ubicación subcelular, purificación, caracterización y
Post on 18-Feb-2022
1 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UNIVERSIDAD DE LOS ANDESFACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIALABORATORIO DE ENZIMOLOGIA DE PARASITOS
Ubicación Subcelular, purificación, caracterización yestudios de interacción proteína-proteína de la
enolasa de epimastigotes de Trypanosoma cruzi
Trabajo especial de grado presentado porMaría Rosa Domingo Sananes
Como requisito parcial para optar al título deLicenciada en Biología
Tutor Dr. Juan Luis Concepción
Mérida, Julio 2004
ii
Para mis padres
Para todas aquellas personas alrededor del mundo que padecen de la
enfermedad de Chagas y otras enfermedades parasitárias
iii
AGRADECIMIENTOS
A Juan Luis Concepción, por su dirección, su ayuda, su enseñanza y su
amistad.
A Luisana Avilán por su inspiración, sus consejos, su amistad y por todo lo que
aprendí en sus clases.
A la Dra. Andreína Pacheco, al Dr. Ananías Escalante, la técnico Amy Martin y
al Dr. Robert Wohlhueter del Biotechnology Core Facility Branch del National
Center for Infectious Diseases en Atlanta, GA, USA, por la obtención de mapas
peptídicos por MALDI-TOF MS y a Andreína y José David Rosales por su ayuda
en el análisis de los resultados.
Al Dr. Enrique Arsiniegas por su generoso regalo del anticuerpo anti-tubulina.
Al Dr. Cesare Olinto Colasante y al laboratorio de Fisiología de la Conducta en
la Facultad de Medicina de la Universidad de Los Andes por permitirnos el uso
del microscopio de láser confocal y por su asistencia en la obtención de las
fotografías.
Al CDCHT-ULA y ERVIC-CEE, por financiar este trabajo.
A Priscila Peña, Luisana Avilán, Wilfredo Quiñones, William Quintero, Carlos
Sanz, Guido Nuñez, grupo de técnicas analíticas del B-2003 y Tibisay Ruiz, por
su colaboración directa en este trabajo.
A la Universidad de Los Andes por permitirme realizar mi carrera y todos los
demás profesores que me inspiraron a mejorar y a amar lo que hago, en
especial a Juan Puig, Marina Calcagno, Wilfredo Quiñones y muchos más.
A Sioly Márquez, por su ayuda con la burocracia.
iv
A mis compañeros y amigos del Laboratorio de Enzimología de Parásitos, Ana
Cáceres, Priscila, Carlos, Jorge, Melisa, Marco, Elizabeth, David, José, Guido y
más recientemente Ximena y Anelvi, por su apoyo, su enseñanza y los buenos
y malos ratos compartidos.
A todos mis demás amigos y compañeros durante la carrera, Andrea, Marielis,
Diego, Francisco, Luis, Kike, Marisé, Jessica, Alejandra y a todos los que
estudiaron conmigo, porque aprendí mucho más que biología.
A mis amigos, Manuela, Eylin, Yuma, Priscila, Manuela (mi hermana), Marco,
Pablo, Jamie, Rafael, Jacobo, César, porque sin ustedes no hubiese logrado
nada.
A Dorys y a Lisbeth, por su apoyo y ayuda, por ser parte de mi familia.
A Carlos, por ayudarme en todo y por quererme tal como soy.
A mis padres, Marta Sananes y Carlos Domingo, por darme todo.
A la música y a la ciencia...
v
RESUMEN
La enolasa es una enzima de la ruta glicolítica que cataliza la deshidratación
reversible del 2-fosfoglicerato para producir fosfoenolpiruvato en una reacción
dependiente de cationes divalentes, siendo el magnesio el cofactor natural. La
reacción inversa ocurre en la gluconeogénesis. Esta enzima es un potencial
blanco quimioterapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Chagas,
causada por Trypanosoma cruzi, así como para el tratamiento de
enfermedades causadas por otros tipanosomátides. En este trabajo se estudió
la ubicación subcelular de la enolasa en epimastigotes de T. cruzi utilizando
centrifugación diferencial e isopícnica, permeabilización selectiva de
epimastigotes con digitonina e inmunomicroscopía de láser confocal. La
actividad de la enzima se encontró exclusivamente en el citosol, sin embargo,
por Western blot se detectaron posibles isoformas inactivas localizadas en
fracciones membranales poco densas (microsomas), una forma de peso
molecular similar al de la enolasa del citosol y dos de menor peso molecular.
Por inmunomicroscopía de láser confocal se detectó la presencia de enolasa en
la superficie externa de epimastigotes intactos de T. cruzi. Esta enolasa de
superficie podría interactuar con plasminógeno y estar involucrada en procesos
invasivos en el hospedador vertebrado, como se ha visto en otros organismos.
La enolasa activa fue purificada a homogeneidad a partir de citosol mediante
cromatografía en DEAE, cromatografía en Cibacron Blue, precipitación con
sulfato de amonio y cromatografía en fenil Sefarosa, con un peso molecular
entre 49 y 51 kDa aproximadamente, y una actividad específica de 182.1
U/mg. El rendimiento de la purificación fue de 8%. Con la enzima pura y/o
fracciones parcialmente purificadas se realizaron varios ensayos para
caracterizar la enolasa de T. cruzi: el pH óptimo de la enzima fue entre 8 y 8.5,
su óptimo de Mg++ fue de 2 mM y otros cationes divalentes produjeron
inactivación de la enzima en presencia de Mg++, además, su actividad
específica aumenta a medida que se diluye. Se determinaron las constantes
cinéticas de la enzima pura para la reacción en ambos sentidos: el Km fue de
55 µM para el 2-fosfoglicerato y de 147 µM para el fosfoenolpiruvato y la kcat
vi
fue de 4766 min-1 en el sentido glicolítico y de 2038 min-1 en el sentido
gluconeogénico. Para una fracción parcialmente purificada se obtuvieron
resultados similares, aunque el Km para fosfoenolpiruvato fue un poco mayor.
El fluoruro y el fluoruro en presencia de fosfato (1 mM), inhibieron a la enzima
de manera competitiva, siendo los Ki 2570 µM y 45 µM respectivamente. El
pirofosfato también inhibió a la enzima con un Ki entre 200 y 500 µM, lo que
abre la posibilidad del uso de bisfosfonatos como inhibidores de esta enzima
para ser utilizados como agentes quimioterpéuticos. Mediante cromatografía de
filtración, electroforesis en condiciones nativas, electroforesis bidimensional
(condiciones nativas versus desnaturalizantes) y ligand blotting, se realizaron
estudios de interacción de la enolasa con otras proteínas del parásito,
utilizando fracciones parcialmente purificadas de la enzima. Estos
experimentos, junto con observaciones realizadas durante la purificación de la
enolasa, indican que esta enzima interactúa con varias proteínas y podría estar
formando algún tipo de complejo multiprotéico. Con cinco de las proteínas que
posiblemente interactúan con la enolasa de epimastigotes de T. cruzi se
realizaron mapas peptídicos por espectrometría de masas de tiempo de vuelo
con ionización/desorción por láser asistida por matrices para tratar de
establecer su identidad. Aunque no se logró la identificación inequívoca de
ninguna, se cuenta con espectros que pueden ser utilizados para análisis
posteriores, cuando sea publicado el genoma de Trypanosoma cruzi.
Palabras clave: Trypanosoma cruzi, metabolismo, glicólisis.
vii
ABSTRACT
Enolase is a glycolytic enzyme that catalyzes the reversible dehydration of 2-
phosphoglycerate to yield phosphoenolpyruvate in a divalent cation-dependent
reaction, where magnesium is the natural cofactor. The inverse reaction takes
place in gluconeogenesis. This enzyme is a potential drug target for the
treatment of Chagas’ disease, caused by Trypanosoma cruzi, and diseases
caused by other trypanosomatid species. In this work the subcellular
localization of the enolase from T. cruzi was studied by differential and
isopicnic centrifugation, selective digitonin permeabilization and confocal laser
immunomicroscopy. Enzyme activity was exclusively located in the cytosol. By
Western blot however, possible inactive isoforms were detected in low-density
membrane fractions (microsomes). One form has a molecular weight similar to
cytosol enolase, and two other forms have lower molecular weights. Enolase
was detected on the external surface of intact T. cruzi epimastigotes using
confocal laser immunomicroscopy. This surface enolase, as in other organisms,
could interact with plasminogen and might be involved in invasive processes
within the vertebrate host. Active enolase was purified to homogeneity by
DEAE chromatography, Cibacron Blue chromatography, ammonium sulfate
fractionation and phenyl Sepharose chromatography, with an approximate
molecular weight between 49 and 51 kDa and a specific activity of 182.1
U/mg. The purification procedure had an 8% yield. Several assays where
carried out with pure and/or partially purified enolase in order to characterize
the T. cruzi enzyme: the pH optimum was found between 8 and 8.5, the Mg++
optimum was 2 mM and in the presence of this ion, other divalent cations
inactivated the enzyme, also, the specific activity of T. cruzi enolase increased
with dilution. The kinetic constants were determined for the pure enzyme: Km
was 55 µM for 2-phosphoglycerate and 147 µM for phosphoenolpyruvate; kcat
was 4766 min-1 for the glycolytic reaction and 2038 min-1 for the gluconeogenic
reaction. Similar values were obtained for a partially purified fraction, although
the Km for phosphoenolpyruvate was relatively greater. Fluoride both in
absence and presence of phosphate (1mM) competitively inhibited the enzyme,
viii
with Ki of 2570 µM and 45µM respectively. Pyrophosphate also inhibited the
enzyme with a Ki value between 200 and 500 µM. This opens the possibility of
using bisphosphonates as chemotherapeutic agents. Filtration chromatography,
native electrophoresis, bidimentional (native versus denaturizing)
electrophoresis and ligand blotting were used to study the interaction of T.
cruzi enolase with other parasite proteins in partially purified fractions. The
results of these experiments, together with observations made during
purification of the enzyme, indicate that enolase does interact with other T.
cruzi proteins, and could be forming some sort of multiprotein complex. In
order to identify some of these proteins, matrix assisted laser
desortion/ionization time-of-flight mass spectrometry peptide mass
fingerprinting was carried out with 5 proteins. Although the identity of none of
these proteins was firmly established, the spectra obtained may be used for
later analysis, after publication of the Trypanosoma cruzi genome.
