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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO
PEDRO MODESTO NASCIMENTO MENEZES
ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTITUSSÍGENA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides (VERBENACEAE)
PETROLINA - PE
2017
PEDRO MODESTO NASCIMENTO MENEZES
ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTITUSSÍGENA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Lippia origanoides (VERBENACEAE)
Trabalho apresentado ao Programa de Pós-graduação em Recursos Naturais do Semiárido – PPGRNSA da Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF, Campus Centro, como requisito final para obtenção do título de Mestre em Recursos Naturais do Semiárido, Subárea de Fisiologia e Farmacologia. Orientador: Prof. Dr. Fabrício Souza Silva Co-orientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro
Petrolina - PE
2017
Menezes, Pedro Modesto Nascimento M543a Atividade espasmolítica e antitussígena do óleo essencial de
Lippia origanoides (Verbenaceae) / Pedro Modesto Nascimento Menezes. -- Petrolina, 2017.
xix, 149 f. : il. ; 29 cm. Dissertação (Mestrado em Recursos Naturais do Semiárido) –
Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Petrolina, Petrolina-PE, 2017.
Orientadora: Prof. Dr. Fabrício Souza Silva. Coorientador: Prof. Dr. Luciano Augusto de Araújo Ribeiro.
Referências. 1. Asma - Tratamento. 2. Farmacologia. 3. Óleo essencial. 4.
Plantas medicinais. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco.
CDD 616.238 Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF
Bibliotecária: Luciana Souza Oliveira CRB5/1731
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS DO SEMIÁRIDO
FOLHA DE APROVAÇÃO
PEDRO MODESTO NASCIMENTO MENEZES
ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTITUSSÍGENA DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Lippia origanoides (VERBENACEAE)
Dissertação apresentada como requisito final
para obtenção do título de Mestre em
Recursos Naturais do Semiárido, pela
Universidade Federal do Vale do São
Francisco.
Aprovada em: ____ de ____________ de ______.
Banca examinadora
_______________________________________________
Fabrício Souza Silva, Doutor, UNIVASF
_______________________________________________
Julianeli Tolentino de Lima, Doutor, UNIVASF
_______________________________________________
Darizy Flávia Silva Amorim de Vasconcelos, Doutora, UFBA
Aos meus pais e meus irmãos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todas as forças do universo.
Ao meu pai, Adriano Menezes e minha mãe, Lucy Modesto pelo apoio nessa
jornada.
Aos meus irmãos, Luciano e Clarice, pela parceria e amizade.
À minha família por proporcionar momentos de felicidade.
Ao meu orientador, Fabrício Souza Silva e co-orientador Luciano Ribeiro pela
paciência e ajuda no desenvolvimento dos experimentos, discussões acadêmicas e
não-acadêmicas, além da amizade.
À professora Larissa Rolim por seu entusiasmo que contagia qualquer pesquisador,
no auxílio do desenvolvimento e discussão de protocolos experimentais.
Aos professores Julianeli Tolentino e Edilson Beserra pelas contribuições ao
trabalho no momento da qualificação.
À equipe do Laboratório de Farmacologia Experimental, Gabriela Olinda,
Bismarques Augusto, Pablo Dantas, Rafael Menezes, Marcos Moura, Luiz Antônio,
Willian Brito, Gerson Araújo, Deisy Azevedo, Ayla Ribeiro, Alice Bezerra e, em
especial, a Mariana Brito, pelo auxilio nos experimentos, produção de artigos e ótima
companhia quase que diária.
Ao professor Jackson Guedes e a Érica Lavor por disponibilidade dos equipamentos,
ajudarem nos testes farmacológicos que envolveram o Sistema Nervoso Central,
além das análises dos dados.
Aos colegas da turma do mestrado 2015.1, em especial, Pedrita Sampaio, Wilton
Calvalcanti, Morganna Thinnesca e Mariana Gama pela parceria desde a graduação.
A Pedro Guilherme por ajudar nas discussões do desenvolvimento analítico de
protocolos experimentais.
Ao pessoal da Central Analítica de Fármacos, Medicamentos e Alimentos por me
acolherem amigavelmente para realização de experimentos.
Ao Biotério Central da UNIVASF pela disponibilidade dos animais.
A todos meus amigos, que permitiram discussões a qualquer momento, sobre
qualquer aspecto, agregando conhecimento de mundo.
Á todos envolvidos direta e indiretamente na finalização da dissertação.
Segundo Albert Einstein [1879 - 1955], físico teórico e matemático
alemão, “Se, a princípio, a ideia não é absurda, então não há
esperança para ela”.
RESUMO
A asma é considerada uma doença inflamatória crônica caracterizada por hiperresponsividade brônquica e hipersecreção de muco. A terapêutica principal se baseia na utilização de agonistas β2-adrenérgicos, corticosteroides, antagonistas muscarínicos e dos leucotrienos, dentre outros. Esses fármacos, por vezes, não conseguem estabelecer uma melhora clínica nos pacientes e novos tratamentos estão em evidência. Os produtos naturais possuem importância terapêutica de diversas afecções, tendo nos estudos etnofarmacológicos uma importante fonte de dados. Nesse sentido, existem diversos relatos da literatura sobre a utilização da Lippia origanoides Kunth para tratamento de problemas respiratórios, inclusive asma. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a composição química do óleo essencial de L. origanoides (LOO) e, após isso, observar sua atividade farmacológica através do potencial relaxante e mecanismo de ação em traqueia isolada de cobaia (in vitro); a atividade antitussígena a partir do desafio com ácido cítrico (0,4 M), em camundongos; atividade motora e ansiolítica/sedativa em teste de roda Rod e campo aberto (in vivo), em camundongos; além da otimização do protocolo experimental de atividade expectorante através da detecção do indicador vermelho de fenol no lavado broncoalveolar (LBA). Os resultados obtidos demonstraram que o LOO promoveu relaxamento da traqueia isolada de cobaia quando a contração era promovida por carbacol, CE50 = 52,21 (46,03-59,42) µg/mL, e histamina, CE50 = 9,92 (7,52-11,57) µg/mL, mostrando-se mais potente para as contrações histaminérgicas. Além disso, o mecanismo de ação de LOO pode estar envolvido com a via de transdução de sinal NO/GCs/GMPc/PKG com ativação da GCs e posterior regulação de PKG que fosforila os canais para potássio sensíveis a voltagem (Kv) e os modulados por cálcio (KCa) promovendo o relaxamento. Vale ressaltar que, na presença de atropina e dexametasona houve um potencial relaxamento, mostrando que LOO pode estar influenciando na transmissão colinérgicar e/ou estimula um aumento GMPc em conjunto ao corticosteróide, que pode reduzir os níveis de TNF-α (responsável por inibir a via NO/GCs/GMPc/PKG), bem como reduzir os níveis de prostanóides contracturantes, tal como LTD4. O LOO nas doses de 100 e 300 mg/kg conseguiram reduzir a frequência de tosse, sendo na dose de 300 mg/kg capaz de aumentar a latência. No teste do rota-rod e campo aberto o LOO 300 mg/kg apresentou atividade miorrelaxante, ansiolítica/sedativa evidenciado por um aumento no número de quedas da barra e redução no tempo de permanência, para o rota-rod e aumento dos rearings, redução do número de cruzamentos e aumento do tempo de imobilidade para o campo aberto, o que sugere uma atividade sobre o sistema nervoso central (SNC). A otimização do protocolo experimental e método analítico para avaliação da atividade expectorante foi validado para se obter avaliações precisas e exatas do vermelho de fenol no LBA. Portanto, LOO apresenta atividade espasmolítica, antitussígena e uma possível ação sobre o SNC. Além disso, o LOO agora pode ser utilizado frente ao protocolo de atividade expectorante com um método validado e preciso. Palavras-chave: atividade ansiolítica/sedativa, atividade antitussígena, atividade espasmolítica, Lippia origanoides Kunth, óleo essencial.
ABSTRACT
Asthma is considered a chronic inflammatory disease characterized by bronchial hyperresponsiveness and mucus hypersecretion. The primary therapy is based on the use of β2-adrenergic agonists, corticosteroids, muscarinic and leukotriene antagonists, among others. These drugs sometimes fail to establish a clinical improvement in patients and new treatments are in evidence. The natural products have therapeutic importance in various affections, being the ethnopharmacological studies an important source of new compounds. In this sense, there are several literature reports on the use of Lippia origanoides Kunth for the treatment of respiratory problems, including asthma. Therefore, the aim of this study was to evaluate the chemical composition of the essential oil of L. origanoides (LOO) and, after that, to observe pharmacological activity through the relaxing potential and mechanism of action in isolated trachea of guinea pig (in vitro); the antitussive activity by challenge with citric acid (0.4 M) in mice; motor and anxiolytic/sedative activities byrota-rod and open field test (in vivo), in mice; and the optimization of the experimental protocol of expectorant activity through detection of red phenol indicator in bronchoalveolar lavage (BAL). Results showed that LOO caused a relaxation on guinea pig tracheal contractions induced by carbachol, EC50 = 52.21 (46.03-59.42) µg/mL or histamine, EC50 = 9.92 (7.52-11.57) µg/mL, being more potent for histaminergic contractions. In addition, the LOO mechanism of action may be involved with the NO/GCs/GMPc/PKG signal transduction pathway with GCs activation and subsequent PKG uptake that phosphorylates the voltage-sensitive K+ channel (Kv) and calcium activated K+ channels (KCa) promoting relaxation. It is noteworthy that in the presence of atropine and dexamethasone there was a potential relaxation, showing that LOO may be influencing cholinergic transmission and/or stimulating cGMP increase in conjunction with corticosteroid, which may reduce TNF-α levels (responsible for inhibiting NO/GCs/GMPc/PKG pathway), as well as reducing levels of contracting prostanoids, such as LTD4. The LOO at doses of 100 and 300 mg/kg was able to reduce the frequency of coughing, and at a dose of 300 mg/kg increaseditslatency. In the rota-rod and open-field tests, the LOO 300 mg/kg presented a myorelaxant and anxiolytic/sedative activity evidenced by an increase in the number of bar drops and reduction in the dwell time in the bar, for the rota-rod, and increase of rearings, reduction in the number of crosses and increased immobility time, for the open field, suggesting an central nervous system (CNS)activity.The optimization of the experimental protocol and analytical method for evaluation of expectorant activity has been validated to obtain precise and accurate evaluations of phenol red in the BAL. LOO showed spasmolytic and antitussive activities and possible action on the CNS. Furthermore, LOO can now be used though the expectorant activity protocol with a valid and accurate method. Keywords: anxiolytic/sedative activity, antitussive activity, spasmolytic activity,
Lippia origanoides Kunth, essential oil.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Diferença histológica e imunológica entre asma e DPOC.
Figura 2 - Atividade relaxante e contracturante de prostanoides sobre o músculo liso
das vias aéreas.
Figura 3 - Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina ou carbacol.
Figura 4 - Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença ou ausência de bloqueadores de canais para
potássio (K+).
Figura 5 - Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador β-adrenérgico e
inibidores da via dos eicosanóides.
Figura 6 - Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador ganglionar e
muscarínicos.
Figura 7 - Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueadores da via do
NO/GCs/GMPc.
Figura 8 – Valores de CE50 de LOO na ausência e presença dos bloqueadores.
Figura 9 – Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO e/ou
aminofilina.
Figura 10 - Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO,
nitroprussiato de sódio e/ou azul de metileno.
Figura 11 - Análise de frequência de tosse e latência, obtidos na presença de LOO.
Figura 12 - Número de quedas e tempo de permanência dos camundongos no
aparelho rota-rod.
Figura 13 - Análise de LOO na dose de 300 mg/kg, em relação ao tempo.
Figura 14 - Principais parâmetros de avaliação no campo aberto.
Figura 15 - Distribuição das espécies iônicas de vermelho de fenol de acordo com a
variação do pH.
Figura 16 - Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em
pHs diferentes.
Figura 17 - Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em
condições básicas obtidas por NaOH e NaHCO3.
Figura 18 - Varredura espectrofotométrica das amostras de LBA na presença e
ausência de vermelho de fenol.
Figura 19 - Regressão linear das soluções de vermelho de fenol.
Figura 20 - Quantificação de vermelho de fenol a partir de dose fixa e concentrações
variáveis.
Figura 21 - Possível mecanismo tussígeno do ácido crítrico.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica.
Tabela 2 - Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides.
Tabela 3 - Informações sobre o protocolo de atividade expectorante disponível na
literatura.
Tabela 4 - Composição do óleo essencial de L. origanoides por CG-EM.
Tabela 5 - Dados numéricos dos parâmetros analisados no campo aberto.
Tabela 6 - Resultado da relação absorbância média de pH da amostra de LBA.
Tabela 7 - Verificação na altura do sedimento das partículas do vermelho de fenol.
Tabela 8 - Dados observados nos protocolos experimentais da literatura.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4-AP 4-aminopiridina
AA Ácido araquidônico
AC Adenililciclase
AMN Aminofilina
AMPc Adenosina monofosfato cíclico
anti-TNF Anti-fator de necrose tumoral
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APC´s Células apresentadoras de antígeno
ATP Adenosina trifosfato
ATR Atropina
AZM Azul de metileno
BKca Canais para K+ de grande condutância ativados por cálcio
CCh Carbacol
CE50 Concentração efetiva que causa 50% do efeito máximo
CEUA-UNIVASF Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal
do Vale do São Francisco
CG-EM Cromaografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
CN Controle negativo
COX Cicloxigenase
CP Controle positivo
CsCl Cloreto de césio
CXCL10 ou IP-10 Proteína 10 induzida por INF-
CXCL12 ou I-TAC Célula T quimioatrativa induzida por interferon
CXCL9 ou MIG Monoquina induzida por INF-
DAG Diacilglicerol
DEX Dexametasona
DPOC Doença pulmonar obstrutiva crônica
DPR% Desvio padrão relativo
DT50 Dose tóxica que afetaria 50% dos animais
FcƐRI Receptor de IgE
FEV1 Volume de expiração forçada em 1 segundo
GCp Guanilil ciclase particulada
GCs Guanilil ciclase solúvel
GLIB Glibenclamida
GMPc Guanilil monofosfato clíclico
ICH International Conference of Harmonization
IFN- Interferon gama
IgE Imunoglobulina E
IL-13 Interleucina 13
IL-4 Interleucina 4
IL-5 Interleucina 5
IL-9 Interleucina 9
IND Indometacina
IP3 Inositol 1,4,5-trisfosfato
iPDE4 Inibidores da fosfodiesterase 4
ISAAC International Study for Asthma and Allergies in Childhood
KATP Canal para K+ sensível ao ATP
KCa Canais para K+ abertos pelo Ca2+
Kir Canais para K+ retificadores de entrada
KV Canais para K+ operados por voltagem
LABA’s Agonistas β2-adrenérgicos de longa duração
LAMA Antagonista muscarínico de longa duração
LAPRON Laboratório de Química de Produtos Naturais e Bioativos
LBA Lavado broncoalveolar
LD Limite de detecção
L-NAME Nω-nitro-L-arginina metil éster
LOO Óleo essencial de L. origanoides
LOX Lipoxigenase
LQ Limite de quantificação
LT’s Leucotrienos
LTB4 Leucotrieno B4
LTD4 Leucotrieno D4
LTRA Antagonistas do receptor de leucotrieno
MLCK Cinase da cadeia leve de miosina
MLCP Fosfatase da cadeia leve de miosina
NaCl Cloreto de sódio
NaHCO3 Bicarbonato de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
NF-kB Fator de transcrição nuclear kb
NH4Cl Cloreto de amônio
NO Óxido nítrico
NPS Nitroprussiato de sódio
OVA Ovalbumina
ODQ 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3,-a]quinoxalina-1-ona
PAF Fator ativador de plaquetas
PG’s Prostaglandinas
PGD Prostaglandina D
PGD2 Prostaglandina D2
PGE Prostaglandina E
PGF Prostaglandina F
PGI Prostaglandina I
PIP2 Inositol 4,5-bifosfato
PK Proteína cinase
PKA Proteína cinase ativada por AMPc
PKC Proteína cinase ativada por cálcio
PKG Proteína cinase ativada por GMPc
PLA2 Fosfolipase A2
PROP Propranolol
RPM Rotações por minuto
SABA’s Agonistas β2-adrenérgicos de curta duração
SHR Ratos espontaneamente hipertensos
SUS Sistema Único de Saúde
TEA Tetraetilamônio
TH2 T-helper tipo 2
TLSP Linfopoetina do estroma tímico
TNF Fator de necrose tumoral
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
TRP Transient receptor potential channel
TRPA Transient receptor potential channel ankyrin
TRPC Transient receptor potential channel canonical
TRPM Transient receptor potential channel melastin
TRPV Transient receptor potential channel vanilloid
TX Tromboxano
TXA2 Tombroxano A2
UEFS Universidade Estadual de Feira de Santana
UNIVASF Universidade federal do vale do São Francisco
YC-1 (3-(5'-hidroximetil-2'-furil)-1-benzilindazol)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 17
2 REFERENCIAL TEÓRICO 20
2.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE A ASMA 20
2.1.1 Abordagem terapêutica da asma 26
2.2 ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTIASMÁTICA DE
ÓLEOS ESSENCIAIS 30
2.3 GÊNERO Lippia e Lippia origanoides Kunth. 41
3 OBJETIVOS 59
3.1 OBJETIVO GERAL 59
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 59
4 MATERIAIS E MÉTODOS 60
4.1 MATERIAIS 60
4.2 PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL 61
4.3 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO
ESSENCIAL 62
4.4 ANIMAIS 62
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E
MECANISMO DE AÇÃO EM MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA
ISOLADA DE COBAIA
62
4.5.1 Investigação da participação de canais para K+
no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída
com histamina
63
4.5.2 Investigação da participação de receptores
β-adrenérgicos no relaxamento induzido por LOO em traqueia
pré-contraída com histamina
63
4.5.3 Investigação da participação das
prostaglandinas no relaxamento induzido por LOO em traqueia
pré-contraída com histamina
64
4.5.4 Investigação da participação da via colinérgica
no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída 64
com histamina
4.5.5 Investigação da participação da via do óxido
nítrico (NO) no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-
contraída com histamina
65
4.5.6 Investigação da participação da via da guanilil
ciclase solúvel (GCs) no relaxamento induzido por LOO em
traqueia pré-contraída com CCh
65
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM
CAMUNDONGOS 66
4.7 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO
ROTA-ROD) 67
4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA ANSIOLÍTICA
ATRAVÉS DO MÉTODO DE CAMPO ABERTO 67
4.9 APERFEIÇOAMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA
QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR VERMELHO DE FENOL
68
4.9.1 Influência do pH da quantificação de vermelho de
fenol em LBA 69
4.9.2 Perfil de absorção no UV do vermelho de fenol no
LBA 69
4.9.3 Validação da metodologia analítica 70
4.9.4 Determinação da solubilidade do vermelho de
fenol em salina e LBA 72
4.9.5 Desenvolvimento de suspensão de vermelho de
fenol estável 72
4.9.6 Aplicação da metodologia analítica para
avaliação de atividade expectorante em camundongos 72
4.10 ANÁLISE DOS DADOS 73
5 RESULTADOS 74
5.1 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO
ESSENCIAL 74
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E
MECANISMO DE AÇÃO EM MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA 75
ISOLADA DE COBAIA
5.2.1 Investigação da participação de canais para K+
no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída
com histamina
77
5.5.2 Investigação da participação de receptores
β-adrenérgicos e das prostaglandinas no relaxamento induzido
por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
78
5.5.3 Investigação da participação da via colinérgica
no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída
com histamina
80
5.5.4 Investigação da participação da via do óxido
nítrico (NO) no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-
contraída com histamina
81
5.5.5 Investigação da participação da via da guanilil
ciclase solúvel (GCs) no relaxamento induzido por LOO em
traqueia pré-contraída com CCh
83
5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM
CAMUNDONGOS 86
5.4 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO
ROTA-ROD) 88
5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA E ANSIOLÍTICA
ATRAVÉS DO MÉTODO DE CAMPO ABERTO 92
5.6 OTIMIZAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA
QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR VERMELHO DE FENOL
94
5.6.1 Influência do pH da quantificação de vermelho de
fenol por espectrometria de absorção no UV-VIS 94
5.6.2 Quantidade de agente basificante adicionada as
amostras de LBA 96
5.6.3 Validação da metodologia analítica 98
5.6.4 Determinação da solubilidade do vermelho de
fenol em salina e em LBA 100
5.6.5 Desenvolvimento de suspensão extemporânea 100
estável de vermelho de fenol
5.6.6 Aplicação da metodologia analítica para
avaliação de atividade expectorante in vivo 101
6 DISCUSSÕES 107
7 CONCLUSÕES 124
REFERÊNCIAS 125
ANEXO - A 145
ANEXO - B 146
17
1 INTRODUÇÃO
A asma é uma doença crônica caracterizada pela instauração de uma
inflamação das vias aéreas inferiores, associada a uma hiperresponsividade
brônquica que leva a recorrentes episódios de sibilância, aperto no peito, dispneia
e tosse. Tem sido descrita como uma enfermidade que apresenta elevada
prevalência e potencialmente danosa, causando limitações de atividades cotidianas
e ataques agudos, estes algumas vezes requerendo cuidados de emergência e
podendo ser fatais (GINA, 2016; POSTMA et al., 2014).
De maneira geral, a patogênese da asma está relacionada a uma resposta
celular mediada por linfócitos T-helper tipo 2 (TH2) e imunoglobulina E (IgE), após o
contato do indivíduo predisponente com um alérgeno. A partir disso, há hiperplasia
das células caliciformes e formação de infiltrado inflamatório. A resolução envolve
metaplasia da mucosa, espessamento da membrana basal sub-epitelial, hipertrofia
e hiperplasiado músculo liso das vias aéreas inferiores, além de fibrose e aumento
da deposição de tecido conjuntivo, por causa da proliferação de fibroblastos e
miofibroblastos (MARTINEZ; VERCELLI, 2013).
A abordagem medicamentosa tem como objetivo o controle da inflamação,
redução da secreção mucosa e relaxamento das vias aéreas, sendo os
corticosteroides e agonistas β2-adrenérgicos os fármacos mais utilizados na
terapêutica (BARNES, 2012). Porém, algumas abordagens são alternativas ao
tratamento convencional no controle da asma, podendo-se destacar os óleos
essenciais obtidos de plantas aromáticas. Como exemplo destas plantas
aromáticas, o gênero Lippia tem uma grande importância para a flora brasileira e
neotropical, devido a sua representatividade como condimento ou pelas suas
propriedades medicinais. Este gênero reúne cerca de 200 táxons, distribuídos nos
trópicos e subtrópicos das Américas e África, sendo comuns nos cerrados e
campos rupestres brasileiros (ADORJAN; BUCHBAUER, 2010; VELASCO-
NEGEUREULA et al., 1993 apud VILJOEN et al., 2005; SOUZA; LORENZI, 2005).
Segundo dados do Index Kewensis, no Brasil, existem cerca de 111 espécies,
no México, 44 e na África, 33 espécies (SALIMENA, 2000), sendo os estudos
voltados à fitoquímica desse gênero, dedicados à composição química dos óleos
18
essenciais com relatos de variação entre indivíduos da mesma espécie, mas de
diferentes origens geográficas (CATALAN; LAMPASONA, 2002).
Há mais de uma década, Pascual e colaboradores (2001) destacaram que os
estudos farmacológicos das espécies de Lippia são focados, principalmente, na
identificação de atividade antimicrobiana, antifúngica, larvicida e repelente, com
preferência dada aos óleos essenciais. Considerando o que aparece atualmente
nas principais bases de dados (Web of Science e Pubmed), pouco foi acrescentado
à farmacologia do gênero desde 2001, em relação relaxamento do músculo liso,
com um agravante da concentração dos estudos em poucas espécies.
A espécie L. origanoides, conhecida popularmente como alecrim de tabuleiro,
alecrim pimenta, alecrim-d’angola, orégano ou salva-do-marajó, é um arbusto
aromático bastante ramificado, encontrado em campos e cerrados de solos
pedregosos e compactos, em altitudes entre 900 e 1100 metros acima do nível do
mar. A ocorrência desta espécie abrange Guiana Francesa, Brasil (desde o estado
do maranhão ao estado do Rio de Janeiro), Colômbia, Venezuela e Guiana, sendo
comum no semiárido brasileiro (SALIMENA-PIRES; GIULIETTI, 1998). As folhas
desta planta são usadas popularmente na forma de decoto ou macerado em álcool
no tratamento de doenças do trato respiratório, incluindo asma, bronquite, gripe,
resfriado e tosse, bem como em distúrbios gastrintestinais, como dores de
estômago e indigestão, além de infecções microbianas (AGRA et al., 2007;
PASCUAL et al., 2001).
Devido a grande utilização de L. origanoides pelas comunidades da Região
Nordeste e o potencial dessa espécie em produzir óleo essencial em larga escala,
estudos sobre as condições de cultivo tem sido realizado por uma equipe de
colaboradores do Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana
(UEFS). Os óleos produzidos contêm como constituinte majoritário o carvacrol,
havendo variação entre os demais componentes (TELES et al., 2014).
Por se considerar a escassez de estudos farmacológicos da espécie
L. origanoides, estre trabalho buscou realizar uma investigação da composição
química do óleo essencial e da atividade farmacológica in vitro e in vivo em
modelos experimentais de distúrbio do trato respiratório, relacionados com o uso
popular dessa espécie, além da observação de neurotoxicidade ou influência na
função motora.
