Falkon überführt und 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert.
Das Pellet und der Fettüberstand wurden in Kultivierungsmedium resuspendiert und
auf 6 cm Gewebekulturplastik ausplattiert. Durch mehrmaliges gründliches Spülen
der Schale mit PBS wurden nicht-adhärente Zellen entfernt (erste Selektion).
2.2.3 Zellpassage
Bei einer Konfluenzdichte von 80-90% wurden die Zellen 1:3, bei langsamem
Wachstum 1:2, auf Zellkulturflaschen umgesetzt. Hierfür wurde das Medium
abgesaugt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die
Zellen für 3-5 min bei 37 °C mit Trypsin-EDTA inkubiert. Das Ablösen der Zellen von
der Gewebekulturplastikschale bzw. den Zellkulturflaschen mit Filter wurde unter
dem Lichtmikroskop kontrolliert. Die abgelösten Zellen wurden nun mit 10 ml
Kultivierungsmedium von der Oberfläche gespült und in ein 50 ml Falkon überführt.
Nach einer 5-min Zentrifugation bei 1000 rpm wurde der Überstand abgesaugt und
das Pellet in 10 ml Medium resuspendiert. Nach Zählung (siehe 2.2.4) wurden die
24 2 Material und Methoden
Zellen auf Gewebekulturflaschen ausplattiert, kryokonserviert (siehe 2.2.5),
durchflusszytometrisch analysiert oder für einen Versuch verwendet.
2.2.4 Zellzählung
Mit Hilfe einer Thoma-Zählkammer wurde die Zellzahl bestimmt. Hierfür wurden 10 µl
resuspendierter Zellen auf die Zählkammer gegeben und unter dem Lichtmikroskop
ausgezählt. Für jede Bestimmung wurden Doppelwerte verwendet. Die genaue
Zellzahl errechnete sich aus folgender Formel:
2.2.5 Kryokonservierung
Zur Kryokonservierung wurden die gezählten Zellen erneut 5 min bei 1000 rpm
zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1,5 ml Kultivierungsmedium mit 8%
Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert und in vorgekühlte Kryoröhrchen überführt.
Diese wurden umgehend in einen Kryo-Container verbracht und über Nacht bei
-80 °C gelagert. Anschließend wurden die Kryoröhrchen in flüssigen Stickstoff
(-196 °C) zur Langzeitkonservierung überführt.
Zum Auftauen wurden die Kryoröhrchen bei 37 °C aufgetaut und in 15 ml Falkons mit
10 ml 37 °C warmem Kultivierungsmedium überführt und vermischt. Das Falkon
wurde dann 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Das Pellet wurde anschließend in
Kultivierungsmedium resuspendiert und auf Gewebekulturflaschen ausplattiert.
2.3 Durchflusszytometrie
Mittels Durchflusszytometrie lässt sich über fluoreszenzaktivierte Antikörper die
Präsentation verschiedener Oberflächenmarker nachweisen. Bestimmte
Oberflächenmarker der Zellen werden durch, an passende Antikörper gebundene,
Fluoreszenzfarbstoffe markiert (siehe Tabelle 2.1). Die gefärbten Zellen befinden
sich in einer wässrigen Lösung. In einem hydrodynamischen System wird ein
2.3 Durchflusszytometrie 25
laminarer Flüssigkeitsstrom erzeugt. Dieser presst die zuvor mit Fluoreszenzfarbstoff
markierten Zellen über ein Schlauchsystem durch einen Messkopf und führt so zu
einer Verengung des Strahls, so dass ein einzelnes Durchtreten der Zellen am
Analysepunkt gewährleistet wird. Hier passieren sie einen Laserstrahl. Trifft das Licht
des Lasers auf eine Zelle wird es gestreut und mittels Detektoren nachgewiesen.
Eine Analyse besteht aus der Summe vieler schnell hintereinander folgender
Einzelmessungen. Die Hintergrundfluoreszenz wird durch unspezifische
Isotypkontrollen gemessen.
Die durchflusszytometrische Untersuchung erfolgte am Modular Flow (DAKO,
Cambridgeshire, UK). Hierbei wurden je Probe 5000-15000 Events gemessen. Die
Messung erfolgte in der dritten bis siebten Passage der Zellen. Je 10 µl der
Antikörper (Ausnahmen: für CD90 nur 5 µl Antikörper und für die Negativkontrolle
kein Antikörper) wurden in separate Eppendorfröhrchen vorgelegt und dunkel bei
4 °C unter Ausschluss von Licht aufbewahrt. Nach Abtrypsinierung der Zellen wurden
sie mit 10% BSA (in PBS) von der Oberfläche gespült und gezählt. Für eine
erfolgreiche Messung war eine Mindestzellzahl von 5x105 notwendig, die in 2 ml 10%
BSA (in PBS) aufgenommen, resuspendiert und je 100 µl der Zellsuspension in die
zuvor vorbereiteten Eppendorfröhrchen überführt wurden. Alle Ansätze wurden gut
durchmischt und 30 min bei 4 °C unter Ausschluss von Licht inkubiert. Nach Zugabe
von 1 ml FACS Puffer und 1 min bei 4000 rpm Zentrifugation wurde der Überstand
verworfen und das Pellet in 600 µl FACS-Puffer resuspendiert. Die Messung erfolgte
unverzüglich. Untersucht wurden Zellen, angefärbt mit Phycoerthrin (PE)
konjugiertem monoklonalen Antikörper (mAK) und Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
konjugiertem mAK, auf die Präsenz bzw. Absenz von in Tabelle 2.1 beschriebenen
Oberflächenmarkern. Es wurde je eine Kontrolle mit PE und FITC gefärbten Zellen
ohne Antikörper gemacht und eine Negativkontrolle ohne Färbung der Zellen. Die
Bearbeitung der Daten erfolgte mit dem Programm Summit 4.3 (DAKO,
Cambridgeshire, UK).
26 2 Material und Methoden
Tabelle 2.1: FACS-Antikörper zum Nachweis von Oberflächenantikörpern zur Klassifizierung der isolierten Zellen aus humanem Knochenmark.
Marker hämatopoetischer Zellen Konjugat Bezeichnung
CD34 PE GP105-120
CD45 FITC Leucocyte common antigen
Marker pluripotenter Zellen Konjugat Bezeichnung
CD13 PE Aminopeptidase N
CD29 PE β1 integrin
CD44 PE GP80-95 (H-CAM)
CD49d PE α4 integrin
CD54 PE Intercellular adhesion molecule-1
CD73 PE Ecto-5‘-nucleotidase
CD90 PE Thy-1 Membrane Glycoprotein
CD106 PE Vascular cell adhesion molecule 1
CD133 PE Prominin-1
CD140b PE Platelet-derived growth factor receptor β
CD166 PE Activated leucocyte cell adhesion molecule
CD271 PE Nerve growth factor
2.4 Differenzierung primärer Zellen
Die isolierten plastikadhärenten Zellen wurden auf ihre Pluripotenz überprüft, indem
sie in die adipogene, chondrogene und osteogene Zellline differenziert wurden. Die
adipogene und osteogene Differenzierung wurde für 21 Tage angesetzt mit
Erntezeitpunkten in uninduziertem Zustand nach 1-2 Tagen, sowie induziert nach 14
und 21 Tagen. Die chondrogene Differenzierung wurde für 28 Tage angesetzt mit
Erntezeitpunkten in uninduziertem Zustand nach 3-5 Tagen und induziert nach 21
und 28 Tagen.
2.5 Histologie 27
2.4.1 Adipogene Differenzierung
Für die adipogene Differenzierung wurden 5000 Zellen/cm² auf 6 cm Petrischalen
und Culture Slides im Monolayer mit Kultivierungsmedium ausplattiert, welches nach
1-2 Tagen gegen adipogenes Induktionsmedium ausgetauscht wurde. Der MW fand
alle 3-4 Tage statt, wobei alternierend adipogenes Induktionsmedium und
Erhaltungsmedium verwendet wurde. Bei jedem MW wurden die Zellen zweimal mit
PBS gewaschen, um Reste des vorigen Mediums zu entfernen. Zellwachstum und –
morphologie wurden lichtmikroskopisch kontrolliert. An den Endpunkten wurde RNA
und Proben für histologische Färbungen gewonnen.
2.4.2 Osteogene Differenzierung
Die osteogene Differenzierung wurde entsprechend der adipogenen angesetzt. Zur
Ausplattierung wurde ebenfalls Kultivierungsmedium verwendet, welches jedoch
nach 1-2 Tagen gegen osteogenes Induktionsmedium ausgetauscht wurde.
2.4.3 Chondrogene Differenzierung
Für die chondrogene Differenzierung wurden dreidimensionale Micromassbodies
(MMB) hergestellt. 2,0-2,2x105 Zellen wurden in 0,5 ml chondrogenem
Induktionssmedium aufgenommen (Negativkontrolle in Kultivierungsmedium), in
15 ml Falkons überführt und 5 min bei 500 rpm zentrifugiert. Für die RNA-Isolierung
wurden an Tag 3-5 (Negativkontolle), 21 und 28 je 4 MMBs mit PBS gewaschen und
in den Lysis Puffer aus dem Nucleo Spin RNAII Kit überführt. Der Lysis-Puffer wurde
mit 1% β-mercaptoethanol versetzt.
Je ein MMB wurde nach erfolgter Waschung mit PBS für Gefrierschnitte blasenfrei
mit Tissue Tec in einem Cryomold eingebettet und bei -20 °C eingefroren.
2.5 Histologie
Für die histologischen Färbungen wurden auf Culture Slides ausplattierte Zellen der
Differenzierungsversuche verwendet. Die Ernte fand bei der adipogenen und
osteogenen Differenzierung uninduziert an Tag 1-2 statt, induziert an den Tagen 14
28 2 Material und Methoden
und 21. Vor dem Färbeprotokoll wurde das Medium verworfen und zweimal mit PBS
gewaschen.
Für die chondrogene Differenzierung wurden die MMBs uninduziert nach 3-5 Tagen
geerntet und induziert an den Tagen 21 und 28. Die in Tissue Tec eingebetteten
MMBs wurden am Kryotom geschnitten (Histologie: 16 μm Dicke,
Immunhistochemie: 10 μm Dicke) und für 24 h bei RTemp luftgetrocknet.
Nach der Färbung wurden die Schnitte mit Vectashield eingedeckt und bei 4 °C
lichtgeschützt gelagert.
2.5.1 Sudan III Färbung
Zum Nachweis von Adipozyten kann Sudan III, ein in Kohlenwasserstoffen, Ölen,
Fetten und Wachsen löslicher Azofarbstoff, verwendet werden, der intrazelluläre
Lipidvakuolen anfärbt.
500 µl der Färbelösung wurden in jede Kammer des Culture Slides gegeben und
15 min inkubiert. Die Färbung wurde unter dem Lichtmikroskop kontrolliert bevor die
Färbelösung abgesaugt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen wurden. 500 µl
Hämatoxylin wurden in jede Kammer gegeben und 10 sec inkubiert. Zum Bläuen des
Hämatoxylins wurden die Zellen mit H2O gewaschen und mit ddH2O nachgespült.
2.5.2 Alkalische Phosphatase
Charakteristisch für Osteoblasten bzw. eine osteogene Zelldifferenzierung ist die
Expression des Oberflächenenzyms alkalische-Phosphatase, die ein früher Marker
für Osteogenese ist.
Es wurde bei RTemp ein alkalische Phosphatase Kit von Sigma (München,
Germany) verwendet. Zuerst wurde eine Fixierlösung aus 2,5 ml Citratlösung, 6,5 ml
Azeton und 0,8 ml 37% Formaldehyd hergestellt, sowie eine Naphtol-Färbelösung
aus 12,5 µl Sodium Nitrit Lösung und 12,5 µl FRV Alkaline Phosphatase Lösung, die
laut Protokoll nach 2 min Inkubation mit 563 µl ddH2O und 12,5 µl Naphtol AS-BI
Alkaline Lösung vermischt wurde. Für 30 sec wurde die Fixierlösung auf die Zellen
2.5 Histologie 29
gegeben. Nach Inkubation wurden die Zellen dreimalig über mindestens 45 sec mit
ddH2O gewaschen. 500 µl der Naphtol-Färbelösung wurden je Kammer des Culture
Slides hinzugegeben und 15 min unter Lichtausschluss inkubiert. Erneut wurde 2 min
mit ddH2O gewaschen. Zur Anfärbung der Zellkerne wurde 10 sec Hämatoxylin
hinzugegeben, welches mit H2O gebläut und mit ddH2O nachgespült wurde.
2.5.3 Alzianblau Färbung
Alzianblau, ein wasserlöslicher Phthalocyaninfarbstoff, wird zur selektiven
Darstellung saurer Mukosubstanzen, insbesondere knorpelspezifischer PGs genutzt.
16 µm dicken Schnitte wurden zweimal in PBS gewaschen und anschließend 30 min
in 3,7% Formaldehyd fixiert. Die Fixierlösung wurde abgesaugt und die Schnitte
dreimalig in PBS gewaschen. Die Alzianblau-Färbelösung (siehe 2.1) wurde
hinzugegeben und über Nacht bei RTemp inkubiert. Am folgenden Tag wurde diese
abgesaugt und die Schnitte dreimalig mit PBS gewaschen.
2.5.4 Kollagen Typ II Färbung
Das für hyalinen Knorpel charakteristische Kollagen Typ II wurde
immunhistochemisch nachgewiesen. Hierfür wurde ein Anti-Kollagen Typ II
Primärantikörper (II-II6B3, Spendertier: Mus musculus) und ein FITC-konjugierter
Anti-Mouse-IgG Sekundärantikörper verwendet. Die Zellkerne wurden mit
4´,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) angefärbt. Das Absorptionsmaximum von FITC
lag bei 495 nm, das Emissionsmaximum bei 528 nm Wellenlänge. Das
Absorptionsmaximum von DAPI lag bei 358 nm, das Emissionsmaximum bei 461 nm
Wellenlänge. DAPI wurde mit ultraviolettem Licht zu blauer Fluoreszenz und FITC
mit blauem Licht zu grüner Fluoreszenz angeregt.