Key words: Trypanosoma cruzi, metabolism, glycolysis
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
2PGA 2-Fosfoglicerato
A.E. Actividad específica
ADP Adenosin difosfato
AENO35 Banda de 35 kDa reconocida por anticuerpo anti-enolasa
AENO26 Banda de 26 kDa reconocida por anticuerpo anti-enolasa
AEP 2-aminoetilfosfonato
AMP Adenosin monofosfato
ATP Adenosin trifosfato
BSA Albúmina de suero bovino
C Citosol
CM Carboximetil
CoA Coenzima A
Cy3 Indocarbocianina
DABCO 1,4-diazabiciclo-[2,2,2]-octano
DEAE Dietilaminoetil. Fracción de purificación por DEAE-52
whatman
DHAP Dihidroxiacetona fosfato
DNA Ácido desoxirribonucléico
DTT Ditiotreitol
E. coli Escherichia coli
EP Cepa Elpidio Padrón de Trypanosoma cruzi
FGG Fracción granular gruesa
FITC Fluoresceína
FM Fracción microsomal
FN Fracción nuclear
F.P. Factor de purificación
FRD Fumarato reductasa
FRG Fracción rica en glicosomas
FS Fenil Sefarosa, fracción de purificación
G6PDH Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
x
G3P Glicerol-3-fosfato
GPI Glicosilfosfatidilinositol
GRAVY Índice de hidropaticidad
H Homogenato
HK Hexokinasa
IDH Isocitrato deshidrogenasa
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido
ki Constante de inhibición
Km Constante de Michaelis-Menten
kcat Constante catalítica
L. major Leishmania major
L. mexicana Leishmania mexicana
MALDI-TOF MS Espectrometría de masas de tiempo de vuelo, con
ionización/desorción por laser asistida por matrices
MES Ácido 2-[N-morfolino]propanosulfónico
MDH Malato deshidrogenasa
MOPS Ácido 3-[N-morfolino]etanosulfónico
mRNA RNA mensajero
NAD+ Nicotin adenin dinucleótido oxidado
NADH Nicotin adenin dinucleótido reducido
NADP+ Nicotin adenin dinucleótido fosfato oxidado
NADPH Nicotin adenin dinucleótido fosfato reducido
Na2EDTA Ácido etiilendiamina tetra-acético
Na2EGTA Ácido etilenglicol-bis-(β-aminoetil eter) N,N’-tetra-acético
P43 Proteína de 43 kDa que co-purifica con la enolasa de
epimastigotes de Trypanosoma cruzi
P45 Proteína de 45 kDa que co-purifica con la enolasa de
epimastigotes de Trypanosoma cruzi
P52 Proteína de 52 kDa que co-purifica con la enolasa de
epimastigotes de Trypanosoma cruzi
P57 Proteína de 57 kDa que co-purifica con la enolasa de
epimastigotes de Trypanosoma cruzi
xi
P61 Proteína de 61 kDa que co-purifica con la enolasa de
epimastigotes de Trypanosoma cruzi
P64 Proteína de 64 kDa que co-purifica con la enolasa de
epimastigotes de Trypanosoma cruzi
P70 Proteína de 70 kDa que co-purifica con la enolasa de
epimastigotes de Trypanosoma cruzi
P75 Proteína asociada a la membrana de los glicosomas de
Trypanosoma cruzi
P80% Precipitado entre 40 y 80% de sulfato de amonio, fracción
de purificación
PEP Fosfoenolpiruvato
PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxikinasa
PEPM Fosfoenolpiruvato mutasa
PGK Fosfoglicerato kinasa
Pi Fosfato inorgánico
PK Piruvato kinasa
Plg Plasminógeno
PMSF Fenil metil sulfonil fluoruro
PPDK Piruvato fosfato dikinasa
PPi Pirofosfato
RNA Ácido ribonucléico
SDH Succinato deshidrogenasa
SDS Dodecil sulfato de sodio
SDS-PAGE Electroforesis en geles de acrilamida en presencia de SDS
T. brucei Trypanosoma cruzi
T. cruzi Trypanosoma brucei
TAO Oxidasa alternativa de tripanosomas
TCA Ácido ticloroacético
TEMED N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina
TIM Triosa-fosfato isomerasa
TLCK Tosyl-leucin-clorometil cetona
tRNA RNA de transferencia
xii
TX-100 Tritón X-100
U Unidades enzimáticas
Vmax Velocidad máxima
xiii
INDICE GENERAL
Pg
I. Introducción 1
Trypanosoma cruzi y la enfermedad de Chagas 1
Trypanosoma cruzi 1
Taxonomía y características 1
Ciclo de vida y transmisión 5
Enfermedad de Chagas 7
Descripción 7
Diagnóstico y tratamiento 9
Búsqueda de nuevos tratamientos 11
Metabolismo de Trypanosoma cruzi 16
Características generales 16
Glicólisis y el glicosoma 21
Modelo del metabolismo intermediario 23
Enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa, EC 4.2.1.11) 28
Características generales 28
Enolasa en tripanosomátides 38
Interacciones proteína-proteína 42
II. Hipótesis 49
III. Objetivos 49
IV. Metodología 50
Material biológico 50
Determinación de concentración de proteínas 50
Ensayos enzimáticos 51
xiv
Electroforesis en geles de acrilamida en presencia de SDS (SDS-
PAGE, electroforesis en condiciones desnaturalizantes) 53
Western Blotting 54
Ubicación subcelular 55
Centrifugación diferencial 55
Centrifugación isopícnica 56
Permeabilización selectiva de epimastigotes con digitonina 57
Inmmunomicroscopía de láser confocal 58
Preparación de Sefarosa CL4B-Cibacron Blue 58
Purificación de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 59
Método A 59
Método B 60
Caracterización de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 61
Actividad enolasa respecto al pH 61
Actividad enolasa en presencia de varios cationes divalentes 61
Actividad enolasa respecto a la concentración de enzima 61
Caracterización cinética de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 62
Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 63
Estudios de Interacción Proteína-Proteína 64
Cromatografía de filtración 64
Electroforesis en condiciones nativas y Western blotting nativo 64
Electroforesis bidimensional (condiciones nativas versus
desnaturalizantes)
65
Ligand blotting 65
Determinación de cantidades relativas de varias proteínas en
SDS-PAGE por análisis de imagen 66
Obtención de mapas peptídicos por espectrometría de masas de
tiempo de vuelo con ionización/desorción por laser, asistida por
matrices (MALDI-TOF MS) 67
Análisis de los resultados de MALDI-TOF MS 67
Inducción y purificación de la enolasa recombinante de L. mexicana 69
xv
V. Resultados 70
Ubicación subcelular de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 70
Centrifugación diferencial 70
Centrifugación isopícnica 74
Permeabilización selectiva de epimastigotes con digitonina 78
Inmunomicroscopía de láser confocal 84
Purificación de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 87
Método A 87
Método B 91
Purificación 1 91
Purificación 2 96
Caracterización de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 100
Actividad enolasa respecto al pH 100
Actividad en presencia de varios cationes divalentes 101
Actividad respecto a la concentración de enzima 103
Caracterización cinética de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 106
Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 108
Inhibición por fluoruro 109
Inhibición por fluoruro en presencia de fosfato 110
Inhibición por pirofosfato 112
Estudios de interacción proteína-proteína 116
Proteínas que co-purifican con la enolasa de T. cruzi 116
Cromatografía de filtración 118
Electroforesis en condiciones nativas 124
Electroforesis Bidimensional (Nativa vs. desnaturalizante) 126
Ligand-blot 130
Determinación de cantidades relativas de varias proteínas en
SDS-PAGE por análisis de imagen 132
Análisis de mapas peptídicos obtenidos mediante MALDI-TOF MS.
Identificación preliminar de varias proteínas que co-purifican con
la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 134
xvi
VI. Discusión 145
Ubicación Subcelular de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 146
Purificación de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 151
Caracterización de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi 155
Estudios de interacción proteína-proteína 163
Consideraciones finales 167
VII. Conclusiones 169
VIII. Referencias 170
IX. Anexos 190
Mapas de masas peptídicas 189
xvii
INDICE DE FIGURAS
Pg
Figura 1. Distribución geográfica de la Enfermedad de Chagas en
América. Zonas endémicas se muestran en negro. Tomada y
modificada de Parasite and Parasitological Resources
(http://www.biosci.ohio-state.edu/~parasite/home.html). 2
Figura 2. Morfología de Trypanosoma cruzi. (a). Dibujo esquemático de
la forma epimastigote, tomado y modificado de: de Souza, 1999. (b).
Esquemas de los distintos estadíos morfológicos. 5
Figura 3. Esquema del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi. Tomada y
modificada de Expert Reviews in Molecular Medicine. 6
Figura 4. Esquema del metabolismo de Trypanosoma cruzi 26
Figura 5. Reacción catalizada por la enolasa 30
Figura 6. Estructura de la enolasa de levadura. Figura realizada con el
programa Cn3d, a partir de la estructura de levadura (Número de
acceso en el Protein Data Bank: 1ONE) 32
Figura 7. Alineamiento de secuencias de proteínas de las enolasas de
tripanosomatides y humanos. Realizado con el programa ClustalW. 40
Figura 8. Distribución de la actividad enolasa y actividades de
marcadores enzimáticos en fracciones obtenidas mediante
centrifugación diferencial en epimastigotes de T. cruzi. 71
Figura 9. Distribución de enolasa y proteínas marcadores en fracciones
obtenidas mediante centrifugación diferencial, detectadas por Western
blot en epimastigotes de T. cruzi. 73
Figura 10. Distribución de la actividad enolasa y actividades de los
distintos marcadores enzimáticos en las fracciones obtenidas mediante
centrifugación isopícnica. 75
Figura 11. Distribución de enolasa y proteínas marcadoras en
fracciones obtenidas mediante centrifugación isopícnica, detectadas por
Western blot en epimastigotes de T. cruzi. 77
xviii
Figura 12. Liberación de la actividad enolasa y de marcadores
enzimáticos de epimastigotes de T. cruzi permeabilizados con
digitonina 80
Figura 13. Detección de enolasa y proteínas marcadoras en las
fracciones obtenidas mediante permeabilización con digitonina en
epimastigotes de T. cruzi 82
Figura 14. Detección de enolasa y α-tubulina en epimastigotes de T.
cruzi permeabilizados y no permeabilizados, mediante microscopía de
laser confocal. 86
Figura 15. SDS-PAGE y Western blot de las fracciones de purificación
de la enolasa citosólica de epimastigotes de Trypanosoma cruzi por el
método A 88
Figura 16. Perfil de elusión de la columna de fenil Sefarosa con el
método A. 89
Figura 17. SDS-PAGE y Western blot de las fracciones de purificación
de la enolasa citosólica de epimastigotes de Trypanosoma cruzi por el
método B, purificación 1. 92
Figura 18. Perfil de elusión de la columna de fenil Sefarosa con el
método B, purificación 1. 94
Figura 19. SDS-PAGE y Western blot de fracciones obtenidas por
cromatografía en fenil Sefarosa mediante el método B, purificación 1. 95
Figura 20. SDS-PAGE de las fracciones de purificación de la enolasa
citosólica de epimastigotes de Trypanosoma cruzi por el método B,
purificación 2. 96
Figura 21. Perfil de elusión de la columna de fenil Sefarosa con el
método B, purificación 2. 98
Figura 22. SDS-PAGE de fracciones obtenidas por cromatografía en
fenil Sefarosa mediante el método B, purificación 2. 99
Figura 23. Curva de actividad de la enolasa de epimastigotes de T.
cruzi en función del pH. 100
Figura 24. Actividad de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi a
distintas concentraciones de Mg2+. 101
xix
Figura 25. Actividad de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi en
presencia de varios cationes divalentes 102
Figura 26. Dependencia de la actividad de la enolasa de epimastigotes
de T. cruzi respecto a la concentración de enzima bajo distintas
condiciones. 105
Figura 27. Determinación de constantes cinéticas para la enolasa de
epimastigotes de T. cruzi. 107
Figura 28. Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi por
fluoruro. 110
Figura 29. Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi por
fluoruro en presencia de fosfato inorgánico (1mM). 111
Figura 30. Inhibición de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi por
pirofosfato. 113
Figura 31. Perfiles de elusión de la actividad enolasa en cromatografía
de filtración de fracciones de enolasa de epimastigotes de T. cruzi
parcialmente purificadas, bajo distintas condiciones. 119
Figura 32. SDS-PAGE (a.) y Western blots (b.) de fracciones obtenidas
mediante cromatografía de filtración de fracciones de enolasa de
epimastigotes de T. cruzi parcialmente purificadas. 121
Figura 33. Perfiles de elusión de la actividad enolasa en cromatografía
de filtración de enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente
purificada, en presencia de TX-100. 123
Figura 34. SDS-PAGE (a.) y Western blot (b.) de fracciones obtenidas
mediante cromatografía de filtración de enolasa de epimastigotes de T.