19
A identificação de produtos vegetais que atuem amenizando o processo
inflamatório desencadeado, reduzindo o excesso e produção anormal de muco
e/ou contribuindo para o relaxamento e diminuição da sensibilidade do músculo liso
das vias aéreas aos mediadores inflamatórios presentes, pode representar uma
alternativa terapêutica para o tratamento da asma.
20
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 ASPECTOS GERAIS SOBRE A ASMA
A asma é uma das doenças crônicas mais comuns em todo o mundo,
afetando mais de 300 milhões de pessoas, e sua prevalência está aumentando,
particularmente em países em desenvolvimento, com projeção para 2025 de cerca
de 400 milhões. Aproximadamente 250.000 mortes são atribuíveis à asma ocorrem
anualmente em nível mundial, sendo a maioria desses óbitos preveníveis
(BARNES, 2010; BRASIL, 2010; KUSCHNIR et al. 2016).
Tratando-se de Brasil, anualmente ocorrem cerca de 350.000 internações
por asma, constituindo-se na quarta causa de hospitalização pelo Sistema Único
de Saúde (SUS) (2,3% do total) e sendo a terceira causa entre crianças e adultos
jovens. Há registro de aumento desse número de internações entre 1993 e 1999 e
indícios de que a prevalência da asma esteja aumentando em todo o mundo,
inclusive no Brasil. Em 1996, os custos do SUS com internação por asma foram de
76 milhões de reais, 2,8% do gasto total anual e o terceiro maior valor gasto com
uma doença e em 2007 foi responsável por cerca de 273 mil internações, gerando,
para o SUS, custo aproximado de R$ 98,6 milhões. Um estudo multicêntrico
(International Study for Asthma and Allergies in Childhood – ISAAC) realizado em
56 países mostrou uma variabilidade de asma ativa de 1,6% a 36,8%, estando o
Brasil em 8º lugar, com uma prevalência média de 20% (BRASIL, 2010;
CONSENSO BRASILEIRO DA ASMA, 2002; SILVA, 2008).
Em estudo realizado em 2016 no Brasil, com adolescentes de todas as
regiões, foi observada uma prevalência média de asma ativa de 13,1% em
adolescentes de 12-17 anos, oscilando entre 6,3% em Teresina (capital do Piauí) e
16,7% em Campo Grande (capital do Mato Grosso do Sul), e com predominância
entre o sexo feminino em todos os estratos geográficos, variando 9,7% na região
Norte e 14,5% na Sudeste. Além disso, a prevalência média de asma
diagnosticada nos municípios de mais de 100 mil habitantes no Brasil foi 8,7%,
com variação de 6,9% na região Centro-Oeste até 13,5% na região Norte. Essa
diferença foi ainda mais acentuada entre as capitais, de 4,8% em Cuiabá a 19,8%
em Porto Alegre, porém sem diferença entre os sexos (KUSCHNIR et al. 2016).
21
A asma é uma doença inflamatória crônica dos pulmões e, de forma
gradativa, tem sido mais observada nos países desenvolvidos. É caracterizada por
episódios recorrentes de sibilo, falta de ar, aperto no peito e tosse, sendo condição
multifatorial determinada pela interação de fatores genéticos e ambientais. Em
indivíduos geneticamente susceptíveis, a exposição a uma grande variedade de
estímulos ambientais, tais como alérgenos (ácaros do pó, fungos, pólen de plantas
e pelos de animais), infecção (particularmente vírus), poluentes aerotransportados
(fumo do tabaco e partículas de diesel), estímulos físicos (exercício e ar frio) e
drogas (aspirina) podem induzir ou agravar a doença (BRASIL, 2010; HAMMAD,
LAMBRECHT, 2008).
A inflamação asmática é caracterizada por eosinofilia, infiltração de
mastócitos e ativação de células TH2 que produzem as interleucinas 4, 5 e 13 (IL-4,
IL-5 e IL-13). As mudanças estruturais, tais como hiperplasia de células
caliciformes das vias aéreas, hipertrofia e hiperplasia do músculo liso, juntamente
com fibrose subepitelial também estão presentes, mesmo na doença leve, embora
seja proeminente na doença grave (ADCOCK, CARAMORI, CHUNG, 2008).
Em homeostase, as células caliciformes produzem uma classe diferente de
mucinas, um gel-polimérico, denominadas MUC5AC e MUC5B. Além disso,
produzem mucinas e as armazenam no meio intracelular que podem ser facilmente
visualizadas em grânulos, ao passo que outras células produzem e secretam
imediatamente as mucinas (especialmente MUC5B), mas não têm grânulos
proeminentes. Sugere-se que no processo asmático há uma disfunção na
produção MUC5B e isso influencie na gravidade da asma. A produção de MUC5AC
está associada à mediação inflamatória e tem papel importante na asma, por
influenciar a metaplasia da mucosa sob estímulo de algumas citocinas,
principalmente IL-13 (ERLE, SHEPPARD, 2014; SONG et al., 2015).
Em alguns modelos experimentais de asma, pode-se demonstrar que as
células TH2 desempenham um papel predominante no curso da doença através da
indução de hiperplasia das células caliciformes e por causar hiperreatividade
brônquica. As células TH2 causam hiperreatividade brônquica por alterar a
excitabilidade das células da musculatura lisa, via liberação de IL-9 e IL-13,
induzindo broncoconstrição em resposta a vários estímulos não específicos
(HAMMAD, LAMBRECHT, 2008). Além disso, deve-se ressaltar o papel da IL-4 na
diferenciação de TH2, onde os estudos identificaram a linfopoetina do estroma
22
tímico (TSLP, sigla em inglês) como responsável pela imunidade mediada por TH2,
principalmente no que diz respeito ao desenvolvimento dos linfócitos. No entanto,
pode também ser produzida pelas células epiteliais em locais de inflamação
alérgica crônica (SOKOL et al., 2008).
Outro importante mediador na asma é a IgE que está envolvida,
principalmente, na hipersensibilidade. A IgE e mastócitos estão concentrados nos
tecidos da mucosa e isso permite que a IgE seja uma das primeiras moléculas de
defesa para o combate a um patógeno invasor. A característica de uma resposta
alérgica, mediada pelo complexo IgE-FcƐRI (receptor de IgE) em mastócitos, é de
hipersensibilidade imediata. A ativação desse complexo na superfície dos
mastócitos por alérgenos conduz, em minutos, para a chamada "fase precoce" da
reação alérgica que envolve a degranulação dos mastócitos e a síntese de
mediadores lipídicos. Ainda na “fase precoce” há liberação de citocinas e
quimiocinas que iniciam a "fase tardia", permitindo em algumas horas o
recrutamento e ativação de células inflamatórias em locais sensíveis ao alérgeno.
De forma semelhante, mas sem sintomas evidentes, alérgenos ativam as células
apresentadoras de antígenos (APC’s) sensibilizadas por IgE, o que promove a
produção de IgE pelas células B para a reposição da IgE consumida na reação
alérgica, mantendo os mastócitos e APC’s sensibilizadas (GOULD, SUTTON,
2008).
Existem divergências na literatura científica sobre a classificação da asma.
Alguns cientistas a classificam como uma doença pulmonar obstrutiva crônica
(DPOC), enquanto outros tratam a asma como uma enfermidade diferenciada. Isso
pode ser explicado, em parte, por características de mobilização das células
inflamatórias e mediadores secretados, como mostrado na Figura 1, mesmo que
exista uma correlação estrita com o fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) e a
amplificação da inflamação das vias aéreas (BARNES, 2008; BRASIL, 2010).
Pacientes que apresentam asma tem um aumento no número de células
T CD4+ nas vias aéreas com predominância para TH2, enquanto que em indivíduos
normais são encontradas TH1. Células TH2 promovem sua função no estímulo a
secreção das citocinas IL-4 e IL-13 que impulsionam a produção de IgE por células
B, além de IL-5 e IL-9, sendo a primeira responsável pela diferenciação de
eosinófilos na medula óssea e IL-9, atraindo e direcionando a diferenciação de
mastócitos. Por outro lado, na DPOC as células T CD4+ que se acumulam nas vias
23
respiratórias e pulmões são, principalmente, células TH1. As células TH1 expressam
o receptor de quimiocina CXCR3 e pode ser atraído para os pulmões através da
liberação de interferon gama (IFN-) induzida pelos ligantes CXCL9 (conhecido
como monoquina induzida por INF- ou MIG), CXCL10 (conhecido como proteína
10 induzida por INF- ou IP-10) e CXCL12 (conhecido como célula T
quimioatrativa induzida por interferon ou I-TAC) que se apresentam em níveis
elevados nas vias aéreas desses pacientes (BARNES, 2008).
Figura 1. Diferença histológica e imunológica entre asma e DPOC.
Evento Asma DPOC
Inflamação +++ +++
Músculo liso das vias aéreas
+++ +
Membrana basal ++ -
Fibrose + (subepitelial) +++ (peribronquial)
Rompimento alveolar - +++
Vasos das vias aéreas ++ Sem modificação
Mastócitos ++ Normal
Células dendríticas ++ Normal
Eosinófilos ++ Normal
Neutrófilos Normal ++
Linfócitos TH2 TH1
Epitélio Frequentemente
descamado Pseudoestratificado
Células caliciformes ++ ++ (+) representa intensidade da resposta e (-) representa a ausência da resposta.
Fonte: adaptada de BARNES, 2008.
Atualmente, existe o reconhecimento de que a asma represente uma
síndrome reversível, associada à inflamação das vias aéreas com várias
anormalidades pulmonares bioquímicas diferentes, sendo que os pacientes
24
apresentam diferenças específicas. Isso amplia os alvos moleculares para busca
de fármacos, para que haja tratamento eficaz e personalizado de acordo com os
marcadores apresentados (GASTON, 2011).
A asma, apesar de a literatura tentar ajustar seu conceito para uma
síndrome, tornou-se uma das doenças crônicas mais comuns nos países
industrializados e sua frequência deverá aumentar em todo o mundo durante a
próxima década, particularmente em países em desenvolvimento. Décadas atrás, a
asma foi vista como uma doença de broncoespasmo e tratada predominantemente
com broncodilatadores. No entanto, atualmente, é considerada como uma doença
inflamatória das vias aéreas, e o pilar de um tratamento moderno é a utilização de
fármacos como corticosteroides inalados (DIAMANT, BOOT, VIRCHOW, 2007;
BARNES, 2006, 2010).
A asma é uma doença altamente complexa, portanto, é pouco provável que
fármacos destinados a um único receptor ou mediador será eficaz. Os
corticosteroides são eficazes por inibirem os mecanismos inflamatórios. É possível
que um alvo chave no complexo processo inflamatório possa ser eficaz, tal como a
terapia anti-fator de necrose tumoral (anti-TNF) na artrite reumatóide. No entanto,
estes alvos são, geralmente, apenas identificáveis na clínica por prescrições
medicamentosas baseadas na tentativa e erro. Uma classificação seletiva de
medicamentos para pacientes com subtipos específicos de asma pode ser possível
no futuro com o desenvolvimento de biomarcadores e perfis genéticos observados
(BARNES, 2006).
Pesquisadores observaram no decorrer do tempo a existência de
componentes que alteravam a contractilidade do músculo liso das vias aéreas. Isso
permitiu surgir à hipótese do envolvimento de fatores derivados do epitélio na
mediação de eventos relaxantes ou contracturantes. Para as últimas décadas,
várias moléculas têm sido reconhecidas como fatores relaxantes/contráteis
derivados do epitélio, incluindo prostanoides, óxido nítrico (NO), adenosina
trifosfato (ATP) e endotelinas (RUAN, ZHOU, CHAN, 2011).
Os prostanoides podem atuar em diversos receptores específicos,
identificados a partir da ligação da substância endógena que promove atividade.
Por exemplo, prostaglandina D (PGD), E (PGE), F (PGF), I (PGI) e tromboxano
(TX), atuam nos receptores DP, EP, FP, IP e TP, respectivamente, sendo
25
responsáveis pelos efeitos relaxantes ou contracturantes, identificados a partir do
acoplamento da proteína G, como mostra a Figura 2 (RUAN, ZHOU, CHAN, 2011).
Figura 2. Atividade relaxante e contracturante de prostanoides sobre o músculo
liso das vias aéreas.
PLA2 = fosfolipase A2; COX = cicloxigenase; PG = prostaglandina; TX = tromboxano; DP = receptor
para prostaglandina D; IP = receptor para prostaglandina I; EP = receptor para prostaglandina E; FP
= receptor para prostaglandina F; TP = receptor para tromboxano; cAMP = monofosfato de
adenosina cíclico; Ca2+
= íon cálcio.
Fonte: adaptado de RUAN, ZHOU, CHAN, 2011.
A atuação nos receptores específicos podem promover a contração a partir
da ativação dos receptores acoplados a proteína Gq que permitem a atividade da
Célula epitelial
Fosfolipídeos
Ácido araquidônico
Relaxamento Contração
Célula do músculo
liso
26
fosfolipase C, metabolismo de fosfolipídios de membrana (inositol 4,5-
bifosfato-PIP2), com formação do inositol trisfosfato (inositol 1,4,5-trisfosfato-IP3) e
diacilglicerol (DAG) que permitirão um aumento nos níveis do cálcio intracelular e
ativação do mecanismo de contração. Por outro lado, a atuação em receptores
acoplados a proteína Gs permitem a atividade da adenilil ciclase (AC) que
metaboliza o ATP em adenosina monofosfato cíclico (AMPC), esse, por sua vez,
tem a capacidade de ativar uma proteína cinase (PK). A proteína cinase ativada
por AMPC(PKA) promove efeitos relacionados a redução do tônus da musculatura
lisa e relaxamento (BARNES, 2011; BRUTON, CHABNER, KNOLLMANN, 2012;
RUAN, ZHOU, CHAN, 2011).
2.1.1 Abordagem terapêutica da asma
A abordagem medicamentosa da asma se baseia, principalmente, na
utilização de corticosteróides inalados e agonistas β2-adrenérgicos de curta
(SABAS’s) e de longa duração (LABA’s), tal como preconizado pelas diretrizes para
atenção à doenças. No caso da rinite, agonistas α-adrenérgicos são usados para
aliviar congestão nasal, anti-histamínicos (H1) não-sedativos e corticosteróides
tópicos são as terapias de controle bem estabelecidas. Além disso, para tratar a
asma, existe a utilização de anticolinérgicos (antagonistas dos receptores
muscarínicos subtipo 3 - M3), inibidores da fosfodiesterase 4 (iPDE4), antagonistas
ou inibidores da produção de leucotrienos e diversos estudos estão sendo
conduzidos para regulação de mediadores e também da IgE que são importantes
no estabelecimento da fisiopatologia da asma (ADCOCK, CARAMORI, CHUNG,
2008; BARNES, 2010, 2011, 2012; GINA, 2016; HOLGATE, POLOSA, 2008).
Vários corticosteroides inalados estão disponíveis para uso clínico e todos
têm a eficácia clínica semelhante, porém existem diferenças do ponto de vista
farmacodinâmico, de modo que a exposição sistêmica pode ser diferente. Como os
pacientes com asma severa podem requerer doses mais elevadas de
corticosteroides inalados, existe uma vantagem no desenvolvimento de
corticosteroides sistêmicos que permitam uma menor probabilidade e possibilidade
de efeitos secundários, apesar de sua existência como sangramento nasal, dor de
cabeça e irritação local (HOSSNY et al., 2016; METERAN, BACKER, 2016). A
27
ciclesonida é um corticosteroide inalado, recentemente desenvolvido, e parece ter
menos efeitos secundários sistêmicos e efeitos locais, porque é um pró-fármaco
ativado nos pulmões em des-ciclesonida por esterases, sugerindo sua utilidade em
asma grave (BARNES, 2012).
Os broncodilatadores (agonistas 2-adrenérgicos) também são utilizados na
terapêutica, isolados ou em associação aos corticosteroides inalados. São
essenciais no tratamento da asma, pois aliviam e previnem a broncoconstrição.Os
SABA’s são comumente usados em crises agudas da asma e tem grande
influência sobre a terapêutica.Os LABA’s, salmeterol e formoterol, são
considerados um grande avanço no tratamento da asma grave e geralmente são
administrados através de inaladores em combinação com corticosteroides. No
entanto, existem estudos com fármacos agonistas 2-adrenérgicos com posologia
de uma vez ao dia, chamados “ultra-LABA’s” (indacaterol, usado em alguns países
para DPOC, carmoterol, vilanterol e olodaterol). Isso pode ser importante, pois a
dose do corticosteroide permanece fixa, reduzindo alguns efeitos
adversos/secundários (BARNES, 2010, 2011, 2012; GINA, 2016).
Ainda se tratando de broncodilatação, os antagonistas muscarínicos podem
ser utilizados, porém apresentam baixa eficácia, já que inibem uma parte da
broncoconstrição, enquanto que os agonistas 2-adrenérgicos regulam os diversos
mecanismos contracturantes, inclusive os que envolvem a histamina, leucotrienos
D4 (LTD4) e prostaglandinas D2 (PGD2). Apesar dessas evidências, estudos
realizados em animais demonstraram um papel importante dos mecanismos
colinérgicos na resposta ao alérgeno inalado em cobaias sensibilizadas,
demonstrando que o antagonista muscarínico de longa duração (LAMA), conhecido
como brometo de tiotrópio (dissocia rapidamente dos receptores M2, enquanto se
dissocia lentamente dos receptores M3), bloqueia completamente a resposta tardia
em animais não anestesiados (BARNES, 2010, 2011, 2012; BEFEKADU,
ONOFREI, COLICE, 2014; BULKHI, TABATABAIAN, CASALE, 2016). Essa
resposta é também bloqueada por drogas que são antagonistas do transient
receptor potential channel ankyrin 1 (TRPA1), um canal iônico que pode ser
encontrado nos nervos sensoriais localizados nas vias aéreas, sugerindo que os
alérgenos induzem a liberação de um mediador (ainda não identificado) que ativa
TRPA1, levando à broncoconstrição colinérgica reflexa (BARNES, 2012). Além
28
disso, existem achados que mostram a ativação dos receptores muscarínicos por
acetilcolina liberada a partir de células não neuronais, tais como células epiteliais e
inflamatórias, sendo que o brometo de tiotrópio também consegue regular esse
mecanismo (BARNES, 2010, 2011; BEFEKADU, ONOFREI, COLICE, 2014;
BULKHI, TABATABAIAN, CASALE, 2016).
Os iPDE4, como roflumilaste e cilomilaste, previnem a inflamação
eosinofílica em sensibilizados com ovalbumina de forma semelhante a budesonida
(corticosteroide). Além disso, os iPDE4 são capazes de suprimir a inflamação
neutrofílica e exercer efeitos anti-inflamatórios distintos em comparação com os
observados com corticosteroides, sugerindo que os inibidores de PDE4 podem ser
úteis no tratamento da asma grave. A atividade imunossupressora dos iPDE4 na
asma envolve a inibição da produção de citocinas, mediadores pró-inflamatórios,
redução ou inibição da migração de eosinófilos, e a mitigação da degranulação. Os
compostos também podem modificar a capacidade de remodelação das vias
aéreas e reduzir a hiperplasia da musculatura lisa, a atividade pró-inflamatória das
células epiteliais e exsudação de plasma que pode levar aoedema (ADCOCK,
CARAMORI, CHUNG, 2008; BARNES, 2010).
Em estudo com humanos, cilomilaste causou pequenas melhorias no
volume de expiração forçada em 1 segundo (FEV1) em 6 semanas, embora este
efeito fosse perdido em 12 meses.De forma diferente, o roflumilaste (500 µg por
dia) produziu grandes efeitos e melhorias no FEV1, fluxo de pico pela manhã e à
noite e os sintomas da asma durante 12 semanas semelhantes, quando
comparados aos observados com beclometasona 400 μg (ADCOCK, CARAMORI,
CHUNG, 2008). Além disso, recentemente o roflumilaste promoveu redução da
hiperresponsividade das vias aéreas, inflamação, reduziu a hiperplasia das células
caliciformes e a fibrose pulmonar, sendo os dois últimos parâmetros de
remodelamento das vias aéreas, em protocolo experimental de asma crônica (KIM
et al., 2016). Interessante ressaltar que em estudos envolvendo seres humanos,
mostra-se uma possibilidade de efeitos adversos com baixa gravidade e incidência,
porém isso não afeta os benefícios para pacientes com asma e, principalmente, os
com DPOCs (CHERVINSKY et al., 2015).
Os antagonistas do receptor de leucotrieno (LTRA), por exemplo,
montelucaste, melhoram a função pulmonar e sintomas de asma em pacientes com
asma leve a moderada, mas são menos eficazes do que corticosteróides inalados.
29
Além disso, esses agentes são menos eficientes na asma severa, embora um
estudo recente sugira que eles podem ser benéficos em pacientes asmáticos
fumantes, mostrando-se mais efetivos do que os corticosteroides quando
comparados a pacientes não fumantes (PRICE et al., 2013). O inibidor da
5-lipoxigenase, zileutona, bloqueia a síntese de leucotrienos e leucotrieno B4
(LTB4) que atua nos receptores BLT1 e tem efeito quimioatraente para neutrófilos,
eosinófilos, monócitos e macrófagos, fornecendo uma eficácia semelhante ao
montelucaste na asma. A inibição dos receptores BLT2 mostrou-se interessante,
pois estão em excesso nos mastócitos, em pacientes asmáticos, e podem mediar a
produção de células TH2. Estudos relatam que a combinação de LTRA com
corticosteroides inalatorios permite uma melhora clínica aos pacientes asmáticos,
porém em menor proporção do que LABAs e corticosteróides (ADCOCK,
CARAMORI, CHUNG, 2008; BARNES, 2011; DUCHARME, LASSERSON, CATES,
2011).
Observando que a asma tem uma condução por células TH2 e que algumas
citocinas mediam essa resposta, foram desenvolvidos fármacos que inibem,
principalmente, IL-4, IL-5 e IL-13. O desenvolvimento de um inibidor da IL-5 não
apresentou benefícios para pacientes asmáticos, visto que houve efeito apenas na
regulação eosinofílica, o que pode ser benéfico para pacientes que tenham níveis
elevados dessa citocina, como observado na síndrome hipereosinofílica. Já os
estudos com um receptor solúvel recombinante humano da IL-4 (altrakincept) em
pacientes com asma leve a moderada mostraram alguma eficácia em manter o
controle da doençaquando corticosteroides inalados foram retirados, mas este
efeito não foi posteriormente confirmadoe a continuidade dos estudos de
desenvolvimento desse fármaco foram interrompidos.Os estudos envolvendo a IL-
13 são promissores, no entanto, promovem resistência aos corticosteroides, sendo
apropriados para asma severa (ADCOCK, CARAMORI, CHUNG, 2008; BARNES,
2010, 2012; BORISH et al., 2001).
Estudos clínicos sugerem que a utilização de um inibidor do receptor da IgE,
conhecido como omalizumabe, reduz a dose de manutenção dos corticosteroides
utilizados no tratamento, principalmente em asma severa. O omalizumabe pode
causar apoptose de células B que foi exposta ao complexo de IgE na membrana,
sendo improvável, no entanto, afetar outras células do plasma que expressam
pouco IgE na membrana. Além disso, ensaios clínicos já mostraram, de forma
30
consistente, uma redução de 50% no número de exacerbações asmáticas e quase
eliminação das exacerbações sazonais, em crianças. Enquanto a tendência de
indivíduos alérgicos expressarem respostas de células TH2 nos seus órgãos-alvo
persiste, há também o risco de recaída se o tratamento com o anticorpo (ou um
inibidor de molécula pequena) é interrompido ou suspenso. Os ensaios clínicos
combinando imunoterapia para alcançar o desvio imune de tipo TH2 para as
respostas do tipo TH1, com omalizumabe, representam um desenvolvimento
interessante (BARNES, 2012; DUNICAN, FAHY, 2015; GOULD, SUTTON, 2008).
Sabendo da importância da asma para uma extensa parcela da população
mundial, Shakeri e Boskabady (2015) revisaram na literatura plantas medicinais
que promoveriam efeito relaxante em músculo liso de traqueia, observando o
mecanismo de ação, eficácia e potência, parâmetros pré-clínicos importantes
naprospecção de plantas medicinais que possam ser utilizadas no tratamento da
asma ou mapeamento de substâncias químicas com relevância terapêutica.
Os estudos mostram que plantas medicinais ou seus derivados tem efeito
sobre a musculatura lisa traqueal, podendo mimetizar algum problema respiratório,
dada as devidas proporções, pois são testadas em roedores e participam da fase
pré-clínicas dos estudos envolvendo a obtenção de medicamentos, porém são
indicativos de atividade.
2.2 ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E ANTIASMÁTICA DE ÓLEOS ESSENCIAS
As propriedades farmacêuticas de plantas aromáticas são parcialmente
atribuídas aos óleos essenciais, termo que foi usado pela primeira vez no século 16
por Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus von Hohenheim ou Paracelso,
nomeando o componente efetivo de uma droga com o nome de “Quinta essencial".
Em meados do século 20, o papel dos óleos essenciais tinha se reduzido ao uso em
perfumaria, cosméticos e aromas alimentares, enquanto a utilização em preparações
farmacêuticas tinha declinado (EDRIS, 2007).