Die 10 µm dicken Kryoschnitte wurden zweimalig mit PBS gewaschen und 5 min mit
-20 °C kaltem Methanol-Aceton-Gemisch (70% zu 30%) fixiert. Rückstände der
Fixierlösung wurden vollständig entfernt und mit 7,5% BSA-Lösung 30 min bei
RTemp geblockt. Alle folgenden Inkubationsschritte wurden in einer feuchten
Kammer bei RTemp durchgeführt. Nach erneuter Waschung mit PBS wurde der
Primärantikörper 1:50 in PBS für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Schnitte wurden
30 2 Material und Methoden
dreimalig mit PBS gewaschen und mit dem Sekundärantikörper 1:200 in PBS, mit
1:1000 DAPI für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Auswertung erfolgte mittels
Fluoreszenzmikroskopie am Axioplan 2 mit Axiocam MRc5 (Carl Zeiss, Jena,
Germany).
2.6 Genexpression
Während der in vitro Differenzierung wurde die Expression gewebespezifischer
mRNA mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) überprüft. Hierfür musste zunächst
die RNA aus den Zellen isoliert und aufgereinigt werden. Durch eine Reverse
Transkription (RT) wurde die RNA in komplementäre cDNA umgeschrieben.
Anschließend wurde im Verlauf der PCR durch Anlagerung (Annealing)
sequenzspezifischer Primerpaare an die cDNA die Amplifikation des
primerspezifischen Genabschnittes bewirkt. Nach Abschluss der PCR fand eine
Einfärbung mit Ethidiumbromid statt, welches in Nukleinsäuren interkaliert und mittels
ultraviolettem-Licht darstellbar ist. Das PCR-Produkt wurde gelelektrophoretisch
aufgetrennt und unter ultraviolettem-Licht sichtbar gemacht. Die spezifische
Genexpression wurde semiquantitativ bestimmt und statistisch ausgewertet.
2.6.1 Isolierung von RNA
Zur Isolierung der RNA wurde das NucleoSpin®RNA II Kit von Machery-Nagel
(Düren, Germany) verwendet. Nach Entfernen des Mediums und anschließender
dreimaliger Waschung mit PBS wurden 350 µl Guanidinthiozyanat-haltiger Lysis-
Puffer (Puffer RA1) sowie 3,5 µl β-Mercaptoethanol aufgebracht. Die Zellen wurden
mittels Zellschaber vom Plastik abgelöst, in Eppendorfröhrchen überführt und
mechanisch lysiert. Um das Lysat zu reinigen und die Viskosität zu reduzieren,
wurde es auf die im Kit enthaltenen rosa Säulen, mit Auffangröhrchen, gegeben
(NucleoSpin® Filter Säulen). Die Säulen wurden 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert.
Um die RNA-Bindungs-Konditionen korrekt einzustellen, wurden die Proben in dem
Auffangröhrchen mit 350 µl 70% Ethanol homogenisiert. Das Lysat-Ethanol-Gemisch
wurde dann auf die im Kit enthaltenen blauen Säulen gegeben (NucleoSpin®RNA II
2.6 Genexpression 31
Säulen) und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert, wobei die RNA von dem Filter
gebunden wurde. Anschließend wurden die Salze mittels Zugabe von 350 µl
Membran Entsalzungspuffer (MDB) und erneuter 1 minütiger Zentrifugation bei
10000 rpm entfernt, wodurch die rDNase-Verdauung effizienter wurde. Um
Verunreinigungen durch DNA an der Membran zu verdauen, wurde ein Gemisch aus
10 µl rDNase und 90 µl Reaktionpuffer für rDNase (Reaktionspuffer für rDNase) je
Probe vorbereitet und hiervon 95 µl auf jede Säule gegeben. Die Säulen wurden bei
RTemp 15 min inkubiert. Um diese Verdauung zu beenden, wurde die
Siliziummembran mit 200 µl Puffer (RA2) gewaschen und 1 min bei 10000 rpm
zentrifugiert. Anschließend erfolgten zwei weitere Waschungsschritte mit 600 µl
Puffer (RA3) und 250 μl Puffer (RA3) mit jeweils einer Zentrifugation bei 1000 rpm für
1 min. Um die Membran nun vollständig zu trocknen, wurde 3 min bei 12000 rpm
zentrifugiert. Die Säulen wurden in nukleasefreie 1,5 ml Eppendorfröhrchen platziert
und in 60 µl RNase-freies H2O eluiert und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Hierbei
wurde die RNA gelöst und mit RNase-freiem H2O in das Eppendorfröhrchen
überführt. Die RNA konnte nun gemessen und weiterverarbeitet werden. Zur
Lagerung wurde sie bei -20 °C eingefroren.
2.6.2 Reverse Transkription
Für die Reverse Transkription (RT) wurden 500 ng RNA benötigt. Die Messung
erfolgte, im Falle der Differenzierungsversuche, an einem Photometer mit
Einmalküvetten (Photometer Bio Mate 3). Hierfür wurde eine Verdünnung mit RNA
(3 μl) und DEPC-H2O (97 μl) hergestellt. Für die Messung eines Leerwertes wurden
100 µl des DEPC-H2O verwendet. Die Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von
260 nm und 280 nm.
Für die RT wurde das Revert Aid H Minus Frost Strand cDNA Synthesis Kit
(Fermentas, St.Leon, Germany) verwendet. Alle Arbeiten fanden bei 4 °C statt.
500 ng der gewünschten RNA wurden mit DEPC-H2O auf ein einheitliches Volumen
von 11 μl aufgefüllt. Zu jeder Probe wurde 1 µl Oligo(dT)-Primer hinzugegeben. Die
Proben wurden sorgfältig durchmischt, für 5 min bei 65 °C inkubiert und
anschließend auf 4 °C gekühlt. Durch die an den Poly-A-Schwanz der mRNA
32 2 Material und Methoden
bindenden Primer (Oligo(dT)-Primer) kann die im folgenden Schritt hinzugegebene
RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) einen cDNA-Strang
synthetisieren. 8 µl eines Mastermixes, bestehend aus 4 µl 5-reaction-buffer, 1 µl
Ribo Lock RNase, 2 µl dNTP (10mM) und 1 µl Reverse Transkriptase wurden jeder
Probe hinzugefügt und durchmischt. Die Proben wurden 60 min bei 42 °C inkubiert.
Die enzymatische Reaktion wurde durch ein 5-minütiges Aufheizen auf 70 °C
inaktiviert. Die Proben wurden bei -20 °C gelagert oder direkt in einer PCR
verwendet.
2.6.3 Polymerase Kettenreaktion
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) beinhaltet drei sich wiederholende Schritte
(Denaturierung, Annealing und Elongation), die in Abhängigkeit des verwendeten
Primers unterschiedlich häufig wiederholt werden.
Die Proben wurden bei 4 °C verarbeitet. Zu Beginn der PCR wurde ein Mastermix
angesetzt, der je Probe 13,2 μl DEPC-H2O, 2,5 μl Puffer (10x Magnesiumpuffer),
1,8 μl 25 mM MgCl2, 4 μl DNTP (2,5 mM je DNTP), 0,25 μl Taq-Polymerase und je
1,25 μl Primer (vorwärts und rückwärts) enthielt. Je Probe wurden 0,75 μl cDNA
vorgelegt und 24,25 μl Mastermix hinzugegeben. Nach einer gründlichen
Durchmischung wurden die Proben in den Thermozykler gegeben, der entsprechend
des verwendeten Primers programmiert war (siehe Tabelle 2.2). Alle Proben
durchliefen eine zweiminütige Initialisierung bei 95 °C, gefolgt von 40 Sek.
Denaturierung bei 95 °C, 40 Sek. Annealing, wobei die Temperatur hier 5-10 °C
unter dem Schmelzpunkt des Primers lag, und 40 Sek. Elongation bei 72 °C. Im
Anschluss an den letzten Zyklus wurde die DNA für 8 min bei 72 °C inkubiert und
anschließend auf 4 °C abgekühlt. Es folgte die Auftragung auf ein Gel mit
anschließender Gelelektrophorese. Die DNA musste solange bei 4 °C aufbewahrt
werden.
2.6 Genexpression 33
Tabelle 2.2: Primer zur Verwendung bei der PCR. Aufgelistet sind die für das Markergen spezifischen Primer mit den dazugehörigen Sequenzen, Annealingtemperaturen, Zyklenanzahl und Fragmentgröße.
Gen →Forward Primer
←Reverse Primer
Annealing
Temp. °C
Zyklen Länge
(bp)
Ad
ipo
gen
e D
iffe
ren
zie
run
g
aP2 →GCTTTGCCACCAGGAAAGTG
←ATGACGCATTCCACCACCAG
60°C 35 279
PPARγ →AAACTCTGGGAGATTCTCCT
←TCTTGTGAATGGAATGTCTT
56°C 35 247
C/EBP →AGAAAGGGGTGGAAACATAGG
←GAAAGCTGAGGGCAAAGG
58°C 35 685
Oste
og
en
e D
iffe
ren
zie
run
g
Alk. Phosph. →ACCTGGGCATTGGTGTTGT
←GGAGATGGGATGGGTGTCT
58°C 38 146
Osteopontin →CATTCAACTCCTCGCTTTCCAAG
←ACTGATTTTCCCACGGACCT
58°C 35 199
Osterix →GCAAAGCAGGCACAAAG
←AGGGAATGAGTGGGAAAAGG
58°C 38 237
MSX2 →GCTGATGGGGAAAGGGAGA
←CCTCGGTCAAGTCGGAAA
58°C 38 377
RunX2 →GAGGCGGTCAGAGAACAAAC
←ATGGCGGGTAACGATGAA
58°C 38 270
34 2 Material und Methoden
Ch
on
dro
gen
e
Dif
fere
nzie
run
g
Collagen II →ACAGTCTTGCCCCACTTACC
←AGGCTCCCAGAACATCACCT
58°C 35 352
Aggrecan →CGCAGGGATAAAGGACTGAA
←GCCACTGAGTTCCACAGA
58°C 35 441
Sta
nd
ard
Gapdh →CCGCATCTTCTTTTGCGTCGC
←GCAACTGTGAGGAGGGGAGATT
CAG
55°C 30 1100
2.6.4 Gelelektrophorese und Densitometrie
Für die Gelelektrophorese wurde ein 2%-iges Agarose-Gel in 1x TBE-Puffer 20mit
25 ng/ml Ethidiumbromid verwendet. Ethidiumbromid lagert sich in die
doppelsträngige DNA ein und ist durch ultraviolettes Licht sichtbar zu machen. Nach
vollständiger Aushärtung in einer Gelkammer konnte es mit Proben beladen werden.
Die Proben wurden mit BJ-Puffer (siehe 2.1) versetzt (7 μl Probe und 5 μl BJ-Puffer)
und anzentrifugiert. Um einen DNA-Längenstandard für die später sichtbaren
Banden zu haben, wurde eine 1 Kb DNA-Leiter aufgetragen die das
Molekulargewicht der DNA-Fragmente darstellt. 20 μl 1 Kb DNA Leiter wurden in
40 μl BJ-Puffer und 140 μl ddH2O gelöst. Das Agarosegel wurde mit 1x TBE-Puffer
überschichtet. Die Taschen des Gels wurden mit 12 μl Probe-Puffer-Gemisch befüllt.
Von der Leiter wurden ebenfalls 12 μl verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei
100 V in horizontalem Lauf über 45-60 min. Im Anschluss wurde das Gel unter
Anregung mit ultraviolettem Licht fotografiert, wobei die PCR-Produkte durch das
Ethidiumbromid sichtbar wurden. Die Auswertung erfolgte mittels ImageJ Software
(NIH, Bethesda, USA), bei der die Intensität der einzelnen Banden gemessen wird.
Die Intensität der Banden der gewebespezifischen Primer wurde in Relation zur
Intensität der Banden des internen Standards GAPDH gesetzt. Je Bedingung
(adipogene, chondrogene oder osteogene Differenzierung) wurde jeweils der
2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 35
höchste Expressionswert als 100% gewertet. Alle weiteren Messungen wurden auf
diesen Maximalwert bezogen.
2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds
Alle Versuche wurden unter Standardbedingungen (siehe 2.2) inkubiert. Die
Probenentnahmen erfolgten im Anschluss an die Besiedlung an Tag 1-3, 21 und 28.
Je Endpunkt waren drei Scaffolds zur Bestimmung für RNA-Isolierung vorgesehen,
und je ein Scaffold zur Bestimmung des cDNA Gehaltes sowie zur histologischen
und immunhistochemischen Ausgewertung.
2.7.1 Scaffoldherstellung
Nano- und mikrofibröse Scaffolds wurden in Zusammenarbeit mit der Mayo Clinic
College of Medicine, Cartilage and Connective Tissue Research, Rochester-
Minnesota, mittels Elektrospinning Technik hergestellt. Zur Herstellung nanofibröser
Scaffolds wurden 1,05 g 80,000 Mn Poly-ε-caprolacton (PCL) in 0,8 g
N,N-dimethylformamide, 6,0 g Chloroform und 3,2 g Azeton gelöst, 4 h in einem
geschlossenen Behältnis bei RTemp zu einer 10,5 wt%-igen homogenen Lösung
vermischt und anschließend in eine 30 ml Glasspritze blasenfrei aufgezogen. Die
Spritze wurde mit einer 10 cm langen 20-gauge Metallnadel ausgestattet. Die Lösung
wurde einem 30 kV elektrischem Feld ausgesetzt, während sie, bei einer
Durchflussrate von 3,3 ml/h, appliziert wurde. Die elektrostatisch aufgeladenen
Fasern wurden auf einer Glasplatte (Kollektionsplatte) aufgefangen. Der Abstand
zwischen Nadelspitze und der Kollektionsplatte betrug 15 cm.