cruzi parcialmente purificada. 123
Figura 35. Electroforesis en condiciones nativas de una fracción de
enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente purificada en varias
condiciones 125
Figura 36. Electroforesis bidimensional (nativa versus desnaturalizante)
de una fracción de enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente
purificada, bajo distintas condiciones. 127
xx
Figura 37. Electroforesis bidimensional (nativa versus desnaturalizante)
de una fracción de enolasa de epimastigotes de T. cruzi parcialmente
purificada, en buffer E. Cada banda señalada en el recuadro del gel
nativo se cortó y se corrió por separado en el gel desnaturalizante 129
Figura 38. Ligand blot de una fracción de enolasa de epimastigotes de
T. cruzi con enolasa recombinante de L. mexicana. 131
Figura 39. Análisis de superficie del gel del perfil de elusión en fenil
Sefarosa de la purificación 1 por el método B, fracción 49 (figura 18),
utilizando el programa ImageJ. 133
xxi
INDICE DE TABLAS
Pg
Tabla 1. Características de enolasas de distintos organismos 36
Tabla 2. Purificación de la enolasa de Trypanosoma cruzi por el método
A 87
Tabla 3. Purificación de la enolasa de Trypanosoma cruzi por el método
B, purificación 1 92
Tabla 4. Purificación de la enolasa de Trypanosoma cruzi por el método
B, purificación 2 96
Tabla 5. Resumen de características cinéticas de la enolasa de
Trypanosoma cruzi 115
Tabla 6. Proteínas presentes en las preparaciones de enolasa de
epimastigotes de T. cruzi parcialmente purificada, obtenidas en
purificaciones independientes. 117
Tabla 7. Relación molar entre las proteínas que co-purifican en la
fracción 49 de la cromatografía en fenil Sefarosa en la purificación 1,
por el método B, de la enolasa de epimastigotes de T. cruzi. 133
Tabla 8. Resultados del mapa de masas peptídicas de p45 con el
programa GeneDB eMowse. 140
Tabla 9. Resultados del mapa de masas peptídicas de p57 con el
programa GeneDB eMowse. 141
Tabla 10. Resultados del mapa de masas peptídicas de p61 con el
programa GeneDB eMowse. 142
Tabla 11. Resultados del mapa de masas peptídicas de p64 con el
programa GeneDB eMowse. 143
Tabla 12. Resultados del mapa de masas peptídicas de p70 con el
programa GeneDB eMowse. 144
1
I. INTRODUCCION
Trypanosoma cruzi y la enfermedad de Chagas
Trypanosoma cruzi es el agente causante de la Enfermedad de Chagas o
tripanosomiasis americana, un importante problema de salud pública en
América Latina, y una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en
el continente, un orden de magnitud mayor que otras enfermedades
parasitarias como malaria, schistosomiasis o leishmaniasis (Urbina y Docampo,
2003).
La enfermedad se encuentra distribuida desde México hasta el sur de América,
encontrándose en 18 países (Figura 1). Aproximadamente 120 millones de
personas (25% de la población de América Latina) se encuentran bajo riesgo
de infección. Se cree que esta cifra ha bajado en los últimos años a unos 40
millones gracias a programas de control de transmisión vectorial,
principalmente a través de la Iniciativa del Cono Sur, que involucra a Brasil,
Argentina, Paraguay y Uruguay, sin embargo, en otras zonas del continente el
progreso no ha sido tan marcado. Actualmente se calcula que entre 13 y 20
millones de personas están infectadas, de los cuales unos 3 millones presentan
síntomas de la enfermedad. Cada año se presentan 200000 casos nuevos y
unas 21000 muertes. (Anónimo, 2002; Anónimo 2003; Urbina, 1999; Urbina y
Docampo, 2003).
Trypanosoma cruzi
• Taxonomía y características
Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario hemoflagelado, perteneciente al
grupo Euglenozoa, orden Kinetoplástida, suborden Trypanosomatina, Familia
Trypanosomatidae y al subgénero Schizotrypanum (Hannaert y col., 2003b;
Coura y de Castro, 2002; Maslov y Simpson, 1995). A la familia
2
Figura 1. Distribución geográfica de la Enfermedad de Chagas en América. Zonas
endémicas se muestran en negro.
Trypanosomatidae también pertenecen otros importantes patógenos de
humanos: Leishmania sp, causante de diversos tipos de leishmaniasis, y
Trypanosoma brucei (subespecies T.b. gambiense y T.b. rhodesiense), agente
causal de la enfermedad del sueño o tripanosomiasis africana (Beverly, 2002;
Verlinde y col., 2001).
Los miembros del suborden Trypanosomatina son parásitos obligados y
muchos, incluyendo a T. cruzi y otras especies de los géneros Trypanosoma,
Leishmania y Endotrypanum poseen ciclos de vida digenéticos, que involucran
un vector invertebrado y un hospedador vertebrado (Maslov y Simpson, 1995).
Los organismos pertenecientes al orden Kinetoplástida se caracterizan por la
presencia del kinetoplasto, una estructura densa que se encuentra dentro de la
única mitocondria ramificada. El kinetoplasto está compuesto por una red de
3
moléculas circulares de DNA: maxicírculos y minicírculos, que se encuentran
concatenadas. La red contiene varias docenas de copias idénticas de los
maxicírculos, de 20 a 40kb, en los cuales están codificados, de forma
encriptada, los genes mitocondriales típicos. Los minicírculos, están presentes
en varios miles de copias con secuencias parecidas pero no idénticas y
codifican RNAs guías para la edición de los mRNAs de los genes mitocondriales,
lo que permite obtener los productos funcionales de estos últimos. Este
proceso de edición es también particular y característico de los kinetoplastides
(de Souza, 1999; Lukes y col., 2002; Hannaert y col. 2003b).
Otras características distintivas son la trascripción de genes nucleares como
RNAs policistrónicos que son posteriormente procesados por trans-splicing, la
ausencia de promotores para la DNA polimerasa II y la presencia de
glicosomas, organelas similares a los peroxisomas donde se encuentra
compartamentalizada parte de la ruta glicolítica (las primeras 6-7 enzimas de
la ruta), junto con otras rutas catabólicas y anabólicas (Hannaert y col.,
2003b).
Además, los tripanosomatides presentan otros organelos peculiares, como los
acidocalcisomas y los reservosomas. Los acidocalcisomas se encuentran en
varios grupos de microorganismos, aunque fueron descritas por primera vez en
tripanosomatides. Son organelas electrón densas y acídicas, que poseen altas
concentraciones de calcio, magnesio y polifosfatos, incluyendo pirofosfato. A
los acidocalcisomas se le han adjudicado funciones de reserva de energía (los
polifosfatos), además, el calcio y pirofosfato, que pueden ser liberados a través
de distintas vías, podrían tener funciones reguladoras (Docampo y Moreno,
2001). Los reservosomas se encuentran en la región posterior del parásito, y
parecen corresponder a vesículas pre-lisosomales, donde se almacenan
macromoléculas ingeridas por la vía endocítica, incluyendo proteínas. Estos
podrían estar involucrados en la transformación entre las formas epimastigote
y tripomastigote de T. cruzi. (de Souza, 1999; Soares, 1999; Urbina, 1994).
4
Otra peculiaridad es la presencia de una red de microtúbulos bajo la
membrana plasmática, el esqueleto subpelicular o microtúbulos subpeliculares.
La asociación de estos microtúbulos entre ellos y con la membrana
posiblemente contribuye a la rigidez de la célula. (de Souza, 1999; de Souza,
2002; Hill, 2003).
El flagelo de los tripanosomas es el responsable del movimiento de los
kinetoplástides y también posee ciertas peculiaridades. Al igual que en otros
organismos está recubierto por una membrana particular pero contigua con la
membrana plasmática. Emerge del cuerpo basal, cerca de la parte
posterior/lateral de la célula, de una invaginación denominada bolsa flagelar.
En tripanosomatides, el flagelo permanece unido a la membrana a lo largo del
cuerpo celular a través de una estructura que une la membrana flagelar con el
citoesqueleto, la zona de unión del flagelo. Por lo tanto, cuando el flagelo se
mueve, desde la punta libre en la parte anterior de la célula, da la apariencia
de que estos parásitos poseen una membrana ondulante, mientras avanzan
hacia adelante. En la estructura del flagelo también se encuentra, dentro de la
membrana flagelar, el cuerpo o bastón paraflagelar, un filamento protéico que
empieza justo antes de la bolsa flagelar y es paralelo al axonema (estructura
típica de “9+2” microtúbulos del flagelo). Este cuerpo paraflagelar está
presente en kinetoplastides, euglenoides y dinoflagelados (Hill, 2003; de Souza
1999; de Souza, 2002).
En la Figura 2a, se muestra un esquema de la forma epimastigote de T. cruzi
donde se señalan algunas de las características descritas anteriormente.
T. cruzi presenta distintos estadíos morfológicos durante su ciclo de vida, que
será explicado más adelante. Estas formas se muestran en la figura 2b y son:
(a) Amastigotes: formas replicativas, intracelulares, que se encuentran dentro
del hospedador vertebrado. Tienen forma redondeada y un flagelo muy corto.
(b) Trypomastigotes: formas infectivas, extracelulares, encontradas tanto en el
vector invertebrado (trypomastigotes metacíclicos), como en el hospedador
5
vertebrado (trypomastigotes sanguíneos). Tienen forma alargada, el
kinetoplasto y la bolsa flagelar (y por lo tanto el punto de emergencia del
flagelo) están en posición posterior al núcleo. (c) Epimastigotes: formas
replicativas, extracelulares, en el vector invertebrado. También poseen forma
alargada, pero en este caso el kinetoplasto y la bolsa flagelar se encuentran en
posición anterior al núcleo (de Souza, 2002; Tanowitz y col., 1992; McConville
y col., 2002).
Figura 2. Morfología de Trypanosoma cruzi. (a.) Dibujo esquemático de la forma
epimastigote. (b.) Esquemas de los distintos estadíos morfológicos.
• Ciclo de vida y transmisión
Como se mencionó anteriormente T. cruzi posee un ciclo de vida digenético. El
parásito infecta una gran variedad de mamíferos en las zonas endémicas, y es
transmitido entre estos hospedadores vertebrados a través de varias especies
de vectores invertebrados: insectos hematófagos pertenecientes a la familia
Reduviidae, subfamilia Triatominiae. Los humanos pueden ser contaminados a
6
través de los vectores cuando entran en contacto en ambientes naturales o
cuando los invertebrados se establecen en las viviendas (Urbina y Docampo,
2003; Sherlock, 2000). Un esquema del ciclo de vida del parásito se muestra
en la figura 3.
Figura 3. Esquema del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi.
Cuando el insecto ingiere sangre de un animal o persona infectada, los
trypomastigotes sanguíneos se diferencian en epimastigotes en la parte media
del tracto digestivo, donde se adhieren al epitelio intestinal y se dividen por
fisión binaria. Algunos epimastigotes se diferencian en trypomastigotes
metacíclicos en el recto del insecto, y son liberados con las heces. La infección
del vertebrado puede ocurrir cuando el insecto ingiere sangre nuevamente y
deposita trypomastigotes que pueden entrar por la herida causada por el
reduvido, sin embargo, el parásito también puede entrar por mucosas, como la
ocular. Dentro del organismo, los trypomastigotes metacíclicos pueden ser
internalizados por una gran variedad de células (como macrófagos, células
musculares y del sistema nervioso), quedando encerrados en una estructura
denominada vacuola parasitofora. Los parásitos escapan al citosol al secretar
7
una hemolisina que perfora la vacuola parasitofora. Una vez allí, los
trypomastigotes se diferencian en amastigotes, que se dividen y
posteriormente se transforman en trypomastigotes. La célula finalmente se lisa
y libera trypomastigotes y amastigotes, que son capaces de infectar células
adyacentes y/o llegar al torrente sanguíneo donde pueden invadir nuevas
células en tejidos distantes o ser tomados nuevamente por un insecto
hematófago, para completar el ciclo (de Souza, 2002; Tanowitz y col., 1992;
McConville y col., 2002; Coura y de Castro, 2002).