A definição de um óleo essencial exclui outros produtos aromáticos ou
voláteis obtidos por diferentes técnicas extrativas, como a extração com solventes,
extração com fluido supercrítico, CO2 supercrítico e extração assistida por
microondas. Os óleos essenciais são extremamente complexos na composição
31
devido à presença de substâncias químicas altamente funcionalizadas que estão
classificados em duas classes químicas distintas: terpenoides e fenilpropanoides,
sendo isolados cerca de 55.000 isoprenoides ou terpenoides, com também são
conhecidos. Os terpenoides são extremamente variáveis, mostrando diferentes
esqueletos de carbono e uma grande variedade de derivados oxigenados, incluindo
álcoois, ésteres, aldeídos, cetonas, éteres, peróxidos e fenóis (MAFFEI, 2010;
REHMAN et al. 2016; TONGNUANCHAN, BENJAKUL, 2014; ZUZARTE,
SALGUEIRO, 2015).
Os óleos essenciais podem ser utilizados em inúmeros testes
farmacológicos, inclusive a sua volatilidade e lipofilicidade admitem a permeação
nos mais diversos sistemas, permitindo o uso para atividade espasmolítica e
antiasmática, por exemplo, o que pode influenciar na escolha desse produto natural
para o desenvolvimento de medicamentos. Na Tabela 1 estão elencados estudos
que envolvem a utilização de óleos essencias no tratamento de doenças
pulmonares (no período de 2001 até 2016), relacionando os aspectos
espasmolítico, sobre a inflamação pulmonar e expectoração.
32 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica.
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50
ou CI50 Referências
Angelicae sinensis Raiz - Asma induzida por OVA em ratos 40-160 mg/kg Wang et al.,
2015
Artemisia marítima -
1,8-Cineol (41,14%);
L-(-)-Canfora
(20,32%)
Atividade espasmolítica em
traqueia isolada de cobaia
410 µg/mL
(CCh)
520 µg/mL (K+)
Shah et al.,
2011
Aster tataricus Raízes e
Rizoma
(R)(-)-p-ment-1-en-4-
ol, 2-undecanona,
ácido undecanoido, (-
)-espatulenol,
hexahidroarnesil
acetona, ácido
hexadecanoico, cis-9,
cis-12-ácido
octaecadienoico e 1-
acetoxi-2-ene(E)-4,6-
decandiina
Atividade expectorante a partir da
secreção traqueal do vermelho
de fenol em camundongos
- Yang et al.,
2008
Atractylodes
macrocephala Rizoma
Atractilona (26,3%)
-panasiseno
(6,98%)
Atividade expectorante a partir da
secreção traqueal do vermelho
de fenol em camundongos
1,95 g/kg
(Intragástrica)
Wang et al.,
2016
33 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Boswellia carterii -
Acetato de octil
(35,1%)
1-octanol (21,5%)
-ocimeno (13,1%)
Tosse induzida por
ácido cítrico em ratos
0,004 e 0,008
cc/kg Taha et al., 2016
Boswellia sacra - -
Asma e
hiperresponsividade das
vias aéreas induzida por
OVA em camundongos
0,3 % (Inalação)
Lee, Yun, Kang,
2008
Lee, Kim, Kang,
2010
Carum copticum Sementes Carvacrol e Timol
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
cobaia
0,1; 0,2 e 0,4 mL
(frações do óleo
essencial)
Boskabady,
Ramazani, Tabei,
2003
Conyza bonariensis Partes
aéreas
Limoneno (45%)
trans--ocimeno
(13%)
trans--farneseno
(6,6%)
Germacreno D
(6,4%)
Pleurisia induzida por
zymosan em
camundongos
100 mg/kg (via
oral) Souza et al., 2003
34 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Croton
nepetaefolius -
1,8-cineol (25%)
Metileugenol (14,9%)
Biciclogermacreno
(11%)
Xantoxilina (10,1%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
cobaias sensibilizadas
ou não por OVA e
células musculares lisas
4,3 µg/mL (basal)
113,0 µg/mL e
128,8 µg/mL (K+)
123,9 µg/mL
(Hist)
102,5 µg/mL
(CCh)
300 e 600 µg/mL
(OVA)
Magalhães et al.,
2003
Croton sonderianus
(OE-13) Folhas
Biciclogermacreno
(16,29%)
-felandreno
(15,42%)
-cariofileno
(13,82%)
-pineno (9,87%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
ratos
62,3±10,7 µg/mL
(K+)
518,97±215,3
µg/mL (ACh)
Pinho-da-silva et
al., 2010
35 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Croton sonderianus
(OE-21) Folhas
Espatulenol
(18,32%)
-cariofileno
(14,58%)
Óxido de cariofileno
(8,54%)
1,8-cineol (8,38%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
ratos
235,47±55,1
µg/mL (K+)
708,37±171,0
µg/mL (ACh)
Pinho-da-silva et
al., 2010
Eucalyptus
tereticornis -
1,8-cineol (74,6%)
-pineno (7,8%)
-pineno (7,4%)
Atividade
espasmolíticaem
traqueia isolada de ratos
260,5µg/mL (K+)
100 e 300
µg/mL(ACh)
Lima et al., 2010
Gerbera
piloselloides Raíz
6-acetil-2,2-dimetil-
8(3-metil-2-butenil)-
2H-cromene
(60.077%)
Óxido de cariofileno
(21,14%)
-cariofileno
(15,16%)
Atividade antitussígena
e expectorante
2g/kg
(Intragástrico) Tang et al., 2003
36 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada Componentes majoritários
Modelo
experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Lavandula
angustifólia Folha
Acetato de linalil (31,78%)
Linalol (25,56%)
Atividade
antiasmática e
resistência
pulmonar induzida
por OVA em
camundongos
5-20 µL (inalação) Ueno-iio et al.,
2014
Lippia dulcis Partes
aéreas
Cânfora (32,62±0,18%)
Hernandulcina
(10,1±0,88%)
Atividade
espasmolítica em
brônquios isolado
de porcos
100 µg/mL (CCh e
Hist)
50 µg/mL (Hist)
Görnemann et
al., 2008
Lippia thymoides Folhas
Outono: -cariofileno
(17,22%) e Cânfora (8,61%)
Inverno: -cariofileno
(26,27% e Germacreno
D(6,18%)
Primavera: -cariofileno
(21,20%) e Borneol (7,36%)
Verão: -cariofileno
(19,28%) e Borneol (6,46%)
Atividade
espasmolítica em
traqueia isolada de
cobaia
729 µg/mL (CCh)
Emáx = 60% de
relaxamento
Silva et al., 2016
37 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Mentha piperita - Mentol (49,97%)
Mentona (19,08)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
ratos
106,33 ± 15,46
µg/mL (CCh) Sousa et al., 2010
Mentha pulegium - Pulegona (70%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
ratos
40,5 ± 3,3 µg/mL
(K+)
96,2 ± 20,3 µg/mL
(ACh)
Soares et al.,
2012
Nepeta cataria -
1,8-cineol (21%)
-humuleno (14,4%)
-pineno (10,43%)
Acetato de geranil
(8,21%)
Atividade espasmolítca
em traqueia isolada de
cobaia
0,05 ± 0,14
mg/mL (CCh)
0,08 + 0,10
mg/mL (K+)
Gilani et al., 2009
Ocimum
micranthum -
E-metil cinamato
(33,6%)
Limoneno (12,9%)
Carvona (9,6%)
-cariofileno (8,03%)
Linalol (7,2%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
ratos sensibilizados, ou
não, com OVA
142,4 µg/mL(K+)
72,1 µg/mL(CCh)
30 e 100 µg/mL
(K+ e CCh) para
animais
sensibilizados ou
não com OVA
Pinho et al., 2012
38 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Phellolophium
madagascariensis
Partes
aéreas
Limoneno (58,5%)
Sabineno (30,25%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
cobaias
100 µL Andriamanantoanina et
al., 2006
Piper betel Folha -
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada e
atividade
broncorelaxante em
cobaias
100 µg/mL (Hist)
100-200 mg/kg
(Broncoconstrição
induzida por Hist)
Hajare et al., 2011
Pistacia
integerrima Galhos
4-carvomentenol
(17,06%)
Acetato de levo-
bornil (13,99%)
L-terpinen-4-ol
(11,93%)
Cimeno (11,54%)
Tetrahidrocarvona
(10,27%)
Borneol (8,90%)
Inflamação bronquial
induzida por LPS em
ratos e
broncoconstrição
induzida por OVA em
cobaias
7,5, 15 e 30 mg/kg Shirole et al., 2014
39 Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Pterodon
polygalaeflorus Sementes
trans-cariofileno
(20,6%)
Espatulenol (16,6%)
-copaeno (10,4%)
-muroleno (8,1%)
-elemeno (8,0%)
-humuleno (7,7%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
ratos
750,5 µg/mL
(5-HT)
379,8 µg/mL(K+)
Evangelista et al.,
2007
Rosmarinus
officinalis Folhas
Mirceno (24,6%)
1,8-cineol (19,8%)
Ácido fenilacético
(10,3%)
2-etil-4,5-dimetilfenol
(6,5%)
Pleurisia induzida por
carragenina em ratos
500 mg/kg (via
oral)
Takaki et al.,
2008
Thymus vulgaris - Timol (51%)
1,8-cineol (8,4%)
Tosse induzida por
ácido cítrico em ratos 0,1 e 0,2 cc/kg Taha et al., 2016
40
Tabela 1. Óleos essenciais com atividade antiasmática e/ou espasmolítica (Continuação).
Planta Parte
utilizada
Componentes
majoritários Modelo experimental
Dose e CE50 ou
IC50 Referências
Xylopia
langsdorfiana Folhas
Germacreno D
(22,9%)
trans--guaieno
(22,6%)
-cariofileno (15,7%)
-pineno (7,3%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
cobaia
243 µg/mL (Emáx) Correia et al.,
2015
Zingiber officinale Rizomas Citral (62,4%)
Eucaliptol (6,9%)
Atividade espasmolítica
em traqueia isolada de
ratos
120 ± 17 µg/mL
(CCh)
Mangprayool,
Kupittayanant,
Chudapongse,
2013
(-) representa ausência de informações sobre esse aspecto; OVA = ovalbumina; CE50 = concentração que promove 50% do efeito máximo; IC50 =
concentração que promove inibição em 50% do efeito máximo; CCh = Carbacol; ACh = Acetilcolina; K+ = excesso de potássio; Hist = Histamina; 5-HT =
Serotonina; Emáx = Efeito máximo.
Fonte: Próprio autor.
41
2.3 GÊNERO Lippia e Lippia origanoides Kunth.
O gênero Lippia é um dos mais importantes da família Verbenaceae,
compreendendo cerca de 200 espécies com ampla distribuição nos neotrópicos,
apresentando maior riqueza de espécies na América do Sul, com poucos
exemplares endêmicos da África, sendo que no Brasil pode ser encontrada nos
biomas Amazônia, Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica e Pampas (PASCUAL et al.,
2001; SALIMENA; MULGURA, 2015; SOUZA; LORENZI, 2005).
Do ponto de vista morfológico, se caracteriza por:
Apresentar plantas arbustivas ou subarbustivas, com folhas decussadas, geralmente com indumento glandular, florescências parciais capituliformes ou espiciformes, congestas, axilares, brácteas membranáceas ou cartáceas, verdes ou coloridas, amarelas, róseas ou vináceas, ultrapassando ou não o comprimento das flores; flores sésseis, cálice comprimido, 2-alado, induplicado, membranáceo, inconspícuo, persistente no fruto; corola hipocraterimorfa, alva, rósea, magenta, lilás ou amarelas, tubo reto ou curvo, limbo 4-5 lobado, lábio superior ou adaxial 2-lobado, lábio inferior ou abaxial único, 2 lobos laterais; estames 4; ovário monocarpelar, bilocular, 2-ovulado, estigma lateral. Fruto dividido na maturidade em dois mericarpos (TRONCOSO, 1974).
Várias espécies de Lippia são usadas pela medicina popular devido a suas
propriedades terapêuticas, principalmente para doenças do sistema respiratório,
como gripe, tosse, bronquite e asma. Entretanto, também são relatados usos como
analgésicos, antinflamatório, antipirético, antidiarreico, tratamento de doenças de
pele, do trato gastrintestinal e urinário, bem como ações sobre o sistema nervoso
central. As plantas desse gênero são caracteristicamente aromáticas,
apresentando os óleos essenciais ricos em limoneno, β-cariofileno, p-cimeno,
cânfora, linalol, α-pineno e timol (PASCUAL et al., 2001).
No nordeste brasileiro, as espécies de Lippia são usadas na medicina
popular para o tratamento de resfriados, gripes, bronquites e tosse. Na maioria das
vezes, as partes empregadas são as folhas e flores na forma de infusão ou decocto
administradas oralmente ou através de emplastos (MESA et al., 2009).
Os estudos sobre os efeitos farmacológicos das espécies de Lippia são
concentrados, principalmente, nos óleos essenciais de poucas espécies, como
42
L. alba, L. sidoides e L. gracilis. Assim, para L. alba foi descrito atividade
antimicrobiana (SENA FILHO et al., 2006), antiulcerogênica (PASCUAL et al.,
2001) e sedativa (ZÉTOLA et al., 2002); L. sidoides apresentou efeitos
antihelmíntico (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2007), antimicrobiano
(BOTELHO et al., 2007), antifúngico (FONTENELLE et al., 2007), anti-inflamatório,
gastroprotetor (MONTEIRO et al., 2007) e cicatrizante (PASCUAL et al., 2001),
L. gracilis apresentou efeitos antimicrobiano (ALBUQUERQUE et al., 2006;
PEDRO, 2008) e analgésico e anti-inflamatório (GUIMARÃES et al., 2012;
MENDES et al., 2010).
Uma das espécies do gênero Lippia com interesse farmacológico é a
Lippia origanoides Kunth que possui ampla distribuição, ocorrendo da Guiana até o
norte da Argentina na América do Sul e na América Central (O’LEARY et al. 2012).
Encontra-se como um arbusto aromático ou pequena árvore de 3 m de altura,
nativa da América Central e do norte da América do Sul, sendo conhecida,
popularmente, como “alecrim-d’angola”, “alecrim pimenta”, “orégano”, “salva-do-
marajó”, com utilização em temperos e na medicina tradicional para afecções
gastrointestinais, respiratórias, infecções da garganta, gastroentéricas, da pele e
couro cabeludo, além de ser usado como analgésico, sedativo e expectorante
(COSTA et al., 2001; COSTA, 2006; MARTINS et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2007;
VICUÑA, STASHENKO, FUENTES, 2010).
São utilizadas, normalmente, as partes aéreas de L. origanoides, com as
folhas apresentando cerca de 4% de óleo essencial, produto natural utilizado em
amplos testes farmacológicos (COSTA, 2006). A composição química do óleo tem
cerca de 60% de timol ou uma mistura de timol e carvacrol, ambos agentes
antimicrobianos, além de outros componentes químicos como flavonoides e
quinonas (LORENZI; MATOS, 2002).
A L. origanoides é alvo de extensos estudos na literatura científica,
principalmente, nas áreas de química e farmacologia, com os dados apresentados
no Quadro 2, onde mostra a parte da planta utilizada, a composição química,
atividade farmacológica e dose ou concentração utilizada no experimento, obtidos
a partir da análise de artigos obtidos nas principais bases de dados, indexados no
período de 2007 até 2016.
43 Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides.
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade
farmacológica Dose ou Concentração
Autores / ano de
publicação
Partes aéreas (óleo essencial) – 3 amostras
A1 – Carvacrol (27,36%), o-cimeno (26,73%) e
timolmetileter (12,77%) A2 - Carvacrol (33,02%) e
o-cimeno (19,00%) A3 - o-cimeno (30,96%),
Carvacrol (26,60%), e timolmetileter (12,61%)
Atividade antimicrobiana por difusão em disco e
microdiluição e toxicidade aguda e crônica em ratos
MIC = 120 µL/mL (Staphylococcus aureus,
Ehcerichia coli e Salmonella cholerasuis).
Possíveis alterações hepáticas a 60 mg/kg
(agudo). Possíveis alterações
eritrocitárias a 120 mg/kg (crônico)
Andrade et al., 2014
Folhas (oleo essencial)
Timol (73,7%), ϱ-cimeno (10,6%)
Atividade antioxidante a partir da captação do
DPPH e ensaio do ABTS
EC50 = 5,58 ± 0,035 mg AEO/mL DDPH
TEAC = 1,16 ± 0,5 mg/mL
Arango et al., 2012
Folhas (Extratos etanólico, hexânico, diclorometânico e acetato de etila)
F. Hexano – Timol (38,67%) e Carvacrol
(36,17%) F. Diclorometano –
Narigenina forma enólica (15,56%) e Narigenina forma cetona (10,4%)
F. Acetato - Isomaltulose (16,37%), Catequina
(11,61%) e Ácido protocatecuico (9,68%)
Atividade antibacteriana através de microdiluição
e modulação da atividade antibiótica
MIC 1024 µg/mL (S. aureus).
As frações hexânica e diclorometânica
apresentaram sinergia com neomicina e amicacina na
concentração de 128 µg/mL
Barreto et al., 2014
44
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Folhas (extrato etanólico) – 4
frações
LODCM – Narigenina (15,56%);
Atividade antibacteriana contra S. aureus e E. coli com e sem exposição à luz UV-A (400-315 nm),
por difusão em disco
O diâmetro da zona de inibição para S. aureus
passou de 7 mm (no escuro) para 9.7 mm (na luz UV-A) com a fração diclorometano e de 6
para 7 mm com o extrato etanólico (10 µL por
disco)
Barreto et al., 2014
Partes aéreas (óleo essencial)
Carvacrol (37,3%), Timol
(22,4%) e -terpineno (10,9%)
Atividade antimicrobiana por ensaio de
microdiluição com cepas clínicas de S. aureaus meticilina resistentes
MIC 1024 μg/mL Barreto et al., 2014
Partes aéreas (óleo essencial)
Timol (78,7%)
Atividade antibacteriana por determinação da
concentração bactericida mínima
MBC = 0,098 mg/mL (S. enteriditis),
0,780 mg/mL (E. coli), 1,560 mg/mL
(S. typhimurium) e 3,125 mg/mL
(L. acidophillus)
Betancourt et al., 2012
45
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/
Produto natural
Composição química Atividade
farmacológica Dose ou Concentração
Autores / ano de publicação
Folhas e caules (óleo essencial)
– 9 amostras
1A – Carvacrol (36,5%), ρ-cimeno (13,9%) e
-terpineno (13,2%) 2B - ρ-cimeno (15,7%)
e trans--cariofileno (9,4%)
3C – Timol (54,5%) e ρ-cimeno (10,0%)
4D - trans--cariofileno (11,3%) e ρ-cimeno
(11,2%) 5E – Carvacrol (46,2%)
e ρ-cimeno (12,0%) 6F – Timol (59,7%) e
Carvacrol (12,2%) 7G - Timol (43,8%), Carvacrol (17,3%) e ρ-cimeno (12,1%)
8H - Timol (53,6%) e ρ-cimeno (11,5%)
9I – Carvacrol (38,8%), Timol (15,1%),
-terpineno (12,6%) e ρ-cimeno (11,5%)
Teste de susceptibilidade
antifúngica (Candida albicans) e atividade
citotóxica em células de Cercopithecus aethiops
(Vero cell line ATCC CCL-81)
CC50 = 29.3±4.8 (5E) MIC = 157,5; 198,4 e
125,0 µg/mL(Candida parapsilosis, C. krusei e Aspergillus flavus) –
3C; MIC = 125,0 µg/mL (Aspergillus flavus) – 8H; MIC = 31,0 µg/mL (A. fumigatus) – 7G
Betancur-Galvis et al., 2011
46
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Não informado (óleo essencial)
Carvacrol (37,3%), timol
(22,4%) e -terpineno (10,9%)
Atividade tripanocida in vitro nas formas
epimastigota, tripomastigota e
amastigota de T. cruzi e efeito citotóxico em
células de mamíferos (macrófagos peritoneais de camundongos Balb/c)
O valor de CI50 contra epimastigotas e
amastigotas foi de 26,2 e 29,8 µg/mL,
respectivamente. Contra tripomastigotas a CL50
foi de 39,7 µg/mL. CC50 = 175,7 µg/mL
Borges et al., 2012.
Não informado (óleo essencial)
-
Atividade antirrelepente frente à Ulomoides
dermestoides e inibidor Quorum sensing (QS)
25 µg/mL (4 horas de exposição)
Cervantes-Ceballos, Caballero-Gallardo, Olivero-Verbel, 2015
Folhas e inflorescências (óleo essencial)
Carvacrol (49,7%) e p-cimeno (13,3%)
Atividade antiparasitária contra
Rhipicephalus microplus (carrapato-de-boi) com avaliação da eficiência reprodutiva de fêmeas ingugitadas através de
teste de imersão e sensibilidade das larvas
no papel impregnado
Para a maior concentração testada (25 mg/mL), o valor da
eficiência reprodutiva foi de 49 e a eficácia foi
39% no teste de imersão. Os valores das
concentrações letais foram 3,08 mg/mL (CL50)
e 8,44 mg/mL (CL90) para larvas de
R. microplus no teste do papel impregnado
Chagas et al., 2016
47
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Folhas (óleo essencial)
Timol (64,1%), m-cimeno
(9,1%) e -terpineno (7,3%)
Atividade antimicrobiana usando a técnica de disco de difusão e pelo método
da diluição
MIC e MFC = 250 µg/mL (A. niger), 2000 µg/mL (S. aureus,
E. coli, S. sonnei, Pseudomonas sp.) e
4000 µg/mL (E. faecalis, B. subtilis, S. thyphimurium)
Chataing et al., 2012
Partes aéreas (extrato
hidroalcoólico) Narigenina
Atividade hipotensora em ratos (intravenosa e oral) e toxicidade oral aguda
Redução da pressão arterial média e frequência cardíaca
50 mg/kg (intravenoso) e 100 e 200 mg/kg (oral)
DL50 2.000 mg/kg
Coelho et al., 2015
Partes aéreas (óleo essencial)
– 6 amostras
A1- Carvacrol (46,2%), p-
cimeno (12,0%) e -terpineno (9,5%); A2 – Carvacrol (36,5%), p-
cimeno (13,9%), -terpineno (13,2%) e timol (9,2%); A3 - p-cimeno (15,7%), trans-β-
cariofileno (9,4%) e limoneno (6,9%); A4 –
Timol (53,6%), p-cimeno
(11,5%) e -terpineno (6,3%); A5 – Carvacrol
(38,8%), timol (15,1%), -terpineno (12,6%) e p-
cimeno (11,5%); A6 - Trans-β-cariofileno (11,3%), p-
cimeno (11,2%) e α-felandreno (9,9%)
Atividade antiparasitária contra formas livres e
intracelulares de L. chagasi e T. cruzi e
citotoxicidade em células Vero e THP-1.
CI50 9,9 (A1), 19,2 (A2), 40,1 (A3), 10,7 (A4), 32,8 (A5) e 7,8
(A6) µg/mL para a forma epimastigota de T. cruzi. Para os amastigotas de T. cruzi os valores foram 50,5 (A1), 77,5 (A2), >100 (A3), >100 (A4), 53,0 (A5) e 94,4 (A6) µg/mL. Contra L. chagasi os valores foram 13,7 (A1), 63,2 (A2),
>100 (A3), 4,4 (A4), 16,0 (A5) e >100 (A6) µg/mL. Os óleos
não foram considerados citotóxicos
Escobar et al., 2010
48
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Folhas e inflorescências (óleo essencial)
Carvacrol (49,7%), p-
cimeno (13,3%) e -terpineno (4,5%)
Atividade antimicrobiana por microdiluição
O valor de MIC e MBC foi de 2500 µg/mL-1 contra Aeromonas
hydrophila para 100 μL de óleo essencial diluído
Majolo et al., 2016
Não informado (óleo essencial)
Carvacrol (44,0%), timol
(15,0%) e -terpineno (10,0%)
Efeito inibitório in vitro do óleo essencial na
replicação do vírus da febre amarela e
citotoxicidade em células Vero
O valor de CC50 foi de 98 ± 3,8 µg/mL nas
células Vero. Valor de MIC do óleo essencial para o vírus da febre
amarela foi 3,7 μg/mL. A razão CC50/MIC é de
26,4 μg/mL
Meneses et al., 2009
Caules e folhas (Óleo essencial)
Carvacrol (46,2%); Timol
(9,9%) e -terpineno (9,5%)
Atividade larvicida e adulticida frente à Aedes
aegypti
CL99 = 88,8 ppm (larvicida)
CL99 = 1.054 ppm (adulticida)
Muñoz, Staschenko, Ocampo, 2014
Folhas (óleo essencial)
Carvacrol (44,4%), timol
(14,3%), -terpineno (10,0%) e p-cimeno
(9,5%)
Atividade antioxidante ou antiradicalar in vitro por meio do método ABTS
modificado e da oxidação do ácido linoleico através
da quantificação do hexanal
O valor de TAA foi de 2040 ± 21 (6 minutos) e
4500 ± 337 (30 minutos). O efeito protetor foi de 77 ± 5% (inibição da
peroxidação)
Muñoz-Acevedo; Kouznetsov; Stashenko,
2009
49
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Partes aéreas (óleo essencial)
Carvacrol (38,6%), timol (18,5%) e p-cimeno
(10,3%)
Atividade antimicrobiana pelo método de difusão
em ágar
Uma gota do óleo (10 μL) devidamente
diluído em água e Tween gerou halos de inibição de 27, 40, 35, 24, 30, 40, 25, 20 e 26
mm de diâmetro em culturas de C. albicans,
C. guilliermondii, C. parapsilosis, C. neoformans,
T. rubrum, F. pedrosoi, S. aureus, L. casei e S.
mutans, respectivamente
Oliveira et al., 2007
Partes aéreas (extrato etanólico)
-
Atividade nociceptiva em modelo experimental de contorções abdominais
induzidas por ácido acético, teste da formalina
e teste da placa quente em camundongos Swiss
machos
O pré-tratamento com a dose de 10mg/kg (menor testada) já resulta numa inibição significante das
contorções e da resposta induzida pela
formalina. Na placa quente são observados efeitos antinociceptivos intermediários com a
dose de 30mg/kg
Oliveira et al., 2014
Não informado (óleo essencial)
- Atividade repelente contra
Tribolium castaneum
CR = 0,2 µL/cm2 (94±4% por 2h e 98±2% por 4h); CR50 = 0,001 (2 horas) e 0,0005 (4 horas) µL/cm2
Olivero-Verbel et al., 2009
50
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Planta inteira (óleo essencial) –
9 amostras
Amostra (VEnaW02B): Timol (54,5%) e ρ-cimeno
(10,0%) Amostra (VEsaWCR-01): Timol (66,0%) e ρ-cimeno
(7,2%)
Avaliação de toxicidade aguda frente à Artemia
franciscana
CL50< 10 µg/mL (para as 9 amostras)
Olivero-Verbel, Güette-Fernandez, Stashenko,
2009
Partes aéreas (óleo essencial)
(E)-metil cinamato (40%) Atividade antimicrobiana
por ensaio de microdiluição
MIC = 78 μg/mL (C. neoformans),
312 μg/mL (A. niger e T. rubrum) e 625 μg/mL
(E. coli)
Perera et al., 2016
Folhas e caules (Extrato aquoso,
hexânico, diclorometânico e acetato de etila)
Triagem Fitoquímica: Folhas – Terpenoides,
esteroides, flavonoides e ácidos fenólicos.