Im Unterschied zu den nanofibrösen Scaffolds wurde bei den mikrofibrösen Scaffolds
eine 12.5 wt%-ige PCL-Lösung (1,9 g 80,000 Mn PCL gelöst in 15,0 g Chloroform)
verwendet. Zudem wurde ein elektrisches Feld von 12 kV erzeugt bei einer
Durchflussrate von 0,5 ml/h. Der weitere Ablauf entsprach dem der Herstellung der
nanofibrösen Scaffolds.
36 2 Material und Methoden
Die Faserqualität beider Fabrikationsansätze wurde lichtmikroskopisch kontrolliert.
Bei einer Fleecedicke auf der Kollektionsplatte von 1 mm wurde der
Fabrikationsprozess beendet. Aus dem hergestellten Fleece wurden Scheiben mit
einem Durchmesser von 6 mm ausgeschnitten. Zur Sterilisation wurden die Scaffolds
über Nacht mit Ethylenoxid begast.
2.7.2 Scaffoldaugmentation
Zur Herstellung hyaluronsäurehaltiger Scaffolds wurden Scheiben beider
Faserstärken in eine Lösung aus gereinigter 1%-iger Natrium-Hyaluronsäure (Mw:
1,65x106 Da) -gelöst in ddH2O- getaucht und gefriergetrocknet. Diese
Hybridscaffolds wurden mit VSNHA und VSMHA gekennzeichnet.
Zur Herstellung TGF-β1-haltiger Scaffolds wurden Scheiben beider Faserstärken wie
oben beschrieben zunächst mit Hyaluronsäure augmentiert und in einem zweiten
Schritt zusätzlich mit 200 ng TGF-β1 (R&D, Minneapolis, USA), gelöst in 20 μl 0,1%
BSA in 4 mM HCl, welches ebenfalls durch Gefriertrocknung fixiert wurde. Diese
Hybridscaffolds wurden mit VSNTGF und VSMTGF gekennzeichnet.
Als Kontrolle dienten Scaffolds beider Faserstärken, auf die weder TGF-β1, noch
Hyaluronsäure aufgetragen wurde. Sie erhielten lediglich den Träger (20 μl
0,1%-iges BSA in 4 mM HCl), welcher ebenfalls mittels Gefriertrocknung fixiert
wurde. Diese Kontrollscaffolds wurden mit VSN und VSM gekennzeichnet.
Zusätzlich wurde eine weitere Kontrollgruppe nanofibröser Scaffolds ohne weitere
Zusätze hergestellt. Hier sollte das chondrogene Differenzierungspotential durch
Zugabe des Wachstumsfaktors TGF-β1 ins Medium dargestellt werden. Diese
Scaffolds wurden mit VSP gekennzeichnet.
2.7.3 Scaffoldcharakterisierung
Scaffoldmorphologie
Die Ultrastruktur unbesiedelter, nicht-augmentierter Scaffolds unterschiedlicher
Faserstärke wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Hierfür
wurden die Scaffolds auf Objektträgern aus Aluminium befestigt und mit
2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 37
Gold/Palladium beschichtet. Aufgrund Fehlens organischer Substanzen konnte auf
eine Fixierung und Dehydrierung verzichtet werden. Bilder wurden an einem Hitachi
S400 Rasterelektronenmikroskop bei 3 kV erzeugt.
Zellmigration
Mit Hilfe eines Migrationsassays sollte überprüft werden, ob die Scaffolds per se
bzw. die Augmentation mit Hyaluronsäure und TGF-β1 eine chemotaktische Wirkung
i.S.e. Rekruitments auf die MSCs haben.
Hierfür wurden 3x104 MSCs der dritten Passage mit 40 μl serumfreiem Diätmedium
(1 g/l Glucose, 0,5% BSA, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml
Streptomycin) vermischt und als Tropfen auf den Polycarbonatfilter
(Porendurchmesser: 8 μm) einer speziellen Chemotaxis 96-well-Platte pipettiert. Die
in Diätmedium getränkten Scaffolds befanden sich im Well unterhalb des Filters. Für
eine Positivkontrolle wurden die Wells mit Kultivierungsmedium befüllt, für die
Negativkontrolle mit Diätmedium. Nach 24 h und 48 h wurden die Zellen 3 min mit
eiskaltem Ethanol/Aceton (1:1 v/v) fixiert. Anschließend wurden die Zellen von der
Oberseite des Filters entfernt und die migrierten Zellen auf der Unterseite des Filters
mit einem Schnellfärbesystem (Hemacolor®: rot) angefärbt. Nach dreimaligem
Spülen mit PBS wurden lichtmikroskopisch drei repräsentative Gesichtsfelder je Well
ausgezählt.
Release von TGF-beta1
Mit dem Quantikine® Human TGF-β1 Kit der Firma R&D Systems (Minneapolis,
USA) wurde die quantitive und zeitliche Freisetzung von TGF-β1 aus VSNTGF und
VSMTGF Scaffolds untersucht.
Hierfür wurden Scaffolds gleicher Faserstärke (n=2) in ein Eppendorfröhrchen mit
1500 μl PBS überführt und bei 37 °C inkubiert. Nach 1 h, 2 h, 4 h, 12 h, 24 h, 36 h,
48 h, 72 h, 120 h und 168 h wurden nach vorsichtigem Schwenken 100 μl Proben
gewonnen und bei -20 °C gelagert.
Der Versuch wurde mit und ohne vorherige Aktivierung von latentem TGF-β1
ausgeführt. Die Proben der nanofibrösen Scaffolds wurden 1:2 mit PBS verdünnt, die
38 2 Material und Methoden
Proben der mikrofibrösen 1:4. Für die Aktivierung wurden je 100 μl Probe mit 20 μl
1 N HCl, vermischt und 10 min inkubiert. Durch Zugabe von 20 μl 1,2 N NaOH und
0,5 M HEPES wurde die Probe neutralisiert. Die Standardreihe wurde lt. Protokoll
hergestellt. In jedes Well der ELISA-Platte wurden 50 μl Assay-Verdünnung
vorgelegt. Anschließend wurden die Standardreihe und die Proben aufgetragen. Das
TGF-β1 hat während einer Inkubationszeit von 2 h an einen für TGF-β1 spezifischen
mAK gebunden, mit dem die Platte beschichtet war. Alle ungebundenen Bestandteile
wurden durch dreimaliges Abspülen der Platte mit Waschpuffer entfernt.
Anschließend wurden 100 μl TGF-β1 Konjugat (horseradish Peroxidase gebunden
an polyklonalen AK gegen TGF-β1) jedem Well hinzugefügt. Dieser AK konnte nun
an das, an den AK der Platte gebundene, TGF-β1 binden. Nach 2 h Inkubation
erfolgte eine erneute Waschung, wobei der überschüssige AK vollständig entfernt
wurde. Je Well wurden nun 100 μl Substratlösung (bestehend aus Farbreagenz I und
Farbreagenz II zu gleichen Teilen) hinzugegeben und 30 min unter Ausschluss von
Licht inkubiert. Hierbei hat sich das Farbreagent (Tetramethylbenzidin) an die
horsradish Peroxidase gebunden. Nach 30 min wurde der Vorgang gestoppt durch
Zugabe von 100 μl Stopplösung. Die Platte wurde nun an einem Plattenlesegerät
(Lucy 3, Anthos, Heerhugowaard, Netherlands) ausgelesen. Hierbei wurde optisch
der Farbumschlag gemessen und bezogen auf den Farbumschlag der Standardreihe
ausgewertet. Es wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm gemessen.
2.7.4 Zellversuch
Besiedlung der Scaffolds
Zur Besiedlung der unterschiedlichen Scaffolds wurden Zelllinien mit
nachgewiesenem Differenzierungspotential bis Passage 4-6 amplifiziert.
Ausschließlich VSP wurde 24 h in HBSS inkubiert. 1,35x105 Zellen wurden in 25 μl
chondrogenes Induktionsmedium (2.2.1), ohne Zusatz von Induktoren wie TGF-β1, je
Scaffold aufgenommen. Die Besiedlung fand in einer mit Poly(2-Hydroxyethyl)-
Methacrylat beschichteten 96-well-Platte statt. Über einen Zeitraum von 2 h wurde
alle 20 min 20 μl des o.g. Mediums hinzugegeben, um die Zellen vor Austrocknung
zu schützen, aber weiterhin einen möglichst direkten Kontakt zum Scaffold zu
2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 39
gewährleisten. Anschließend wurden die Wells mit 150 μl Medium aufgefüllt. Nach 1-
2 Tagen erfolgte eine Umsiedlung der Scaffolds in eine 24-Well-Platte. Bei allen
Versuchen wurde mit den Scaffolds auch das Medium überführt. Auf diese Weise
sollte verhindert werden, dass die in den Scaffolds enthaltenen Induktoren
Hyaluronsäure und TGF-β1 sukzessive ausgewaschen werden.
Histologie
Besiedelte Scaffolds wurden nach 21 und 28 Tagen in vitro Kultur geerntet, in
Cryomolds überführt und querdiagonal in Tissue Tec eingebettet und bei -20 °C
eingefroren. Nach Aushärtung wurden die Scaffolds am Kryotom mit einer Dicke von
16 μm für Alzianblaufärbungen und 10 μm für Kollagen Typ II Färbungen
geschnitten. Die Schnitte wurden 24 h luftgetrocknet und anschließend über Nacht
bei 59 °C inkubiert um eine bessere Adhärenz am Objektträger zu gewährleisten.
Die Färbungen im Detail und deren Auswertung erfolgten wie in 2.5.3 und 2.5.4
beschrieben.
Genexpression
Für die Isolierung der RNA wurde das NucleoSpin®RNA II Kit von Machery-Nagel
(Düren, Germany) verwendet und lt. Protokoll durchgeführt (siehe auch 2.6.1).
Hierbei wurden je Erntezeitpunkt n=3 besiedelte Scaffolds verwendet.
Für die Messung der RNA-Konzentration je μl wurde ein Nanodrop
Spectrophotometer ND-1000 der Firma Peq Lab (Erlangen, Germany) verwendet.
2 μl Probe wurden auf die Messoberfläche pipettiert. Durch Herabführen eines
Hebels wurde die Probe zwischen den optischen Fasern des Spektralphotometers
aufgespannt. Durch die Oberflächenspannung des Tropfens entstand eine
Flüssigkeitssäule, die den Messweg für das Spektralphotometer darstellt. Die Daten
wurden im ND-1000 Data Viewer.vi von Thermo (Waltham USA) dargestellt. Die
Messung erfolgte bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm.
Reverse Transkription
Im Anschluss an die Messung erfolgte wie unter 2.6.2 beschrieben eine RT.
40 2 Material und Methoden
2.7.5 Realtime PCR
Im Gegensatz zur unter 2.6.3 beschriebenen PCR ist mittels Realtime PCR eine
semiquantitative Messung der PCR-Produkte möglich. Wie bei der PCR besteht auch
die Real-time PCR aus drei sich wiederholenden Schritten: Denaturierung, Annealing
und Elongation. Die Quantifizierung findet durch Messung von Fluoreszenz statt.
Hierfür wird eine TaqMan Sonde verwendet, die komplementär an die zu
amplifizierende DNA bindet. Durch ihre 3‘→5‘ Polymeraseaktivität und die 5‘→3‘
Exonukleaseaktivität wird während der Synthese des Gegenstranges das 5‘-Ende
der Sonde abgebaut. Am 5‘-Ende ist ein Reporter-Fluoreszensfarbstoff kovalent
gebunden, am 3‘-Ende ein Quencher-Farbstoff. Die Fluoreszenz des Quencher-
Farbstoffes unterdrückt die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes durch
strahlungsfreie Energieübertragung (Fluorescence Resonance Energy Transfer =
FRET). Durch den Abbau entfernen sich Reporter und Quencher voneinander. Die
Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes wird nicht mehr durch den Quencher
unterdrückt (siehe Abbildung 2.1).
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Prinzips der TaqMan-Sonde. R=Reporter, Q=Quencher, 3´=3´-Ende des Basenstranges, 5´=5´-Ende des Basenstranges.
2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 41
Proportional mit der Menge des PCR-Produktes nimmt die Reporter-Fluoreszenz zu.
Die Zykluszahl, bei der die Reporter-Fluoreszenz erstmals über das Grundrauschen
ansteigt, nennt man Ct-Wert (Cycle Threshold). Trägt man die Kurve linear auf erhält
man eine sigmoidale Kurve mit einer exponentiellen Phase und einem Plateau. Da
zwischen dem Ct-Wert und dem Logarithmus der eingesetzten bekannten Menge
einer Standardverdünnungsreihe eine lineare, umgekehrt proportionale Beziehung
besteht, kann er zur Quantifizierung herangezogen werden. Durch Auftragen des
Logarithmus gegen den Ct-Wert kann eine Standardkurve konstruiert werden.
Abbildung 2.2. Standardkurve der Realtime PCR. Hier beispielhaft die Standardkurve des internen Standards Gapdh.
Um eine Vergleichbarkeit zwischen den Proben gewährleisten zu können, wurde die
Expression eines internen Standards gemessen (hier GAPDH). Die Darstellung der
Ergebnisse erfolgte durch Anwendung des Statistikprogrammes Sigma Plot 2000.
Bei der Wahl der Primer wurde die Internetplattform „National Center for
Biotechnology Information“ (NCBI, Bethesda, USA. http://www.ncbi.nlm.nih.gov),
sowie die Datenbank „Ensembl“ (http://www.ensembl.org/index.html) verwendet. Es
wurde darauf geachtet, dass die Primer mindestens um eine Intronsequenz
auseinander lagen, um kontaminierende genomische DNA von spezifischen
42 2 Material und Methoden
Amplifikaten unterscheiden zu können. Die Primer wurden von der Firma Tib MolBiol
(Tib MolBiol, Berlin, Germany) hergestellt.
Tabelle 2.3. Primer und Sonden zur Verwendung bei der Realtime PCR. Aufgelistet sind die für das Markergen spezifischen Primer mit den dazugehörigen Sequenzen, Annealingtemperaturen und Zyklenanzahl.