La transmisión de T. cruzi actualmente, ocurre principalmente a través del
vector (80-90%), aunque otras vías importantes de transmisión son por
transfusiones de sangre (5 a 20%) y transmisión congénita (0.5 a 8%). Vías
raras de transmisión son los accidentes de laboratorio, transplante de órganos,
vía oral y transmisión sexual. La transmisión por transfusión sanguínea ha
llegado a ser muy importante y ha llevado la enfermedad a zonas urbanas (y
potencialmente a países no endémicos), aunque controles en los bancos de
sangre en los últimos años han disminuido la incidencia (Coura y de Castro,
2002; Dias, 2000; Dias, 1992). Sin embargo, estos controles no son
obligatorios en países no endémicos, donde la enfermedad podría convertirse
en un problema de salud pública (Urbina, 2003).
Enfermedad de Chagas
• Descripción
La enfermedad de Chagas, en humanos, se desarrolla en tres fases:
Luego de la infección y un período de incubación de 1 a 2 semanas se
desarrolla la fase aguda de la enfermedad, durante la cual se encuentran
trypomastigotes en la sangre y en fluido cerebroespinal. Se puede formar una
lesión inflamatoria conocida como chagoma, en el sitio de entrada del parásito
8
junto con otros síntomas más o menos severos. Estos incluyen edema
periorbital unilateral (signo de Romaña), fiebre, lifoadenopatía,
hepatoesplenomegalia, nauseas, vómitos, diarrea, anorexia, cansancio,
erupciones, miocarditis e irritación de la meninges. Sin embargo, es
importante resaltar que estos síntomas suelen presentarse solo en niños y
algunos adultos, y en la mayoría de los casos esta fase pasa desapercibida y/o
se resuelve espontáneamente en 3 a 4 meses (Coura y de Castro, 2002;
Tanowitz y col. 1992). La mortalidad en esta fase es baja, (menor o igual al
10%) y ocurre principalmente debido a complicaciones asociadas con
miocarditis aguda o meningoencefalitis (Urbina y Docampo, 2003; Tanowitz y
col. 1992).
La resolución de la fase aguda da lugar a la fase indeterminada de la
Enfermedad de Chagas. Esta última se caracteriza por el control de la infección
por parte del sistema inmune (inmunidad elevada, control de la
hipersensibilidad y reducción de la respuesta inflamatoria) y en consecuencia,
la disminución de la cantidad de parásitos en sangre. Sin embargo, la persona
sigue infectada y es posible detectar parásitos en tejidos y lesiones
inflamatorias (Coura y de Castro, 2002). Esta fase puede durar varias décadas.
La siguiente fase de la enfermedad de Chagas, la fase crónica, se desarrolla en
20-50% de los casos, dependiendo del área endémica. Durante esta fase
tampoco es fácil detectar parásitos en sangre, sin embargo, se desarrollan los
síntomas característicos de la enfermedad: problemas cardíacos, digestivos o
neuronales (Coura y de Castro, 2002), como arritmias, defectos de conducción,
aneurismas cardíacos, hipertrofia miocelular, inflamación del corazón,
disfunción del sistema nervioso autónomo (que suele asociarse a algunos de
los problemas cardíacos y digestivos), daños al sistema nervioso central,
megaesófago, megacolon, problemas estomacales y de la vesícula, entre otros
(Tanowitz y col. 1992). Las consecuencias de estos problemas suelen ser
mortales.
9
Todavía existen controversias sobre como se origina la patología de la
enfermedad de Chagas, principalmente en la fase crónica. Existen evidencias
que dan un carácter autoinmune a la enfermedad, como la presencia de
anticuerpos que reconocen tejidos humanos en personas enfermas (que
podrían originarse como consecuencia de semejanzas moleculares entre los
dos organismos) y el hecho de que células del sistema inmune tomadas en
organismos infectados son capaces de causar lesiones en tejidos normales,
entre otras (Urbina, 1999; Tanowitz, 1992). Sin embargo, evidencias más
recientes contradicen la hipótesis de autoinmunidad, por ejemplo, pruebas de
la persistencia de parásitos en lesiones inflamatorias, obtenidas a través de
inmunihistoquímica y reacción en cadena de la polimerasa (métodos más
sensibles que los utilizados comúnmente); evidencias de que la quimioterapia
antiparasitaria tiene efectos contra el desarrollo de la enfermedad; el hecho de
que la inmunosupresión, ya sea por quimioterapia o enfermedades, produce en
muchos casos reactivación o recrudecimiento de la enfermedad de Chagas,
entre otras. Por lo tanto, se cree que la persistencia del parásito, aunque en
bajos números, y una respuesta inmune desbalanceada juegan el papel más
importante en el desarrollo de la fase crónica de la enfermedad de Chagas
(Urbina y Docampo, 2003).
• Diagnóstico y Tratamiento
El diagnóstico de la enfermedad de Chagas durante la fase aguda suele
hacerse mediante la visualización del parásito en sangre por microscopía de
luz, cultivo en medio líquido, infección de animales de laboratorio o
xenodiagnóstico (Tanowitz y col. 1992).
Aunque algunas de estas pruebas (como xenodiagnóstico y cultivos) pueden
ser positivas durante la fase crónica (Coura y de Castro, 2002), el diagnóstico
durante esta fase (y en la fase indeterminada) suele basarse en pruebas
serológicas, como inmunofluorescencia indirecta, fijación de complemento y
ELISA. Sin embargo, un problema con estas técnicas son el gran número de
10
falsos positivos, por lo que actualmente se están haciendo esfuerzos para
caracterizar antígenos del parásito que sean más específicos para el
serodiagnóstico (Tanowitz y col. 1992).
Otro método altamente sensible y específico para la detección de los parásitos,
es la reacción en cadena de la polimerasa de ciertos marcadores del DNA del
parásito (Tanowitz y col., 1992), que de hecho ha sido utilizado para probar la
persistencia del parásito durante la fase crónica (Urbina y Docampo, 2003).
Sin embargo, existen problemas para la aplicación de esta técnica como
método de diagnóstico generalizado: la dificultad del procesamiento de
muestras al comparar con métodos de serodiagnóstico, y la posibilidad de
contaminación de estas, dando lugar a falsos positivos (Tanowitz y col., 1992)
además de los altos costos.
El tratamiento de la enfermedad de Chagas tradicionalmente se ha basado en
dos drogas: nifurtimox (un nitrofuran, comercializado bajo el nombre de
Lampit®, Bayer) y benznidazole (un derivado de nitroimidazol, comercializado
como Rochagan®, Roche). Las actividades antiparasitarias de ambos fueron
descubiertas de forma empírica hace varias décadas (Urbina y Docampo,
2003). El nifurtimox, que actualmente está descontinuado, actúa a través de
su modificación por nitroreductasas a un nitroanión inestable que reacciona
para producir intermediarios reactivos del oxígeno (como anión superóxido y
peróxido de hidrógeno). Su actividad contra T. cruzi se basa en que este
organismo es deficiente en mecanismos de detoxificación de intermediarios
reactivos, comparado con células humanas (Coura y de Castro, 2002; Urbina y
Docampo, 2003). El benznidazole parece actuar a través de la modificación
covalente de diversos tipos de macromoléculas por intermediarios de
nitroreducción (Urbina y Docampo, 2003).
Ambos compuestos tienen una significativa actividad anti-T. cruzi durante la
fase aguda o infecciones crónicas recientes, produciendo cura parasitológica en
50-80% de las personas tratadas (Urbina y Docampo, 2003, Anónimo, 2002).
11
Sin embargo, la eficacia del tratamiento parece depender de la susceptibilidad
de las cepas de T. cruzi a estas drogas, ya que hay diferencias entre distintas
zonas endémicas. Además, estos medicamentos deben ser tomados por largos
períodos de tiempo y producen efectos secundarios severos (posiblemente
debido a daños en los tejidos) como anorexia, vómitos, polineuropatía
periférica y dermopatía alérgica, que en muchos casos puede llevar al
abandono del tratamiento (Urbina y Docampo, 2003; Tanowitz y col. 1992).
El tratamiento durante la fase crónica de la enfermedad de Chagas se basa en
controlar la sintomatología, y las drogas utilizadas en la infección temprana
producen cura parasitológica en menos de 80% de los pacientes tratados. La
demostración de que la enfermedad en esta fase está relacionada con la
persistencia del parásito hace que el tratamiento de la fase crónica sea un
problema por resolver (Urbina y Docampo, 2003).
• Búsqueda de nuevos tratamientos
A pesar de los avances realizados en materia de transmisión de la enfermedad,
el hecho de que los compuestos actualmente utilizados no producen cura en
100% de los pacientes en fase aguda y que prácticamente no tienen efecto
para la fase crónica, plantea la necesidad de buscar nuevos tratamientos para
la enfermedad de Chagas.
Lamentablemente, el hecho de que la enfermedad Chagas junto con el resto de
las enfermedades causadas por tripanosomátides, sean problemas de países
pobres, trae como consecuencia que el desarrollo de nuevas terapias por parte
de la industria farmacéutica no sea de alta prioridad, debido a la limitada
ganancia que generarían. Sin embargo, las investigaciones continúan (aunque
de manera limitada), gracias al apoyo de ciertas organizaciones
internacionales, a iniciativas de los países afectados y a la investigación básica
de las interesantes características de la biología de los tripanosomátides
(Verlinde y col., 2001; Barret y col., 1999).
12
En los últimos tiempos, la búsqueda de nuevos tratamientos se ha basado en
un enfoque racional, que incluye en primer lugar la validación de blancos
quimioterapeúticos y posteriormente la validación de posibles drogas. Un buen
blanco debe ser un paso esencial del metabolismo del parásito para el cual sea
posible la inhibición potente y selectiva, ya sea por la no existencia de dicho
paso en el hospedador (explotar diferencias metabólicas entre el parásito y el
hospedador) o por la existencia de diferencias significativas en este paso entre
el parásito y el hospedador (diferencias en estructuras tridimensionales de
enzimas o existencia de residuos reactivos en el sitio activo de enzimas del
parásito) (Verlinde y col., 2001; Urbina , 1999). Comúnmente, la validación de
blancos quimioterapeúticos se hace comparando características bioquímicas del
parásito con las del hospedador (Barret y col., 1999).
Varios métodos se pueden utilizar para saber si un paso del metabolismo,
como por ejemplo una ruta metabólica o una reacción catalizada por una
enzima, es esencial. Se suelen emplear métodos bioquímicos, como inhibición
por drogas que se sabe actúan en dicho paso y actualmente también se
emplean métodos genéticos, como la eliminación de genes, por recombinación
homologa (Barret y col., 1999) o el silenciamiento de su expresión, utilizando
RNA de interferencia, que ha sido ampliamente utilizado con T. brucei.
Lamentablemente, este último método no ha sido aún estandarizado para su
uso en T. cruzi (Beverly, 2003).
Ahora, el hecho de que un paso sea esencial, tampoco implica que es un buen
blanco. Por ejemplo, es difícil que una droga inhiba completamente una
enzima, y la actividad restante puede ser suficiente para permitir la
subsistencia del patógeno. Además es usual que los pasos esenciales del
metabolismo sean altamente conservados durante la evolución y por lo tanto
similares entre el parásito y humanos, lo que hace difícil el desarrollo de
agentes quimioterapéuticos. No obstante, genes no esenciales también pueden
ser blanco quimioterapeúticos. (Barret y col., 1999).
13
Como se menciona anteriormente, el otro punto importante para la validación
de un blanco quimioterapeútico, es que existan diferencias suficientes entre
humanos y el parásito que permitan el diseño de drogas específicas para el
blanco del parásito. Esto va desde rutas exclusivas en el parásito hasta
enzimas conservadas con suficientes diferencias estructurales, que pueden ser
encontradas mediante el estudio de el metabolismo del parásito por métodos
bioquímicos.