Cumarina e antraquinonas (hexânica e
diclorometânica) e saponinas (acetato de
etila e aquosa) Caule – Terpenoides e
esteroides. Cumarinas e antraquinonas (hexânica),
flavonoides e ácidos fenólicos
(diclorometânica, acetato de etila e aquosa) e
saponinas (acetato de etila e aquosa)
Atividade antimicrobiana em disco de difusão e
microdiluição
Halos de inibição (extrato da folha) = 13,0 ± 0,5 mm (S. aureus),
11,7 ± 0,4 mm (C. albicans) e 7,1±0,4 mm (C. parapsilosis)
MIC = 0,329 mg/mL(S.aureus –
frações Hexanica e acetato das folhas) e
0.658 mg/mL (E. coli e C. albicans – fração dlicorometânica e S. aureus – fração
Hexânica)
Pinto et al., 2013
51
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade
farmacológica Dose ou Concentração
Autores / ano de publicação
Folhas (óleo essencial)
Timol (48,7%)
Atividade antimicrobiana em disco de difusão e
microdiluição
Halos = 8-12 mm (S. aureus de diferentes
isolados de 15-120 µL/mL)
MIC = 15-60 µL/mL a depender do isolado
Queiroz et al., 2014
Folhas (óleo essencial)
10 amostras: 6amD – 1,8-cineol (19,4%) 6amR - 1,8-cineol (25,3%),
carvacrol (23,6%) 9amD - ρ-cimeno (26%),
carvacrol (11,8%) e
-terpineno (10,1%)
9amR - -pineno (18,7%) e 1,8-cineol (10%)
12amD – (E)-metil cinamato (26,6%), (E)-nerolidol
(16,9%) e 1,8-cineol (9,9%) 12amR – 1,8-cineol (19,2%),
carvacrol (15%), (E)-cariofileno (11,8%) 3pmD – (E)-nerolidol
(14,7%), 1,8-cineol (12,3%), (E)-metil cinamato (10,8%) e
ρ-cimeno (9,1%)
3pmR - -pineno (18,1%) e (E)-cariofileno (16,3%)
6pmD – 1,8–cineol (16,8%), (E)-metil cinamato (11,1%) e
ρ-cimeno (9,1%) 6pmR - (E)-nerolidol (46,7%)
Ribeiro et al., 2014
52
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Partes aéreas (óleo essencial) –
3 amostras
OECAM – carvacrol (42,9%), p-cimeno
(15,8%), -terpineno (8,0%) e metil timol (7,0%); OECAB –
carvacrol (37,3%), p-
cimeno (12,1%), -terpineno (10,0%) e metil timol (8,7%); OEFRE – carvacrol (33,5%), p-
cimeno (11,9%), -terpineno (10,5%) e timol
(8,4%)
Atividade antibacteriana e antifúngica em disco de
difusão
Discos de filtro de papel impregnados com 10 μL das
amostras gera halo de inibição de15, 15, 21, 23 e 27 mm para OECAB; 15, 18, 25, 23 e 30 mm para OECAM e 15, 17, 24, 25 e 28 mm para
OEFRE contra E. coli, S. aureus, S. aureus MRSA, C. albicans e C. tropicalis,
respectivamente
Santos et al., 2004
Folhas e caules (óleo essencial)
Variação sazonal de janeiro-dezembro (2012):
Carvacrol (47,2% em junho), timol (12,8% em junho), p-cimeno (11,8%
em outubro) e p-metoxitimol (14,1% em
dezembro)
Atividade antimicrobiana por microdiluição
MIC = 0,15 μL/mL (E. coli) e 1,25 μL/mL (S. aureus)
Sarrazin et al., 2015
53
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Folhas e caules finos (óleo essencial)
Carvacrol (47,2%), timol (12,8%), p-cimeno (9,7%)
e p-metoxitimol (7,4%)
Atividade antimicrobiana em disco de difusão e
microdiluição Atividade antioxidante pelo
método do sequestro do DPPH e auto-oxidação do
-caroteno Toxicidade aguda em camundongos (DL50)
MIC 1.25 μL/mL (Salmonella typhimurium e Bacillus
subtilis) e de 0.62 μL/mL (Bacillus cereus); Diâmetro
do halo 27,9 ± 0,4 mm (Salmonella typhimurium),
50,9±0,6 mm (Bacillus cereus),
35,8±0,3 mm (Bacillus subtilis).
CE50 para DPPH = 23,0±1,5 μg/mL; Inibição da auto-
oxidação do -caroteno = 85,2±6,8%.
DL50 = 1.673,84 mg/kg
Sarrazin et al., 2015
Folhas (Extrato etanólico)
- Toxicidade frente à
Tetranychus cinnabarinus
Extrato etanólico (20% v/v), promoveu 96,6% de
mortalidade e 100% na inibição da ovoposição
Sivira et al., 2011
Não informado (óleo essencial)
- Atividade antimicrobiana
em disco de difusão e microdiluição
Halo = 10 mm (aproximadamente para
S. aureus e E. coli na concentração de 160 μL/mL) MIC = 160 μL/mL (S. aureus
e E. coli)
Souza et al. 2015
Não informado (óleo essencial)
- Atividade antimicrobiana
em disco de difusão e microdiluição
Halo = 10 mm (aproximadamente para
S. aureus e E. coli na concentração de 160 μL/mL) MIC = 160 μL/mL (S. aureus
e E. coli)
Souza et al. 2015
54
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Não informado (oleo essencial –
2 quimiotipos)
1º quimiotipo: Carvacrol (44,4-51,8%) e ρ-cymene
(8,8-10,1%) 2º quimiotipo: ρ -cymene
(11,3-15,7%) e 1,8-cineole (6,8-10,9%)
Atividade antioxidante - Stashenko et al.,
2008
Folhas e Caules (óleo essencial)
Carvacrol (43,8%) e Timol (17,3%) – amostra B
Teste de susceptibilidade antifúngica (Candida albicans) e atividade
citotóxica em células de Cercopithecus aethiops
(Vero cell line ATCC CCL-81)
MIC = 157,5 µg/mL e 198,4 µg/mL (isolados
clínicos). CI50 = 31,4±5,6 µg/mL
(amostra mais potente - B)
Tangarife-Castaño et al., 2011
Folhas e caule (óleo essencial)
5E – Carvacrol (46,2%), ρ-cimeno (12,0%), Timol
(9,9%) e -terpineno (9,5%)
1A – Carvacrol (36,5%),
ρ-cimeno (13,9%), -terpineno (13,2%) e Timol
(9,2%) 6F - Timol (59,7%), Carvacrol (12,2%) e
ρ-cimeno (8,8%)
Teste de susceptibilidade antifúngica e atividade
citotóxica em células de Cercopithecus aethiops
(Vero cell line ATCC CCL-81)
MIC = 500 µg/mL – amostras 5E e 6F (Fusarium
oxyporum, Trichophyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes), 500 e
396,85 µg/mL – amostra 1A (F. oxyporum e
T. mentagrophytes, respectivamente)
CI50 = 29,3±4,8 µg/mL (5E), 52,3±11,5 µg/mL (1A) e
34,3±6,5 µg/mL (6F)
Tangarife-Castaño et al., 2012
55
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Folhas e inflorescências (óleo essencial)
4 amostras cultivadas sobre fertilização orgânica
e coletadas em dias diferentes
T150 – Carvacrol (56,53±8,04%)
T240 – Carvacrol (50,50±0,35%)
T330 – Carvacrol (43,83±4,16%), Linalol
(12,13±1,62%) e Biciclogermacreno
(8,50±2,10%) T420 – Carvacrol
(33,23±9,75%), Linalol (15,87±2,60%) e
-terpineno (8,03±3,17%)
Atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical DPPH, ABTS e
ensaio de potência redutora
DPPH - CE50 = 0,71 ± 0,08 e 1,20 ± 0,17 mg/mL
(cultivo orgânico e mineral – T150)
ABTS – CE50 = 0,13 ± 0,00 e 0,25 ± 0,02 (cultivo
orgânico e mineral – T150) Potência redutora – CE50 = 1,99 ± 0,10 mg/mL (cultivo
orgânico – T330) e 1,87 ± 0,23 (cultivo mineral
– T150)
Teles et al., 2014
Folhas e inflorescências (óleo essencial)
2 amostras cultivadas sobre fertilização orgânica
e mineral O – Carvacrol (56,53±8,04%) M – Carvacrol
(47,20±8,93%) e ρ-cimeno (11,07±5,56%)
Atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical DPPH, ABTS e
ensaio de potência redutora
DPPH – CE50 = 0,71 mg/mL (orgânica) e
1,20 mg/mL (mineral) ABTS – CE50 = 0,13
mg/mL (orgânica) Potência redutora – CE50 =
1,87 mg/mL (mineral) e 2,05 mg/mL (orgânica)
Teles et al., 2014
56
Tabela 2. Aspectos químicos e farmacológicos de L. origanoides (Continuação).
Parte da planta/ Produto natural
Composição química Atividade farmacológica Dose ou Concentração Autores / ano de
publicação
Não informado (óleo essencial)
Carvacrol (32,3%), p-cimeno (12,0%), β-mirceno (2,8%), β-
cariofileno (2,5%) e α-humuleno isopulegol
(1,4%)
Avalição da atividade inseticida do óleo
essencial isolado ou combinado com óleo
essencial de Lippia alba em larvas de
Aedes aegypti Rockefeller
Na maior concentração estudada (70 ppm), a
mortalidade das larvas de A. aegypti foi de 80 ±
13% após 24 horas (CL50 53,37 ppm) e 82 ±
13% após 48 horas (CL50 38,06 ppm). Na mistura com OE de
L. alba, a mortalidade foi de 70 ± 12% após 24
horas (CL50 40,13 ppm) e 70 ± 11% após 48
horas (CL50 37,55 ppm), numa concentração de
45 ppm.
Vera et al., 2014
Folhas e flores (óleo essencial)
COL519799 – Timol (59,6%) e ρ-cimeno
(8,4%) COL516290 – Timol (34,5%), Carvacrol
(25,8%), ρ-cimeno (9,3%)
e -terpineno (9,1%)
Atividade antigenotóxica frente a danos ao DNA
induzidos por bleomicina em cepas PQ37 de E. coli
Doses = 7,4 mg/mL (55% de inibição) e a partir de 118,7 mg/mL
(100% de inibição)
Vicuña, Stashenko, Fuentes, 2010
Planta completa (óleo essencial)
3 quimiotipos: trans--cariofileno (11,3%), p-
cimeno (11,2%); timol e carvacrol (46,2%)
Atividade citotóxica
CI50 = 9,1±1 µg/mL (células HeLa)
CI50 = 29,3 ± 4,8 µg/mL (células Vero)
Zapata et al., 2009
57
ABTS, ácido 2,2´-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6)-sulfônico; CC50, concentração citotóxica 50%; CE50, concentração efetiva que promove 50% do efeito
máximo; CI50, concentração inibitória que promove 50% do efeito máximo; CL99, concentração letal que promove 99% de mortes; CR, concentração
repelente; CR50, concentração repelente que promove 50% do efeito máximo; DL50, dose letal que promove 50% de mortes; DPPH, 2,2-difenil-1-picrilhidrazil;
CL50, concentração letal que promove 50% de mortes; CL90, concentração letal que promove 90% de mortes; MBC, concentração bactericida mínima; MFC,
concentração fungicida mínima; MIC, concentração inibitória mínima; TAA, atividade antioxidante total; TEAC, atividade antioxidante equivalente a Trolox.
Fonte: Próprio autor.
58
É possível observar que os estudos referentes a L. origanoides são
concentrados sobre a atividade antimicrobiana, antifúngica, citotóxica, antioxidante,
repelente, antiviral e antiprotozoária. São poucos os dados referentes a estudos em
animais, com destaque para aqueles em que se utilizam modelos animais de
nocicepção, inflamação e hipertensão ou contratilidade vascular. Isso representa
uma maior possibilidade dos estudos envolvendo os aspectos etnofarmacológicos
no que tange, principalmente, a modelos experimentais de doenças do trato
respiratório.
Há de se observar que os estudos envolvem, em sua maioria, a utilização do
óleo essencial de L. origanoides em detrimento de outros produtos naturais.
Ressalta-se, no entanto, que os estudos desenvolvidos estão relacionados à
observação de atividade antimicrobiana, repelente, hipotensora, antioxidante,
genotóxica, toxicologia aguda e sub-aguda, citotóxica, antinociceptiva e
antiparasitária, ou seja, ainda são incipientes sobre os aspectos da farmacologia
gastrintestinal e respiratória, por exemplo, que tem ampla citação nos estudos
etnofarmacológicos.
59
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Investigar a atividade farmacológica do óleo essencial de Lippia origanoides
em modelos experimentais in vitro e in vivo visando a aplicação desse produto no
tratamento da asma.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar o possível efeito espasmolítico in vitro do óleo essencial de
L. origanoides em músculo liso de traqueia isolada de cobaia.
Investigar o provável mecanismo de ação pelo qual o óleo essencial de
L. origanoides esteja induzindo relaxamento.
Avaliar o efeito do óleo essencial de L. origanoidesem modelo de tosse
induzido por ácido cítrico em camundongos.
Avaliar o efeito do óleo essencial de L. origanoidessobre os modelos de
atividade motora em rota rod e campo aberto.
Aperfeiçoamento do método analítico para avaliação da atividade
expectorante a partir da análise do vermelho de fenol.
60
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 MATERIAIS
Os equipamentos e reagentes foram utilizados de acordo com os protocolos
experimentais propostos e podem ser observados na lista a seguir:
4-aminopiridina Sigma-Aldrich ® (St.Louis, Missouri, EUA)
Aminofilina Farmace® (Barbalha-CE, Brasil)
Amplificador modelo EFF-321A Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)
Aparelho de Campo aberto Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)
Aparelho de Rota Rod Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)
Atropina Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)
Azul de metileno Isofar® (Duque de Caxias-RJ, Brasil)
Balança analítica modelo ALC-210.4 Acculab®
Balança semi-analítica modelo B-17-BI Even®
Banho de órgãos modelo EFF-321 Insight® (Ribeirão Preto-SP, Brasil)
Banho Maria modelo NT236 Novatecnica®
Bicarbonato de sódio (NaHCO3) Isofar® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)
Carbacol Sigma-Aldrich ® (St. Louis, Missouri, EUA)
Cloreto de cálcio (CaCl2.2H2O) Isofar® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)
Cloreto de césio (CsCl) CRQ®
Cloreto de potássio (KCl) Dinâmica® (Diadema-SP, Brasil)
Cloreto de sódio (NaCl) 0,9% estéril Kabipac®
Cloreto de sódio (NaCl) Proquímios® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)
Computador HP Compaq Pro 6305 SFF®
Cremophor EL Fluka-Biochemika® (Alemanha)
Cuba de ultrassom Cristófoli® (Campo Mourão-PR, Brasil)
Dexametasona Riedel-de Haën® (Alemanha)
Espectrofotômetro modelo IL – 592 Even®
Fosfato de sódio (NaH2PO4.1H2O) Isofar® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)
61
Glibenclamida Sigma-Aldrich ®(St.Louis, Missouri, EUA)
Glicose (C6H12O6) Synth® (Diadema-SP, Brasil)
Hexametônio Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)
Hidróxido de sódio (NaOH) Proquímios® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)
Histamina Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)
Indometacina Sigma-Aldrich ®(St.Louis, Missouri, EUA)
Mistura Carbogênica White Martins®
Nω-nitro-L-arginina metil éster(St.Louis, Missouri, EUA)
Nitroprussiato de sódio NEON® (São Paulo –SP, Brasil)
pHmetro modelo PHS-30 Even®
Propranolol Sigma-Aldrich® (St. Louis, Missouri, EUA)
Softwares Windaq 32® (DATAQ Instruments, Inc., Akron, Ohio, EUA)
Sulfato de magnésio (MgSO4.7H2O) Proquímios® (Rio de Janeiro-RJ, Brasil)
Tetraetilamônio Sigma-Aldrich®(St.Louis, Missouri, EUA)
Transdutor de força isométrico modelo TRI201 Panlab®(Barcelona,
Espanha)
Vermelho de fenol Vetec ®
4.2 PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL
A espécie Lippia origanoides foi coletada a partir do cultivo no Horto Florestal
da UEFS e fornecida por colaboradores da mesma instituição. O material vegetal foi
dessecado em estufa com ar circulante à temperatura média de 40o C até completa
estabilização, com posterior análise da umidade residual. Após a determinação da
umidade, as folhas e inflorescências foram utilizadas para a extração dos óleos
essenciais por hidrodestilação por arraste a vapor d’água, em aparelho tipo
Clevenger (durante 3 horas). O processamento para obtenção do produto natural foi
realizado pelos colaboradores do Laboratório de Química de Produtos Naturais e
Bioativos (LAPRON).
62
4.3 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL
A análise da composição química do óleo essencial de L. origanoides (LOO) foi
realizada pela combinação de cromatografia gasosa acoplada a um detector de
ionização em chamas (CG/DIC) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria
de massas (CG/EM), ambas as análises foram realizadas em colaboração com
pesquisadores do LAPRON da UEFS.
4.4 ANIMAIS
Este trabalho foi submetido à Comissão de Ética no Uso de Animais da
Universidade Federal do Vale do São Francisco (CEUA-UNIVASF) e teve parecer
favorável sob o protocolo de nº 0006/021014 para o julgamento da utilização de
animais de laboratório nos modelos experimentais propostos. Foram utilizados os
seguintes animais nos modelos experimentais propostos: a) cobaias
(Cavia porcellus), de ambos os sexos com 300 a 500 g, para os ensaios de
avaliação atividade espasmolítica in vitro em músculo liso de traqueia; e b)
camundongos (Mus musculus) da linhagem Swiss, machos, com 4 a 8 semanas de
idade e peso variando de 30 a 50 g, no ensaio de atividade antitussígena,
expectorante e antiasmática. Todos os animais foram disponibilizados pelo Biotério
Central da UNIVASF, mantidos em caixas adequadas, com ciclo claro escuro de 12
horas e água e ração ad libitum, de acordo com cada procedimento experimental.
4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E MECANISMO DE AÇÃO EM
MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA ISOLADA DE COBAIA
As cobaias (n = 5) foram eutanasiadas por deslocamento cervical, a traqueia
retirada e após limpeza de todo o tecido conjuntivo e adiposo, o órgão foi dividido
em segmentos contendo 4 a 5 anéis cartilaginosos, suspensos individualmente em
cubas de vidro com o auxílio hastes de aço inoxidável e conectadas a transdutores
de força através de linhas de algodão. Os tecidos foram deixados em repouso por 60
63
minutos, sob uma tensão de 1 gF a 37 ºC e aeração constante com mistura
carbogênica (95% O2 e 5% CO2), sendo a solução de Krebs substituída a cada 15
minutos. Após o período de estabilização uma contração foi induzida através da
adição de carbacol (CCh) ou histamina, na concentração de 1 µM, às cubas.
Durante o componente tônico da contração foi adicionado o LOO, individualmente,
de maneira cumulativa e em concentrações crescentes (1, 3, 9, 27, 81, 243 e
729 μg/mL).
4.5.1 Investigação da participação de canais para K+ no relaxamento induzido
por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A traqueia foi montada como descrito no item 4.5, sendo que 20 minutos
anteriormente à indução da segunda contração com histamina 1 µM, as preparações
foram expostas ao CsCl (inibidor não seletivo dos canais para K+), na concentração
de 5 mM (LATORRE et al., 1989); glibenclamida (inibidor do canal para K+ sensível
ao ATP (KATP)), na concentração de 3 µM (CUNHA et al., 2001); tetraetilamônio
(inibidor dos canais para K+ abertos pelo Ca2+ (KCa)) na concentração de 5 mM
(JANSSEN et al., 2001); e 4-aminopiridina (inibidor dos canais para K+operados por
voltagem (KV)), na concentração de 2 mM (LI et al., 1997). Após a estabilização da
segunda contração, durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas
diferentes preparações, de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a
729 µg/mL), sendo os efeitos relaxantes registrados.
4.5.2 Investigação da participação de receptores β-adrenérgicos no
relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A traqueia foi montada como descrito no item 4.5, sendo que 20 minutos
anteriormente à indução da segunda contração com histamina 1 µM, as preparações
foram expostas ao propranolol (antagonistas β-adrenérgico), na concentração de
3 µM (SÁNCHEZ-MENDOZA et al., 2007). Após a estabilização da segunda
contração, durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas diferentes
64
preparações, de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a 729 µg/mL),
sendo os efeitos relaxantes registrados.
4.5.3 Investigação da participação das prostaglandinas no relaxamento
induzido por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A traqueia foi montada como descrito no item 4.5, sendo que 20 minutos
anteriormente à indução da segunda contração com histamina 1 µM, as preparações
foram expostas a indometacina (inibidor não seletivo da ciclooxigenase), na
concentração de 10 µM e a dexametasona (corticosteroide), na concentração de
10 µM (SCHLEMPER et al., 2005). Após a estabilização da segunda contração,
durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas diferentes preparações,
de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a 729 µg/mL), sendo os
efeitos relaxantes registrados.
4.5.4 Investigação da participação da via colinérgica no relaxamento induzido
por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A traqueia foi montada como descrito no item 4.5, sendo que 20 minutos
anteriormente à indução da segunda contração com histamina 1 µM, as preparações
foram expostas a atropina (antagonista muscarínico) na concentração de 1 µM
(TANAKA, GRUNSTEIN, 1986) e hexametônio (antagonista do receptor nicotínico
neuronal), na concentração 100 μM (CHÁVEZ et al., 2011). Após a estabilização da
segunda contração, durante a sua fase tônica, LOO foi adicionada às cubas, nas
diferentes preparações, de maneira cumulativa em concentrações crescentes (1 a
729 µg/mL), sendo os efeitos relaxantes registrados.
65
4.5.5 Investigação da participação da via do óxido nítrico (NO) no relaxamento
induzido por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A traqueia foi montada como descrito no item 4.5, sendo que 20 minutos
anteriormente à indução da segunda contração com histamina 1 µM, as preparações
foram expostas a Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, inibidor da óxido nítrico
sintase), na concentração de 10 µM (ESTRADA-SOTO et al., 2012), azul de
metileno (inibidor da guanilil ciclase solúvel), na concentração de 25 μM (LIN; CHEN;
KO, 2007), e aminofilina (inibidor da fosfodiesterase) na concentração 1 µM (HIRSH
et al., 2004). Após a estabilização da segunda contração, durante a sua fase tônica,
LOO foi adicionada às cubas, nas diferentes preparações, de maneira cumulativa
em concentrações crescentes (1 a 729 µg/mL), sendo os efeitos relaxantes
registrados.
4.5.6 Investigação da participação da via da guanilil ciclase solúvel (GCs) no
relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída com CCh
Para investigar a via da GCs no relaxamento do músculo liso das vias aéreas,
a traqueia foi montada como descrito no item 4.5, e foi induzida uma contração com
CCh 1 µM. Após o componente tônico da contração as cubas eram lavadas durante
30 minutos para remoção do agonista e havia incubação de LOO, por 15 minutos,
nas concentrações de 9, 27 e 81 µg/mL. Passado esse tempo, foram adicionadas às
cubas aminofilina 0,3 µM (RODRÍGUEZ-RAMOS, GONZÁLEZ-ANDRADE,
NAVARRETE, 2011) por mais 15 minutos até a realização de uma nova contração
com CCh 1 µM que foi comparada a curva controle (primeira contração).