Gen →Forward Primer
←Reverse Primer
Annealing Temp. °C Zyklen
Collagen 1 →ACCgATggATTCCAgTTCgAgTA
←CTCCggTgTgACTCgTgC
59°C 50
Collagen 1 TM 6FAM-CTgACCTTCCTgCgCCTgATgT--BBQ
Collagen 2 →CgggTgAgAACggATCTCC
←gACCACgggCACCAgTg
59 50
Collagen 2 TM 6FAM-CCTggTgAAAgAggACggACTggC--BBQ
Gapdh →gAAggTgAAggTCggAgTC
←gAAgATggTgATgggATTTC
51 50
Gapdh TM 6FAM-CAAgCTTCCCgTTCTCAgCC--BBQ
Primeretablierung
Zu Beginn wurde eine PCR mit den wie oben beschrieben erstellten Primern
durchgeführt. Die PCR-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und mit Hilfe des
Peq Gold Gelextraktion Kit (PeqLab, Erlangen, Germany) eluiert. Mit Hilfe des Topo
TA Cloning Kits (Invitrogen, Paisley, UK) wurde die extrahierte DNA kloniert. Nach
Anzucht über Nacht auf einer Agarplatte mit Lb-Medium (Invitrogen, Paisley, UK)
2.7 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 43
wurden 5 Kolonien gepickt und erneut über Nacht in 4 ml flüssigem Lb-Medium
inkubiert. 2 ml des Mediums wurden für eine Plasmidpreparation verwendet, 2 ml
wurden zentrifugiert. Das Pellet wurde in 300 μl Glycerin gemischt mit 600 μl Lb-
Medium aufgenommen und bei -20 °C gelagert. Für die Plasmidpreparation wurde
das Nucleo Spin Plasmid Miniprep Kit von Machery Nagel (Düren, Germany)
verwendet. Anschließend erfolgte eine Testrestriktion mit Eco RI (Roche, Grenzach-
Wyhlen, Germany). 2 μl Plasmid RNA wurden mit 1 μl Enzym und 2 μl Puffer H mit
DEPC-H2O auf 20 μl aufgefüllt. Nach einer zweistündigen Inkubation bei 37 °C wurde
für eine Erfolgskontrolle ein Gel laufen gelassen (siehe 0). Der Rest der Plasmid
RNA wurde für die Standardreihe der Realtime PCR verwendet.
Durchführung der Realtime PCR
Auf einer 96-well-Platte wurden je well 10 μl Maxima Mastermix, bestehend aus
0,4 μl Primer forward, 0,4 μl Primer reverse, 0,4 μl TaqMan-Sonde und 3,8 μl DEPC-
H2O, zu 5 μl Probe hinzupipettiert (die Probe wurde zuvor 1:5 mit DEPC-H2O
verdünnt). Für die Standardverdünnungsreihe wurden sieben Konzentrationen von
0,2 ng/μl in 10er Potenzen absteigend bis 0,2 fg/μl verwendet. Anschließend wurde
die Platte verschlossen und in den iCycler gestellt. Das Programm des iCyclers
begann mit einer zweiminütigen Initialisierung bei 95 °C. Es folgten 40 Sek.
Denaturierung bei 95 °C, 40 sek. Annealing bei 55-65 °C (siehe Tabelle 2.3), 40 Sek.
Elongation bei 72 °C und einer Termination für eine Minute bei 95 °C. Es wurden 50
Zyklen durchgeführt.
2.7.6 DNA-Quantifizierung
Um das Zellwachstum auf den Scaffolds zu quantifizieren wurde eine Analyse der
cDNA-Konzentration vorgenommen. Nach 1-3, 21 und 28 Tagen wurde hierfür
jeweils eines der unterschiedlichen Scaffolds in ein Eppendorfröhrchen überführt und
bei -20 °C eingefroren. Die DNA wurde mit Hilfe des NuceolSpin®Tissue Kits von
Macherey-Nagel (Düren, Germany) aufgereinigt. Die Messung der DNA-
Konzentration wurde mittels Quant-iT™PicoGreen®dsDNA Kits (Invitrogen, Paisley,
UK) durchgeführt, bei dem die die doppelsträngige DNA mittels eines
Fluoreszenzfarbstoffes angefärbt wird.
44 2 Material und Methoden
Zur Aufreinigung der DNA wurde je ein Scaffold in 200 μl T1-Puffer aufgenommen
und mit 25 μl Proteinase K und 200 μl B3-Puffer vermischt. Die Probe wurde 10-
15 min bei 70 °C inkubiert (da der Schmelzpunkt der Scaffolds bei 60 °C liegt haben
sich diese zu einem großen Teil aufgelöst). Dann wurden 180 μl T1-Puffer und 25 μl
Proteinase K hinzugegeben und 1 h bei 56 °C inkubiert und mechanisch lysiert. Um
Messfehler durch vorhandene RNA auszuschließen, wurden die Proben 5 min bei
RTemp mit 20 μl RNase A (20mg/ml) inkubiert. Nach gründlicher Durchmischung der
Proben wurde 200 μl B3-Puffer hinzugegeben und 10 min bei 70 °C inkubiert. Um die
DNA-Bindung an die Siliziummembran vorzubereiten, wurden 210 μl hinzugegeben
und gut durchmischt. Die Proben wurden in die NucleoSpin®Tissue Röhrchen
überführt und 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Hierbei bindet die DNA an die
Siliziumfilter im Röhrchen, welche durch Zugabe von 500 μl und 600 μl BW-Puffer
gewaschen und jeweils für 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert wurde. Die aufgereinigte
DNA wurde nun in Eppendorfröhrchen überführt, mit 100 μl BE-Puffer 1 min inkubiert
und für 1 min bei 10000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurden die Proben bei
-20 °C eingefroren und aufbewahrt.
Zur Messung der DNA-Konzentration wurde eine 200fache Verdünnung der DMSO-
Lösung in 1xTE hergestellt. Die Arbeitslösung wurde unter Ausschluss von Licht
gelagert, um einen photooxidativen Abbau zu verhindern. Um eine Standardkurve zu
erstellen, wurde eine Stammlösung von 2 μg/ml doppelsträngiger DNA in 1xTE-
Puffer hergestellt, indem der lambda-DNA-Standard (100μg/ml) 50fach verdünnt
wurde. Eine Standardkurve mit Konzentrationen von 1 ng/ml bis 1 μg/ml wurde
erstellt. Die Proben wurden mit TE-Puffer auf 1 ml aufgefüllt. 1 ml der Arbeitslösung
des Quant-iT™Pico GreenReagenz wurden jeder Probe hinzugefügt. Nach einer
Inkubation von 2-5 min unter Ausschluss von Licht wurde die Fluoreszenzemission
an einem Plattenlesegerät (BertholdTech Mithras, Bad Wildbad, Germany)
gemessen. Für die Auswertung wurde der Leerwertes der Standardkurve von den
Proben subtrahiert und die Proben wurden bezogen auf die Standardkurve
ausgewertet.
3.1 Mesenchymale Stammzellen 45
2.7.7 Statistische Auswertung
Statistischen Auswertungen erfolgten per JMP statistical software (JMP, Cary NC,
USA) anhand 1-factor ANOVA, 2-factor-ANOVA und Students-t-test. Signifikanz
wurde bei p<0,05 definiert.
3 Ergebnisse
3.1 Mesenchymale Stammzellen
3.1.1 Morphologie und Zellkultur
Eine Isolierung von Zellen aus humanem Knochenmark war in 15 von 16 Proben
erfolgreich. Nach Isolierung konnten plastikadhärente Zellen mit einer
spindelförmigen fibroblastoiden Morphologie nachgewiesen werden. Zu Anfang der
2D in vitro Kultur bildeten sich Kolonien um einzelne Zellen, welche später
konfluierten. Dabei hing die Proliferationsgeschwindigkeit von der initialen
Besiedlungsdichte ab: je mehr Zellen adhärent waren, umso schneller proliferierten
sie. Wurden sie im Verlauf zu dünn ausgesiedelt, verlangsamte sich die Proliferation
deutlich. Von o.g. 15 Isolaten wurden für die Differenzierungsversuche und die
anschließenden Scaffoldversuche vier Proben zufällig ausgewählt.
Abbildung 3.1: Kulturverlauf primärer Zellen aus humanem Knochenmark. A: 14 Tage nach der Isolation. B: 24 Tage nach der ersten Passage.
Präsentation spezifischer Oberflächenmarker
Die Untersuchung auf spezifische Oberflächenmarker wurde durchgeführt, um
festzustellen ob es sich bei den isolierten Zellen um Vorläuferzellen der
46 3 Ergebnisse
mesenchymalen Zelllinie handelte und nicht um andere ebenfalls im Knochenmark
vorkommende Zellen, wie z.B. hämatopoetische Vorläuferzellen. Es konnte auf diese
Weise die Homogenität der vorhandenen Zelllinie dargestellt werden.
Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchung wurden in einem Dot
Plot dargestellt.
Abbildung 3.2: Exemplarische Darstellung eines Dot Plots der Isotypkontrolle FITC. R1 und R4 einfachpositiver, R2 doppeltpositiver und R3 doppeltnegativer Sektor. Jeder Punkt entspricht einer gemessenen Zelle.
Für die Veranschaulichung der Fluoreszenzsignale wurde eine logarithmische
Darstellung gewählt. Die Fluoreszenzsignale der einzelnen Marker wurden auf die in
der Negativkontrolle gemessene Eigenfluoreszenz der Zellen bezogen.
Tabelle 3.1: exemplarische Darstellung einer FACS-Analyse.
Isotypkontrolle FITC
Isotypkontrolle PE
3.1 Mesenchymale Stammzellen 47
CD13, 97.2 %
CD29, 97,1%
CD34, 6,1%
CD44, 96,9%
CD49d, 55,0%
CD54, 81,3%
CD73, 96,2%
CD90, 98,5%
CD106, 63,1%
CD133, 1,6%
CD140b, 88,5%
CD166, 92,9%
CD271, 2,0%
CD45, 0,3%
Die isolierten und im Monolayer kultivierten Zellen zeigten in der FACS-Analyse ein
überwiegend einheitliches Muster an Oberflächenmarkern. Hämatopoetische
Oberflächenmarkern wie CD34 (0,2-6%) und CD45 (0,0-2,8%) zeigten sich kaum.
Die Expression von mesenchymalen Oberflächenmarkern wie CD44 (83,1-96,6%)
und CD90 (83,5-98,5%) war hingegen deutlich. Ebenfalls nachweisbar waren die
Oberflächenmarker CD13 (83,5-97,2%), CD29 (77,8-97,1%), CD73 (79,5-96,2%) und
CD166 (58,6-93,6%). Nur eine geringe Expression wiesen CD133 (0,5-2,6%) und
CD271 (0,0-3,4%) auf. Uneinheitlich war die Expression von CD49d (11,9-63,3%),
CD54 (51,2-82,6%), CD106 (5,8-62,1%) und CD140b (43,1-88,5%).
48 3 Ergebnisse
3.2 Differenzierung primärer Zellen
3.2.1 Histologischer Nachweis der Differenzierungsfähigkeit
Da die Präsentation von spezifischen Oberflächenmarkern nicht ausreicht, um eine
Zelle sicher als Vorläuferzelle der mesenchymalen Zelllinie zu identifizieren, ist der
Nachweis der Pluripotenz nötig. Mit Hilfe von Differenzierungsversuchen unter
Verwendung unterschiedlicher Induktionsmedien wurden die Vorläuferzellen in die
adipogene, chondrogene und osteogene Zelllinie ausdifferenziert. Insgesamt wurden
n=4 Isolationen vollständig in alle drei Zelllinien differenziert.
Adipogene Differenzierung
Im adipogenen Induktionsmedium konnte eine rasche Konfluenz der flächig
wachsenden Zellen beobachtet werden.
Nach 14 Tagen konnten vereinzelt Sudan III positive Zellen dargestellt werden. Nach
21 Tagen stieg die Anzahl der Sudan III positiven Zellen und vereinzelt konnten
Sudan III positive Zellaggregate gefunden werden.
Abbildung 3.3: Sudan III Färbung primärer Zellen im adipogenen Differenzierungsversuch. (A) uninduziert, (B) nach 14 Tagen und (C) nach 21 Tagen.
Osteogene Differenzierung
Im osteogenen Induktionsmedium fand sich ebenfalls eine rasche Konfluenz der
Zellen, die eine große morphologische Variabilität aufwiesen. Im Gegensatz zu
3.2 Differenzierung primärer Zellen 49
uninduzierten Zellen fand sich eine zunehmende Expression der alkalischen
Phosphatase im Induktionsmedium mit zunehmender Kultivierungsdauer.
Abbildung 3.4: Färbung der alkalische Phosphatase primärer Zellen im osteogenen Differenzierungsversuch. (A) uninduziert, (B) nach 14 Tagen und (C) nach 21 Tagen.
Chondrogene Differenzierung
Mit Hilfe der Alzianblaufärbung konnte für Chondrozyten typische saure sulfatreiche
Proteoglycanmatrix in den MMBs nachgewiesen werden. Dabei fand sich kein
Unterschied zwischen oberflächlichen oder tiefer liegenden Zellen. In der
Negativkontrolle hingegen waren nur wenige hellblau gefärbte Areale zu sehen.
(siehe Abbildung 3.5). Die Zellenmorphologie änderte sich von einer anfänglich
länglichen zu einer sphärischen im Verlauf der 3D Kultur. Nach außen waren die
MMBs abgegrenzt durch flache, dicht beieinander liegende, deutlich blau angefärbte
Zellen, die eine Art Hülle zu bilden schienen.
Abbildung 3.5: Alzianblaufärbung eines MMB. Uninduziert nach 3 Tagen (A), induziert nach 21 Tagen (B) und 28 Tagen (C)
50 3 Ergebnisse
Mittels Anti-Kollagen Typ II Immunhistochemie konnte nach 21-tägiger chondrogener
Induktion eine zarte Expression von Kollagen Typ II ausschließlich in den
Randbereichen nachgewiesen werden, nach 28 Tagen Induktion fast im gesamten
Volumen der MMBs (siehe Abbildung 3.6 A, B, C).