Una nueva posibilidad para la búsqueda de estas diferencias en el análisis de
secuencias en bases de datos y la identificación de proteínas por técnicas de
proteómica, mediante las cuales se pueden detectar posibles blancos de una
manera más rápida y eficiente. Por ejemplo, se pueden detectar secuencias
conservadas entre varias especies de parásitos pero ausentes en humanos,
que tienen una posibilidad alta de ser esenciales, o secuencias exclusivas del
parásito (Ashton y col. 2001; Tarleton y Kissinger, 2001). Por proteómica, se
pueden identificar proteínas que tienen expresión diferencial bajo ciertas
condiciones (distintas formas morfológicas, como en el trabajo realizado por
Paba y col (2004), bajo la influencia de drogas y otras) u otras propiedades
interesantes, que permiten un mejor entendimiento de la biología de estos
organismos patógenos. De todas formas es necesaria la caracterización
bioquímica posterior para la validación del blanco.
Actualmente, el proyecto de secuenciamiento y anotación del genoma de
Trypanosoma cruzi (El Proyecto Genoma de T. cruzi), específicamente de la
cepa CL-Brener, esta siendo llevado a cabo por el TIGR-Seattle Biomedical
Research Institute-Karolinska Institute T. cruzi Sequencing Consortium (TSK-
TSC) (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/tca1/). Para otros tripanosomatides, como
Trypanosoma brucei y Leishmania mayor también existen proyectos de
secuenciación en progreso. En la base de datos del NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) están depositadas alrededor de 1600
secuencias de proteínas de T. cruzi. Sin embargo, estos valores son
subestimados, ya que hay un retardo considerable entre las secuencias que
14
están en las bases de datos de los proyectos y las que son depositadas en
GenBank (Tarleton y Kissinger, 2001). De hecho, para T. cruzi, numerosas
secuencias preliminares obtenidas por el proyecto genoma, se encuentran en
las bases de datos GeneDB (http://www.genedb.org/) y TcruziDB
(http://tcruzidb.org/). En la primera, actualmente existen más de 25000
marcos de lectura predichos.
El siguiente paso en el desarrollo de nuevos tratamientos es la búsqueda y
validación de agentes quimioterapeúticos. Un buen candidato debe ser capaz
de entrar al organismo patógeno y poseer características farmacocinéticas y
farmacodinámicas adecuadas, como grandes volúmenes de distribución en
tejidos, vida media larga y posibilidad de introducción por vía oral, en el caso
específico de la Enfermedad de Chagas (Urbina, 1999).
Basándose en lo anterior, hasta ahora varios blancos han sido validados en
tripanosomatides y en T. cruzi en particular. Actualmente se están
desarrollando drogas que pudieran actuar sobre estos blancos, algunas de las
cuales parecen prometedoras. Muchas de estas drogas, o la alteración del
posible blanco, impiden el crecimiento, metaciclogénesis y/o disminuyen la
infectividad del parásito; por ejemplo, inhibidores de la vía de incorporación de
purinas, específicamente de la hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa
(HGPRT); inhibición de enzimas del metabolismo de tripanotión, principal
metabolito redox en tripanosomátides; inhibición de la síntesis de nucleótidos;
inhibidores de la DNA topoisomerasa II, necesaria para la replicación del
kinetoplasto; inhibidores de la neuroaminadasa de T. cruzi, que incorpora ácido
siálico proveniente del hospedador a la membrana del parásito; inhibidores del
intercambiador de Na+/H+ del acidocalcisoma y drogas relacionadas con el
metabolismo de pirofosfato (Urbina y Docampo, 2003; Barret y col. 1999;
Urbina, 2003)
Algunas pocas han sido probadas en modelos animales, en los que inducen
cura parasitológica. Por ejemplo: inhibidores de la cruzipaina, la proteasa
15
principal del parásito (Urbina y Docampo, 2003) e inhibidores de la síntesis de
ergoesterol. Entre estos últimos, algunas drogas se encuentran en pruebas
clínicas (Urbina, 2003).
Las enzimas de la glicólisis (y enzimas relacionadas) han sido consideradas
como un blanco ideal en tripanosomátides, ya que su conmpartamentalización
en los glicosomas es una característica única de estos organismos (Barret y
col, 1999; Verlinde y col., 2001). Dicha compartamentalización ha otorgado
propiedades únicas a las enzimas de la ruta glicolítica. Se han realizado
numerosos estudios relacionados con la caracterización de las enzimas de la
glicólisis, principalmente con las primeras seis o siete (dependiendo de la
especie) que se encuentran en el glicosoma y se han desarrollado inhibidores
específicos para varias de estas, por ejemplo, para fosfofructokinasa, aldolasa
y gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y la oxidasa alternativa mitocondrial,
(Verlinde y col, 2001).
A pesar de estos avances, todavía no hay una quimioterapia adecuada para el
tratamiento de la enfermedad de Chagas y la búsqueda aún continúa. Por lo
tanto, el estudio del metabolismo de T. cruzi es importante para la
identificación de nuevos blancos, y la posterior caracterización de estos,
además de ser un peculiar e interesante modelo de estudio.
16
Metabolismo de Trypanosoma cruzi
El metabolismo de los tripanosomátides es variado; las distintas especies
poseen características particulares y existen esquemas metabólicos muy
diferentes entre los distintos estadíos morfológicos de una misma especie.
Probablemente, los trypomastigotes sanguíneos de T. brucei son los que
poseen el metabolismo más sencillo (y más estudiado): obtienen toda su
energía por la vía glicolítica, no poseen ciclo de Krebs y son posiblemente
deficientes en algunas rutas anabólicas. Sin embargo, el resto de los
tripanosomátides, incluyendo los trypomastigotes procíclicos de T. brucei (que
se encuentran en el vector invertebrado), Leishmania sp y las diversas formas
de T. cruzi poseen un esquema metabólico más complejo (Michels y col., 2000;
Hannaert y col., 2003b).
Existen diferencias entre los distintos estadíos de T. cruzi, por ejemplo, los
amastigotes, en contraste con los epimastigotes son resistentes a la lisis por
complemento y se han realizado diversos estudios que muestran expresión
diferencial de proteínas y de mRNA (Paba y col., 2004; Minning y col., 2003).
Sin embargo, otros autores señalan que todas las formas poseen un
metabolismo similar, por lo menos en cuanto a consumo de glucosa y
productos de excreción (Rogerson y Gutteridge, 1980, citado en Engel y col.,
1987). En todo caso, la mayoría de los estudios sobre esta especie son
realizados con epimastigotes, ya que estos son fácilmente crecidos en medios
de cultivo axénicos por numerosas generaciones (Engel y col., 1987) y
constituyen un modelo para el estudio del metabolismo de T. cruzi y de los
tripanosomátides en general.
Características generales
T. cruzi es capaz de utilizar tanto glucosa como aminoácidos para obtener
energía. La glucosa parece ser el sustrato preferencial (a diferencia de
Leishmania sp), aunque también podría ocurrir la utilización simultanea de
17
ambos sustratos. Inclusive, un sustrato u otro podría ser preferido
dependiendo de la disposición de estos en el medio en que viven los parásitos
y de la composición enzimática de las distintas formas (Cazzulo y col., 1985;
Engel y col., 1987).
Las principales formas de T. cruzi parecen poseer un catabolismo de glucosa
similar al de los trypomastigotes procíclicos de T. brucei (Cazzulo, 1992). Esto
es, degradan la glucosa sólo parcialmente hasta CO2, inclusive bajo
condiciones aeróbicas, por lo que este catabolismo se ha denominado
“fermentación aeróbica”: parte del carbono proveniente de la glucosa es
excretado al medio como distintos catabolitos parcialmente oxidados,
principalmente succinato, acetato y L-alanina, aunque se han detectado otros
productos, en menor cantidad como piruvato, lactato y malato. El succinato es
siempre el producto principal para todas las formas (Cazzulo y col., 1985;
Engel y col., 1987; Cazzulo, 1992).
La ruta glicolítica no es regulada de la manera clásica (a nivel de la hexokinasa
(HK) y la fosfofructokinasa (PFK)) y se encuentra parcialmente
compartamentalizada en los glicosomas. Tampoco ocurre el efecto Pasteur
(disminución en el consumo de glucosa al pasar de anaerobiosis a aerobiosis),
por lo que se cree que esta ruta es en general poco regulada y los parásitos
consumen tanta glucosa como es capaz de entrar a la célula (Urbina, 1994;
Cazzulo, 1992)
Los tripanosomátides también consumen, hasta un 40% de la glucosa a través
de la vía de las pentosas fosfato (Besteiro y col., 2002), que produce NADPH,
utilizado en rutas de biosíntesis y ribosa para la síntesis de nucleótidos.
Los epimastigotes de T. cruzi son capaces de catabolizar prolina, leucina y
otros aminoácidos (posiblemente provenientes de proteínas del medio,
internalizadas y acumuladas en los reservosomas) completamente a CO2 y
productos para biosíntesis, junto con la excreción de grandes cantidades de
18
amonio (Urbina, 1994). La alanina que es excretada podría provenir de la
transaminación del piruvato catalizada por una alanina aminotransferasa
(Cazzulo, 1992), por lo tanto esto representaría una manera de excretar
amonio (proveniente del catabolismo de amino ácidos), junto con un producto
parcialmente oxidado de la glicólisis.
El catabolismo de aminoácidos conduce a la producción de intermediarios del
ciclo de Krebs, que podrían ser oxidados en la mitocondria, convertidos a
fosfoenolpiruvato (PEP), por la fosfoenolpiruvato carboxikinasa (PEPCK) para
ser utilizado en gluconeogénesis (aunque la existencia de esta ruta es
controversial en tripanosomatides), o a piruvato, a través de la PEPCK y la PK
o la enzima málica, lo que permitiría la producción acetil-coA (Urbina, 1994).
En todo caso, este proceso requiere de un ciclo de Krebs funcional (Cazzulo,
1992) y de una cadena transportadora de electrones acoplada a una
fosforilación oxidativa (ATPasa) para poder obtener energía.
El funcionamiento del ciclo de Krebs y de la cadena transportadora de
electrones en la mitocondria de los tripanosomátides ha sido puesta en duda
debido a la existencia de la fermentación aeróbica. De hecho, en los
trypomastigotes sanguíneos de T. brucei no son funcionales (Cazzulo, 1992).
Sin embargo, el resto de los tripanosomatides posee todas las enzimas del
ciclo de Krebs y una cadena transportadora de electrones (Urbina, 1994)
acoplada a una ATPasa para la producción de energía.
Posiblemente, la cadena transportadora de electrones posee algunas
peculiaridades (Cazzulo, 1992), por ejemplo, se ha propuesto que uno de los
principales donadores de electrones a la cadena es el succinato, en lugar del
NADH (Denicola-Seoane y col., 1992; Bochud-Allemann y Schneider, 2002),
aunque ahora se sabe que los tripanosomátides si poseen una NADH-
deshidrogenasa mitocondrial, el punto usual de entrada de los electrones a la
cadena transportadora (Tielens y Van Hellemond, 1998).
19
Recientemente, experimentos con trypomastigotes procíclicos de T. brucei han
indicado que estos no utilizan el ciclo de Krebs para generar energía (por lo
menos en un medio de cultivo que contiene tanto aminoácidos como glucosa,
en condiciones aeróbicas) aunque el funcionamiento de oxidasas terminales
sería esencial. Los autores proponen un modelo en que la prolina es
transformada a succinato, utilizando solo una parte del ciclo de Krebs,
produciendo NADH y ATP (van Weelden y col., 2002), pero no se considera el
consumo de otros aminoácidos ni el metabolismo en ausencia de glucosa.