De modo semelhante os experimentos foram realizados com nitroprussiato de
sódio (SNP), um doador de NO, na concentração de 3 µM (HWANG, WU, TENG,
1999). Após a incubação do LOO por 15 minutos nas concentrações de 9, 27 e
81 µg/mL houve a adição de SNP (3 µM) às cubas. Passados mais 15 minutos uma
nova contração foi realizada CCh 1 µM para compração com a curva controle
(primeira contração).
66
Ainda nesse sentido, foram realizados experimentos com o azul de metileno
(AZM) na concentração de 25 µM e/ou SNP 3 µM. Após a incubação do LOO por 15
minutos na concentração de 81 µg/mL houve a adição de AZM (25 µM) isolado ou
em conjunto com SNP (3 µM) às cubas. Passados mais 15 minutos uma noca
contração foi realizada com CCh 1 µM para comparação com a curva controle
(primeira contração).
Para todos os experimentos, foram montadas traqueias que seriam controles
experimentais. As cubas foram submetidas a duas curvas concentração-resposta
sucessivas de CCh 1 µM e em uma das cubas hoube incubação apenas de
LOO 81 µg/mL para observação do seu efeito individual sob a inibição da contração.
4.6 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM CAMUNDONGOS
O modelo experimental para avaliação da atividade antitussígena foi
realizado com camundongos machos (n = 25), colocados em câmara de vidro
(volume aproximado de 500 mL) e expostos, individualmente, a aeração por
nebulização de ácido cítrico 0,4 M durante 3 minutos para observação da tosse. Os
animais foram separados por grupos (n = 5). A tosse em camundongos é
caracterizada por contração abdominal e distinta abertura da boca, sendo contadas
quantas vezes houve esse comportamento durante a exposição. No entanto, para
critério de inclusão os animais deveriam apresentar um número superior a 3 (três) e
inferior a 20 (vinte) tosses. Os animais que apresentaram 3 tosses ou menos, foram
considerados insensíveis, enquanto os que apresentaram 20 tosses ou mais, foram
considerados hiperresponsivos (KAMEI et al. 2011, 2013; TANAKA, MARUYAMA,
2005).
Passadas 23 horas e 30 minutos houve o tratamento com NaCl 0,9% (CN),
LOO nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg ou morfina 5 mg/kg (CP) por via
intraperitoneal (i.p.) para que ao serem completadas as 24 horas da primeira
exposição, os animais fossem submetidos a uma nova nebulização de solução de
ácido cítrico 0,4 M. Foram observados os parâmetros de latência (período, em
segundos, do início da exposição ao agente tussígeno até o aparecimento da 1ª
tosse) e a frequência de tosse (quantas vezes o animal apresentou o
67
comportamento tussígeno durante 3 minutos) (KAMEI et al. 2011, 2013). Ao final do
experimento os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.
4.7 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO ROTA-ROD)
O protocolo experimental foi semelhante ao proposto por Dunham & Miya
(1957), com algumas modificações. O qual utiliza o aparelho do rota-rod que é
constituído de uma barra, subdividida em quatro compartimentos, permitindo avaliar
se os tratamentos promovem alteração motora nos animais por sedação e/ou
relaxamento muscular (LAPA et al., 2003).
Os animais foram pré-selecionados 24 horas antes do estabelecimento do
teste, sendo escolhidos aqueles que permaneceram na barra por 60 segundos em
pelo menos uma de três tentativas (ALMEIDA et al., 2006). Camundongos foram
divididos em grupos contendo 5 animais, sendo tratados por via i.p. com NaCl 0,9%
(CN), diazepam 2,5 mg/kg (CP) ou LOO nas doses de 30, 100 ou 300 mg/kg, Após
30 minutos da administração, os animais foram colocados individualmente na barra
giratória (sentido contrário ao movimento da barra) e houve o registro do tempo de
permanência do animal por 3 minutos (SANTOS-JUNIOR et al., 2005). Os animais
foram observados nos intervalos de tempo 30, 60 e 120 minutos após otratamento.
Além disso, os animais que receberam da maior dose do de LOO (300 mg/kg) foram
avaliados nos tempos de 240 e 480 minutos após a administração para avaliar a
relação tempo-resposta.
4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA ANSIOLÍTICA ATRAVÉS DO MÉTODO
DE CAMPO ABERTO
O protocolo experimental fornece dados importantes sobre a atividade
locomotora e ansiolítica animal. Utiliza-se do aparelho de campo aberto para análise
comportamental dos animais colocados no centro do equipamento. Quando o animal
está na posição central do campo aberto é iniciada uma observação por cinco
minutos para análise dos seguintes parâmetros: locomoção horizontal (número de
cruzamentos com as quatro patas, entre as divisões do campo), o número de
68
comportamentos de auto-limpeza (grooming), de levantar (rearing), defecação
(número de bolos fecais), imobilidade (freezing) (CARLINI; MENDES, 2011).
Os camundongos foram divididos em 5 grupos (n = 5) tratados com solução
NaCl 0,9% (CN), LOO nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg e diazepam 2,5 mg/kg
(CP), via i.p. Aguardados 30 minutos após a administração, os animais foram
colocados individualmente na arena e os mesmos parâmetros foram observados
durante 5 minutos. Após a avaliação de cada animal, o aparelho foi limpo com álcool
a 5% (CARLINI; MENDES, 2011). Ao final do protocolo experimental todos os
animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.
4.9 APERFEIÇOAMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR
VERMELHO DE FENOL
A metodologia para avaliação de expectoração é variável na literatura,
principalmente no que diz respeito ao agente baseificante utilizado, o comprimento
de onda para análise, concentração do vermelho de fenol, dose asministrada, dentre
outros. Além disso, o procotolo se baseia na utilização do vermelho de fenol em
suspensão 30 minutos após administração de um fármaco padrão que tem efeito
expectorante comprovado. A partir da eutanaisa dos animais, após 30 minutos da
administração do vermelho de fenol, a traqueia dos animais são removidos por
técnica cirúrgica ou do lavado broncoalveolar (LBA) é recuperado para que seja
analisada a concentração do vermelho de fenol secretado.
A otimização da metodologia analítica em quantificar o vermelho de fenol
(C19H14O5S) no LBA para a avaliação da atividade expectorante, foram observadas a
influência do pH na quantificação de vermelho de fenol por espectrometria de
absorção no UV-VIS, a quantidade do agente basificante no preparo da amostra, o
comprimento de onda adequado para avaliação e a taxa de recuperação do
vermelho de fenol no LBA.
As determinações quantitativas foram realizadas em espectrofotômetro de
UV-Vis, utilizando-se cubetas de vidro com 1 cm de caminho óptico.
A utilização deste indicador para avaliação da atividade expectorante de
novos protótipos a fármacos expectorantes vem sendo descrita há algum tempo
69
desde Engler e Szelenyl (1984). No entanto, os estudos anteriores não detalham
esta metodologia analítica em fluidos biológicos, como o lavado broncoalveolar.
Para o aperfeiçoamento do protocolo de avaliação da atividade expectorante
em camundongos, foram utilizados os modelos propostos na literatura por Alves et
al. (2014), Engler e Szelenyl (1984), Gong et al. (2015), Lin et al. (2008), Liu, Wang,
Liu (2009) e Schickaneder, Engler, Szelenyl (1987), além de outras referências
expostas no Tabela 3.
4.9.1 Influência do pH na quantificação de vermelho de fenol em LBA
Para quantificação de vermelho de fenol de forma seletiva no LBA é
necessário a mudança de pH do meio. Sendo assim, foi realizada a basificação da
amostra de LBA com NaHCO3 e com NaOH a fim de verificar a influência de
absortividade e deslocamento batocrômico.
4.9.2 Perfil de absorção no UV do vermelho de fenol no LBA
Devido a discrepância dos comprimentos de onda relatados para
determinação de vermelho de fenol, como demonstrado no Tabela 3, avaliou-se a
absortividade do mesmo ao ser adicionado a LBA de camundongos, em
concentrações conhecidas, variando-se o comprimento de onda de 400 a 600 nm,
utilizando-se como solução de compensação apenas solução salina e sendo a
absorbância registrada de 5 em 5 nm.
70
Tabela 3. Informações sobre o protocolo de atividade expectorante disponível na
literatura.
Comprimento de
onda (nm)
Agente
basificante
Concentração do
vermelho de fenol Referência
535 NaOH 1% Alves et al., 2014
546 NaHCO3 5% Chakraborty et al.
2013
546 NaOH 5% Chand et al., 1993
558 NaHCO3 5% Dapaah et al., 2016
546 NaOH 5% Engler, Szelenyi,
1984
546 NaOH 1% Fernandez et al.,
2009
558 NaHCO3 5% Ge et al., 2015
558 NaHCO3 5% Ge, Liu, Su, 2009
570 NaOH 2,5% Guo et al., 2009
546 NaHCO3 5% Han et al., 2010
558 NaHCO3 - Jiang et al., 2014
558 NaHCO3 5% Koffuour et al. 2014
546 NaOH 5% Liu et al., 2015
546 NaOH 5% Liu, Wang, Liu, 2009
546 NaOH 5% Shang et al., 2010
546 NaOH 2,5% Song et al., 2015
558,5 NaHCO3 5% Wang et al., 2012
550 NaOH - Wong et al.,2015
546 NaHCO3 2,5% Yu et al., 2015
558 NaOH 5% Zhang et al., 2009
557 NaHCO3 5% Zhou et al., 2013
(-) representam os dados não informados nos estudos.
Fonte: Próprio autor.
71
4.9.3 Validação da metodologia analítica
Na literatura a análise variava a partir do comprimento de onda utilizado por
cada pesquisador, sem análise do perfil de absorbância do vermelho de fenol.
Portanto, após verificação dos possíveis interferentes na quantificação precisa e
exata do vermelho de fenol em amostras de LBA, a metodologia definida consiste
em utilizar 500µL de LBA após centrifugação (2500 RPM por 10 min), adicionar 50
µL de solução de NaOH (0,001 M) e determinar absorbância em 565 nm em
espectrofotômetro utilizando cubetas de vidro.
Para a validação desse método analítico foram avaliados parâmetros quanto
à seletividade, linearidade, precisão (repetitividade), limites de detecção (LD), limite
de quantificação (LQ) e exatidão, tendo como finalidade atestar a eficiência do
método. Todas as análises foram realizadas em triplicata e a confiabilidade dos
parâmetros foi verificado pelo desvio padrão relativo (DPR%) (ANVISA, 2003).
A seletividade do método analítico foi demonstrada com a sobreposição dos
espectros de absorção obtidos com vermelho de fenol diluído em NaCl 0,9%, o LBA,
e da amostra de LBA com adição de vermelho de fenol ambos na concentração de
20 µg/mL, obtidos pela varredura na faixa de 400 a 600 nm.
A linearidade foi avaliada a partir da média das análises de três curvas, com
sete níveis de concentração (0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 µg/mL). As curvas foram obtidas
a partir das médias das absorbâncias em função da concentração. Os resultados
foram tratados estatisticamente através do cálculo de regressão linear, com o
objetivo de determinar a equação da reta e o coeficiente de determinação (r²), sendo
o valor mínimo aceitável r2> 0,99.
O LD e LQ foram calculados (em µg/mL) a partir das curvas, de acordo com
as equações, onde DPa é o desvio padrão do intercepto com o eixo Y, obtido da
média das três curvas de linearidade e IC é a inclinação da reta das respectivas
curvas de calibração. O LD e LQ podem ser calculados pelas Equações (1 e 2)
abaixo:
LD= DPa x 3 / IC (1)
LQ= DPa x 10 / IC (2)
72
A exatidão foi avaliada através da taxa de recuperação, a partir da adição de
uma quantidade conhecida de vermelho de fenol ao LBA de animais saudáveis sem
tratamento prévio. Foi adicionado 400 µL de LBA, 100 µL da solução de vermelho de
fenol (20 µg/mL) e 50 µL de NaOH (0,001 M) em cada cubeta em triplicata, enquanto
que na repetitividade foi avaliada a concordância dos resultados de quantificação da
concentração média de 1 µg/mL em sextuplicata tendo o desvio padrão relativo entre
as amostras determinado (ANVISA, 2003; ICH, 2005).
4.9.4 Determinação da solubilidade do vermelho de fenol em salina e LBA
Foi obtida a solução saturada do vermelho de fenol em 1 L de solução salina
a 25°C em triplicata, sendo esta quantificada a partir da metodologia analítica
desenvolvida.
4.9.5 Desenvolvimento de suspensão de vermelho de fenol estável
Para o desenvolvimento de uma suspensão extemporânea estável foram
testadas as concentraçõesde 1,25%, 2,5% e 5% dispersas em solução salina, além
de avaliadas quanto a altura do sedimento formado e, in vivo, na aplicação
intraperitoneal na avaliação da atividade expectorante descrita no item 4.7.6.
4.9.6 Aplicação da metodologia analítica para avaliação de atividade
expectorante em camundongos
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) da linhagem Swiss, com 4 a 8
semanas de idade e peso variando de 30 a 50 g. Os animais (n = 5) foram tratados
com o cloreto de amônio (NH4Cl, controle positivo) na dose de 1.500 mg/kg (LIU et
al., 2015), por via oral, e após 30 minutos foi administrada solução salina (controle
negativo) ou suspensão da vermelho de fenol nas doses de 5, 25, 50, 250 ou
500 mg/kg, via i.p. Devido a baixa solubilidade do vermelho de fenol em solução
salina, avaliou-sea concentração da suspensão do indicador (1,25%, 2,5% ou 5%
73
em solução salina) que se obteve o volume a ser administrado. Com essa avaliação,
foi selecionadaa dose e a concentração da suspensão de vermelho de fenol
administrada mais eficaz para a aplicação no modelo experimental de atividade
expectorante.
4.10 ANÁLISE DOS DADOS
Os dados numéricos obtidos foram expressos como média ± erro padrão da
média (X ± e.p.m) ou média e intervalo de confiança (95%) e n representou o
número de animais utilizados ou experimentos realizados em um dado protocolo. Os
dados obtidos dos registros dos experimentos em traqueia isolada de cobaia foram
plotados em curvas concentração-resposta e estas ajustadas por regressão
não-linear no software Graphpad Prism 6 (GraphPad Software Inc.), para obtenção
do valor de CE50 (concentração do extrato ou fração em que é capaz de causar 50%
de seu efeito máximo) servindo como parâmetro de potência relativa de uma
amostra, e o Emáx (valor médio, em percentagem, do efeito máximo obtido pelo
extrato ou fração em relação ao maior valor possível num dado tecido) servindo
como parâmetro de eficácia relativa de duas amostras.
Diferenças entre as médias foram comparadas estatisticamente usando o teste
t de Student não-pareado, análise de variância uma via (ANOVA one-way) com
pós-teste de Tukey ou análise de variância duas vias (ANOVA two-way) com
medidas repetidas, seguido de pós-teste de Sidak, usando o Graphpad Prism 6,
sendo as diferenças consideradas significantes quando o valor calculado de p foi
menor que 0,05 (* p< 0,05).
Para o aperfeiçoamento do método expectorante, os softwares utilizados para
análise estatísticas dos resultados do desenvolvimento e validação da metodologia
analítica foram Microsoft Excel® e OriginPro 8® e os dados foram apresentados
comomédia ± desvio padrão (X ± SD), sendo todas as determinações realizadas em
triplicata. A análise estatística dos dados foi realizada por ANOVA one-way,
considerando significativamente diferentes quando p < 0,05.
74
5 RESULTADOS
5.1 ANÁLISE DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL
O óleo essencial extraído de L. origanoides (LOO) foi caracterizado por
CG-EM para detecção dos metabólitos e determinação quali-quantitativa da sua
composição, como mostrado na Tabela 4.
Tabela 4. Composição do óleo essencial de L. origanoides por CG-EM.
Composição KIlit KIcalc % ± DP
-tujeno 930 930 0,16±0,03
-pineno 939 938 Traço
Canfeno 954 954 0,14±0,03 Mirceno 990 992 0,51±0,14
-terpineno 1020 1019 0,46±0,12
p-cimeno 1026 1028 4,03±1,03 Limoneno 1029 1032 0,15±0,02
γ-terpineno 1064 1063 3,50±0,95 linalool 1196 1100 5,84±2,15 Canfora 1146 1148 1,69±0,57 Borneol 1169 1169 0,82±0,23
terpinen-4-ol 1177 1180 0,63±0,05 Timol metil eter 1235 1238 2,87±0,15
Timol 1290 1296 4,00±0,04 Carvacrol 1299 1311 53,89±0,70
Acetato de carvacrol 1372 1376 0,26±0,05 E- cariofileno 1419 1423 5,86±0,57
α-bergamoteno 1434 1438 0,28±0,02 Aromadendreno 1441 1442 1,13±0,10
α-humuleno 1454 1457 1,80±0,18 Biciclogermacreno 1500 1500 4,16±0,22
7-epi--selineno 1522 1521 0,43±0,05
Spatulenol 1578 1581 1,59±0,53 Óxido de cariofileno 1583 1586 0,73±0,43
Viridiflorol 1592 1594 0,18±0,04 Monoterpenos 78,95
Sesquiterpenos 16,16 Total identificados 95,11
KIlit = índice de Kovats da literatura; KIcalc = índice de Kovats calculado; DP = desvio padrão. Fonte:
próprio autor.
75
A partir dos dados de Índice de Kovats que indica a retenção experimental
dos componentes do óleo essencial, foi possível identificar o monoterpeno carvacrol
como componente majoritário, representando 53,89 ± 0,7 % da amostra, seguido do
sesquiterpeno E-cariofileno com 5,86 ± 0,57% e linalool com 5,84±2,15%, estando
os demais constituintes com um percentual abaixo de 5% na composição do óleo
essencial. Esses compostos se apresentam como potenciais marcadores sobre os
possíveis efeitos do LOO em modelos farmacológicos.
5.2 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ESPASMOLÍTICA E MECANISMO DE AÇÃO EM
MÚSCULO LISO DE TRAQUEIA ISOLADA DE COBAIA
O LOO foi utilizado para avaliar seu potencial efeito espasmolítico em traqueia
isolada de cobaia, a partir de contrações induzidas por carbacol ou histamina (1 µM),
dois agonistas que atuam, principalmente, nos receptores muscarínicos (M3) e
histamínicos (H1). Após estímulo contrátil foi realizada adição de LOO a cuba em
concentrações cumulativas (1 a 729 µg/mL) para observar o efeito relaxante do óleo
essencial frente a esses agonistas. Com isso, na Figura 3 tem-se que o efeito de
LOO sob essas contrações apresentaram efeito máximo (Emáx) igual a 100%, ou
seja, promoveram um relaxamento total da traqueia isolada de cobaia, com
diferença na concentração de LOO responsável por esse efeito. Nas contrações
induzidas por histamina o LOO na concentração de 27 µg/mL, enquanto nas
contrações induzidas por carbacol o LOO foi utilizado na concentração de
243 µg/mL, refletindo também na potência relativa do LOO frente a esses agonistas.
Os dados também foram expressos em potência relativa (CE50) do óleo, o que
demonstra uma maior potencia de LOO em relaxar a traqueia isolada de cobaias a
partir de contrações induzidas por histamina com CE50 = 9,92 (7,52-11,57) μg/mL
quando comparado a carbacol com CE50 = 52,21 (46,03-59,42) µg/mL. Os valores da
CE50 de LOO em contrações induzidas por histamina foram cerca de 6 vezes
menores do que as induzidas por carbacol, sendo estatisticamente diferentes, a
partir da análise estatística (teste-t), com o valor de p< 0,05.
76
Figura 3. Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina ou carbacol.
A, representa o gráfico concentração-resposta de LOO em contrações induzidas por histamina () e
carbacol (☐), com representação do efeito máximo obtido por LOO nessas condições. B,
representação dos valores de CE50 de LOO sobre contrações induzidas por histamina e carbacol.
n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: histamina vs carbacol). Dados expressos em média e
intervalo de confiança (95%).
Fonte: próprio autor.
Então, a partir da observação da ausência de relatatos para o óleo essencial
de L. origanoides sobre o relaxamento da musculatura lisa, utilizou-se de
ferramentas farmacológicas para entender o mecanismo de ação pelo qual LOO
promove relaxamento na musculatura lisa traqueal. Com base nisso, buscou-se
identificar se o LOO estaria agindo como: 1) ativador de canais para potássio;
2) agonista β-adrenérgico; 3) modulador da produção de prostanoides e
leucotrienos; 4) através da participação na via colinérgica; 5) influência na via do
NO/GMPc ou AMPc; ou 6) influência da via da GCs/PKG.
77
5.2.1 Investigação da participação de canais para K+ no relaxamento induzido
por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A priori, os resultados foram obtidos a partir do bloqueio dos canais para
potássio (K+), evidenciados na Figura 4, os quais permitem inferir que existe uma
interferência de LOO em alguns desses alvos.
Figura 4. Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença ou ausência de bloqueadores de canais para
potássio (K+).
A, B, C e D, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença de
bloqueadores de canais para K+. A, na presença de 4-aminopiridina (4-AP) na concentração de 2
mM. B, na presença de Glibenclamida (GLI) na concentração de 3 µM. C, na presença de Cloreto de
césio (CsCl) na concentração de 5 mM. D, na presença de Tetraetilamônio (TEA) na concentração de
78
3 mM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs presença dos bloqueadores). Dados
expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
Na presença de GLIB e CsCl as CE50 de LOO ficaram por volta de
5,64 ± 2,11 µg/mL e 11,10 ± 4,92 µg/mL, respectivamente, não apresentando
diferença significante. Já na presença de 4-AP e TEA houve uma redução na
potênca do LOO, apresentando valores na CE50 de 20,12 ± 3,53 e
20,18 ± 2,99 µg/mL, respectivamente, o que conferiu diferença significante (p < 0,05;
teste t-student) quando comparado ao controle que apresentou CE50 = 9,92 (7,52-
11,57) μg/mL, indicando que a via dos canais para K+ operados por voltagem e por
Ca2+ (Kv e KCa, respectivamente) podem influenciar no efeito de LOO sobre a
musculatura lisa traqueal.
5.5.2 Investigação da participação de receptores β-adrenérgicos e das
prostaglandinas no relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída
com histamina
Por ter relaxamento influenciados pela via do AMPc/PKA e pelos
prostanóides, investigou-se a influência de LOO no relaxamento da musculatura lisa
das vias aéreas, a partir do bloqueio da trandução de sinal desses alvos. Como
podem ser observadas na Figura 5, algumas dessas vias influenciararam na
atividade relaxante do óleo essencial em traqueia isolada de cobaia.
O valor da CE50 de LOO na presença de propranolol (PROP) foi de
6,56 ± 1,82 µg/mL, mostrando que, provavelmente, não influencia nessa via, pois
não apresentou alteração na CE50 que proporcionasse diferença significante.
Na presença de indometacina (IND) a CE50 foi de 7,45 ± 2,13 µg/mL, não
apresentando diferença significante quando comparado a CE50 de LOO na ausência
desse bloqueador. A partir desses dados, pode-se sugerir que não há influência da
via dos prostanoides no mecanismo relaxante de LOO em músculo liso traqueal.
Porém, quando houve pré-incubação de dexametasona (DEX), houve uma redução
da CE50 de LOO em contrações induzidas por histamina. Na presença de DEX, o
79
óleo essencial se apresentou com maior potência, com valores de CE50 na ordem de
2,59 ± 0,60 µg/mL, conferindo diferença significante (p < 0,05; teste t-student).
Figura 5. Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador β-adrenérgico e
inibidores da via dos eicosanóides.
A, B e C, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença dos
bloqueadores. A, na presença de propranolol (PROP) na concentração de 3 μM. B, na presença de
indometacina (IND) na concentração de 10 μM. C, na presença de dexametasona (DEX) na
concentração de 10 µM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs presença dos
bloqueadores). Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
80
5.5.3 Investigação da participação da via colinérgica no relaxamento induzido
por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A partir da observação do efeito relaxante de LOO sobre o músculo liso
traqueal, buscou-se analisar a influência ganglionar e muscarínica na atividade
relaxante do óleo essencial. Então foi utilizada atropina (ATR) e hexametônio (HEX)
para observar de que forma LOO promoveria seu efeito relaxante nas vias aéreas,
como mostra na Figura 6.
Os dados mostraram que LOO na presença de HEX apresentou uma
CE50 = 11,54 ± 2,88 µg/mL semelhante aos valores na ausência desse bloqueador,
não conferindo diferença significante. Por outro lado, o LOO na presença de ATR
apresentou-se com maior potência (CE50 = 3,95 ± 1,45 µg/mL) quando comparado o
efeito do óleo essencial na ausência desse bloqueador, o que representou uma
diferença significante (p<0,05; teste t-student).
Figura 6. Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueador ganglionar e
muscarínicos.