Abbildung 3.6: Anti-Kollagen Typ II Immunhistochemie (FITC Gegenfärbung = grün; Kernfärbung durch DAPI = blau). Uninduziert (A), sowie induziert nach (B) 21 Tagen und (C) 28 Tagen.
3.2.2 Genexpression
Um das Differenzierungspotential auf Genexpressionsebene darstellen zu können,
wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt.
Nachweis der adipogenen Differenzierung
Die adipogene Differenzierung der MSCs resultierte in der Expression spezifischer
adipogener Gene (PPARγ und AP2/FABP). In allen Isolationen konnte im Verlauf der
adipogenen Monolayer-Differenzierung ein Anstieg der Expression beider Gene
relativ zu Gapdh festgestellt werden. Einzig bei PPARγ fiel die Konzentration nach
initialem Anstieg in zwei Isolationen leicht wieder ab.
3.2 Differenzierung primärer Zellen 51
Abbildung 3.7: Durchschnittliche Genexpression im Verlauf der adipogenen Differenzierung (n=4).
Nachweis der osteogenen Differenzierung
Für den Nachweis der osteogenen Differenzierung im Monolayer wurde die
Expression der charakteristischen Markergene Alkalische Phosphatase, Osteopontin,
RunX, Osterix und Osteocalcin gemessen (siehe Abbildung 3.8). Durchschnittlich
stiegen die Marker Alkalische Phosphatase, RunX und Osterix mit zunehmender
Dauer der osteogenen Induktion relativ zu Gapdh an, Osteopontin und Osteocalcin
fielen hingegen nach initialem Anstieg wieder ab. Nach 21 Tagen osteogener
Induktion fand sich die höchste relative Genexpression für Alkalische Phosphatase,
die niedrigste für Osteocalcin relativ zu Gapdh.
52 3 Ergebnisse
Abbildung 3.8: Durchschnittliche Genexpression im Verlauf der osteogenen Differenzierung (n=4)
Nachweis der chondrogenen Differenzierung
Zum Nachweis einer chondrogenen Differenzierung im dreidimensionalen System
wurde die Expression knorpeltypischer Markergene wie Aggrecan und Kollagen
Typ II untersucht (siehe Abbildung 3.9). In allen Proben konnte ein deutlicher Anstieg
der relativen Genexpression von Kollagen Typ II und Aggrecan mit zunehmender
Dauer der chondrogenenInduktion festgestellt werden.
3.3 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 53
Abbildung 3.9: Durchschnittliche Genexpression im Verlauf chondrogener Differenzierung (n=4).
3.3 Poly-ε-caprolactone Scaffolds
3.3.1 Rasterelektronenmikroskopie
Es konnten erfolgreich rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen nanofibröser
sowie mikrofibröser Scaffolds angefertigt werden.
54 3 Ergebnisse
Abbildung 3.10: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen. (A) nanofibröses und (B) mikrofibröses Scaffold.
Rasterelektronenmikroskopisch fand sich sowohl in nano- als auch mikrofibrösen
Scaffolds eine zufällige Anordnung der Fasern, wobei die Faserdicke, die
Faserdurchmesserkonstanz und die sich daraus ergebenden Porengröße in sich
variierten. So konnten in nanofibrösen Scaffolds z.T. mikrofibröse Fasern
nachgewiesen werden und ebenso in mikrofibrösen Scaffolds z.T. nanofibröse
Fasern.
3.3.2 Migrationspotential
Weder für VSN oder VSM, noch deren Augmentations Design mit HA oder TGF-β1
konnte eine chemotaktische Wirkung auf die MSCs im in vitro Migrationsassay
nachgewiesen werden. In der Positivkontrolle hingegen kam es zu einer deutlichen
Migration: nach 24 h migrierten im Mittel 3099 Zellen und nach 48 h 3313 Zellen
durch die Membran. In der Negativkontrolle kam es zu keiner Migration.
3.3 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 55
Abbildung 3.11: Migrationsassay der unterschiedlichen Scaffoldtypen
3.3.3 Release von TGF-β 1
Aus TGF-β1 haltigen Scaffolds (VSNTGF und VSMTGF) konnte unabhängig von
Faserstärken ein Release von TGF-β1 über den gemessenen Zeitraum von 168 h
nachgewiesen werden. Eine Veränderung der gemessenen TGF-β1-Konzentration,
durch eine Aktivierung von latentem TGF-β1, konnte nicht festgestellt werden.
Obwohl beide Scaffolddesigns mit der gleichen Menge an TGF-β1 geladen wurden,
fand sich grundsätzliche eine höhere TGF-β1 Abgabe auf mikrofibrösen Scaffolds,
wobei nach einem initialen Anstieg innerhalb der ersten 4-12 h ein deutlicher Abfall
nach etwa 48-72 h gemessen wurde. Die Abgabe aus VSNTGF fiel hingegen rasch
innerhalb der ersten 10 h und verbleibt auf einem niedrigen Niveau bis zum
Endpunkt der Messung.
56 3 Ergebnisse
Abbildung 3.12: Release von TGF-β1 über einen Zeitraum von 168 in einer 1:2 Verdünnung nanofibröser Scaffolds, sowie einer 1:4 Verdünnung mikrofibröser Scaffolds gemessen mittels ELISA (durchschnittliche Werte in pg/ml inkl. Standardfehler).
3.3.4 Histologie
Entsprechend der rasterelektronenmikroskopischen Bilder stellten sich die
unterschiedlichen Faserstärken der nano- und mikrofibrösen Scaffolds auch
lichtmikroskopisch dar. Die unterschiedlichen Augmentationen wirkten sich nicht auf
das morphologische Erscheinungsbild aus. Die randständige Kompaktierung der
nanofibrösen Scaffolds sowie die zentrale Zerreißung muss als Artefakt der
Schneidetechnik gewertet werden. Grundsätzlich lagen die Zellen oberflächlich und
bildeten einen Zellrasen. Im Zentrum der Scaffolds konnten nur wenige Zellen
gefunden werden.
Vereinzelt fanden sich Alzian-Blau positive Zellen in VSNTGF (siehe Abbildung 3.13
A+B). Ein immunhistochemischer Nachweis von Kollagen Typ II positiven Zellen
gelang hingegen in keinem Scaffolddesign.
3.3 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 57
Abbildung 3.13: Alzianblaufärbung (A+B) nanofibröser Scaffolds mit TGF-β Augmentation, sowie immunhistochemische Kollagen Typ II Färbung eines (C) mikrofibrösen und (D) nanofibrösen Scaffolds, jeweils mit TGF-β1 Augmentation nach 21 Tagen (A, C, D) und 28 Tagen (B)
3.3.5 DNA-Quantifizierung
Scaffolds augmentiert mit HA (VSNHA und VSMHA) konnten im Vergleich zu den
anderen Scaffolddesigns und unabhängig von Faserstärke eine höhere initiale
Effizienz der Besiedlung demonstrieren. Dies war signifikant in der Gruppe
nanofibröser Scaffolds (p<0,05). Die Augmentation mit TGF-β1 (VSNTGF und
VSMTGF) hatte hingegen keinen signifikanten proliferativen Effekt auf die MSCs. Die
niedrigsten cDNA Werte fanden sich für Scaffolds, die kontinuierlich eine TGF-β1-
Supplementierung durch das Medium erhielten.
58 3 Ergebnisse
Abbildung 3.14: Durchschnittliche cDNA-Konzentration in ng/ml auf (A) nanofibrösen Scaffolds und (B) auf mikrofibrösen Scaffolds im Verlauf über insgesamt 28 Tage in vitro Kultur.
3.3.6 Realtime PCR
Kollagen Typ I Expression
Mittels Realtime PCR wurde semiquantitativ die Konzentration von Gapdh -als
interner Standard- sowie die Konzentration von Kollagen Typ I und Kollagen Typ II
gemessen. Die Ergebnisse der Kollagen Primer wurden auf den internen Standard
bezogen. Gapdh konnte in 57 von 58 Proben erfolgreich gemessen werden.
In allen Scaffolddesigns konnte die Expressoin von Kollagen Typ I mittels rtPCR
nachgewiesen werden. Diese Beobachtung war unabhängig von Scaffolddesign oder
verwendetem Medium (VSP). Die höchsten Werte konnten, wenn auch nicht
statistisch signifikant, in TGF-β1 haltigen Scaffolds nachgewiesen werden (VSNTGF
und VSMTGF). Während die Konzentration auf den mit TGF-β1 und/oder HA
augmentierten Scaffolds nach 21 Tagen wieder abzufallen schien, fand sich in
Scaffolds mit Induktionsmedium (VSP) eine Plateauphase nach initialem Anstieg.
3.3 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 59
Abbildung 3.15: Durchschnittliche Kollagen Typ I Expression auf (A) nanofibrösen und (B) mikrofibrösen Scaffolds nach 1, 21 und 28 Tagen in vitro Kultur.
Kollagen Typ II Expression
Die höchste Kollagen Typ II Expression konnten in Scaffolds festgestellt werden die
kontinuierlich mit chondrogenem Induktionsmedium supplementiert wurden (VSP).
Diese Beobachtung war im Vergleich zu den anderen Scaffolddesigns signifikant
(p <0,05). Trotzdem fand sich auch in den übrigen Scaffolddesigns ein Anstieg der
Kollagen Typ II Expression zumindest bis Tag 21 der in vitro Kultur. Dabei schienen
TGF-β1 haltige Scaffolds unabhängig von der Faserstärke eine höhere Expression
zu ermöglichen als Scaffolds mit und ohne HA (p>0,05).
60 3 Ergebnisse
Abbildung 3.16: Durchschnittliche Kollagen Typ II Expression auf (A) nanofibrösen Scaffolds, (B) mikrofibrösen Scaffolds nach 1, 21 und 28 Tagen in vitro Kultur.
3.3.7 PCR
Zusätzlich zur Bestimmung von Kollagen Typ I und II mittels rtPCR wurde die
Expression von Markern der osteogenen (Alkalische Phosphatase, Osteocalcin und
Osteopontin) sowie chondrogenen (Aggrecan) Differenzierung relativ zu Gapdh
mittels PCR bestimmt.
Osteogene Marker
Die Expression des Markes Osteopontin sank relativ zu Gapdh signifikant nach 21
Tagen in vitro Kultur unabhängig von Scaffoldtyp, Augmentation oder kontinuierlicher
Supplementierung mit chondrogenen Induktoren. Wenn auch nicht signifikant, fand
sich für alle Scaffolddesigns tendenziell ein Anstieg der Marker Alkalische
Phosphatase und Osteopontin. Die Bande der osteogenen Marker in diesen
Versuchen war jedoch deutlich schwächer als die der Versuche mit osteogenem
Induktionsmedium (siehe Abbildung 3.17).
3.3 Poly-ε-caprolactone Scaffolds 61
Abbildung 3.17: Durchschnittliche Genexpression osteogener im Verlauf der Differenzierung von Zellen auf (A) nanofibrösen Scaffolds (VSN, VSNHA, VSNTGF), (B) mikrofibrösen Scaffolds (VSM, VSMHA, VSMTGF) und (C) VSP
chondrogene Marker
Für Scaffolds mit kontinuierlicher Supplementierung chondrogener Induktoren per
Medium (VSP) fand sich eine konstant hohe relative Expression von Aggrecan relativ
zu Gapdh. Im Gegensatz hierzu stieg die relative Expression von Aggrecan in allen
nanofibrösen Scaffolds (VSN, VSNHA, VSNTGF) nach 28 Tagen an. Die relative
Expression von Aggrecan in mikrofibrösen Scaffolds (VSM, VSMHA, VSMTGF)
zeigte einen umgekehrten Verlauf, nach einem initialen Anstieg fielen die Werte nach
28 Tagen (siehe Abbildung 3.18).
62 3 Ergebnisse
Abbildung 3.18: Durchschnittliche Genexpression von Aggrecan auf (A) nanofibrösen und (B) mikrofibrösen Scaffolds
4.1 Mesenchymale Stammzellen 63
4 Diskussion
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines biokompatiblen, bioaktiven und
biomimetischen Scaffolds, das im Anschluss an eine Mikrofrakturierung zur
Defektabdeckung verwendet werden soll. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der
Scaffolds in vitro auf die mesenchymalen Stammzellen untersucht. Besonderes
Augenmerk wurde hierbei auf das Migrationspotential, die Zelladhärenz und –
proliferation, die Abgabe von TGF-β1 durch das Scaffold, sowie die chondrogene
Differenzierung der MSCs gelegt.
4.1 Mesenchymale Stammzellen
Die Isolierung von Vorläuferzellen aus dem Knochenmark ist mittels vieler
verschiedener Methoden möglich und die meisten hiervon sind erfolgreich
(HEGEWALD et al. 2004; KASSEM 2004; WAGNER u. HO 2007). Hierbei finden
sowohl simple, als auch aufwändige Verfahren Verwendung. In der vorliegenden
Arbeit wurde eines der simpleren Verfahren angewendet. Es konnten erfolgreich aus
15 von 16 Proben MSCs isoliert werden, mit einem durchschnittlichen Alter der
humanen Spender von 72,87 Jahren. Von diesen 15 isolierten Proben wurden vier
Proben zufällig ausgewählt, erfolgreich differenziert und klassifiziert und
anschließend zur Besiedlung der Scaffolds verwendet. Studien haben gezeigt, dass
die Anzahl der MSCs im Knochenmark bei steigendem Alter des Patienten
exponentiell abnimmt (CAPLAN 1994), ebenso wie die Selbsterneuerungs- und
Proliferationskapazität (QUARTO et al. 1995; D'IPPOLITO et al. 1999;
INDRAWATTANA et al. 2004). Ungeachtet dessen konnten trotz eines hohen
Durchschnittsalters der humanen Knochenmarkspender MSCs isoliert, amplifizert
und differenziert werden. In vivo konnte gezeigt werden, dass die Erfolge von
knochenmarkstimulierenden Techniken bei jüngeren Patienten (human) größer sind
als bei älteren (STEADMAN et al. 2003; KNUTSEN et al. 2004; KREUZ et al. 2006).
