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TruSeq DNA & RNA サンプル調製の

ベストプラクティスとトラブルシューティング

渡辺 真子 (Masako Watanabe, PhD) テクニカルアプリケーションサイエンティスト

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Outline

TruSeq DNA & RNA サンプル調製

• 成功へのベストプラクティス

• よくある問題のトラブルシューティング

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次世代シーケンス (NGS) のためのTruSeq ライブラリー

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ライブラリーの評価

qPCR を用いたTruSeq DNA ・ RNA ライブラリーの定量

- プライマーはイルミナシーケンシングライブラリーのアダプター末端に一致

Bioanalyzerを用いた品質の評価

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ライブラリー調製のベストプラクティスとトラブルシューティング

TruSeq DNA

– ワークフロー

– インプットに用いるサンプル

– 断片化

– ゲルによるサイズセレクション

TruSeq RNA

– ワークフロー

– インプットに用いるサンプル

– 断片化

TruSeq DNA と RNAに共通すること

– 試薬の取り扱い

– サーマルサイクラ―の設定とキャリブレーション

– AMPure ビーズを用いた精製

– バイオアナライザートレースの評価

TruSeq DNA & RNA サポートツール (Illumina Website)

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TruSeq DNA -ワークフロー

-インプットサンプル

-断片化

-ゲルによるサイズセレクション

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TruSeq DNA ワークフロー

http://www.illumina.com/documents//products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf

Gel size selection

A. ゲノムDNA の断片化

B. End repair とリン酸化

C. A-tailing

D. Index adapter のligation

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TruSeq DNA ライブラリー

Gel-free method for TruSeq Enrichment

Gel-method for whole-genome resequencing

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べストプラクティス:

インプットサンプル, DNA

TruSeq DNA 1ug ゲノム DNA

定量 蛍光ベースの方法

起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い

期待していないピークの検出

Nanodropなど紫外分光法による定量は推奨しておりません。

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べストプラクティス:

インプットの品質, TruSeq DNA

純度 260/280nm比: 1.8-2.0

サイズの確認 ゲル電気泳動

ゲノムDNA のサイズの確認

起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い

期待していないピークの検出 不正確なライブラリーサイズ

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ベストプラクティス:

TruSeq DNA 断片化

断片化方法: Covaris

Covaris での断片化

(whole-genome resequencing)

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断片化

気泡の混入

不正確なインプット

15 100 200 300 500 850 [bp]

[FU]

100

50

0

DNA インプット

– 品質

– 量

Covaris

– 気泡を防ぐ

– 脱気

– 水量

– ウォーターバスの温度 (6-8°C)

起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い

不正確なライブラリーサイズ

改善策：既知のDNAでのcovaris の動作確認

Air これはどういう意味なのか？

気泡が含まれている場合

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ベストプラクティス:

ゲルによるDNA のサイズセレクション

プロトコルに準じて実施して下さい。

サンプル毎に異なるレーン、またはゲルあたり1サンプルを流すことにより、 コンタミネーションを最小にして下さい。

サイズマーカー

– 推奨のプロメガ社製のマーカーをご使用下さい。

– DNA ラダーをオーバーロードしないようご注意下さい。 (load 3µl)

SyBr Gold Nucleic acid gel stainで前染色をしたゲルをご使用下さい。

400-500bp for

whole-genome

resequencing

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正確なサイズセレクションのためには、SYBR Gold で前染色したゲルが必要

TruSeq DNA ゲルによるサイズセレクション– Part I

400-500 bpを選択

SYBR Gold, 前染色

470 bp

SYBR Gold, 後染色

400-500 bpを選択

360 bp

起こりうる問題：不正確なライブラリーサイズ

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Life Technologies (Invitrogen) 社製 E-gels

ターゲットとしていないサイズを選択してしまう

TruSeq DNA ゲルによるサイズセレクション – Part II

ゲル電気泳動, 300-400 bp を選択

増幅前

340 bp

増幅後

270 bp

起こりうる問題：不正確なライブラリーサイズ

ここはどのような説明をすればよいか？

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TruSeq RNA - ワークフロー

- インプットサンプル

- 断片化

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TruSeq RNA ワークフロー

http://www.illumina.com/documents//products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf

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最終産物 ~260bp

TruSeq RNA ライブラリー

Lower

Maker

Upper

Maker

Sample

Peak

Baseline

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ベストプラクティス:

インプットサンプル, RNA

TruSeq RNA 0.1-4ug total RNA

定量 蛍光ベースの方法

起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い 期待していないピークの検出

不正確なライブラリーサイズ

Nanodropなど紫外分光法による定量は推奨しておりません。

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ベストプラクティス:

RNA Integrity (RIN ≥ 8)

From: Agilent’s Bioanalyzer Applications for Next-Gen Sequencing: Updates and Tips March 1, 2011

Human

起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い

不正確なライブラリーサイズ

例：分解したサンプルを使用すると 、ライブラリー収量が低くなる。

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ベストプラクティス:

RNA の断片化

二価陽イオンと温度 (94°C) によるRNA の断片化

不十分な断片化

– インプットRNA の量が多い

– 不正確な温度

起こりうる問題：ライブラリー収量が低い 不正確なライブラリーサイズ

不十分な断片化

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TruSeq DNAとRNAに共通すること -試薬の取り扱い

-サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション

- AMPure ビーズを用いた精製

-バイオアナライザートレースの評価

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ベストプラクティス:

試薬の取り扱い

A-テーリングミックス(ATL) とライゲーションミックス (LIG) は 粘性有

試薬を分注してマスターミックスの凍結融解を回避

ユーザーガイドにリストされた順序で試薬を添加

DNA RNA

- End Repair Mix

- A-Tailing Mix

- Ligation Mix

- PCR Master Mix

- First Strand Master Mix

- Second Strand Master Mix

- End Repair Mix

- A-Tailing Mix

- Ligation Mix

- PCR Master Mix

起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い 期待していないピークの検出

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ベストプラクティス:

サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション

加熱 有り 加熱 無し

A B

起こりうる問題：ライブラリー収量が低いまたは無い

サーマルサイクラーのフタは

100ºC に加熱

– チューブのフタへの凝縮

– 酵素活性効率の低下

– 高い塩濃度

サーマルサイクラーのキャリブレーション

推奨の粘着シールを使用

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Agencourt AMPure XP Beads を用いたDNA のサイズ選択

磁気ビーズを用いたDNA 精製法

ビーズ溶液:サンプル比に基づくサイズセレクション

あるサイズ以上の核酸をキャプチャー。

よりサイズの小さい核酸や夾雑物を除去。

Beads Double stranded DNA Enzymes, primers, adapters, etc.

サンプル ビーズの結合 分離 エタノール洗浄 溶出 別のチューブへ

マグネット

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ベストプラクティス:

AMPure XP ビーズ

ビーズ – 室温

ビーズ をVortex で撹拌

推奨のプレートとマグネットスタンド(Ambion)

注意深いピペッティング

用時調製した80% Ethanolを使用

ドライアップ中は、プレートをマグネットスタンドに置いたままにしておく

エタノールが残ると以降のステップを阻害

magnetic stand

1 2

3 4

1) clear 2) partly

3) in suspension

4) no beads

起こりうる問題: ライブラリー収量が低い

期待していないピークの検出

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TruSeq DNAとRNAに共通すること -試薬の取り扱い

-サーマルサイクラーのセッティングとキャリブレーション

-AMPure ビーズを用いた精製

-バイオアナライザートレースの評価

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サイズが大きくブロードなピーク

AMPure ビーズの持ち込み

考えられる原因

– ビーズを用いた分離の際、異なるマグネットを使用

– ピペットを用いた溶出の際、ビーズのペレットを分散

– ライブラリーをマグネット上に推奨時間保持しない

ビーズの持ち込み マグネット上での保持を追加した後

改善策: マグネット上での保持時間の追加

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ピークが混ざっている場合

Bioanalyzer Chipへのオーバーロード

High Sensitivity DNA 5-500pg/μl

DNA 1000 0.1-50ng/μl

改善策: サンプルの希釈

希釈してロード オーバーロード

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約100bpのピークの検出

PCR プライマーダイマー

プライマーダイマー

考えられる原因

– AMPure ビーズ

– 低品質または少量のインプットサンプル

起こりうる問題: プライマーダイマーがフローセルに結合

改善策: AMPure XP ビーズ シーケンス

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約120bp のピークの検出

アダプターダイマー

考えられる原因

– AMPure ビーズ

– 低品質または少量のインプットサンプル

– End Repair Mix または A-Tailing Mix の酵素の効率低下

– ゲルでのサイズセレクション

アダプター

起こりうる問題: アダプターがクラスターを形成

改善策: AMPure XP ビーズまたはゲル精製

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サイズが大きいピーク

PCR アーティファクト

考えられる原因 : PCRプライマーの枯渇

– サイクル数の増加

– 過剰なインプットサンプル

起こりうる問題: 期待していないクラスター密度

改善策: qPCR 後にシーケンス

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定量: 蛍光法

サンプルの質: ゲル(DNA) Bioanalyzer (RNA)

断片化: Covaris (DNA)

Fragmentation mix (RNA)

試薬: 粘性試薬の取り扱い

AMPure ビーズ: ベストプラクティスに準拠

ゲルによるサイズセレクション:

ゲル精製のプロトコルに準拠

PCR: PCRプライマーの枯渇を回避

サーマルサイクラ―の設定とキャリブレーション

ライブラリーのバリデーション :

qPCR と Bioanalyzer

TruSeq ベストプラクティス まとめ

プロトコルに準拠

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ライブラリー トラブルシューティング まとめ

低収量

– インプットサンプル

– 断片化

– AMPure ビーズでの精製

– 試薬の取り扱い

– サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション

異なるライブラリーサイズ

期待していないピーク

– インプットサンプル

– 断片化

– AMPure ビーズでの精製

– ゲルでのサイズ選択

– PCR プライマーの枯渇

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TruSeq DNA & RNAサンプル調製

サポートツール

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For More Information Visit www.illumina.com – Support

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References

TruSeq Sample Preparation Best Practices Guide

https://icom.illumina.com/download/summary/xDKeCXABrEa2bkONskKNAw

TruSeq DNA LT Sample Prep Kit Support

http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_lt_sample_prep_kit.ilmn

TruSeq DNA HT Sample Prep Kit Support

http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_ht_sample_prep_kit.ilmn

TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support

http://www.illumina.com/support/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v

2.ilmn

Illumina Adapter Sequences Letter

https://icom.illumina.com/Download/Summary/5kKzNLtAtUCIhbHYc3NkUw

Sequencing Library qPCR Quantification Guide

https://icom.illumina.com/download/summary/mTte7HhpAEyCxBFbeMVqTw

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ご清聴ありがとうございました。

ご質問はtechsupport@illumina.comでも承ります。