A e B, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença dos
bloqueadores. A, na presença de hexametônio (HEX) na concentração de 10 μM. B, na presença de
atropina (ATR) na concentração de 1 μM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs
presença dos bloqueadores). Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
81
5.5.4 Investigação da participação da via do óxido nítrico (NO) no relaxamento
induzido por LOO em traqueia pré-contraída com histamina
A análise das informações obtidas na literatura e na tentativa de desvendar o
mecanismo de ação de LOO foi necessária à utilização de bloqueadores que
estivessem envolvidos na via do óxido nítrico (NO) e na via que aumenta a
concentração de nucleotídeos cíclicos no meio citosólico da musculatura lisa. Para
tanto, utilizou-se a aminofilina (AMN), L-NAME e azul de metileno (AZM), como
bloqueadores, como mostrado na Figura 7.
Figura 7. Efeito relaxante de LOO em músculo liso traqueal em contrações
induzidas por histamina na presença e ausência de bloqueadores da via do
NO/GCs/GMPc.
A, B e C, representam gráficos de concentração-resposta de LOO, na ausência e presença dos
bloqueadores. A, na presença de aminofilina (AMN) na concentração de 1 µM. B, na presença de
82
Nω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) na concentração de 10 μM. C, na presença de azul de
metileno (AZM) na concentração de 25 μM. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs
presença dos bloqueadores). Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
Na presença de AMN a CE50 (8,71 ± 0,88 µg/mL) apresentada por LOO não
diferiu significantemente do valor obtido na sua ausência. Quando houve incubação
de L-NAME a CE50 (5,83 ± 1,83 µg/mL) também não proporcionou diferença
significante. No entanto, foi evidenciado que na presença de AZM, inibidor da guanilil
ciclase solúvel (GCs), a CE50 de LOO foi de 16,58 ± 1,85 µg/mL, apresentando
diferença significante, comparado a CE50 do óleo na ausência de bloqueadores
(p <0,05; teste t-student), sugerindo que pode existir uma contribuição da via do
NO/GCs no mecanismo de ação espasmolítica do óleo essencial.
Diante dos dados apresentados, pode-se observar na Figura 8, a
comparação entre a CE50 de LOO na ausência ou presença dos bloqueadores,
indicando que o óleo essencial de L. origanoides possui componentes que atuam
como relaxante do músculo liso das vias aéreas por diversas vias de transdução de
sinal.
Figura 8. Valores de CE50 de LOO na ausência e presença dos bloqueadores.
Valores de CE50 de LOO na ausência e presença de bloqueadores. LOO = óleo essencial de L.
origanoides; 4-AP = 4-aminopiridina; GLI = Glibenclamida; CsCl = Cloreto de césio; TEA =
83
Tetraetilamônio; ATR = Atropina, PROP = Propranolo; IND = Indometacina; DEX = Dexametasona; L-
NAME = Nω-nitro-L-arginina metil éster; AZM = Azul de metileno; AMN = Aminofilina; HEX =
Hexametônio. n = 5; * p < 0,05 (teste t-student não pareado: controle vs presença dos bloqueadores).
Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
5.5.5 Investigação da participação da via da guanilil ciclase solúvel (GCs) no
relaxamento induzido por LOO em traqueia pré-contraída com CCh
Para confirmar a importância da via GCs/GMPc/PKG sobre oefeito relaxante
de LOO no músculo liso traqueal, foram realizados experimentos envolvendo a
incubação de LOO nas concentrações de 9, 27 e 81 µg/mL, AMN na concentração
de 0,3 µM, nitroprussiato de sódio (NPS) na concentração de 3 µM e AZM na
concentração de 25 µM. Além disso, foi realizado o estudo com a incubação da
mistura desses bloqueadores e o LOO sobre contrações induzidas por CCh 1 µM.
Como mostrado na Figura 9, contrações sucessivas induzidas por CCh 1 µM
apresentaram uma resposta contrátil de 110,1 ± 9,85%. Quando havia a presença de
AMN 0,3 µM, as contrações obtiveram resposta de 115,9 ± 13,28%, não
proporcionando diferença significante. Na pré-incubação de AMN 0,3 µM em
conjunto com LOO nas concentrações de 9, 27 ou 81 µg/mL, pode-se perceber uma
redução na resposta contrátil, 96,83 ± 7,507% (LOO 9 µg/mL), 97,71 ± 9,904%
(LOO 27 µg/mL) e 47,44 ± 11,57% (LOO 81 µg/mL), sendo que nessa última
condição houve diferença significante (p < 0,05). No entanto esse valor não diferiu
daqueles em que o LOO 81 µg/mL foi incubado individualmente (61,92 ± 3,864%) e
testado frente à contração com CCh 1 µM. Essas informações confirmam que LOO
não atua na via da fosfodiesterase (Figura 7), no entanto, proporcionam um
aumento na inibição da contração em comparação a aminofilina na ordem de 15%
(LOO 81 µg/mL ≈ 60% e LOO 81 µg/mL com AMN 0,3 µM ≈ 45% de contração).
84
Figura 9. Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO e/ou
aminofilina.
Percentual de contração de CCh 1 µM na presença ou ausência de bloqueadores. AMN = aminofilina
(0,3 µM); LOO = óleo essencial de L. origanoides; H2O = água destilada. n = 5; * p < 0,05 (ANOVA
one-way com pós-teste de Tukey: AMN+H2O vs AMN+LOO 9, 27 ou 81 µg/mL ou LOO 81 µg/mL).
Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
Essas informações permitem inferir que LOO não atua sobre a
fosfodiesterase, pois haveria um efeito aditivo ou potencializador na inibição da
contração na presença de AMN em conjunto com LOO 81 µg/mL, haja vista que o
inibidor de PDE isolado não garantiu uma proteção frente à ação do carbacol. Além
disso, provavelmente não há uma ativação direta de PKG, pois haveria uma
potencialização de sua atividade catalítica por aumento na concentração de GMPc
nas células musculares lisas das vias aéreas.
Como a inibição da fosfodiesterase não potencializou o efeito de LOO,
utilizou-se de ferramentas farmacológicas que ajudassem a identificar a importância
de outros componentes da via NO/GMPc/PKG. Para tanto, empregou-se na
metodologia o nitroprussiato de sódio (NPS) na concentração de 3 µM, como doador
de NO, com o objetivo de observar potencialização da via de transdução de sinal e
relaxante do músculo liso traqueal. Então, como exposto na Figura 10A, pode-se
perceber que a atividade do CCh 1 µM, na presença de NPS, mostrou
126,3 ± 14,7% de contração, não sendo observada diferença significante quando
havia incubação comcomitante com LOO 9 µg/mL (127,2 ± 8,358%) e
LOO 27 µg/mL (89,25 ± 7,915%). Porém quando houve a incubação de
LOO 81 µg/mL o nível de resposta contrátil foi de 23,68 ± 7,963%, apresentando
% C
on
tra
çã
o
0
5 0
1 0 0
1 5 0
A M N + C C h
L O O 9 g /m L + A M N + C C h
L O O 2 7 g /m L + A M N + C C h
L O O 8 1 g /m L + A M N + C C h
L O O 8 1 g /m L + C C h
**
C C h
85
diferença significante (p < 0,05). Além disso, observou-se que LOO 81 µg/mL
potencializou o efeito NPS de quando comparado com LOO 81 µg/mL pré-incubado
na ausência de NPS (teste t, p<0,05), indicando influência sobre a GCs,
corroborando com os dados obtidos com adição de LOO cumulativamente na
presença de azul de metileno em contrações induzidas por histamina.
No sentido de confirmar a participação da GCs para o mecanismo de
relaxamento do LOO sobre musculatura lisa traqueal, adicionais protocolos foram
realizados com LOO 81 µg/mL na presença ou ausência de AZM 25 µM e
NPS 3 µM. Foi observado, como consta na Figura 10B, que na presença de água
destilada, NPS ou AZM com NPS, não houve diferença significante em relação a
repsota contrátil obtida pelo carbacol. Quando houve incubação de LOO 81 µg/mL,
foi apresentada uma contração de 61,92 ± 3,864%, a qual se apresentou diferente
de forma significativa (p<0,05; teste t), daquelas obtidas na presença de
LOO 81 µg/mL e NPS (23,68 ± 7,963%); ou o conjunto formado pela incubação de
LOO 81 µg/mL, AZM e NPS (26,62 ± 10,3%). O efeito potencializador, de forma
significante (p < 0,05), demonstra que a via do NO/GCs/GMPc/PKG pode estar
envolvida no mecanismo relaxante da traquea isolada de cobaia.
86
Figura 10. Análise da contração por CCh na ausência e presença de LOO,
nitroprussiato de sódio e/ou azul de metileno.
Percentual de contração de CCh 1 µM na presença ou ausência de ferramentas farmacológicas. NPS
= nitroprussiato de sódio (3 µM); LOO = óleo essencial de L. origanoides; H2O = água destilada; AZM
= azul de metileno. n = 5, *p < 0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de Tukey: NPS+H2O vs
NPS+LOO 9, 27 ou 81 µg/mL ou LOO 81 µg/mL), #p < 0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de
Tukey: LOO 81 µg/mL vs NPS + LOO 81 µg/mL ou LOO 81 µg/mL vs AZM + NPS + LOO 81 µg/mL ).
Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
5.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUSSÍGENA EM CAMUNDONGOS
Um fármaco ou produto natural para ser considerado antiasmático, deve
controlar diversos parâmetros como modular a expectoração, reduzir o tônus
bronquial, regular a tosse, ter efeito anti-inflamatório, dentre outras atividades. Logo,
% C
on
tra
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o
0
5 0
1 0 0
1 5 0
L O O 9 g /m L + N P S + C C h
N P S + C C h
L O O 2 7 g /m L + N P S + C C h
L O O 8 1 g /m L + N P S + C C h
L O O 8 1 g /m L + C C h*
#
*
C C h
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H 2 O + A Z M + N P S + C C h
L O O 8 1 g /m L + A Z M + N P S + C C h
L O O 8 1 g /m L + N P S + C C h
H 2 O + N P S + C C h
L O O 8 1 g /m L + C C h
*
* *##
B
87
o controle da tosse se faz importante, pois é um dos sintomas que agridem o
paciente asmático. Para uma observação mais completa sobre a ação de LOO, foi
conduzida observaçãodo efeito antitussígenoem um modelo experimental de tosse,
em camundongos.
Os animais separados por grupo (n = 5) e ainda sem tratamentoforam
expostos à nebulização de ácido cítrico 0,4 M, diluída em solução salina, por 3
minutos em câmara de vidro e apresentaram média de tosse de 10,8 ± 0,663 (CN –
NaCl 0,9%); 7,8 ± 2,154 (LOO 30mg/kg); 8 ± 1,517 (LOO 100 mg/kg); 7,4 ± 0,979
(LOO 300 mg/kg); e 6,6 ± 1,077 (CP – morfina 5 mg/kg). Passadas 23 horas e 30
minutos a primeira exposição, os animais foram tratados nos respectivos grupos, por
via IP, e após 30 minutos, ou seja, 24 horas após a primeira exposição, os animais
foram submetidos novamente à solução de ácido cítrico 0,4 M em câmara de vidro.
Após o tratamento com os testes e os controles (CN e CP) os animais
apresentaram as seguintes médias do número de tosse 8,2 ± 1,158 (CN); 7,5 ± 2,25
(LOO 30 mg/kg); 3,2 ± 0,663 (LOO 100 mg/kg); e 1 ± 0,632 (LOO 300 mg/kg); e
3 ± 0,707 (CP), mostrando uma redução na frequência de tosses em todos os
grupos, no entanto houve diferença significativa (p<0,05; teste t) para CP, LOO100 e
300 mg/kg, quando comparados ao CN.
Na observação da latência, ou seja, o tempo (em segundos) para se notar o
reflexo de tosse nos camundongos, após nebulização de ácido cítrico 0,4 M, diluída
em solução salina, por 3 minutos em câmara de vidro, os animais sem tratamento
apresentaram media de latência de 11 ± 1,817 (CN); 17,60 ± 4,179 (LOO 30 mg/kg);
10,80 ± 1,158 (LOO 100 mg/kg); 21,8 ± 6,515 (LOO 300 mg/kg); e
19,20 ± 5,704 (CP). De modo semelhante à frequência de tosse, observou-se uma
mudança no tempo de latência quando houve o tratamento e exposição 24 horas
após a primeira nebulização com ácido cítrico 0,4 M, apresentando média de
latência de 12,4 ± 2,315 (CN); 15,5 ± 3,862 (LOO 30 mg/kg); 12 ± 1,265 (LOO 100
mg/kg); 123 ± 34,91 (LOO 300 mg/kg); e 16,40±2,249 (CP), demonstrando que
houve diferença significativa entre o LOO300mg/kg em comparação ao CN (p<0,05;
teste t), Figura 11.
88
Figura 11. Análise de frequência de tosse e latência, obtidos na presença de LOO.
A, frequência de tosse a partir da exposição do ácido cítrico (0,4 M) após administração dos
tratamentos. B, latência, em segundos, para obtenção da primeira tosse após exposição ao ácido
cítrico (0,4 M) e tratamento. n = 5; * p < 0,05 (ANOVA two-way com pós-teste de Sidak). Dados
expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
5.4 AVALIAÇÃO DA COORDENAÇÃO MOTORA (TESTE DO ROTA-ROD)
Durante os estudos envolvendo o ensaio de tosse, observou-se que o óleo
essencial de L. origanoides na dose de 300 mg/kg modificou o comportamento. Após
o tratamento os acamundongos se apresentavam letárgicos ou com uma ambulação
reduzida. Isso permitiu uma análise profunda sobre o óleo essencial ter produzido
um efeito ansiolítico, sedativo ou até neurotóxico. Existem na literatura, diversos
métodos que podem indicar esses efeitos sobre os animais, sendo os modelos
experimentais de atividade motora em rota rod e o campo aberto, dois dos métodos
mais utilizados.
No modelo de Rota Rod, os camundongos tiveram que permanecer por
1 minuto ininterrupto para estarem aptos ao prosseguimento do experimento. Após
89
isso, os mesmos foram separados por grupo de forma aleatória com administração
dos tratamentos 23 horas e 30 minutos depois, para que fosse dado prosseguimento
24 horas após o treinamento, sendo avaliados o número de quedas e o tempo de
permanência na barra (em segundos).
Os animais separados por grupo (n = 5) e tratamentos apresentaram média
de quedas de 0,4 ± 0,245 (CN –NaCl 0,9%); 0,6 ± 0,6 (LOO 30 mg/kg); 2,4 ± 1,503
(LOO 100 mg/kg); 3,2 ± 2,709 (LOO 300 mg/kg); e 13,25 ± 5,693 (CP – diazepam
2,5 mg/kg), após 30 minutos de administração dos tratamentos, por via
intraperitoneal. Passados 60 minutos da administração os animais apresentaram
0±0 (CN); 0,8±0,49 (LOO 30 mg/kg); 1 ± 0,6325 (LOO 100 mg/kg); e 0,2 ± 0,2
(LOO 300 mg/kg); 0,2 ± 0,2 (CP) no número de quedas. Após 120 minutos da
administração, os animais apresentaram 0,2 ± 0,2 (CN); 1,6 ± 1,364
(LOO 30 mg/kg); 1,4 ± 1,166 (LOO100 mg/kg); 8,8 ± 3,68 (LOO300 mg/kg); e 0 ± 0
(CP) quedas no aparelho de rota Rod, como mostrado na Figura 12.
Nessa última avaliação, tempo de 120 minutos, o LOO apresentou um
possível efeito sobre o sistema nervoso central que afetou a coordenação motora
dos camundongos, quando comparado com o CN e o CP (p<0,05).
Outra forma de avaliação foi o tempo de permanência na barra do aparelho
durante os 3 minutos de rotação. Dessa forma, os camundongos apresentaram um
tempo médio, em segundos, de permanência na barra na ordem de 178,2 ± 1,2
(CN); 177,4 ± 2,6 (LOO 30 mg/kg); 172 ± 4,658 (LOO 100 mg/kg); 156,6 ± 3,789
(LOO 300 mg/kg); e 137,3 ± 19,93 (CP – diazepam 2,5 mg/kg), após 30 minutos da
administração dos tratamentos. No tempo de 60 minutos da administração, a
permanência na barra foi de 180 segundos (CN); 176,6 ± 2,088 (LOO 30 mg/kg);
176,6 ± 2,135 (LOO 100 mg/kg); 179,4 ± 0,6 (LOO 300 mg/kg); e 179,4 ± 0,6 (CP).
Após 120 minutos da administração a média de tempo de permanência na barra foi
de 179,4 ± 0,6 (CN); 173±5,831 (LOO 30 mg/kg); 176 ± 3,098 (LOO 100 mg/kg);
136 ± 6,45 (LOO 300 mg/kg); e 180 segundos (CP), como mostrado na Figura 12.
No tempo de 120 minutos, o LOO apresentou uma redução no tempo de
permanência na barra do rota rod de forma significativa quando comparada ao CN
(p<0,05).
90
Figura 12. Número de quedas e tempo de permanência dos camundongos no aparelho rota-rod.
Os gráficos representam o número de quedas e tempo de permanência na barra dos animais na barra do Rota Rod. Em A, está representada o número de
quedas após 30 minutos; B, número de quedas após 60 minutos; C, número de quedas após 120 minutos da administração dos tratamentos; D, tempo de
permanência na barra após 30 minutos; E, tempo de permanência na barra após 60 minutos; F, tempo de permanência na barra após 120 minutos. n = 5,
* p<0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de Tukey). Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
A
nº
de
qu
ed
as
CN
LO
O 3
0m
g/k
g
LO
O 1
00m
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g
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P
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B
nº
de
qu
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LO
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g
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g
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1 0
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C
nº
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CN
LO
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g
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*
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E
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CN
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g
LO
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g
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gC
P
0
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2 0 06 0 m in
F
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mp
o n
a b
arra
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)
CN
LO
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g
LO
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g
LO
O 3
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g/k
gC
P
0
4 0
8 0
1 2 0
1 6 0
2 0 0
*
1 2 0 m in
91
Além dessas análises, foi observada a correlação tempo resposta de
LOO 300 mg/kg, haja vista seu potencial em modular a fisiologia do sistema nervoso
central. Para tanto, os dados coletados foram estendidos com mais duas avaliações,
no tempo de 240 e 480 minutos após administração de LOO. Os dados mostraram
uma correlação tempo resposta significante do LOO 300 mg/kg no que tange o
número de quedas (r = 0,8204; p = 0,0342), porém não apresentou correlação
significante para tempo de permanência na barra (r = 0,7684; p = 0,0511), como
apresentados na Figura 13.
Percebe-se, a partir dos dados, a existência de uma relação tempo-resposta
farmacológica que influenciou diretamente nos dados apresentados. A média de
quedas dos animais nos tempos de 240 e 480 minutos foi de 20,5 ± 1,041 e
24,5 ± 1,19 com os tempos de permanência na barra, em segundos, de
105,5 ± 5,694 e 97,75 ± 3,351, respectivamente.
Figura 13. Análise de LOO na dose de 300 mg/kg, em relação ao tempo.
Em A, análise exponencial do número de quedas e, em B, tempo de permanência dos animais na
barra do rota-rod após administração de LOO 300 mg/kg, no decorrer do tempo. n = 5, *p < 0,05
(Correlação de Pearson). Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
Os dados apresentados após 30 minutos da administração comparados com
60 minutos, para quedas e tempo na barra, não apresentaram diferença estatística.
92
De modo semelhante, os dados de 240 e 480 minutos, partindo da administração
dos testes, também não apresentaram diferença. Por outro lado, a partir de 60
minutos os animais apresentaram um efeito proeminente de característica sedativa,
ansiolítica ou neurotóxica, até os 240 minutos (p<0,05), onde parece se estabelecer
um efeito constante de LOO, como observado na Figura 13.
5.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE MOTORA E ANSIOLÍTICA ATRAVÉS DO
MÉTODO DE CAMPO ABERTO
As evidências de uma ação sobre o sistema nervoso central promovido por
LOO tornou necessária à realização do experimento com campo aberto para avaliar
além da atividade motora, mas também o efeito ansiolítico promovido pelo óleo
essencial.
Os animais submetidos aos tratamentos NaCl 0,9% (CN), LOO 30, 100 e
300 mg/kg e diazepam 2,5 mg/kg (CP) foram expostos a análise comportamental e
os dados numéricos foram apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Dados numéricos dos parâmetros analisados no campo aberto.
nº de
rearing
nº de
grooming
Latência
(s)
nº de
cruzamentos
Tempo de
imobilidade
(s)
nº de
bolos
fecais
CN 9,2±1,83 2,4±0,24 8,2±3,83 64,5±4,13 31,4±6,43 2,2±0,86
LOO
30 4,4±3,41 2,8±0,58 2,6±0,68 47,6±7,5 71,2±12,56 0,0±0,0
LOO
100 1,8±1,56 1,8±1,11 16±6,25 26,2±8,09 136,8±24,26* 0,6±0,6
LOO
300 0,0±0,0* 0,0±0,0 9,4±5,10 15,6±2,25* 200,6±13,53* 0,8±0,58
CP 0,25±0,25* 4,800±0,86 6,6±1,83 63,25±18,74 120,8±36,74* 1,4±0,93
CN = NaCl 0,9%; LOO30 = LOO 30 mg/kg; LOO100 = LOO 100 mg/kg; LOO300 = LOO 300 mg/kg;
CP = Diazepam 2,5 mg/kg. n = 5; *p < 0,05 (ANOVA one-way com pós-teste de Tukey). Dados
expressos em média ± E.P.M.
Fonte: próprio autor.
93
Nesse teste, o LOO na dose de 300 mg/kg apresentou diferença significante
(ANOVA-one way, p < 0,05) quando comparada ao grupo que foi tratado com
NaCl 0,9% nos parâmetros de número de rearings (0,0 ± 0,0 vs 9,2 ± 1,83), número
de cruzamentos (15,6 ± 2,25 vs 64,5 ± 4,13), e tempo de imobilidade (200,6 ± 13,53
vs 31,4 ± 6,43), como mostrados na Figura 14.
Figura 14. Principais parâmetros de avaliação no campo aberto.
A, nº de rearing; B, nº de cruzamentos; e C, tempo de imobilidade (s) dos camundongos após o
tratamento com NaCl 0,9% (CN), LOO nas doses de 30, 100 e 300 mg/kg e diazepam 2,5 mg/kg
(CP). n = 5; *p < 0,05 (ANOVA one-way com pós teste de Tukey). Dados expressos em média ±
E.P.M.
Fonte: próprio autor.
A
nº
de
re
arin
g
CN
LO
O 3
0 m
g/k
g
LO
O 1
00 m
g/k
g
LO
O 3
00 m
g/k
gC
P
0
2
4
6
8
1 0
1 2
* *
B
nº
de
cru
za
me
nto
s
CN
LO
O 3
0 m
g/k
g
LO
O 1
00 m
g/k
g
LO
O 3
00 m
g/k
gC
P
0
1 5
3 0
4 5
6 0
7 5
9 0
*
C
Te
mp
o d
e i
mo
bil
ida
de
(s
)
CN
LO
O 3
0 m
g/k
g
LO
O 1
00 m
g/k
g
LO
O 3
00 m
g/k
gC
P
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
*
**
94
Isso demonstra que o óleo essencial de L. origanoides nessas doses
apresenta efeito na redução da locomoção e, de modo geral, tem atividade
ansiolítica. Os outros parâmetros não apresentaram diferenças significativas nesse
teste, porém isso não exclui a possibilidade de eventos em nível de SNC que
proporcionem efeito ansiolítico/sedativo.
5.6 APERFEIÇOAMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE EXPECTORANTE A PARTIR DA QUANTIFICAÇÃO DO MARCADOR
VERMELHO DE FENOL
5.6.1 Influência do pH da quantificação de vermelho de fenol por
espectrometria de absorção no UV-VIS
O vermelho de fenol é um agente indicador amplamente utilizado em
titulações potenciométricas e determinações de pH (KRISTENSEN; LESTER;
JÜRGENS, 1925; ROBERT-BALDO; MORRIS; BYRNE, 1985). Sendo também
utilizado com indicador para determinação de algumas atividades biológicas e
análises microbiológicas (CHASIS et al., 1938; CONN, 2013; CSEKE et al., 2003;
RODKEY, 1961; VOGEL, 2008). A diversidade de usos para o indicador vermelho de
fenol advém da sua capacidade de mudança de coloração e consequente
absorbância a depender do pH da solução em que se encontra, como pode ser
observado na Figura 15.
Para utilização do vermelho de fenol na determinação da atividade
expectorante in vivo, a literatura cita a basificação do meio quantificando o vermelho
de fenol desprotonado nas duas hidroxilas fenólicas (em pHs superiores a 8,5) em
que apresenta uma coloração fúcsia.
95
Figura 15. Distribuição das espécies iônicas de vermelho de fenol de acordo com a
variação do pH.
Fonte: Próprio autor.
Sendo assim, foi realizado a varredura, em espectrofotômetro, da amostra de
LBA com adição de vermelho de fenol com e sem agente basificante para
verificação do comprimento de onda de absorção máxima (λmáx), buscando maior
seletividade analítica. Como pode ser observado na Figura 16, a mudança de pH
acarreta um deslocamento do λmáx de 435 para 565 nm.
96
Figura 16. Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em
pHs diferentes
Fonte: Próprio autor.
5.6.2 Quantidade de agente basificante adicionada as amostras de LBA
Na avaliação da quantidade do agente basificante para quantificação do
vermelho de fenol, inicialmente foi verificado se o comprimento de onda de absorção
máxima do indicador sofreria algum deslocamento batocrômico por influência do
agente basificante. Portanto, Figura 17, é possível evidenciar que independente do
agente basificante utilizado a absortividade do vermelho de fenol não altera,
permanecendo em 565 nm.