Zum Zeitpunkt dieser Arbeit lagen noch keine Studien bezüglich der MSCs
Konzentration im Knochenmark in Abhängigkeit zum Alter des Spenders/Patienten
beim Tier vor.
64 4 Diskussion
4.2 Poly-ε-caprolactone Scaffolds
Zur Herstellung nano- und mikrofibröser Scaffolds verwendeten wir in dieser Arbeit
PCL, ein synthetisches Polymer, welches gute Verarbeitungseigenschaften aufweist
und gleichzeitig biokompatibel und biodegradierbar ist. Letztere Eigenschaften
wurden sowohl für Menschen als auch im Tiermodell bewiesen (CAO et al. 2003;
SHAO et al. 2006; LI et al. 2009). Auch wenn synthetische Polymere wie PCL per se
keine intrinsische Bioaktivität zeigen, wirken sich die biomechanischen
Eigenschaften im Vergleich zu natürlichen aber auch anderen synthetischen
Polymeren positiv aus (CAO et al. 2003; LI et al. 2006a). Idealerweise sollte die
Degradierungskinetik eines Kunstimplantates mit der sukzessiven Regeneration
eines chondralen Defektes synchron ablaufen. Daher sollte das anvisierte Material
eine langsame Zersetzungskinetik besitzen, um einem frühen Verlust der
strukturellen Integrität durch körpereigene Abbaukräfte entgegen zu wirken; dies ist
insbesondere für Scaffolds mit großer Angriffsfläche wie z.B. nanofibröse Konstrukte
relevant. PCL ist somit ein geeigneter Kandidat, da es im Gegensatz zu PGA,
PLGA5050, PLGA8515 und PDLLA einen langsamen Polymerabbau aufweist
(ZONG et al. 2003; LI et al. 2006a). So konnte gezeigt werden, dass Scaffolds aus
PCL in der Lage sind, die charakteristischen mechanischen Eigenschaften über bis
zu sechs Monate beizubehalten, bis die vollständige Metabolisierung nach etwa zwei
Jahren abgeschlossen ist (HUTMACHER et al. 2001; SHAO et al. 2006). Scaffolds
aus PLA und PLGA schrumpften hingegen innerhalb der ersten Wochen aufgrund
eines frühen Polymerabbaus (LI et al. 2003; ZONG et al. 2003). Zudem ist die
langsame Abbaugeschwindigkeit des PCL für Wachstum und Rekonstruktion von
Knorpelgewebe geeignet, da es die Mechanoinduktion von Zellen zu einem
entsprechenden Phänotyp zulässt (CAO et al. 2003) und mehr mechanische und
strukturelle Stabilität für Zellwachstum gewährleistet (LI et al. 2003; SHAO et al.
2006).
Zur Herstellung der fibrösen Scaffolds wurde die Technik des Elektrospinnings
angewendet, wobei durch Modifikation der Flussrate und Spannung Fasern mit
Durchmessern im Mikro- und Nanometerbereich erzeugt werden konnten. Auf die
4.3 Einfluss der Faserstärke 65
Anordnung der Fasern und Porengröße konnte kein Einfluss genommen werden, sie
war zufällig. So fanden sich Mikrofasern in nanofibrösen Scaffolds und Nanofasern in
mikrofibrösen Scaffolds.
4.3 Einfluss der Faserstärke
In der vorliegenden Arbeit wurde der Effekt von Scaffolds unterschiedlicher
Faserstärke auf das Differenzierungspotential von MSCs untersucht. Grundlage
hierfür sind Studien, die belegen, dass Biomaterialien, die eine Oberflächenstruktur
im Nanometerbereich haben, biologisch bevorzugt werden (WEBSTER et al. 2000;
WEBSTER et al. 2001; LI et al. 2006b). Dabei spielen die Oberfläche, deren
Rauigkeit und Struktur, das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen sowie die
Steifigkeit bzw. Elastizität des Scaffolds eine wesentliche Rolle (ZHANG L u.
WEBSTER TJ 2009). So zeigten unsere Versuche, dass die relative Expression von
Aggrecan offensichtlich nicht signifikant durch die An- oder Abwesenheit von
Wachstumsfaktoren (TGF-β1) oder Molekülen der hyalinen Matrix (Hyaluronsäure)
beeinflusst wurde, sondern dass sie vielmehr der ultrastrukturellen Beschaffenheit
der Scaffolds unterlag: Nanofasern begünstigten die Expression von Aggrecan mit
zunehmender Dauer der Kultur, wohingegen Mikrofasern eher einen gegenteiligen
Effekt hatten. Zudem begünstigten Nanofasern im Vergleich zu Mikrofasern auch die
Expression von Kollagen Typ II, auch wenn TGF-β1 sicherlich der entscheidende
Effekt zukommt. Demnach kann festgestellt werden, dass nanofibröse PCL Scaffolds
biomimetisch im Kontext der Knorpelhomöostase sind. Dies schlussfolgerten u.a.
auch die Arbeitsgruppen um LI et al. (2005a; 2006b) und HUTMACHER et al. (2001).
Diese Feststellung wird aber auch durch die Beobachtung untermauert, dass MSCs
in nanofibrösen PCL Scaffolds eine niedrigere Proliferationsrate aufwiesen als in
mikrofibrösen Scaffolds, was insofern relevant ist, als dass eine mitotische Aktivität
chondrogener Zelllinien immer dann beobachtet werden kann, wenn Abweichungen
von der strukturellen Integrität der genuinen hyalinen Matrix zu finden sind, oder aber
Reparationsvorgänge stattfinden (LI et al. 2006b). Die nanofibrösen Scaffolds
66 4 Diskussion
signalisierten den MSCs also offenbar ein intaktes chondrogenes und somit
biomimetisches Milieu.
4.4 Einfluss der Wachstumsfaktoren
4.4.1 Einfluss von TGF-β1
Da synthetische Polymere per se keine intrinsische Bioaktivität besitzen,
kombinierten wir die nano- und mikrofibrösen PCL Scaffolds u.a. mit TGF-β1, einem
potenten, intrinsisch chondrogenen Faktor (PEDROZO et al. 1998; DEFAIL et al.
2006). Diverse Arbeiten konnten eine TGF-β1 induzierte chondrogene
Differenzierung von MSCs belegen (HAYES et al. 2001; HUANG et al. 2002;
INDRAWATTANA et al. 2004; KISIDAY et al. 2010), wobei dieser Vorgang sowohl
dosis- als auch zeitabhängig zu sein scheint (BOSNAKOVSKI et al. 2006). Die
Ergebnisse unserer Arbeit deuten ebenfalls einen Zusammenhang zwischen
zeitabhängiger TGF-β1 Substitution und der Expression von Kollagen Typ II an. Eine
initiale Freisetzung von TGF-β1 aus den Scaffolds begünstigte dabei durchaus schon
eine Induktion entlang der chondrogenen Zelllinie, war jedoch insuffizient über einen
Zeitraum länger als 21 Tage. LI et al. (2005b) konnten sogar zeigen, dass MSCs auf
PCL Scaffolds mit kontinuierlicher TGF-β1 Supplementation per Medium nicht nur
Kollagen Typ II exprimierten, sondern auch eine zonale Morphologie entwickeln. Es
konnte eine superfiziale Zone mit flachen Zellen, eine mittlere Zone mit runden Zellen
und eine tiefe Zone mit kleinen flachen Zellen, ähnlich dem Aufbau hyalinen
Knorpels, beobachtet werden. Interessanterweise hatte die Freisetzung von TGF-β1
aus den Scaffolds keinen Einfluss auf die Expression von Aggrecan, diese unterlag
eher der strukturellen Beschaffenheit der unterschiedlichen Konstrukte. Wir konnten
auch keinen chemotaktischen Effekt von TGF-β1 nachweisen, auch wenn für TGF-β1
eine solche Wirkung auf MSCs beschrieben worden ist (CENTRELLA et al. 1994;
HUNZIKER u. ROSENBERG 1996; RIPAMONTI et al. 1997). Der zugrunde liegende
Mechanismus basiert auf einer hoch-affinen Interaktion mit einem heteromeren
Rezeptorkomplex, der zwei strukturell abhängige Serinethreonin Kinasen umfasst.
4.4 Einfluss der Wachstumsfaktoren 67
Hierbei werden die Signale mittels Smad-Signalweg transduziert, was zu einer
Aktivierung der sox9 Transkription führt (ATTISANO u. WRANA 2002;
HATAKEYAMA et al. 2003). Eine andere Studie hingegen zeigte, dass TGF-β1
alleine keine Migration bewirken kann, sondern nur in Kombination mit anderen
Additiven wie z.B. konditioniertem Serum (ZHANG et al. 2009). Der Mechanismus
der TGF-β1-vermittelten Rekrutierung von MSCs wird kontrovers diskutiert, sicher
scheint jedoch eine dosisabhängige Wirkung. Wird eine hohe TGF-β1 Dosis von 200
ng/ml appliziert, kann dies zwar eine Chemotaxis induzieren, aber auch eine
Aktivierung von Entzündungszellen bewirken, die wiederum in einer Fibrose und
Osteophytenbildung resultiert (VAN BEUNINGEN et al. 1994; VAN BEUNINGEN et
al. 1998; CAI et al. 2007). Wurden aber Microspheres mit einer solch hohen Dosis an
TGF-β1 beladen, anstelle der üblichen Dosis von 20 ng/ml, konnte keine
Osteophytenbildung beobachtet werden, da TGF-β1 sukzessive in konstant geringen
Mengen abgegeben wurde (HOLLAND et al. 2003). Die ideale Konzentration an
TGF-β1 und deren Freisetzungskinetik bleibt letztendlich ungeklärt. Konsens besteht
hingegen, dass TGF-β1 keinen proliferativen Effekt auf die MSCs hat (MACKAY et
al. 1998; BARRY et al. 2001; LI et al. 2005b). Auch unsere Ergebnisse bestätigen,
dass die Zellzahl unter Einfluss von TGF-β1 konstant bis leicht abfallend ist.
4.4.2 Einfluss von HA
Hyaluronsäure ist eines der wichtigsten GAGs und verantwortlich für die
Matrixhomöostase hyalinen Knorpels. Hyaluronsäure interagiert mittels
transmembraner Rezeptoren mit Zellen und steuert auf diese Weise
Zelldifferenzierung, -metabolismus und matrixsynthese (SCHAGEMANN et al. 2008).
Daher war Hyaluronsäure ein potentieller Kandidat, um die begrenzten biologischen
Eigenschaften synthetischer PCL Scaffolds zu optimieren. Auch wenn in unserer
Studie Hyaluronsäure weder auf mikrofibrösen noch auf nanofibrösen Scaffolds
einen signifikanten chondrogenen Effekt hatte, wirkte sich die Freisetzung doch
positiv auf die initiale Besiedlungsdichte aus. Zudem hatte Hyaluronsäure im
Gegensatz zu TGF-β1 einen tendenziell hemmenden Effekt auf die Expression von
Kollagen Typ I, also einen indirekt chondrogenen Effekt. Überdies konnten KUJAWA
et al. (1986) zeigen, dass Hyaluronsäure in der Lage ist, eine chondrogene
68 4 Diskussion
Differenzierung mesenchymaler Zellen zu induzieren. Molekulargewicht (Mw) und
Konzentration spielten hierbei eine große Rolle. Die Untersuchungen ergaben ein
ideales Mw von 2 x 105 Da und 4 x 105 Da - bei einem höheren Mw konnte hingegen
eine Inhibierung der Chondrogenese beobachtet werden. Eine mögliche Ursache für
dieses Phänomen war eine Blockierung der Aggregation der Zellen, die jedoch
unabdingbar ist für deren Differenzierung. Die Erkenntnisse von KUJAWA et al.
(1986) widersprechen in Teilen unseren Ergebnissen, da wir Hyaluronsäure mit
einem Mw von 1.65 x 106 Da zur Augmentierung der Scaffolds verwendeten, und
trotzdem einen indirekten chondrogenen Effekt vermuteten, was durch eine Arbeit
von HEGEWALD et al. (2004) gestützt wird. Die Kollegen wiesen für kommerziell
erhältliche Präparate wie Ostenil® und Hylartil® mit hohem Mw (2-3 x 106 Da) eine
chondrogene Wirkung auf equine MSCs nach. Gesichert ist hingegen, dass der
chondrogene Effekt durch die Interaktion zwischen Hyaluronsäure und seinem auf
MSCs vorkommenden Rezeptor CD44 vermittelt wird. Die Wichtigkeit dieser
Interaktion für die Regulierung von Proliferation, Matrixsynthese und Chondrogenese
konnte bereits in diversen Studien nachgewiesen werden (MALESKI u. KNUDSON
1996; ISHIDA et al. 1997; SCHAGEMANN et al. 2010). Den u.a. von ERGELLET et
al. (2007) beschriebenen chemotaktischen Effekt von Hyaluronsäure auf MSCs
konnten wir wiederum nicht reproduzieren.
4.5 Integration der Wachstumsfaktoren
Im Gegensatz zur Wirkungsweise der Hyaluronsäure, die bereits durch eine initiale
Dosis eine Differenzierung der MSCs entlang der chondrogenen Zelllinie begünstigt,
legen unsere Ergebnisse nahe, dass die für die chondrogene Differenzierung
essentielle Expression von Kollagen Typ II von einer kontinuierlichen TGF-β1 Dosis
abhängig zu sein scheint. Diese Annahme wird von Lee et al. (2004a), DEFAIL et al.