En todo caso, el hecho de que se excreten productos parcialmente oxidados
podría indicar que la mitocondria es incapaz de metabolizar los productos de la
glicólisis y/o del catabolismo de los aminoácidos de manera completa a CO2 y
H2O, no por falta de componentes enzimáticos, sino por la alta velocidad de
producción de los metabolitos que tendrían que ser oxidados, provenientes
principalmente de una glicólisis poco regulada (Urbina, 1994, Cazzulo, 1992).
De hecho, una de las explicaciones para la producción de acetato es la
deacilación del acetil-CoA cuando este se encuentra en exceso (Engel y col.,
1987, Cazzulo, 1992). Sin embargo, recientemente se ha propuesto que la
enzima acetato:succinato CoA-transferasa es la responsable de la secreción de
acetato en tripanosomátides. La subsiguiente eliminación de la CoA del
succinato por la succinato sintasa produciría ATP en la mitocondria (Van
Hellemond y col., 1998, Hannaert y col., 2003b). De acuerdo con esto,
Bochud-Allemann y Schneider (2002), muestran que la fosforilación a nivel de
sustrato, en la mitocondria, es una de las principales formas de generar
energía, siendo más importante, posiblemente, que la fosforilación oxidativa
que utiliza la cadena transportadora de electrones. Parte de esta producción de
ATP sería a través del ciclo acetato:succinato coA, y otra parte directamente a
través de la succinil-coA sintetasa. Esta última enzima sería posiblemente
esencial en las formas procíclicas de T. brucei, según experimentos con RNAi
(Bochud-Allemann y Schneider, 2002).
20
Engel y col. (1987) sugieren que los amastigotes de T. cruzi presentan un
metabolismo glicolítico, ya que poseen altos niveles de enzimas glicolíticas, un
rápido consumo de glucosa y deficiencia en algunas enzimas del ciclo de Krebs
y de la cadena transportadora de electrones, además de la falta de excreción
de amonio. Sin embargo, se debe tener en cuenta que estos experimentos
fueron llevados a cabo con formas similares a amastigotes, obtenidas in vitro,
por corto tiempo y en un medio que posiblemente no refleje las condiciones
bajo las que se encuentra esta forma, dentro de las células del hospedador
vertebrado.
Posiblemente, una de las características debatidas sobre el metabolismo en
tripanosomátides, es la existencia de la ruta gluconeogénica. En estos
organismos, se considera que no hay carbohidratos de reserva, excepto
posiblemente en Leishmania, donde se ha encontrado un polisacárido de
manosa (Blum, 1993). No obstante, las células son capaces de crecer en
medios pobres en glucosa (en los que continúan produciendo proteínas
glicosidadas, si bien en menores cantidades), y siguen creciendo cuando la
glucosa del medio se ha agotado (Urbina, 1994; Morris y col., 2002). Otros
experimentos muestran que los promastigotes de T. brucei crecen más rápido
en presencia de un exceso de aminoácidos, y bajo estas condiciones pareciera
disminuir el consumo de glucosa (ter Kuile, 1997). Este crecimiento
probablemente requiere de síntesis de nucleótidos, para lo cual es necesario el
funcionamiento de la vía de las pentosas fosfato, dependiente de glucosa-6-
fosfato.
Las actividades de las enzimas de la ruta gluconeogénica, fructosa bisfosfatasa
y glucosa 6-fosfatasa no han sido detectadas (Cronín y col., 1989), sin
embargo, recientemente se ha reportado las existencia de genes candidatos a
codificar estas enzimas (Michels y col., 2000; Morris y col., 2002; Hannaert y
col., 2003b). La otra enzima de esta ruta, la PEPCK, se encuentra localizada en
los glicosomas (Urbina, 1994, Besteiro y col., 2002; Hannaert y col., 2003b).
21
En Leishmania (aunque no en otros tripanosomátides), ciertos reportes indican
que las células incorporan acetato y el carbono proveniente del ácido graso
laureato en sus reservas de manan. Esto, implica la existencia del ciclo del
glioxilato. Además, se ha encontrado que las dos enzimas particulares de la
ruta, citrato liasa y malato sintasa están presentes (Keegan y Blum, 1993).
Esta síntesis de carbohidratos a partir de acetato o ácidos grasos implica,
además de la existencia del ciclo del glioxilato, la presencia de la ruta
gluconeogénica.
Glicólisis y el glicosoma
Como se ha mencionado antes, una de las peculiaridades de los
tripanosomátides es la compartamentalización de parte de la ruta glicolítica en
una organela, el glicosoma. Esta organela es similar a los peroxisomas de otros
organismos en diversos aspectos, como la maquinaria de importación de
proteínas, proceso de biogénesis y presencia de ciertas rutas metabólicas como
la β-oxidación de ácidos grasos y la biosíntesis de esteroles (Opperdoes y
Borst, 1977; Hannaert y col, 2003b).
Los glicosomas parecen ser esenciales, ya que la eliminación de las proteínas
de la maquinaria de importación de proteínas es letal, por lo menos para T.
brucei, tanto para los trypomastigotes sanguíneos como para las formas
procíclicas presentes en el insecto (Guerra-Giraldez y col.,2002).
Dependiendo de la especie y el estadío morfológico de los tripanosomátides,
distintas enzimas del metabolismo, y las primeras 6 o 7 enzimas de la ruta se
encuentran compartamentalizadas. Principalmente varía la presencia de la
fosfoglicerato kinasa (PGK) y posiblemente de rutas de biosíntesis (Hannaert y
col., 2003b; Michels y col., 2000).
Actualmente se considera que la membrana del glicosoma es poco permeable a
la mayoría de los intermediarios glicolíticos, adenin nucleótidos y nicotin adenin
22
nucleótidos. Por lo tanto, se cree que debe existir un balance entre estos
compuestos, por ejemplo, esto implica que se debe mantener la relación
ATP/ADP, y la relación NAD(P)H/NAD(P)+ (Bakker y col., 1997; Michels y col.,
2000; Hannaert y col., 2003b).
Durante los últimos años, se han propuesto diversas hipótesis sobre el por qué
de la existencia del glicosoma. Entre ellas se consideran el aumento del flujo
de la ruta, ya que se evita la difusión de los intermediarios (Aman y col., 1985,
Michels y col., 2000) y la separación de rutas que podrían competir con la
glicólisis, utilizando los mismos intermediarios, como la ruta de las pentosas
fosfato y la gluconeogénesis (Michels y col, 2000). Sin embargo, actualmente
estas dos hipótesis han sido puestas en duda, debido a que, según modelos
metabólicos, el flujo glicolítico parece estar limitado por las características de
las enzimas, al parecer, principalmente por el transportador de glucosa hacia la
célula, por lo menos en la forma sanguínea de T. brucei (Bakker y col., 1997;
Bakker y col., 1999; Michels y col., 2000; Hannaert y col., 2003b). Además
también se ha encontrado que enzimas de la ruta de las pentosas fosfato se
encuentran parcialmente compartamentalizadas en los glicosomas (Duffieux y
col., 2000; Heise y Opperdoes, 1999; Michels y col., 2000), así como enzimas
de la gluconeogénesis, como la PEPCK, y posiblemente la fructosa 1,6-
bisfosfatasa, cuyo gen posee una señal de importación al glicosoma (Michels y
col., 2000; Morris y col., 2002; Hannaert y col., 2003b).
Más recientemente se ha propuesto que la compartamentalización existe para
evitar la producción de altas concentraciones de hexosas-fosfato (Bakker y
col., 2000; Furuya y col., 2002), aunque esto último podría ser una
consecuencia de las propiedades de las enzimas de la glicólisis (principalmente
HK y PFK), relacionadas con la compartamentalización y no una causa directa
del fenómeno. También se cree que la presencia de glicosomas podría proveer
de flexibilidad metabólica a los tripanosomátides, lo que permitiría a estos
últimos adaptarse a condiciones ambientales (como disponibilidad de
sustratos) muy diferentes, de una manera exitosa (Hannaert y col., 2003b).
23
Modelo del metabolismo intermediario
La presencia de la ruta glicolítica en los glicosomas, le da ciertas peculiaridades
al metabolismo. En el modelo más sencillo, el del glicosoma de los
trypomastigotes sanguíneos de T. brucei, la ruta se encuentra
compartamentalizada hasta la PGK. Por lo tanto, el ATP consumido por la
hexokinasa y la fosfofructokinasa es regenerado por la PGK, manteniéndose el
balance de ATP/ADP dentro del glicosoma (Hannaert y col., 2003b; Michels y
col., 2000, Bakker y col., 1997).
El NAD+ reducido por la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa es reoxidado
por una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa glicosomal, produciendo glicerol-3-
fosfato (G3P), que es transportado a la mitocondria, donde es transformado de
nuevo a dihidroxiacetona fosfato (DHAP) por una glicerol-3-fosfato oxidasa.
Los electrones son transferidos al oxígeno, en la mitocondria, a través de
ubiquinona y una oxidasa terminal denominada oxidasa alternativa de
trypanosoma (TAO). Este es un sistema lanzadera de DHAP y G3P entre
mitocondria y glicosoma. En condiciones de anaerobiosis, cuando la TAO no
puede funcionar, se acumula G3P dentro del glicosoma y se produce glicerol y
ATP, a través de una glicerol kinasa, manteniéndose el balance energético
dentro de la organela. No obstante, de esta manera sólo se obtiene un mol ATP
en el citosol por cada mol de glucosa, a través de la reacción catalizada por la
piruvato kinasa. El piruvato y el glicerol son excretados al medio (Hannaert y
col., 2003b; Michels y col., 2000, Bakker y col., 1997; Tielens y Van
Hellemond, 1998; Verlinde y col., 2002).
En el resto de los organismos, el modelo es más complicado: en los
trypomastigotes procíclicos de T. brucei la PGK se encuentra fuera del
glicosoma, por lo tanto, el balance de ATP/ADP no se mantiene a este nivel. Lo
que se propone es que el PEP, producido por la enolasa en el citosol, reentra al
glicosoma, donde es convertido en oxaloacetato por la PEPCK o en piruvato por
la piruvato-fosfato dikinasa (PPDK). Ambas reacciones producen ATP,
24
reestableciendo el balance energético (considerando que todo el PEP producido
entra de nuevo al glicosoma) con la particularidad de que la PPDK utiliza AMP y
pirofosfato para producir el ATP. El balance de NAD+/NADH puede ser
reestablecido de diversas formas: por la misma vía que en los trypomastigotes
sanguíneos (aunque algunos autores no lo consideran), o a través de la malato
deshidrogenasa glicosomal, que cataliza la reducción dependiente de NADH del
oxaloacetato a malato. El malato puede salir del glicosoma y ser convertido a
piruvato por la enzima málica en el citosol. El piruvato podría entonces ser
oxidado en la mitocondria para producir acetil-CoA (Hannaert y col., 2003b;
Besteiro y col., 2002; Coustou y col., 2003; Bringaud y col., 1998).
Además, en el glicosoma el malato puede ser convertido en fumarato por la
fumarasa y este es a su vez reducido a succinato por una fumarato reductasa
glicosomal dependiente de NADH. La actividad de esta última enzima explicaría
la excreción de succinato por parte de la mayoría de los tripanosomátides,
como producto final de la glicólisis (Besteiro y col., 2002). Esta enzima
ayudaría al mantenimiento del balance redox en caso de que no todo el PEP
reentre al glicosoma o de que parte de este sea convertido en piruvato por la
PPDK. Un esquema que resume el metabolismo energético de T. cruzi se
muestra en la figura 4.