97
Figura 17. Varredura em espectrofotômetro da solução de vermelho de fenol em
condições básicas obtidas por NaOH e NaHCO3.
Fonte: Próprio autor.
No que diz respeito à quantidade de agente basificante, foi evidenciado que
em já publicados, referenciados no Tabela 3, houve utilização de excesso de agente
basificante, como pode ser observado na Tabela 6 a partir dos dados obtidos em
relação ao pH do meio, o qual está inserido o vermelho de fenol e sua absorbância.
Tabela 6. Resultado da relação absorbância média de pH da amostra de LBA.
[NaOH] pH médio DP DPR (%) ABS média DP DPR (%)
1,0.10-5 8,01 0,09 1,11 0,011 0,01 10,78
5,00.10-5 7,49 0,11 1,43 0,054 0,02 45,25
5,00.10-4 9,74 0,51 5,26 0,854 0,02 2,34
1,00.10-3 10,44 0,41 3,92 0,856 0,02 1,80
0,05 12,69 0,01 0,12 0,876 0,01 1,08
0,1 12,97 0,01 0,12 0,877 0,01 0,69
0,2 13,25 0,02 0,15 0,856 0,01 0,67 [NaOH] – concentração de hidróxido de sódio adicionada a amostra de LBA; LBA – lavado bronco
alveolar; DP – desvio padrão; DPR – Desvio padrão relativo.
Fonte: Próprio autor.
98
Logo, não há necessidade da adição de grandes concentrações de NaOH
para mudança do pH das amostras de LBA. Assim sendo, foi selecionada a adição
de alíquotas de 50 µL de NaOH na concentração de 0,001 M para a validação da
metodologia analítica.
5.6.3 Validação da metodologia analítica
A seletividade do método foi verificada com a sobreposição dos espectros de
absorção das amostras de LBA sem adição e com a adição de vermelho de fenol.
Como pode ser observado na Figura 18, o método demonstrou-se seletivo, pois a
absortividade do LBA não é considerável no comprimento de onda de 565 nm,
selecionado para desenvolvimento do método de quantificação do vermelho de fenol
no LBA.
Figura 18. Varredura espectrofotométrica das amostras de LBA na presença e
ausência de vermelho de fenol.
Fonte: Próprio autor.
99
Para avaliar o parâmetro de linearidade da resposta espectrofotométrica do
vermelho de fenol, foi realizada a regressão linear a partir da média das três curvas,
sendo a equação obtida y=0,1741x + 0,0168em que y é a absorbância (UA) e x é a
concentração (µg/mL), como mostrada na Figura 19.
Figura 19. Regressão linear das soluções de vermelho de fenol.
Os pontos escuros representam as concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0 µg/mL de vermelho de
fenol.
Fonte: Próprio autor.
Os resultados da regressão para coeficiente de determinação (R2) foi de 0,99,
comprovando que mais de 99% do método apresentou linearidade satisfatória entre
o aumento da concentração do analito e a resposta espectrofotométrica. Com limites
de detecção (LD) de 0,76 µg/mL e quantificação (LQ) de 2,50 µg/mL, demonstrando
a acuracidade do método.
Quanto aos parâmetros de repetitividade os valores apresentaram DPR de
7,32% e os valores de taxa de recuperação, foi observada uma exatidão média de
106,36 % (DP = 2,03).
100
5.6.4 Determinação da solubilidade do vermelho de fenol em salina e em LBA
A determinação do coeficiente de solubilidade do vermelho de fenol em
solução salina foi de Cs = 0,0036 g/L, sendo esse resultado de extrema importância
para o desenvolvimento da suspensão extemporânea de administração in vivo.
5.6.5 Desenvolvimento de suspensão extemporânea estável de vermelho de
fenol
A avaliação da concentração da suspensão do indicador vermelho de fenol foi
necessária, haja vista sua baixa solubilidade em solução salina, produzindo
suspensões fisicamente instáveis. As suspensões fisicamente instáveis produzem
um sedimento defloculado, denso e de difícil redispersão. A utilização de sistemas
defloculados prejudicam a execução do protocolo farmacológico experimental por
apresentar problemas de não uniformidade de dose administrada aos animais,
interrupção da administração devido a obstrução de agulhas e irritabilidade local
pela presença de alta quantidade de partículas sólidas (AULTON, 2005).
Sendo assim, foi verificada pela altura do sedimento formado a estabilidade
em 24h após a obtenção de suspensões nas concentrações de 1,25%, 2,5% e 5%
dispersas em solução salina, com resultados expressos na Tabela 7, mostrando que
a suspensão na concentração de 1,25% de vermelho de fenol forma um sedimento
de maior altura e consequentemente de mais fácil redispersão que as demais.
101
Tabela 7. Verificação na altura do sedimento das partículas do vermelho de fenol.
% de vermelho de fenol
em suspensão
Média da altura do
sedimento formado
DP da altura do
sedimento formado
1,25 1,35 0,25
2,5 1,20 0,30
5 1,22 0,22
DP – desvio padrão.
Fonte: Próprio autor.
5.6.6 Aplicação da metodologia analítica para avaliação de atividade
expectorante in vivo
Para avaliar a dose e concentração de vermelho de fenol em que ele seria
detectado com maior eficiência pelo espectrofotômetro, foram necessários testes
para unificar os dados e otimizar o processo. A partir disso, como mostrada na
Figura 20, foi observado que a dose de 500 mg/kg apresentou diferença significativa
no que diz respeito a dosagem de vermelho de fenol.
Figura 20. Quantificação de vermelho de fenol a partir de dose fixa e concentrações
variáveis.
A, teste de doses diferentes para secreção do vermelho de fenol. B, utilização de 3 concentrações de
vermelho de fenol na dose de 500 mg/kg para avaliar a que permite melhor secreção no LBA. n = 5, *
p<0,05 (ANOVA one-way com pós teste de Tukey). Dados expressos em média ± E.P.M.
Fonte: Próprio autor.
102
Observa-se que na concentração de 1,25% ou 12,5 mg/mL a com maior
possibilidade de sua secreção nas vias aéreas, haja vista maior possibilidade de
partículas dispersas em suspensão.
Os dados obtidos no decorrer do aperfeiçoamento do método corroboram
com alguns dados da literatura e refuta outras informações, como mostrado na
Tabela 8. Nesse sentido, foi evidenciado o melhor comprimento de onda (565 nm),
agente basificante (NaOH), dose de vermelho de fenol (500 mg/kg) e concentração
da suspensão de vermelho de fenol (1,25% ou 12,5 mg/mL). Além disso, foi possível
observar que 0,001 M de NaOH é o suficiente para mudar a coloração do vermelho
de fenol (amarelo para fúcsia), sendo uma concentração 100 vezes menor do que a
observada na maioria dos estudos da literatura.
103
Tabela 8. Dados observados nos protocolos experimentais da literatura.
Fármacos Dose (mg/kg) Via de
administração
Comprimento
de onda (nm)
Agente
basificante
Dose de
vermelho de
fenol (mg/kg)
Concentração
do vermelho
de fenol
Referência
Ambroxol
1 V.O 535 NaOH 200 1% Alves et al.,
2014
143 V.O 546 NaOH 500 5% Lin et al., 2008
250 V.O 546 NaOH 200 µL 2,5% Song et al.,
2015
Carbacol 0,03; 0,06;
0,125 S.C 546 NaOH 500 5%
Engler,
Szelenyi, 1984
Cloreto de
Amônio
(NH4Cl)
250 V.O 546 NaHCO3 - 2,5% Yu et al., 2015
1000
V.O 546 NaOH 500 5% Engler,
Szelenyi, 1984
V.O 558 NaHCO3 500 - Jiang et al.,
2014
104
Tabela 8. Dados observados nos protocolos experimentais da literatura (Continuação).
Fármacos Dose (mg/kg) Via de
administração
Comprimento
de onda (nm)
Agente
basificante
Dose de
vermelho de
fenol (mg/kg)
Concentração
do vermelho
de fenol
Referência
Cloreto de
Amônio
(NH4Cl)
1000
V.O 546 NaHCO3 - 5% Han et al.,
2010
V.O 558 NaHCO3 500 5% Ge, Liu, Su,
2009
V.O 546 NaOH 500 5% Liu, Wang,
Liu, 2009
V.O 546 NaHCO3 - 5% Chakraborty et
al. 2013
V.O 558 NaHCO3 500 5% Ge et al., 2015
V.O 570 NaOH 200 2,5% Guo et al.,
2009
V.O 558 NaHCO3 500 5% Koffuour et al.
2014
105
Tabela 8. Dados observados nos protocolos experimentais da literatura (Continuação).
Fármacos Dose (mg/kg) Via de
administração
Comprimento
de onda (nm)
Agente
basificante
Dose de
vermelho de
fenol (mg/kg)
Concentração
do vermelho
de fenol
Referência
Cloreto de
Amônio
(NH4Cl)
1000
V.O 550 NaOH 500 - Wong et
al.,2015
V.O 558 NaHCO3 500 5% Dapaah et al.,
2016
V.O 546 NaOH 500 5% Lin et al., 2008
1500
V.O 558,5 NaHCO3 500 5% Wang et al.,
2012
V.O 546 NaOH 500 5% Shang et al.,
2010
V.O 546 NaOH 500 5% Liu et al., 2015
2000 V.O 546 NaOH 500 5% Engler,
Szelenyi, 1984
106
Tabela 8. Dados observados nos protocolos experimentais da literatura (Continuação).
Fármacos Dose (mg/kg) Via de
administração
Comprimento
de onda (nm)
Agente
basificante
Dose de
vermelho de
fenol (mg/kg)
Concentração
do vermelho
de fenol
Referência
Emetina 50/100 V.O 546 NaOH 500 5% Engler,
Szelenyi, 1984
Guaifenesina 50
V.O 557 NaHCO3 500 5% Zhou et al.,
2013
V.O 558 NaOH 500 5% Zhang et al.,
2009
500/1000 S.C 546 NaOH 500 5% Engler,
Szelenyi, 1984 Iodeto de
potássio 4000/5000 V.O 546 NaOH 500 5%
Salbutamol
3/10 V.O 546 NaOH 500 5% Chand et al.,
1993
4/8 V.O 546 NaOH 500 5% Engler,
Szelenyi, 1984
2/4 V.O 546 NaOH 100 1% Fernandez et
al., 2009
(-) representam os dados não informados nos estudos. Fonte: Próprio autor.
107
6 DISCUSSÕES
O óleo essencial de L. origanoides (LOO) apresentou percentual maior
do que 50% da sua composição do monoterpeno alcoólico carvacrol que é
encontrado em concentrações elevadas também no óleo essencial de Thymus
vulgaris, uma planta amplamente distribuídana Europa, sendo utilizado como
um aditivo de sabor em alimentos e bebidas. Ressalta-se que outras espécies
e subtipos de plantas do gênero Thymus, como a Thymus spathulifolius,
Thymus serpylluse Thymus capitata, apresentam um alto percentual de
carvacrol no óleo essencial, cerca de 30%, 58% e 79%, respectivamente
(BUCHBAUER, 2010; JÄGER, 2010).
Diversas outras plantas apresentam carvacrol na sua composição. Em
relação a L. origanoides um estudo de Tangarife-Castaño e colaboradores
(2011) mostrou uma composição do óleo essencial de 17,3% de carvacrol.
Outros pesquisadores, como Escobar e colaboradores (2010), mostraram que
o local de coleta pode influenciar na composição química do óleo essencial de
L. origanoides. Foi demonstrado que da coleta de 6 amostras, em locais
diferentes da Colômbia, houve uma variação na concentração do carvacrol (0,5
a 46,2 %), influenciando, inclusive, na sua atividade antiparasitária e citotóxica.
Já Muños-Acevedo, Kouznetsov e Stashenko (2009) identificaram um
percentual de 44,4% de carvacrol no óleo essencial de L. origanoides em
cultivos experimentais na Colômbia.
Além de ser encontrado no óleo essencial de alguns subtipos de
L. origanoides, foi relatada a presença de carvacrol na fração hexânica do
extrato dessa espécie, por Barreto e colaboradores (2014), coletada no Piauí-
PI, apresentando um percentual de 36,17% na composição química e 1,77% na
fração diclorometânica.
Uma análise de extrema relevância em relação à espécie L. origanoides,
foi a identificação de quimiotipos dessa planta medicinal, realizada por Zapata
e colaboradores (2009) e Betancur-Galvis e Colaboradores (2011), a partir de
dados obtidos por Stashenko e colaboradores (2008), isso permitiu a
caracterização de 3 quimiotipos obtidos na Colômbia: carvacrol, timol e trans--
cariofileno/ρ-cimeno, sendo que algumas das amostras, nos estudos de Zapata
108
e colaboradores (2009), apresentaram cerca de 46,2% de carvacrol, entretanto
outras amostras das plantas nos estudos de Betancur-Galvis e colaboradores
(2011), apresentaram cerca de 36,5 ou 38,8 % de carvacrol.
Essas informações podem sugerir que o quimiotipo de L. origanoides
utilizado nesse estudo seja o carvacrol, visto que esse monoterpeno tem
concentraçãoa cima de 50% no óleo essencial. Além disso, podem indicar que
os dados referentes aos efeitos farmacológicos podem estar relacionados a
esse componente majoritário, porém não se descarta a atividade de outros
componentes ou até um efeito sinérgico entre os mesmos.
O estudo envolvendo a capacidade do LOO em relaxar a musculatura
lisa traqueal de cobaias foi avaliado frente a contrações induzidas por carbacol
ou histamina. O LOO promoveu relaxamento da musculatura lisa em ambos os
estímulos contracturantes. No entanto, houve diferença significante (p < 0,05)
em relação à potência de LOO frente às contrações induzidas por histamina em
comparação àquelas promovidas por carbacol.
Essa informação pode ser explicada, pois os receptores muscarínicos
são expressos em quase todos os tipos de células das vias aéreas e dos
pulmões, além da musculatura lisa vascular e do sistema respiratório, células
epiteliais glandulares, células endoteliais e várias células inflamatórias, sendo
que normalmente encontra-se o receptor muscarínico M2, acoplado a proteína
Gi e promove a inibição do AMPc-PKA, além de inibir a abertura dos canais
para potássio de forma não seletiva, e o M3 que é acoplado a proteína Gq-
PLC-IP3/DAG-PKC, promovendo efeitos contracturantes sobre a musculatura
lisa das vias aéreas em ambos (COULSON, FREYER, 2003; RACKÉ,
JUERGENS, MATTHIESEN, 2006).
Os receptores M2 são mais abundantes do que os M3 na musculatura lisa
das vias aéreas (proporção de 4:1), apesar disso, os receptores M3 são os
principais responsáveis pela contração brônquica e traqueal no músculo liso,
devido à importância da proteína Gq, o que foi evidenciado com estudo de
afinidade funcional de vários antagonistas seletivos em tecidos das vias aéreas
de diversas espécies, inclusive seres humanos. Os mecanismos envolvidos na
contração muscarínica são diversos, sendo relatado a ativação da CD38, uma
proteína que modula ação da ribose de adenosina difosfato cíclica (ADPRc) e
permite a ativação da quinase da cadeia leve de miosina (MLCK). Além disso,
109
Rho quinase também está envolvida inibindo a fosfatase da cadeia leve de
miosina (MLCP), promovendo uma exarcebação da contração (GOSENS et al.,
2006).
Por outro lado, a histamina exerce seus efeitos sobre a musculatura lisa
das vias aéreas, in vitro e in vivo, através dos receptores H1 (acoplados a
proteína Gq-PLC-IP3/DAG-PKC). Esses receptores podem ser bloqueados por
antagonistas clássicos dos receptores H1, como a clorfeniramina, mepiramina,
loratadina, dentre outros. Alguns estudos sugerem a presença de receptores H2
(acoplados a proteína Gs-AMPc-PKA) nas vias aéreas, sendo que níveis
elevados de AMPc-PKA estão ligados ao processo relaxante da musculatura
lisa, porém sua importância ainda permanece desconhecida (BARNES, 1989;
ESCH, LEURS, 2008; STARK, 2007).
Historicamente, os anti-histamínicos foram verificados por meio de
ensaios farmacológicos em íleo de cobaia ou músculo liso traqueal, sendo
observado que as substâncias que promoviam um deslocamento paralelo na
concentração-resposta de histamina poderiam ser classificadas como
antagonistas competitivos para receptores de histamina, principalmente H1
(CRIADO et al., 2010).
No intuito de observar a participação dos canais para potássio no
processo relaxante e observar outras vias de sinalização que pudessem
evidenciar o mecanismo de ação de LOO, os canais para potássio foram
bloqueados para análise. Neste protocolo, foi observado que LOO pode estar
envolvido na abertura dos canais para potássio operados por voltagem (Kv) e
também com os canais para potássio operados por cálcio (BKCa).
O desenvolvimento de fármacos que abrem os canais para K+ no
músculo liso despertou o interesse nesses canais iônicos, pois tais fármacos
podem relaxar o músculo liso das vias aéreas e reduzir a hiperreatividade em
pacientes asmáticos. Além disso, existe uma grande diversidade de canais
para K+ em diferentes tecidos, levantando a possibilidade de que fármacos
seletivos para esses canais também podem apresentar um benefício
terapêutico (BLACK, BARNES, 1990).
A contractilidade da musculatura lisa bronquial pode ser dependente de
um fluxo iônico através da membra plasmática que alteram a sensibilidade
desse tecido aos agentes agonistas. Isso permite crer que a modulação de
110
canais para potássio, por exemplo, seja de extrema importância no mecanismo
de relaxamento da musculatura lisa, principalmente porque na fisiologia
existem formas de controle desses canais para a contração e relaxamento nas
vias aéreas e fármacos que atuem nesses canais podem promover efeitos
terapêuticos (BLACK, BARNES, 1990; PELAIA et al., 2002).
Esses canais têm sido associados com a repolarização de células
excitáveis após despolarização, promovendo hiperpolarização, e os fármacos
que os bloqueiam, como 4-AP e TEA, causam um aumento da excitabilidade e
contratilidade, inclusive na musculatura lisa das vias aéreas (BLACK, BARNES,
1990; FUKUSHIMA et al., 1996; PELAIA et al., 2002).
Estudos concluíram que as vias aéreas de cobaias e humanos podem
ser moduladas pela aplicação de ativadores ou bloqueadores de canais para K+
operados por voltagem (KV7), sugerindo que esses canais tem o potencial de
regular o diâmetro e são responsáveis por manter o tônus basal nas vias
aéreas, podendo ser considerados broncodilatadores úteis (JEPPS, OLESEN,
GREENWOOD, 2013).
Os canais para potássio são de extrema importância para o tônus
muscular das vias aéreas, incluindo os Kir e KATP que também são bloqueados
por 4-AP e TEA de maneira inespecífica, por modular as concentrações de
Ca2+ no meio citosólico (LI et al., 1997; OONUMA et al., 2002)
Além disso, é relatado na literatura que os canais para potássio ativados
por cálcio (KCa) são de extrema importância no processo de regulação da
contratilidade da musculatura lisa das vias aéreas, sendo os de grande
condutância (BKCa) os mais relevantes nesse processo, haja vista que e a
atuação de ferramentas farmacológicas dependentem da composição das
subunidades formadoras desses canais, como é o caso da dependência da
ativação por 4-AP (LI et al., 2014). Poucos fármacos ou produtos naturais
atuam nesses canais para potássio, sendo importante ressaltar que a abertura
desses canais se dá por atuação de mecanismos independentes e
dependentes de AMPc, por exemplo, o efeito broncodilatador de agonistas 2-
adrenérgicos (PELAIA et a., 2002).
Testai e colaboradores (2016) identificaram que o carvacrol, componente
majoritário de LOO, promovia efeito relaxante na musculatura vascular, através
111
da ativação dos Kv, uma evidência importante para inferência do mecanismo de
ação de LOO sobre o músculo liso traqueal.
Na busca pelo mecanismo de ação pelo qual LOO promovia efeito
relaxante do músculo liso traqueal, foram observados novos alvos de fármacos.
Dentre eles, foi analisada a via dos prostanoides e atividade agonista -
adrenérgica. Evidenciando que o LOO, na presença de dexametasona,
promovia efeito relaxante traqueal potencializado.
Importante observar que o metabolismo do ácido araquidônico, a partir
de fosfolipídios de membrana, promovida pela fosfolipase A2 gera compostos
que podem atuar de forma parácrina e autócrina no organismo, dentre eles se
encontram os leucotrienos, prostaglandinas e tromboxanos que tem papel
crucial na patogênese da asma (ZASLONA, GOLDEN, 2015).
As prostaglandinas e tromboxanos são produzidos pelo metabolismo do
ácido araquidônico pelas isoenzimas da ciclooxigenase (COX), enquanto que
os leucotrienos são produzidos pela enzima lipoxigenase (LOX), sendo que
esses produtos são caracterizados, principalmente, em problemas
inflamatórios, como é o caso da asma, inclusive sendo alvo de fármacos por
regular toda a homeostasia da função das vias aéreas (MONTUSCHI et al.,
2007; ZASLONA, GOLDEN, 2015).
Essas informações da literatura ajudam a compreender os dados
obtidos, em que na presença de IND (inibidor não seletivo da COX) a CE50 =
7,452 ± 2,135 µg/mL não apresentou diferença significante com os valores na
ausência desse bloqueador (9,927 ± 1,888 µg/mL), sendo que de forma
diferente, houve diferença significante na presença de DEX (CE50 =
2,587 ± 0,599 µg/mL) que tem como um dos efeitos farmacológicos ser um
inibidor da fosfolipase A2 (PLA2) e síntese proteica. Isso pode mostrar uma
influência intensa dos prostanoides e leucotrienos nos mecanismos de
contração da musculatura lisa. Porém, quando a produção dos prostanoides é
interrompida, através da ação da indometacina, não há influência no
relaxamento das vias aéreas exercido por LOO. Entretanto, quando
dexametasona promoveu a redução na produção de prostanoides e
leucotrienos, a resposta relaxante de LOO foi potencializada, mostrando o
papel crucial da via da lipoxigenase e produção de leucotrienos no mecanismo
112
de ação contracturante e a influência do óleo essencial nessa via de
transdução de sinal.
Além do efeito da dexametasona na sobre a produção de mediadores
inflamatórios, estudos tem demonstrado que os glicocorticoides podem
promover um aumento na densidade de receptores β2-adrenérgicos ou
modulação direta da adenilil ciclase e produção de PKA que é uma molécula
conhecida por fosforilar alvos que promovem o relaxamento das vias aéreas,
tais como abertura dos canais para potássio, inibição da Ca2+-ATPase do
retículo sarcoplasmático (SERCA), inibição dos IP3R, dentre outras (HIRST,
LEE, 1998; ADCOCK, MANEECHOTESUWAN, USMANI, 2002).
A via colinérgica também faz parte do processo contrátil para a
musculatura lisa das vias aéreas e foram utilizadas ferramentas para observar
a influência dessas vias sobre o mecanismo de ação relaxante de LOO sobre a
traqueia de cobaia. Os dados da literatura sugerem que há liberação de
acetilcolina através de estímulos histaminérgicos (H1) no neurônio pré-
sináptico, auxiliando no processo contrátil (BARAK, RUBINSTEIN, COHEN,
1997). Porém, mesmo na presença de haxametônio não há diferença
significante no relaxamento promovido por LOO sobre a musculatura lisa.
Contudo, quando se tem a presença de ATR, a CE50 de LOO reduz,
promovendo um efeito relaxante potencializador. Isso pode significar que o
LOO pode estar atuando em alguma via de liberação de acetilcolina ou até
como antagonista muscarínico.
A condução muscarínica nas vias aéreas é de extrema importância no
papel da contração muscular lisa, pois pode se apresentar através dos
receptores M1 e M3 (acoplados a proteína Gq) ou M2 (acoplado a proteína Gi),
sendo alvo de fármacos para o tratamento de doenças pulmonares, apesar de
que isso pode gerar uma liberação maior de acetilcolina a partir do bloqueio M2,
localizado no neurônio pré-sináptico, considerado um autorreceptor (BUELS,
FRYER, 2012; RACKÉ, JUERGENS, MATTHIESEN, 2006). Além disso, as
densidades desses receptores nos tecidos são diferentes, os M1 se localizam
no nervo pós-ganglionar para permitir a condução nervosa e liberação de
acetilcolina na fenda sinaptica, os M2 estão localizados nos nervos e regulam a
liberação de acetilcolina e os M3 se localizam mais na musculatura lisa. O
bloqueio promovido pela atropina nos receptores muscarínicos permitiu que
113
houvesse redução de uma via importante pra contração da musculatura lisa
das vias aéreas, sugerindo o aumento da potência (3,949 ± 1,455 µg/mL) de
LOO na presença dessa antagonista muscarínico (BULKHI, TABATABAIAN,
CASALE, 2016).
Outra análise possível é a de que agentes anticolinérgicos podem atuar
como agonistas inversos nos receptores M2 e M3 e iniciar uma nova cascata de
sinalização que permite aos inibidores de PDE produzirem um relaxamento
substancial do músculo liso das vias aéreas através do aumento intracelular de
AMPc e GMPc (GONZÁLEZ, et al., 2004), fato que poderia explicar o efeito de
LOO sobre traqueia isolada de cobaia.