(2006), JACLENEC et al. (2008) u. a. gestützt. Die TGF-β1 Augmentation von nano-
und mikrofibrösen PCL Scaffolds per Gefriertrocknung, wie in unserer Arbeit, ist aber
nicht geeignet, eine kontinuierliche Freigabe von TGF-β1 in wirksamer Dosis zu
4.6 Expression osteogener Marker 69
gewährleisten. Alternativ könnte eine kontinuierliche Supplementierung über das
Medium erfolgen, wobei dies logischerweise ausschließlich für in vitro und nicht für in
vivo Versuche geeignet ist. Ein möglicher Lösungsansatz ist die Einbettung von
Wachstumsfaktoren wie TGF-β1 in Microspheres. Der Vorteil gegenüber der
Aufbringung mittels Gefriertrocknung ist die kontinuierliche und kontrollierte Abgabe
über einen definierbaren Zeitraum (LEE et al. 2004a; CAI et al. 2007). Die
Freisetzungskinetik kann dabei über die molekulare Zusammensetzung der
Microspheres (LEE et al. 2004a) und deren Zersetzungskinetik (DEFAIL et al. 2006)
gesteuert werden. Auch wenn auf dieser Basis das ideale Microspheredesign
hergestellt werden kann, so müssen auch potentiell negative Effekte des
Microspherezerfalls, wie Hitze oder die Freisetzung toxischer Abbauprodukte, die
sich sowohl auf die Wachstumsfaktoren, die Scaffoldbeschaffenheit und den Körper
auswirken können, berücksichtigt werden (CAI et al. 2007; O'SHEA u. MIAO 2008).
Letztendlich ist jedoch jeder dieser Ansätze theoretisch, da die komplexe,
multifaktorielle in vivo Homöostase die Zell-Zell- und Zell-Matrixinteraktionen in vitro
nicht zu simulieren sind.
4.6 Expression osteogener Marker
Für den Beleg einer chondrogenen Differenzierung der MSCs ist ein Nachweis der
Expression knorpelspezifischen Marker Kollagen Typ II und Aggrecan essentiell
(RINGE 2006; JAKOBSEN et al. 2009; KISIDAY et al. 2010). Der Nachweis von
Kollagen Typ I aber auch Osteopontin, Osteocalcin und Alkalische Phosphatase
hingegen weist vordergründig auf eine osteogene Differenzierung hin (ENDRES et
al. 2003; RINGE 2006; BERNHARDT et al. 2009). Unsere Versuche zeigten, dass
eine relative Expression von Kollagen Typ I und Osteopontin unabhängig vom
Scaffolddesign evident war und nach 21 Tagen in vitro Kultur abfiel. Desweiteren
fand sich tendenziell ein Anstieg der Marker Osteocalcin und Alkalische Phosphatase
über 28 Tage in vitro Kultur. Auch dies war unabhängig vom Versuchsaufbau und -
wie die vorherigen Beobachtungen zeigten- gleichfalls gültig für Versuche mit
kontinuierlicher Supplementierung chondrogenen Induktionsmediums (VSP), so dass
70 4 Diskussion
geschlussfolgert werden kann, dass eine passagere osteogene Genexpression im
Rahmen der chondrogenen Differenzierung von MSCs auftritt. Da die Banden der
osteogenen Marker in den Scaffolds jedoch deutlich schwächer ausfielen als in
Zellversuchen mit osteogener Induktion, ist es fraglich, ob aufgrund unserer
Beobachtungen von einer passageren osteogenen Differenzierung der MSCs
gesprochen werden kann. So kommt es auch bei der Hypertrophie von MSCs u.a. zu
einer Expression von osteogenen Markern (STEINERT et al. 2003). Um zu
evaluieren, ob es sich um eine passagere osteogene Differenzierung oder aber um
eine Hypertrophie handelt, wäre eine längere Versuchsdauer von Nöten sowie die
Untersuchung anderer Faktoren, die den Verdacht der Hypertrophie bestätigen, wie
z.B. die Expression von Kollagen Typ X.
4.7 Schlussfolgerung
In der vorliegenden Studie wurden mit mesenchymalen Stammzellen besiedelte
Poly-ε-caprolactone Scaffolds in unterschiedlicher Faserstärke und Augmentation auf
ihr chondrogenes Differenzierungspotential untersucht. Weder das Scaffold selbst,
noch die aufgebrachten Wachstumsfaktoren konnten eine Rekrutierung von Zellen
bewirken. Hyaluronsäure verbesserte die initiale Besiedlung der Scaffolds, z.T.
signifikant, unabhängig von der Faserstärke der Scaffolds, während TGF-β1 einen
hemmenden Effekt auf die Proliferationsrate der MSC´s ausübte. Unter Einfluss von
TGF-β1 stieg sowohl die Kollagen Typ I als auch Typ II Konzentration, während
Hyaluronsäure einen hemmenden Einfluss auf die Expression von Kollagen Typ I zu
haben schien. Im Gegensatz zur Kollagen Expression wurde die Expression von
Aggrecan nicht durch TGF-β1 oder Hyaluronsäure beeinflusst, sondern vielmehr
durch die ultrastrukturelle Beschaffenheit des Scaffolds, wobei Nanofasern die
Expression mit zunehmender Dauer der Kultur begünstigt haben. Mikrofasern hatten
einen eher gegenteiligen Effekt. Es kann daher geschlussfolgert werden, dass eine
initiale TGF-β1-Dosis bereits einen Effekt auf die chondrogene Differenzierung hat,
dieser jedoch über einen Zeitraum von 21 Tagen nicht ausreichend ist, während
71
Hyaluronsäure einen längerfristigen chondrogenen Effekt zu haben scheint, auch
wenn hier ebenfalls nur von einer initialen Freisetzung ausgegangen werden kann.
Fazit ist daher, dass das optimale PCL-Scaffold eine nanofibröse Struktur aufweisen
sollte, eine initial hohe Dosis an Hyaluronsäure freisetzt und eine kontinuierliche
Konzentration von TGF-β1 gewährleistet, z.B. durch die Verwendung von
Microspheres.
72 5 Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Svenja Paul
Chondrogene Differenzierung mesenchymaler Knochenmarkstammzellen mittels
bioaktiver Poly-ε-caprolactone Scaffolds.
Geschädigter hyaliner Knorpel wird durch ein morphologisch, metabolisch und
biomechanisch inkompetentes Narbengewebe ersetzt. Die Folge sind chronische
Schmerzen, Lahmheit und Einschränkungen der Leistungsfähigkeit. Bisher etablierte
regenerative Verfahren sind nicht in der Lage zur Bildung von adäquatem -im
Idealfall hyalinartigem- und langlebigem Ersatzgewebe zu führen. Ziel dieser Arbeit
war es ein Scaffold zu entwickeln, das in vivo zur Defektabdeckung im Anschluss an
eine Mikrofrakturierung (MFX) eingesetzt werden kann und eine Anhaftung mit
anschließender chondrogenen Differenzierung der, durch die MFX
eingeschwemmten, mesenchymalen Stammzellen (MSC) bewirkt und somit die
Regeneration des hyalinen Knorpels unterstützt.
Die Herstellung biomimetischer Scaffolds aus PCL war erfolgreich. Durch
Modifikation der Elektrospinning Variablen Flussrate und Spannung konnten Fasern
unterschiedlicher Stärke im Nano- bis Mikrometerbereich erzeugt werden. Auf die
Anordnung der Fasern sowie Konstanz der Faserdurchmesser konnte kein Einfluss
genommen werden; sie war zufällig. Auch wenn konstatiert werden kann, dass die
hergestellten Scaffolds biomimetisch waren, so konnte keines der Scaffolds Zellen
rekrutieren. Diese Beobachtung fand sich auch für TGF-β1-haltige Scaffolds, auch
wenn diese TGF-β1 über einen Zeitraum von bis zu 170 h freisetzten. Auffällig war,
dass mikrofibröse Scaffolds initial TGF-β1 in hohen Konzentrationen über einen
Zeitraum von bis zu 70 h freisetzten, wohingegen für nanofibröse Scaffolds ein
rascher Abfall der TGF-β1 Konzentration innerhalb der ersten 10 h nachgewiesen
wurde.
Die Besiedlung der Scaffolds mit MSCs war in allen Fällen erfolgreich, wobei die in
VSNHA und VSMHA enthaltene Hyaluronsäure eine teils signifikante Steigerung der
initialen Besiedlung erbrachte. Die niedrigsten cDNA Werte fanden sich in Scaffolds
73
mit einer kontinuierlichen TGF-β1-Supplementierung (VSP), sodass davon
ausgegangen werden muss, dass TGF-β1 einen hemmenden Effekt auf die
Proliferationsrate der MSCs hat. So ist es auch erklärbar, warum Scaffolds, die
sowohl TGF-β1 als auch Hyaluronsäure enthielten, niedrigere cDNA Werte als
hyaluronsäurehaltige Scaffolds, aber höhere als VSP aufwiesen. TGF-β1 schien
zudem die Expression von Kollagen Typ I und II zu bewirken, was sich in hohen
Konzentrationen in TGF-β1-haltigen Scaffolds sowie VSP widerspiegelte. Dabei hatte
die kontinuierliche Supplementierung von TGF-β1 einen teils signifikanten Einfluss
auf die Expression dieser beiden Marker. Die Anwesenheit von Hyaluronsäure
schien hingegen einen hemmenden Einfluss auf die Expression von Kollagen Typ I
zu haben.
Die relative Expression von Aggrecan wurde offensichtlich nicht durch die An- oder
Abwesenheit von Wachstumsfaktoren (TGF-β1) oder Molekülen der hyalinen Matrix
(Hyaluronsäure) beeinflusst. Sie unterlag vielmehr der ultrastrukturellen
Beschaffenheit der Scaffolds. So konnte gezeigt werden, dass Nanofasern die
Expression von Aggrecan mit zunehmender Dauer der Kultur begünstigen und
Mikrofasern eher einen gegenteiligen Effekt haben. Diese Beobachtung fand sich
auch für die Expression von Kollagen Typ II. Die Expression osteogener Marker
konnte hingegen für alle Scaffolddesigns unabhängig von Faserstärke oder An- und
Abwesenheit bestimmter Wachstumsfaktoren nachgewiesen werden. Und deren
Verlauf ähnelte dem des VSP Versuchs, sodass gefolgert werden muss, dass eine
passagere Expression osteogener Genprodukte im Rahmen der chondrogenen
Differenzierung zu finden ist.
Vor dem Hintergrund der vorliegenden Ergebnisse schlussfolgern wir, dass ein
nanofibröses Scaffold augmentiert mit Hyaluronsäure einen chondrogenen Effekt auf
MSCs ausübt und eine Differenzierung entlang der osteogenen Zelllinie hemmt. Dies
ist umso erstaunlicher, als dass davon ausgegangen werden muss, dass die
Freisetzung und folglich auch die Konzentration von Hyaluronsäure innerhalb
weniger Tage deutlich absinkt. Demnach hat bereits eine initiale Dosis an
Hyaluronsäure einen entscheidenden Effekt auf die spätere chondrogene
74 5 Zusammenfassung
Differenzierung der MSCs. Der Effekt von TGF-β1 ist komplexer. So scheint die
Expression von Kollagen Typ II von einer kontinuierlichen TGF-β1 Dosis abhängig zu
sein, wohingegen die Expression von Kollagen Typ I sowohl bei kontinuierlicher als
auch passagerer Supplementierung von TGF-β1 nach einem initialen Anstieg wieder
abfällt. Das bedeutet, dass bereits eine initiale Freisetzung von TGF-β1 aus den
Scaffolds eine Induktion entlang der chondrogenen Zelllinie begünstig, dies jedoch
über einen Zeitraum länger als 21 Tage nicht ausreichend ist. Theoretisch sollte
demnach das ideale Scaffold eine nanofibröse Struktur aufweisen, welche eine initial
hohe Dosis an Hyaluronsäure freisetzt und eine kontinuierliche Konzentration von
TGF-β1 gewährleistet. Letzteres wäre z.B. durch eine Kombination mit TGF-β1-
haltigen Microspheres möglich.
75
6 Summary
Svenja Paul
Chondrogenic Differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells by
bioactive Poly-ε-caprolactone Scaffolds.
Injured hyaline cartilage is replaced by morphologically, metabolically and
biomechanically incompetent replacement tissue. The consequences are chronic
pain, lameness and limitations of capability. Previously established regenerative
procedures are not capable to lead to adequate –ideally hyaline-like- and long-lasting
replacement tissue. The object of this paper was the development of a scaffold for
the defect coverage following a microfracture (MFX) and an attachment with
subsequent chondrogenic differentiation of the mesenchymal stem cells, which are
washed in by MFX and therefore supports the regeneration of hyaline cartilage.
The development of a biomimetic PCL-Scaffold was successful. By modification of
the elektrospinning variable flow rate and voltage it was possible to create nano- and
microfibers. We had no influence on the adjustment and constancy of the
fibrediameter, it was randomly. Though we state that the manufactured Scaffolds
were biomimetic they were not able to recruit cells. This observation was also seen in
the TGF-β1 containing Scaffolds, though they released TGF-β1 over a period of up to
170 h. Noticeable was that microfibrous Scaffolds initially released high TGF-β1
concentrations over a period of 70 h, whereas nanofibrous Scaffolds showed a rapid
decrease of the TGF-β1 concentration within the first 10 h.
The cell-seeding of the Scaffolds with MSCs was successful in all cases, though the
hyaluronic acid contained in VSNHA and VSMHA showed a partially significant
increase of the initial cell-seeding. The lowest cDNA-concentration was seen in the
Scaffolds with continuous TGF-β1 supplementation (VSP), so it can be assumed that
TGF-β1 has an inhibiting effect on the proliferation of the MSCs. That explains why
Scaffolds containing both, TGF-β1 and hyaluronic acid, showed lower cDNA
concentrations than Scaffolds only containing hyaluronic acid, but higher
concentrations than VSP. TGF-β1 seemed furthermore to induce the Collagen Type I
76 6 Summary
and Type II expression, which is shown in the high concentrations in TGF-β1
containing Scaffolds and VSP. Although the continuously supplementation of TGF-β1
had a partly significant Influence on the expression of both of these markers. In
contrast the presence of hyaluronic acid seemed to have an inhibitory effect on the
expression of Collagen Type I.
The relative expression of Aggrecan was obviously not influenced by the pre- or
absence of growthfactors (TGF-β1) or molecules of the hyaline matrix (hyaluronic
acid). Rather it is bound to the ultrastructural composition of the scaffolds. So it was
shown that nanofibers promote the expression of Aggrecan with increasing time of
culture, whereas microfibers rather have an opposite effect. This observation was
also found for the expression of Collagen type II. However the expression of
osteogenic markers was demonstrated for all scaffolddesigns independent from
fibrestrenght or pre- and absence of particular growthfactors. And the course is
similar to the VSP-experiment, so that it can be concluded that a transient expression
of osteogenic genproducts within the chondrogenic differentiation is found.