Sin embargo, este modelo no considera varios factores: en el glicosoma
existen otras rutas además de la glicólisis. Por ejemplo, una proporción de la
actividad de la parte oxidativa de la ruta de las pentosas fosfato se encuentra
en el glicosoma. Esta ruta consumiría glucosa-6-fosfato producida por la HK,
sin embargo no regeneraría el ATP invertido y produciría NADPH. La biosíntesis
de ergoesterol y nucleótidos que ocurre en el glicosoma también requiere ATP.
Según el modelo presentado arriba, no hay producción neta de ATP en el
glicosoma, y de hecho, es necesario que todo el PEP reentre para que no haya
un déficit en el balance. Así, no habría producción neta de ATP en el citosol por
la piruvato kinasa (a pesar de que esta actividad se encuentra por lo menos en
las formas procíclicas de T. brucei).
25
En T. cruzi en particular, existe otra enzima, además de la PK que utiliza PEP,
la PEP-mutasa, que se encuentra localizada, por lo menos parcialmente en el
citosol. Esta enzima cataliza la conversión de PEP a fosfonopiruvato, que es
posteriormente convertido en 2-aminoetilfosfonato (AEP) y posteriormente
incorporado a macromoléculas, como fosfonolípidos y proteoglicanos. Además,
aparentemente, en T. cruzi, el AEP puede sustituir a la etanolamina en la unión
de proteínas a anclas de glicosilfosfatidilinositol (GPI), y parece sustituir a la
glucosamina en estas mismas anclas. La expresión de mucinas y otras
glicoproteínas asociadas a la superficie de los parásitos por anclas de GPI
posiblemente es importante para la supervivencia e invasión del parásito en el
hospedador vertebrado, por lo que esta ruta consumidora de PEP es
posiblemente muy importante para T. cruzi (Sarkar y col., 2003).
Parte de estos problemas (relacionados con el balance energético dentro del
glicosoma), se resuelven si se considera la evidencia de que en los
trypomastigotes procíclicos de T. brucei y por lo menos en los epimastigotes de
T. cruzi, existen isoenzimas de la PGK dentro del glicosoma. En T. cruzi,
existen tres tipos de PGK: la PGKB que se encuentra en el citosol, y según
mediciones in vitro contribuiría con la mayor parte de la actividad, y la PGKA y
PGKC dentro del glicosoma (Concepción y col., 2001a; Hannaert y col.,
2003b). Este hecho implica que al menos parte del balance energético se
mantendría a este nivel, por lo tanto no es necesario que todo el PEP reentre al
glicosoma y posibilita la producción neta de ATP dentro del glicosoma. Esto
último, explicaría la existencia de rutas de síntesis que consumen ATP y de la
vía de las pentosas fosfato dentro del glicosoma. Otro mecanismo de
suministrar ATP al glicosoma, sería a través de la PPDK y la adenilato kinasa
glicosoma (Besteiro y col., 2002; Bringaud y col., 1998)
26
Figura 4. Esquema del metabolismo intermediario de Trypanosoma cruzi.
27
El balance redox puede ser mantenido mediante los mecanismos ya explicados.
El sistema de la glicerol-3-fosfato oxidasa mitocondrial y la glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa glicosomal, presente en T. cruzi (Concepción y col., 2001b)
junto con la malato deshidrogenasa y la fumarato reductasa podrían reoxidar
el NADH producido por la glicealdehido-3-fosfato deshidrogenasa. El NADPH
producido por la ruta de las pentosas fosfato y por la β-oxidación de ácidos
grasos posiblemente sería reoxidado durante reacciones de las rutas se
biosíntesis presentes dentro de los glicosomas.
En todo caso, es importante resaltar la relevancia del tráfico de PEP, el
producto de la enolasa, ya que este jugaría un rol determinante, junto con la
PGK, en el mantenimiento del balance energético dentro del glicosoma y en la
distribución de la producción neta de ATP, entre el citosol y el glicosoma.
Además, la producción de PEP sería absolutamente necesaria para la PEPM.
La posibilidad de que la enolasa contribuya de alguna manera a la distribución
de su producto la hace un punto de estudio sumamente interesante en el
metabolismo de los tripanosomátides.
Estas características de la distribución del PEP y la disposición de las rutas que
lo consumen, no presentes en mamíferos, podrían hacer pensar que la enolasa
posee propiedades regulatorias particulares e interesantes, e inclusive hacen
pensar en ella como un posible blanco quimioterapéutico para el tratamiento
de la enfermedad de Chagas y otras tripanosomiasis.
28
Enolasa (2-fosfo-D-glicerato hidrolasa, EC 4.2.1.11)
Características generales
La enolasa es una enzima que cataliza la deshidratación del 2-fosfoglicerato
(2PGA) para formar fosfoenolpiruvato (PEP), en la ruta glicolítica, y la reacción
inversa en gluconeogénesis (figura 5a). La reacción tiene un cambio de energía
libre pequeño, de aproximadamente 1Kcal/mol. La actividad catalítica es
dependiente de la presencia de cationes divalentes en el sitio activo de la
enzima, preferiblemente magnesio (Wold y Ballau, 1957a; Wold y Ballau,
1957b; Lee y Nowak, 1992a; Lebioda y Stec, 1991).
Prácticamente todas las enolasas caracterizadas hasta ahora tienen un peso
molecular de entre 40 y 50 kDa por subunidad. Estas normalmente se agregan
en dímeros, de peso molecular de 80 a 100 kDa, aunque enolasas octaméricas
(compuestas de tetrámeros de dímeros) han sido caracterizadas en procariotas
(Cárdenas y Wold, 1971; Schurig y col., 1995; da Silva y col. 2003, ver Tabla
1). A pesar de que existen reportes de monómeros activos de enolasa (Faller y
col., 1977; Zhang y col., 1997), lo más probable es que la estructura dimérica
sea esencial para la actividad catalítica (Kornblatt y col., 1997).
Varias estructuras cristalográficas de la enolasa bajo distintas condiciones y
para varios organismos han sido determinadas. Estas, junto con estudios de
características cinéticas y fisicoquímicas, y de mutagénesis sitio dirigida, han
ayudado a entender las propiedades estructurales y el mecanismo de acción de
la enolasa, si bien algunos puntos permanecen todavía sin esclarecerse del
todo (Poyner y col., 1997; da Silva y col., 2003).
La reacción de la enolasa es interesante, ya que involucra la substracción de
un protón poco acídico del carbono 2 del 2PGA y la eliminación de un grupo de
salida pobre, el hidroxilo del carbono 3. Diversos estudios, como los de
intercambio isotópico realizados por Dinovo y Boyer (1971), mostraron que la
29
reacción de la enolasa probablemente ocurre a través de un intermediario
carbanión, formado por la eliminación del protón del carbono 2 del 2PGA por
una base de la enzima. Posteriormente ocurre la eliminación del hidroxilo del
carbono 3, a través de un ácido de la enzima y la formación del doble enlace
entre los carbonos 2 y 3, para formar PEP (Lebioda y Stec, 1991; Duquerroy y
col., 1995; Poyner y col., 2001). Un esquema de este proceso se muestra en la
figura 5a.
Estudios cinéticos y algunas estructuras indican que existen por lo menos dos
sitios de unión a cationes divalentes en cada monómero de enolasa. Uno de
estos sitios se encuentra ocupado en ausencia de sustrato, y ha sido
denominado “sitio conformacional”. La unión de cationes a este sitio parece ser
importante para la estabilidad del dímero de enolasa. El sitio conformacional es
aparentemente poco selectivo, y diversidad de cationes divalentes se unen a él
(Lebioda y col., 1989; Lee y Nowak, 1992 a). El segundo sitio, denominado
“sitio catalítico”, es muy probablemente ocupado luego de la unión del
sustrato, lo que parece ser esencial para la actividad catalítica de la enolasa
(Poyner y col., 2001; Faller y col., 1977; Lebioda y Stec, 1991).
Es interesante el hecho de que a pesar de que la enolasa es una enzima que
posee un solo sustrato, se ha propuesto un mecanismo ordenado para su
actividad catalítica. La apoenzima, une un ión de Mg2+ por monómero, en el
sitio conformacional, posteriormente ocurre la unión del sustrato y luego
secuencialmente, se une el segundo ión al sitio catalítico, ocurre la reacción y
se libera el ión del sitio catalítico. Por último se disocia el producto, quedando
la enzima unida a Mg2+ en el sitio conformacional (Faller y col, 1977; Poyner y
col, 2001). Un esquema de este mecanismo, para una subunidad de enolasa,
se muestra en la figura 5b.
Hasta ahora, para todas las enolasas, la mayor activación se obtiene cuando el
catión divalente es Mg2+. Aunque otros cationes, como Zn2+, Mn2+,
Fe(II)2+,Cd2+, Co+2, y Ni2+ pueden activar a la enzima (en forma decreciente
30
según el orden presentado) para catalizar la reacción (e inclusive poseen
mayor afinidad por la enzima que el magnesio) en presencia de Mg+2 las
concentraciones crecientes de los primeros producen curvas hiperbólicas de
inactivación. En general para todos los cationes, incluyendo Mg+2, las curvas de
actividad versus log [catión] tienen forma de campana. Esto implica que a
concentraciones altas, los cationes divalentes tienen un efecto inhibitorio
(Cárdenas y Wold, 1971; Lee y Nowak, 1992 b; Kustrzeba-Wócicka y Golczak,
2000; Pancholi, 2001).
Figura 5. Reacción catalizada por la enolasa. (a.) mecanismo químico. (b.) mecanismo
enzimático, se muestra un monómero de enolasa.
Una de las explicaciones a este fenómeno, ha sido la proposición de un tercer
sitio de unión a metales que tendría un efecto inhibitorio sobre la actividad
enzimática (Faller y col., 1977; Brewer y col., 2003; Lee y Nowak, 1992a). La
evidencia de estudios de unión de Mg+2 es ambigua para probar esta hipótesis,
y este sitio no había aparecido en las estructuras cristalográficas (Poyner y
col., 2001), hasta hace poco. La estructura de la enolasa de T. brucei muestra
un tercer sitio de unión a metales que podría representar el hipotético tercer
sitio inhibitorio (da Silva y col., 2003).
31
Otra explicación para este fenómeno, es sencillamente la acción de masas en
el mecanismo ordenado propuesto para la reacción catalizada por la enolasa
(mostrado en la figura 6b). Un exceso de Mg+2 dificultaría la salida del
producto y por lo tanto provocaría un efecto de inhibición en la actividad
enzimática (Poyner y col., 2001).
Las primeras estructuras cristalográficas determinadas, para la enolasa de
levadura (Lebioda y col., 1989) y langosta (Duquerroy y col., 1995), son muy
parecidas y muestran, como es de esperarse según las mediciones de pesos
moleculares nativos, que la enolasa se encuentra como un dímero de
subunidades idénticas. Este dímero presenta simetría bilateral y cada
subunidad tiene dimensiones de 60x55x45 Å (para la enolasa de levadura).
Estos estudios también muestran que cada subunidad consta de dos dominios
y una corta cola C-terminal (aminoácidos 421-436 de la estructura de
levadura) (Lebioda y col., 1989).
El dominio principal, ubicado hacia el C-terminal (aminoácidos 143-420 en la
estructura de levadura), es un barril α+β con 8 hélices α y 8 hebras β. La
topología de este barril es distinta al del barril típico de la triosa fosfato
isomerasa (TIM), ya que en lugar de intercalarse las hebras β con las hélices α,
y de ser todas las hélices paralelas y todas las hebras paralelas entre sí (y
antiparalelas unas respecto a las otras), en el barril de enolasa, las primeras
dos hebras β están seguidas y son antiparalelas, al igual que las dos primeras
hélices. El patrón usual del barril de la TIM sigue después de esta diferencia,
por lo que la topología del barril de la enolasa se denomina ββαα(βα)6 en lugar
de (βα)8. En el fondo de este barril se encuentra el sitio activo de la enzima
(Lebioda y col., 1989).