Against this background of the present results we conclude that a nanofibrous
Scaffold augmented with hyaluronic acid has a chondrogenic effect on MSCs and is
inhibiting an osteogenic Differentiation. This is more surprising as we can assume
that the release and therefore the concentration of hyaluronic acid within a few days
significantly decreases and so already an initial dose of hyaluronic acid has an
essential effect on the chondrogenic differentiation of the MSCs later on. The effect
of TGF-β1 is more complex. It seems that the expression of Collagen Type II is
dependent on a continuous TGF-β1 dose, whereas the expression of Collagen Type I
decreases after an initial increase in a continuous as well as in a transient
supplementation of TGF-β1. This means that already an initial release of TGF-β1
from the scaffolds promotes an induction along the chondrogenic Zellline, which is
not sufficient over a period of time longer than 21 days. Theoretically the ideal
scaffold should have a nanofibrous structure, which releases a high initial dose of
hyaluronic acid and ensures a continuous concentration of TGF-β1. The latter would
be possible e.g. with a combination of TGF-β1 containing microspheres.
7.2 Geräte 77
7 Anhang
7.1 Verbrauchsmaterialien
Biosphere Filter Tips 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl,
1000 µl
Sarstedt, Nümbrecht, Germany
Cryo 1°C Freezing Container Nalgene™ Labware, Rochester, USA
Cryomolds Sakura Tissue Tek, Zoeterwuede, Netherlands
Culture Slides BD Falkon, Franklin Lakes, USA
Eppendorf Tube Eppendorf, Hamburg, Germany
Kryoröhrchen 2 ml TPP, Trasadingen, Switzerland
Masterclear cap strips Eppendorf, Hamburg, Germany
Milipore Express-Plus (Flaschenfilter) Millipore, Billerica, USA
Minisart (Spritzenfilter) Sartorius, Göttingen, Germany
Objektträger Superfrost Plus Menzel-Glaser, Braunschweig, Germany
Perfusionssyringe 50 ml BD Plastipak™, Franklin Lakes, USA
Pipettetierhilfe Eppendorf Research 0,5-10 µl, 2-
20 µl, 10-100 µl, 50-200 µl, 100-1000 µl
Eppendorf, Hamburg, Germany
Pipettierhilfe Thermo Finnpipette 1-10 μl, 10-
100 μl, 100-1000 μl
Thermo, Waltham, USA
Spritzen 5 ml, 10 ml BD Discardit II, Franklin Lakes, USA
Urinbecher Sarstedt, Nümbrecht, Germany
Zellkulturflasche mit Filter (75 cm², 150 cm²,
300 cm²)
TPP, Trasadingen, Switzerland
Zellkulturschale (22,1 cm²) TPP, Trasadingen, Switzerland
Zellkulturtestplatte (24 well, 48 well, 96 well) TPP, Trasadingen, Switzerland
Zellschaber TPP, Trasadingen, Switzerland
Zentrifugenröhrchen konisch (15 ml, 50 ml) TPP, Trasadingen, Switzerland
7.2 Geräte
Autoklav 2540EL Systec, Wettenberg, Germany
78 7 Anhang
Beckmann GPR Centrifuge Beckmann Instruments GmbH, München,
Germany
Brutschrank HERAcell® Heraeus Holding, Hanau, Deutschland
Brutschrank Nuaire US Airflow Nuaire, Plymouth, USA
Modular Flow (FACS) DAKO, Cambridgeshire, UK
Feinwaage TE 1502S Sartorius, Göttingen, Germany
Fluoreszenzmikroskop Axioplan 2 mit Axio Cam
MRc5
Carl Zeiss, Jena, Germany
Inversionsmikroskop Leitz Diavert Leitz, Wetzlar, Germany
iCycler Bio-Rad, Hercules, USA
Kammer Sub Cell GT WIDE Mini Bio Rad, Hercules, USA
Cryostat Reichert & Jung Frigocut 2800 Leica, Bensheim, Germany
Magnetrührer VWR VMS-C7 VWR, Darmstadt, Germany
Mikroskop Axiovert 40C mit Axiocam MRC Zeiss Carl Zeiss, Jena, Germany
Mikroskop Philips EM400 Philips, Eindhoven, Netherlands
Nano drop Spectrophotometer ND-1000 Peq Lab, Erlangen, Germany
PH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin, Germany
Photometer Bio Mate 3 Thermo, Waltham, USA
Rüttler IKA-VIBRAX-VXR IKA Labortechnik, Staufen, Germany
Nuaire Biological Safety Cabinet Class II Nuaire, Plymouth, USA
Stickstofftank Arpege 40 Air Liquide Air Liquide, Düsseldorf, Germany
Thermal Cycler Bio Rad My Cycler Bio Rad, Hercules, USA
Thermal Cycler MJ Research PTC-200 MJ Research, San Francisco, USA
Thermo Forma -86°C ULT Freezer Thermo, Waltham, Germany
Thoma Zählkammer Brand, Wertheim, Germany
Transformator Power Pac Basic Bio Rad, Hercules, USA
Vortexer K-550GE Bender&Hobein AG, Zürich. Switzerland
Wärmeschrank KS-15 Edmund Bühler GmbH, Hechingen, Germany
Wasserbad Bachofer, Reutlingen, Germany
Zentrifuge 5415 D Eppendorf, Hamburg, Germany
Zentrifuge 5415 R Eppendorf, Hamburg, Germany
7.4 Reagenzien 79
Zentrifuge Biofuge pico Heraeus Holding, Hanau, Germany
Zentrifuge Combi Spin PeqLab, Erlangen, Germany
Lucy 3 Platereader Anthos, Heerhugowaard, Netherlands
Berthold 96 BertholdTechnologies, Bad Wildbad, Germany
7.3 Software
Corel Draw Corel, Ottawa, Canada
Image J NIH, Bethesda, USA
JMP statistical software JMP, Cary NC, USA
ND-1000 Data Viewer.vi Thermo, Waltham, USA
Sigma Plot Systat, Erkrath, Germany
Summit 4.3 DAKO, Cambridgeshire, UK
Zeiss Axio Vision 3.0.6 Zeiss, Oberkochen, Germany
7.4 Reagenzien
10x Magnesium Puffer Fermentas, St. Leon, Germany
12/21/1-C-6-s (AGC/Proteoglycan) Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa,
USA
25 mM MgCl2 Fermentas, St- Leon, Germany
4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Roche, Grenzach-Wyhlen, Germany
Aceton Roth, Karlsruhe, Germany
Agarose NEEO Ultra-Qualität Roth, Karlsruhe, Germany
Alzian blau Sigma, München, Germany
Antikörper CD13 PE BD Bioscience, Franklin Lakes, USA
Antikörper CD133 PE MACS (Miltenyi Biotec), Bergisch-Gladbach,
Germany
Antikörper CD271 MACS (Miltenyi Bitec), Bergisch-Gladbach,
Germany
Antikörper CD34 PE BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper CD45 FITC BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD106 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
80 7 Anhang
Antikörper PE labeled CD140b BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD166 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD29 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD44 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD49d BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD54 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD73 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE labeled CD90 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper PE Mouse IgG1 BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Antikörper rabbit antimouse (FITC mouse IgG1
Isotyp Kontrolle)
BD Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Ascorbinsäure (L-Ascorbic Acid) Sigma, München, Germany
Azeton Fisher Scientific
Borsäure Roth, Karlsruhe, Germany
Bromphenolblau Merck, Darmstadt, Germany
BSA Sigma, München, Germany
Chloroform Fisher Scientific
DEPC H2O (RNase-, DNase-frei) Invitrogen, Paisley, UK
Dexamethason (Fortecortin) MERCK, Darmstadt, Germany
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat Merck, Darmstadt, Germany
DMSO Sigma, München, Germany
dNTP Mix 2,5 mM Fermentas, St. Leon, Germany
Dulbeccos modifies eagel medium Invitrogen, Paisley, UK
EDTA Bochrom, Berlin, Germany
EDTA Dinatriumsalz-Dihydrat Roth, Karlsruhe, Germany
Ethanol Roth, Karlsruhe Germany
Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe, Germany
Fast Ruler Middle Range DNA Ladder Fermentas, St.Leon-Roth, Germany
Fetales Kälberserum (FKS) Invitrogen, Paisley, UK
Ficoll Sigma, München, Germany
7.4 Reagenzien 81
Formaldehyd 37% Merck, Darmstadt, Germany
HBSS Invitrogen, Paisley, UK
HCl Roth, Karlsruhe, Germany
Heamatoxylin Solution Gill No.3 Sigma München, Germany
Hemacolor® Merck, Darmstadt, Germany
Heparin Rationpharm, Ulm, Germany
HEPES Roth, Karlsruhe, Germany
Hyaluronat Acros Organics, NJ, USA
IBMX Sigma, München, Germany
II-II6B3-s (Coll II) Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa,
USA
Indomethacin Sigma, München, Germany
Insulin Sigma, München, Germany
ITS-plus premix BD, Franklin Lakes, USA
Kaliumchlorid zur Analyse Merck, Darmstadt, Germany
Kaliumhydrogenphosphat zur Analyse Merck, Darmstadt, Germany
L-Glutamin PAA, Pasching, Austria
LiCl Sigma, München, Germany
L-Proline Sigma, München, Germany
M-38 Supe (Coll I) Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa,
USA
Maxima Probe/qPCR Mastermix 2x Fermentas, St. Leon, Germany
MEM NEAA Invitrogen, Paisley, UK
Methanol Roth, Karlsruhe, Germany
N,N-dimethylformamide Fisher Scientific
NaOH Roth, Karlsruhe, Germany
Natriumacitat Sigma, München, Germany
Natriumchlorid zur Analyse Merck, Darmstadt, Germany
PCR-Primer: Agga Eurogentec Oli Gold™
PCR-Primer: Aggs Eurogentec Oli Gold™
PCR-Primer: aP2F Eurogentec Oli Gold™
82 7 Anhang
PCR-Primer: aP2R Eurogentec Oli Gold™
PCR-Primer: HuAPl TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: HuAPr TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: Hu-Col2a1L TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: Hu-Col2a1R TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: Huosteopont l Eurogentec Oli Gold™
PCR-Primer: Huosteopont r Eurogentec Oli Gold™
PCR-Primer: HuOsterixl TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: HuOsterixr TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: HuRunX2l TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: HuRunX2r TIP Molbio, Berlin, Germany
PCR-Primer: PPARgammaF Eurogentec Oli Gold™
PCR-Primer: PPARgammaR Eurogentec Oli Gold™
Penicillin/Streptomycin PAA, Pasching, Austria
Poly-ε-caprolacton Sigma, München, Germany
Poly(2-Hydroxyethyl)-Methacrylat Sigma, München, Germany
Primer Coll 1 TM TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Coll 1f TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Coll 1r TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Coll 2 TM TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Coll 2f TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Coll 2r TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Gapdh fwd TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Gapdh rev TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer Gapdh TM TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer TaqMan Collagen 1 TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer TaqMan Collagen 2 TIP Molbio, Berlin, Germany
Primer TaqMan Gapdh TIP Molbio, Berlin, Germany
Sodium-Pyruvate Solution PAA, Pasching, Austria
SudanIII Färbelösung Sigma, München, Germany
7.5 Kits 83
Taq-Polymerase Fermentas, St. Leon, Germany
TGF-β 1 R&D, Minneapolis, USA
TGF-β 3 R&D, Minneapolis, USA
Tissue Tec O.C.T. Compound Sakura Tissue-Tek, Zoeterwuede, Netherlands
Tris-Base Roth, Karlsruhe, Germany
Trypsin-EDTA PAA, Paschin, Austria
Vectashield Vector Inc., Burlingame, USA
β-Glycerophosphat Sigma, München, Germany
β-Mercaptoethanol Sigma, München, Germany
7.5 Kits
Alkalische Phosphatase Kit Sigma, München, Germany
NucleoSpin RNA II Machery Nagel, Düren, Germany
NucleoSpin Tissue (250) Machery Nagel, Düren, Germany
Quantikine® Human TGF-β1 R&D, Minneapolis, USA
Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Invitrogen, Paisley, UK
Revert Aid H Minus Frost Strand cDNA Synthesis
Kit
Fermentas, St.Leon-Roth, Germany
84
8 Literaturverzeichnis
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Danksagung 105
Danksagung
Ich bedanke mich bei Dr. med. Jan Schagemann für die fachliche Betreuung, die
freundliche und hilfreiche Unterstützung sowie für die kritische Korrektur und die
stets aufmunternden Worte.
Bei Priv.-Doz. Dr. Jan Kramer und Prof. Dr. rer. nat. Jürgen Rohwedel möchte ich
mich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes bedanken. Mein besonderer Dank gilt
hier den Technischen Assistentinnen Barbara Andresen und Alexandra Tiedtke, die
stets ein offenes Ohr und eine helfende Hand für mich hatten. Auch Dr. rer. nat. Silke
Erdmann hat durch Ihre hilfsbereite Art meine Arbeit sehr unterstützt.
Bei Ralf Haller möchte ich mich für die Geduld und Hilfsbereitschaft bedanken und
für die aufmunternden Worte, durch die der Alltag und die kleinen Frustrationen der
in vitro Kultur auszuhalten waren.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei meiner Tochter Hannah bedanken für ihre Geduld
und Genügsamkeit, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Ebenso wie
bei den zahlreichen Babysittern (Renate Paul, Klemens Thiede sowie Andrea und
Peter Gerstenkorn).
Ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern Renate Paul und Klaus Müller, die mir
mein Studium und die Promotion ermöglicht haben. Meiner Mutter danke ich
besonders für die vielen Stunden, in denen sie sich meine Sorgen und Nöte
angehört, mich aufgebaut und motiviert hat. Sie ist in der Phase der Promotion
immer eine große Stütze gewesen.
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