El otro dominio, formado por el N-terminal (aminoácidos 1-142 para la
estructura de la enolasa de levadura), envuelve al dominio principal. La
estructura puede describirse como β3α4, ya que consta de una lámina β de tres
hebras antiparalelas, seguidas de una vuelta que se extiende hacia la entrada
32
del sitio activo y de cuatro hélices α. (Lebioda y col., 1989, Duquerroy y col,
1995). Un esquema de la estructura de la enolasa de levadura donde se
señalan algunas de las características estructurales anteriormente
mencionadas se muestra en la figura 6.
Los contactos entre las dos subunidades ocurren principalmente entre átomos
de la cadena principal del dominio N-terminal de una subunidad y los residuos
de la última hélice α del barril de la otra subunidad. Existen varios contactos
iónicos y hay pocas interacciones hidrofóbicas entre las dos subunidades
(Lebioda y col., 1989)
Figura 6. Esquema de la estructura de la enolasa de levadura y algunas características.
En cuanto a los residuos involucrados en el sitio activo, todavía existen ciertas
controversias. Pruebas con agentes químicos han mostrado que, posiblemente,
33
grupos carboxilo y las cadenas laterales de los aminoácidos arginina, histidina
y tirosina estarían relacionados con el sitio activo. Todos estos aminoácidos se
encuentran cerca del sitio activo de la enolasa de levadura, excepto tirosina.
Adicionalmente, se encuentran cerca de este sitio dos residuos de lisina.
(Lebioda y col., 1989). El mecanismo propuesto hasta ahora, basado en
diversas estructuras cristalográficas (principalmente de la enolasa de levadura)
se resume a continuación.
El primer ión de Mg2+ se une a la apoenzima, al sitio catalítico (o sitio I),
aparentemente coordinado a tres residuos acídicos: Asp246, Glu295 y Asp320
(Larsen y col., 1996). Esta unión no parece inducir cambios conformacionales
importantes en la estructura de la proteína, que se encuentra en conformación
“abierta” (da Silva y col., 2003). Posteriormente se une el sustrato, el grupo
carboxilo de este interactúa con Gln167, Lys396 y el ión de Mg2+, mientras que
el grupo fosfato se une a Arg374. Aparentemente aquí ocurren ciertos cambios
conformacionales: una vuelta (o “loop”), formada entre los residuos Ser36-
His43 (loop 1) se mueve, produciendo una conformación intermedia entre la
“abierta y la “cerrada” que permitiría la unión del segundo ión de Mg2+ al sitio
catalítico o sitio II, formado posiblemente, por el grupo carboxilo y el grupo
fosfato del sustrato, junto con el hidroxilo de Ser39 (perteneciente al loop1).
Posteriormente, otros dos loops, Val153-Phe169 (loop 2) y Ser250-Gly277
(loop 3), se mueven produciendo la conformación “cerrada” de la enzima
(Larsen y col., 1996; Zhang y col., 1997; da Silva y col., 2003).
Aparentemente, His159 en la vuelta 2, dona un protón al grupo fosfato. Esto,
junto con la interacción con Arg374 y el Mg2+ unido al sitio catalítico,
probablemente hace que el grupo fosfato del 2PGA, quede sobreneutralizado,
facilitando la salida del protón del carbono 2 (Zhang y col., 1997; Brewer y
col., 2003).
La eliminación de la molécula de agua del 2PGA debe ser anti, esto es, el
protón del carbono 2 y el hidroxilo del carbono 3 deben salir de lados opuestos
respecto al plano de los átomos de carbono del 2PGA. De forma que los
34
residuos propuestos para la eliminación de estos grupos deberían estar en
lados opuestos del sustrato (Lebioda y Stec, 1991; Poyner y col., 2001).
Lys345 es posiblemente la base que abstrae el protón del carbono 2, mientras
que Glu211, o un protón compartido por Glu211 y Glu168, funcionan como el
ácido que promueve la eliminación del grupo hidroxilo del carbono 3 del 2PGA
(Zhang y col., 1997; Poyner y col., 2001). Otros pares base/ácido de residuos
propuestos, son His156/Lys396 e His159/His373 (Poyner y col., 2001; da Silva
y col., 2003).
Otra de las características generales de las enolasas es su inhibición por
fluoruro, y sobre todo, un efecto sinérgico en presencia de fosfato inorgánico
(Cárdenas y Wold, 1971). Los mecanismos propuestos para esta inhibición son
contradictorios en la literatura. En varios trabajos se propone que la inhibición
por fluoruro es competitiva en presencia de fosfato y no competitiva en
ausencia de fosfato (Pietkiewicz y col., 1983; Schurig y col., 1995), aunque
también se ha reportado un mecanismo no competitivo para la inhibición en
presencia de fosfato y mecanismo competitivo para la unión en ausencia de
fosfato (Kustrzeba-Wójcicka y Golckzak, 2000). Más aun, en algunos casos se
reporta que el fluoruro por sí solo no tiene efecto inhibitorio (Cárdenas y Wold,
1971). En todo caso, se determinó una estructura cristalina del complejo
enolasa-magnesio-fluoruro-fosfato, donde se observa una conformación
cerrada, que explicaría la inhibición por fluoruro en presencia de fosfato
(Lebioda y col., 1993).
Un estudio comparativo realizado con enolasas de distintos organismos
(Cárdenas y Wold, 1971), mostró que las propiedades catalíticas de las
enolasas son bastante similares. Los Km para 2PGA, se encuentran en un rango
entre 40 y 160 µM. Existen ciertas diferencias apreciables en las actividades
específicas de las distintas enzimas y en los pH óptimos. Comparaciones de
varios trabajos muestran diferencias substanciales entre las enolasas de
distintos organismos (ver Tabla 1) e inclusive entre las enolasas de un mismo
organismo. Esto puede deberse a variaciones en las metodologías
35
experimentales, o a verdaderas variaciones en las propiedades catalíticas de la
enolasa.
La enolasa es una de las proteínas más abundantemente expresadas en el
citosol de diversos organismos (Pancholi, 2001). No se ha encontrado que las
enolasas tengan propiedades regulatorias (Lebioda y col., 1898). Sin embargo,
los niveles de expresión de enolasa varían en distintos organismos y en
muchos de ellos existen diversas isoenzimas. En vertebrados, existen tres
genes que codifican a tres subunidades distintas de la enolasa: α, β, y γ. La α-
enolasa se encuentra en variedad de tejidos, la β es la principal forma en el
músculo, y la γ-enolasa suele encontrarse exclusivamente en tejido nervioso.
La isoenzima α puede formar heterodímeros con las formas β y γ, sin embargo,
el dímero βγ no se ha aislado (posiblemente debido a que estas isoenzimas no
se expresan en los mismos tejidos) aunque puede ser producido a partir de los
componentes purificados (Pancholi, 2001). La expresión de estas isoenzimas
también parece variar durante el desarrollo. Por lo menos, en el músculo de
ratón, la α-enolasa es la más expresada en el feto, y va siendo reemplazada
por la isoforma β (Merkulova y col, 1997).
En plantas, también hay evidencias de múltiples isoenzimas. En algunos casos
(junto con Euglena gracilis), se han encontrado, como para otras enzimas
glicolíticas, formas distintas en el citosol y dentro del cloroplasto. Además
existen varios genes de enolasa y otras evidencias de isoenzimas (Miernyc y
Dennis, 1984; Anderson y col., 1997, Hannaert y col., 2000). En levadura,
existen dos genes que codifican para enolasa, y se han aislado tres isoenzimas.
La expresión de estas parece depender de la fuente de carbono que utilizan las
células (Entian y col., 1983).
36
37
También se ha observado que condiciones externas pueden modular la
expresión de la enolasa. De hecho, esta enzima ha sido caracterizada como
proteína de stress hipóxico (Aaronson y col., 1995) y de stress por calor, ya
que se identificó que la HSP48 de levadura es enolasa (Pancholi, 2001).
Además, existen diversos reportes de que la enolasa puede sufrir
modificaciones postraduccionales variadas que podrían modular su actividad
(Pancholi, 2001, Fratelli y col., 2001; Boël y col., 2004).
Estudios recientes han mostrado que varias enzimas glicolíticas tienen otras
funciones, además de su rol en el metabolismo energético. De hecho, la
enolasa es considerada actualmente como una proteína multifuncional
(Pancholi, 2001). Identificada como τ-cristalina, forma parte del lente ocular en
algunos vertebrados, una isoforma producida por traducción alternativa del
mRNA de enolasa está involucrada en la regulación transcripcional del oncogén
c-myc en humanos, se ha identificado como uno de los componentes del
degradosoma (complejo encargado de la degradación de los mRNAs) de E. coli,
y parece tener importancia en diversos procesos patológicos como cáncer,
enfermedades neurológicas, enfermedades autoinmunes e invasividad de
organismos patógenos y alergias e inmunosupresión causadas por estos
(Pancholi, 2001; Leroy y col., 2002).
La relación con procesos patológicos parece deberse al hecho de que la enolasa
se encuentra en la superficie de diversos organismos, como Streptococcus,
levadura, Candida, e inclusive humanos, entre otros. No es claro como es
transportada la enolasa a la superficie de estas células, ya que esta proteína
no posee ninguna de las señales típicas de exportación. En cualquier caso,
parece actuar como receptor de plasminógeno y/o plasmina (Pancholi y
Fischetti, 1998; Edwards y col., 1999; Pancholi, 2001; Jong y col., 2003; Miles
y col., 1990). El plasminógeno (Plg), una glicoproteína de 92 kDa, es el
zimógeno precursor de la plasmina, la principal proteasa del sistema
fibrinolítico (Castellino, 1981). La unión de Plg a la superficie de la célula
parece estar involucrada en procesos de invasión de tejidos de organismos
38
patógenos y células cancerosas (Pancholi y Fischetti, 1998; Pancholi, 2001;
Jong y col., 2003; Miles y col., 1990).
Además de la principal ubicación citosólica de la enolasa y de la localización en
superficie en varios organismos, parecen existir otras ubicaciones posibles para
esta enzima. Se ha identificado el heterodímero αγ de enolasa en terminales
sinápticos en rata (Ueta y col., 2004), por lo menos la isoforma de enolasa que
regula la expresión de C-myc debe encontrarse en el núcleo (Pancholi, 2001),
y recientemente se ha descrito la asociación de varias enzimas de la ruta
glicolítica, incluyendo enolasa, a la superficie externa de las mitocondrias en
células de Arabidopsis (Giege y col., 2003).
Enolasa en tripanosomátides
Las enolasas de tripanosomátides habían sido muy poco estudiadas hasta hace
poco. Los primeros estudios de ubicación subcelular mostraron que la enolasa
se encontraba fuera del glicosoma, en el citosol, junto con la PGM y la PGK
(Opperdoes y Borst, 1977; Taylor y Gutteridge, 1987; Hannaert y col., 2003b).
Los modelos matemáticos de metabolismo de los trypomastigótes procíclicos
de T. brucei, consideran en equilibrio la reacción catalizada por la enolasa (y
por la PGM), y por lo tanto no consideran que esta pueda tener algún control
sobre el flujo de la ruta, excluyéndola como posible blanco quimioterapeútico
(Bakker y col., 1997; Bakker y col., 1999). Esto, posiblemente basado en
observaciones en otros organismos, ya que para esa fecha, no se había
determinado ningún parámetro cinético para la enolasa de ningún
tripanosomátide.
Las enzimas citosólicas de la ruta glicolítica en general, no han sido muy
estudiadas, posiblemente debido a que se consideraba que tenían pocas
particularidades que pudiesen ser explotadas para quimioterapia. Sin embargo,
se ha encontrado que estas proteínas citosólicas si poseen ciertas
particularidades, por ejemplo, la PGM de tripanosomátides es independiente
top related