Então, foi necessária uma análise da via de sinalização envolvendo o
NO produzido pelo epitélio das vias aéreas que tem grande importância para o
relaxamento da musculatura lisa bronquial, pois ativa a guanilil ciclase soúvel
(GCs), aumenta a produção de GMPc e ativação de PKG para fosforilação de
proteínas alvo. Além disso, deve-se observar que há regulação do GMPc pelas
fosfodierases (PDEs), transformando-as em GMP. Outra forma de guanilil
ciclase é a particulada (GCp), uma proteína transmembrana com atuação como
receptora para alguns peptídeos com mecanismo intracelular semelhante a
GCs (DUPONT et al., 2014; HAMAD et al., 2003; RHO et al., 2002).
A formação de NO, para propagação da via de transdução de sinal, se
dá a partir da reação catalizada pela óxido nítrico sintase (NOS) que se
apresentam em trêes isoformas: neural (nNOS), endotelial (eNOS) e indutível
(iNOS). Essas isoformas da NOS catalizam a mesma reação de conversão da
L-arginina, em L-citrulia e NO, usando oxigênio, NADPH e outros cofatores
(MAYER, WERNER, 1995; ALDERSTON, COOPER, KNOWLES, 2001;
FÖRSTERMANN, SESSA, 2012). Um análogo da L-arginina, conhecido por L-
NAME, atua reduzindo a síntese de NO por inibir as isoformas de NOS
evitando a diminuição da ativação de GCs, produção de GMPc, ativação de
PKG e relaxamento da musculatura lisa (PFEIFFER et al., 1996). Nesse
sentido, a utilização de L-NAME compromete a via do NO, por não permitir a
sua produção e continuidade da transdução de sinal exercida por esse gás,
porém quando o L-NAME foi incubado não houve diferença significante
comparado ao LOO, em relação à resposta relaxante da traqueia de cobaia.
114
Alguns ativadores e inibidores da guanilil ciclase são utilizados na
farmacologia para rastrear o mecanismo de ação, sendo o azul de metileno um
dos mais importantes inibidores da guanilil ciclase solúvel, interrompendo a
transdução de sinal da via do óxido nítrico e formação do GMPc (EVORA,
2016). Sabe-se que o NO atua na GCs em dois sítios de ligação, um formando
o complexo Fe2+-NO de forma direta e o outro, em excesso de NO, promove
mudança conformacional do bolsão do grupo heme, aumentando a afinidade
do NO à região catalítica (DERBYSHIRE, MARLETTA, 2009).
Nos dados apresentados foi evidenciada uma redução na potência do
LOO em relaxar o músculo liso pré-contraído com histamina, na presença do
azul de metileno, inibidor da guanilil ciclase solúvel. Além disso, na presença
de L-NAME e aminofilina não houve diferença significante no relaxamento
traqueal, indicando a influência da GCs no mecanismo relaxante promovido
pelo óleo essencial.
Apesar de não ser possível identificar a participação dos nucleotídeos
cíclicos no mecanismo relaxante de LOO, sabe-se que os inibidores da
fosfodiesterase tem impacto na terapêutica de diversas doenças por aumentar
as concentrações intracelulares de AMPc e GMPc, segundos mensageiros que
promovem diversas modificações celulares, envolvendo todos os sistemas do
organismo de acordo com cada isoforma e suas particularidades no processo
de des-ciclizar esses nucleotídeos, removendo sua atividade de regulação das
proteínas cinases (MAURICE et al., 2014)
Para isso novos experimentos foram utilizados com a incubação de
aminofilina para inibir contrações com carbacol. A aminofilina é um inibidor
inespecífico (normalmente as isoformas 3,4,5,7 e 9) da fosfodiesterase,
regulador de nucleotídoes cíclicos como AMPc e GMPc, sendo composta por
teofilina e um sal etilenodiamina, o que proporciona maior solubilidade
(BARNES, 2013).
Apesar de ser um inibidor inespecífico, Ise e colaboradores (2003)
relataram que a teofilina promove sua ação relaxante, principalmente por
aumentar os níveis de AMPc e, a partir daí ativar os canais para potássio de
grande condutância ativados por cálcio (BKCa), promovendo hiperpolarização
da célula, no entanto, Rabe, Magnussen e Dent (1995) já descreviam que a
teofilina inibia de forma inespecífica as PDE’s e induziria um aumento na
115
produção de GMPc no interior de células musculares lisas. Novamente os
dados não apresentaram diferença significante, evidenciando que a ação
semelhante às xantinas, pode não ser o mecanismo relaxante do LOO sobre a
traqueia de cobaia.
Em geral, o relaxamento da musculatura lisa induzida por NO ou outros
mediadores acontecem por dois mecanismos principais: um mecanismo
dependente de GMPc no qual o NO se liga e ativa o GCs para gerar cGMP; ou
um mecanismo independente de NO, no qual uma alteração funcional de
GMPc (ativação) ocorre através da nitrosilação de grupos tióis, sendo que
ambos podem estar relacionados a musculatura lisa traqueal (GASTON et al.,
2006; PEREZ-ZOGHBI, BAI, SANDERSON, 2010).
Os dados apresentados por LOO na presença de um doador de NO
(NPS) são semelhantes, dadas às devidas proporções, aos obtidos por Hwang,
Wu e Teng (1999), com o YC-1, uma substância pura, onde demonstraram que
essa molécula tinha a capacidade de ativar a GCs para relaxar a musculatura
lisa das vias aéreas. Esse efeito foi demonstrado como potencializante nas
curvas concentrações-cumulativas entre o controle com NPS na presença de
YC-1. Para promover esse efeito ativador de GCs, YC-1 se liga a um sítio
alostérico da GCs, o que permite maior afinidade do NO ao grupo heme
(DERBYSHIRE, MARLETTA, 2009; DERBYSHIRE, MARLETTA, 2012;
MONFORT, WALES, WEISCHEL, 2017).
Além de YC-1, outro estimulador da GCs que pode se assemelhar ao
LOO, é o BAY 41-2272 que foi capaz de induzir relaxamento das vias aéreas
de ratos por mecanismo independente do grupo heme, apresentando efeito
sinérgico com NO na formação de GMPc e bloqueio dos canais para Ca2+ de
forma independente (TOQUE et al., 2010; MONFORT, WALES, WEISCHEL,
2017).
O azul de metileno tem sido alvo de diversos estudos sobre sua
atividade, por exemplo, Hamad e colaboradores (1997) demonstram a partir de
experimentos na presença de azul de metileno e hemoglobina a atividade de
ambos em reduzir os níveis de GMPc, o que indica a confirmação da atividade
do azul de metileno como inibidor da GCs. No entanto, outros pesquisadores
como Marczin, Ryan e Catravas (1992) mostraram que o mecanismo de ação
de azul de metileno em reduzir os níveis de GMPc estaria relacionado a
116
produção de ânios superóxido, sem relação com inibição de GCs, atividade que
foi revertida na presença de superóxido dismutase.
Estudos relataram que a GCs pode ser estimulada por duas formas
distintas, na primeira há ligação do NO em um sítio onde se localiza o grupo
heme da proteína, na segunda há um sítio alostérico que ativa a proteína por
modificação estrutural, inclusive melhorando a sua afinidade pelo NO (GOSH et
al., 2016). Por esse motivo, acredita-se que os componentes de LOO pode
também interagir com esse sítio alostérico e promover o relaxamento do
músculo liso das vias aéreas, a partir de estímulos histaminérgicos ou
colinérgicos.
A via de sinalização regulada pelo NO e GMPc, responsáveis pelo
relaxamento do músculo liso das vias aéreas, é mediada pela abertura dos
canais para K+, incluindo os canais KATP e canais para K+ ativados com Ca2+. A
ativação dos canais de K+ causa o efluxo dos íons potássio, hiperpolarização
da membrana plasmática, fechamento dos canais de cálcio operados por
voltagem (Cav) e uma diminuição dos níveis de cálcio intracelular nas células
do músculo liso (VIEIRA et al., 2013). Esses eventos podem acontecer,
principalmente, pela ativação da PKG por ação do GMPc, permitindo a
fosforilação de alguns alvos, incluindo os canais para potássio ou até ação
direta do nucleotídeo cíclico em relaxar a musculatura lisa. Adicionalmente,
dados sugerem que essa via tem influencia na [Ca2+]i por modular ação de IP3
nos IP3R no retículo sarcoplasmático (PEREZ-ZOGHBI, BAI, SANDERSON,
2010).
Os resultados indicam que o efeito de LOO sobre o musculo liso traqueal
é, provavelmente, mediado pela ativação da via NO/GCs/GMPc/PKG, levando
a um aumento do efluxo de K+ com subsequente atenuação da contratilidade
associada ao influxo de Ca2+. Além disso, dexametasona modulou a produção
de GMPc, em podócitos, de maneira tempo dependente, o que pode estar
relacionado à atividade de regulação da produção de proteínas e, de alguma
forma, pode explicar a resposta de LOO quando na presença de
corticosteroides, obtendo extensa potencialização no seu efeito relaxante da
musculatura lisa traqueal (LEWKO et al., 2015).
Outra informação relevante é que cosrticosteroides, tal qual
dexametasona, tem a capacidade de regular a produção de TNF-, um fator
117
pró-inflamatorio de extrema importância na produção de respostas celulares.
Isso permite inibir a atividade da TNF- sobre a via NO/GCs/GMPc/PKG que
promovem o relaxamento das vias, permitindo que haja aumento dos seus
níveis e melhora na atividade espasmolítica da susbstâncias teste, nesse caso,
os componentes do óleo essencial de L. origanoides (WU et al., 2006).
O estabelecimento dos efeitos farmacológicos de LOO foi avaliado sobre
o modelo de tosse induzido por ácido cítrico, sendo que sua inalação estimula
todo o trato respiratório, a partir da cavidade nasal até os brônquios e, por
conseguinte, não só induz tosse, mas também espirros. Essa substância tem a
capacidade de promovera tosse estimulando as fibras C ou Aδ, sendo
considerada uma metodologia efetiva para análise de tosse ou teste de
antitussígenos. Isso porque quando realizada análisecomparada à capsaicina
(estimulador de fibras C), foi descoberto o papel do ácido cítrico em ter um
mecanismo de ação duplo, sendo que as fibras Aδ são consideradas, em
cobaia, como “receptores da tosse” (TANAKA, MARUYAMA, 2005). Outro
estudo propõe o mecanismo tussígeno do ácido cítrico a partir da estimulação
de mastócitos ou ação direta sobre as fibas C (LAI et al., 2009), como mostrado
na Figura 21.
O controle positivo para avaliação da atividade antitussígena foi um
fármaco narcótico que tem importância na terapêutica, porém seu mecanismo
ainda não está completamente elucidado, apesar de evidências indicarem a
atividade sobre os receptores opioides. O “padrão ouro” para estudo
envolvendo atividade antitussígena é a codeína (morfina metilada no carbono
3), porém foi utilizada a morfina, visto que são envolvidos os receptores
opioide-µ e κ (acoplado a proteína Gi), principalmente o subtipo µ2, não sendo
considerados os efeitos adversos provocados pela morfina (KARLSSON,
LANNER, PERSSON, 1990; TAKAHAMA, SHIRASAKI, 2007).
Experimentos realizados por Karlsson, Lanner, Persson (1990)
demonstraram que a morfina a 5 mg/kg, administrada por via intramuscular,
permitiu uma redução de cerca de 50% no número de tosses, quando o
estímulo era promovido por ácido cítrico 0,4M em cobaias, sendo considerado
o fármaco de maior potência nesse método em comparação com a codeína e
mepiridina, apresentando valor de DI50 de 2,6 mg/kg, com intervalo de
confiança entre1,3 e 5,1 mg/kg.
118
Em estudo realizado através da metodologia duplo-cego cruzado com 27
pacientes que apresentavam tosse, foi utilizado 5 mg de sulfato de morfina
duas vezes ao dia, durante 1 mês, houve redução significativa na frequência de
tosse. Além disso, estudos relatam que 5 mg de sulfato de morfina são
suficientes, em humanos, para reduzir cerca de 40% a frequência de tosse
desses indivíduos (DICPINIGAITIS et al., 2014).
Figura 21. Possível mecanismo tussígeno do ácido crítrico.
As setas indicam ativação de mediadores para o estímulo tussígeno.
Fonte: adaptado de Lai et al., 2009.
Outros fármacos se inserem na terapêutica, a partir da descoberta de
novos alvos farmacológicos. Um dos alvos estudados são os receptores de
potencial transiente (TRP’s), sendo os mais importantes na tosse os da
anquirina (TRPA) e o vaniloide (TRPV) que são canais iônicos e permitem o
fluxo, principalmente de Ca2+, com destaque para o TRPA1 e TRPV1.Os
receptores TRPV1 são ativados por baixo pH, temperaturas acima de 43ºC e
mediadores pró-inflamatórios e antagonistas podem mediar o bloqueio da
tosse, apesar dos efeitos adversos já relatados como hiperalgesia inflamatória.
Já os TRPA1 são conhecidos por estarem relacionados à nocicepção, além de
119
promover inflamação e irritação das vias aéreas, sendo que alguns ácidos
fracos e cloreto (Cl-) podem promover sua atividade comcontrole por alguns
antagonistas (BROOKS, 2011; DICPINIGAITIS, 2006; DICPINIGAITIS et al.,
2014; GEPPETTI et al., 2010; MIHARA, SHIBAMOTO, 2015).
O TRPA1 é um receptor importante no processo de desenvolvimento da
tosse, pois sua ativação pode se dar através do estímulo da poluição do ar e
fumaça de cigarros. O carvacrol, componente majoritário de LOO, tem a
capacidade de ativá-los em culturas celulares HEK293 que foram induzidas a
expressar tal receptor. O carvacrol na concentração de 250 μM promove uma
robusta ativação na corrente do TRPA1 e rápida dessensibilização (em cerca
de 100 segundos), o que pode explicar seu efeito antitussígeno. Nesses
estudos também foi possível observar que o carvacrol (1mM) não foi capaz de
ativar os receptores TRPV1 (XU et al., 2006; MIHARA, SHIBAMOTO, 2015).
Ibarra e Blair (2013) também mostraram, em células HEK293
expressando receptores TRPA1 que o potencial do carvacrol em promover
ação agonista do receptor TRPA1 ocorre de forma não eletrofílica
(independente do resíduo de cisteína amino-terminal do receptor) e,
possivelmente, tem atuação em um local que não pertence ao sítio ativo para
promover seu efeito, mostrando também que na concentração de 300 μM
promoveu completa dessensibilização do receptor.
Em estudo realizado por Dantas e colaboradores (2015), foi utilizado
carvacrol sobre tecido vascular sem endotélio funcional provenientes de ratos
espontaneamente hipertensos (SHR) que após incubação de vermelho de
rutênio (antagonista não seletivo TRPV), o carvacrol reduziu sua atividade
sobre o relaxamento, sugerindo um efeito sobre os TRPV. A confirmação do
efeito foi realizada com a utilização de capsaicina, mostrando atenuação dos
efeitos do carvacrol, indicando ação sobre os TRPV1, haja vista que capsaicina
é um conhecido agonista desses receptores. Nos estudos in vivo, o carvacrol
apresentou atividade sobre os TRPV1 e TRPV4, levando a um efeito
bradicárdico e hipotensor. No entanto, esses efeitos não foram seletivos,
sugerindo-se atuação sobre TRPV1, TRPV4, TRPC1, TRPM7 e TRPM8 em ratos
SHR.
Desse modo, o LOO nas doses de 100 e 300 mg/kg podem estar
exercendo efeito sobre os receptores TRP de modo que a atividade
120
antitussígena é observada e amplificada quando avaliado a frequência e
latência de tosse, em que LOO300 mg/kg se apresentou de forma efetiva. Os
dados podem sugerir que os componentes do óleo essencial, bem como o
monoterpeno marjoritário, carvacrol, podem estar relacionados à atividade do
sobre os receptores TRPA1 e TRPV1, e apresentar tais propriedades
farmacológicas.
Os estudos envolvendo atividade antitussígena permitiram observar um
comportamento animal incomum, uma redução da ambulação e letargia. Para
observar atividade ansiolítica ou neurotóxica, foi realizado o método do rota-rod
que segundo Dunham e Miya (1957) tem o objetivo de estabelecer a
neurotoxicidade de anticonvulsivantes, visto que os estudos que envolviam
essa atividade poderiam apresentar falso positivos. Além disso, a proposta
poderia se expandir no teste de fármacos relaxantes musculares esqueléticos,
depressores do sistema nervoso central, dentre outros, com a possibilidade de
se calcular até a dose tóxica que afetaria 50% dos animais (DT50).
Um óleo essencial de L.origanoides, obtido no estado do Piauí, com
composição de 23,89% para presença de ρ-cimeno, 21,78% de timol e 18,87%
de carvacrol, foi testado frente ao teste de coordenação motora (rota rod) nas
doses de 300 e 2000 mg/kg, administradas por via oral. O teste evidenciou que
não houve diferença significativa comparada ao controle, no tempo de
permanência dos animais na barra (SANTOS, MEDEIROS, 2015).
Na literatura já existem estudos em relação à modificação da
coordenação motora do carvacrol (componente majoritário de LOO). Melo e
colaboradores (2010) demonstraram que as doses de 12,5; 25 e 50 mg/kg de
carvacrol, administradas por via oral, em camundongos, não alteraram a
coordenação motora ou apresentaram efeitos neurotóxicos e miorrelaxantes
quando os animais ficavam sobre a barra em 5, 15 e 40 rotações por minuto.
De modo semelhante, Melo e colaboradores (2012) demonstraram que as
doses de 50 e 100 mg/kg administrados por via oral, também não alteraram os
eventos no teste de rota rod, quando os animais ficavam sobre a barra em 5,
15 e 40 rotações por minuto.
A discordância dos resultados obtidos para o óleo essencial de
L. origanoides aos apresentados na literatura, podem estar relacionados ao
fato de que no LOO o carvacrol está em um percentual maior do que 50% da
121
composição química do óleo essencial, o que evidencia uma diferença dos
estudos anteriores. Além disso, a via de administração pode influenciar na
resposta do LOO, por isso as diferenças na resposta farmacológica.
Por outro lado, os estudos com carvacrol corroboram com os dados
obtidos para a dose de 100mg/kg de LOO que apresenta cerca de metade
desse valor de carvacrol, possibilitando um comparativo da dose de 50 mg/kg
do monoterpeno na literatura. O que explicaria o efeito de quedas e menor
tempo de barra, mas que não representou diferenças significativas.
Outro protocolo realizado, esse com caráter de determinar o efeito
ansiolítico ou sedativo de LOO, foi o do campo aberto que proporciona uma
avaliação sistematica à exploração de novos ambientes, a atividade locomotora
geral e fornece informações iniciais relacionados ao comportamento de
ansiedade ou sedação em roedores, sendo o isolamento social resultante da
separação física dos companheiros para o aparato e o estresse criado pelo
ambiente novo, iluminado e desprotegido (aberto) como dois fatores principais
para avaliação do comportamento animal (BAILEY, CRAWLEY, 2009; PRUNT,
BELZUNG, 2003).
O comportamento animal avaliado pelo teste do campo aberto apresenta
parâmetros podem possuir algumas interpretações. O gromming, por exemplo,
é descrito como uma resposta ao deslocamento para o ambiente novo e que
seria reduzido à exposição repetida ao aparelho (ESPEJO, 1997). O número de
bolos fecais e urina sãoreportados como avaliação para emocionalidade, a
partir de estímulo autonômico simpático (CRUZ, LANDEIRA-FERNANDEZ,
2012; HALL, 1934), no entanto, para ansiedade isso tem sido questionado, haja
vista que um ambiente novo pode estimular a defecação, mas não por medo ou
processos de ansiedade (BINDRA, THOMPSON, 1953; LISTER, 1990). Em
estudo de Royce (1977) ele relata que a medida de defecação é em
decorrencia de uma descarga autonômica e micção de marcação territorial,
sendo a latência para primeiro movimento, atividade locomotora e penetração
ao centro do campo aberto, os parâmetros que envolvem descarga motora.
A metodologia do campo aberto permite diversas possibilidades sobre a
ação no sistema nervoso central de substâncias. Alguns parâmetros como
número de cruzamentos, tempo de imobilidade e frequência de rearing são
122
tratadas como medidas de atividade locomotora, exploração e ansiedade
(PRUNT, BELZUNG, 2003; WALSH, CUMMINS, 1976).
Santos e Medeiros (2015) utilizaram óleo essencial de L. origanoides,
obtido no estado do Piauí, com composição diversa do LOO proveniente do
herbário da UEFS, no modelo de campo aberto. Foram utilizadas as doses de
300 e 2000 mg/kg, administradas por via oral e não foi evidenciada alteração
na locomoção, rearing e grooming, o que pode explicada pela composição dos
óleos essenciais testados e vias de administração.
Os dados conflitantes com a literatura podem estar relacionados a
variedade de compostos químicos presentes no LOO, quantidade de carvacrol
nas doses utilizadas de LOO (30, 100 e 300 mg/kg), considerando o carvacrol
com cerca de 50% da composição do óleo essencial, além da diferença na via
de administração.
Seguindo a observação das respostas farmacológicas de LOO, foi
observada a diferença nas metodologias que envolvem a atividade
expectorante a partir da avaliação do marcador vermelho de fenol. A
repetitividade e taxa de recuperação demonstraram concordância com o
preconizado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e
International Conference of Harmonization (ICH) (ANVISA, 2003; ICH, 2005). O
coeficiente de solubilidade observado para solução de NaCl 0,9% difere
substancialmente da solubilidade do vermelho de fenol em água descrita na
literatura, cerca de 0,77 g/L (MAYNARD, 1997). As outras informações obtidas
para o aperfeiçoamento do método promoveram uma utilização de menor
quantidade de agentes químicos, sendo importante para o meio ambiente e
estão de acordo com a preconização da química verde, definida como:
Invenção, planejamento e aplicação de produtos e processos químicos para reduzir ou eliminar o uso e a geração de substâncias perigosas (ANASTAS e WARNER, 1998).
Além disso, pensa na “prevenção da poluição” e não no sentido de
“poluição para posterior limpeza”, como é estabelecido pelo pensamento
industrial antigo, sendo o seu objetivo uma redução nos impactos ambientais e
econômicos causados por quaisquer ações humanas (DUA et al., 2012).
123
Desse modo, a utilização da ideia de prevenção a impactos, além de
melhorar a capacidade de um método farmacológico foi de extrema
importância, principalmente, quando os estudos se inserem no contexto da
asma que acomete uma parcela extensa da população mundial.
Nesse sentido, um agente expectorante pode ser definido como aquele
capaz de induzir a descarga ou a expulsão do muco através do trato
respiratório. Isto requer uma ação de tossir ou espirrar para soltar o muco dos
pulmões ou do trato respiratório superior. Estes eventos podem ser vistos como
benéficos se removerem o muco, melhorando a ventilação alveolar e
proporcionar alívio da irritação neuronal que é disparado por propriedades
mecânicas dos mucos ou efeitos de mediadores inflamatórios contidos nos
mesmos. Os expectorantes podem reduzir o esforço mecânico da respiração e
dispneia, sendo que o mecanismo preciso pelo qual expectorantes exercem a
sua ação ainda não está bem estabelecido, embora se sugira uma atuação
sobre os receptores vagais irritantes gástricos, além de recrutar reflexos
parassimpáticos eferentes que induzem exocitose glandular de uma mistura
mucosa menos viscosa (BALSAMO, LANATA, EGAN, 2010).
A condição de hipersecreção mucosa nas vias aéreas pode levar a uma
obstrução da respiração, limitação no fluxo de ar, desequilíbrio na ventilação e
problemas relacionados às trocas gasosas, sendo que o envolvimento de um
comprometimento na função mucociliar, com redução na remoção de muco,
pode incentivar a colonização bacteriana, levando a infecções pulmonares
repetidas e exacerbações. Além disso, a hipersecreção mucosa crônica está
relacionada ao reduzido controle da asma, o que pode levar a uma perda
acelerada da função pulmonar e aumento da mortalidade (ROGERS, 2007).
O processo asmático, a partir da inflamação das vias aéreas produz
modificações no metabolismo do tecido. Dessa forma, pode induzir uma
hipersecreção mucosa, disfunção ciliar, mudanças na composição e
propriedades biofísicas de secreções das vias aéreas (DHAR, 2013; ROGERS,
2007).
A partir disso, a otimização do estudo analítico envolvendo a secreção
do vermelho de fenol como indicador da expectoração se faz importante para o
mapeamento da atividade de tais fármacos de modo preciso e exato,
contribuindo para as pesquisas farmacológicas pré-clínicas.
124
7 CONCLUSÕES
Após a exposição dos dados, foi demonstrado que o LOO possui
atividade espasmolítica em traqueia isolada de cobaia, com maior potência
para contrações induzidas por histamina. Seu mecanismo de ação pode estar
envolvido com a ativação de guanilil ciclase solúvel (GCs) o que permitiria um
aumento nas concentrações de GMPc, regulação da atividade de PKG e
fosforilação dos canais para potássio sensíveis a voltagem (Kv) e os modulados
por cálcio (KCa).
O LOO também apresentou ação antitussígena, nas doses de 100 e 300
mg/kg, reduzindo a frequência de tosse, sendo a dose de 300 mg/kg capaz de
aumentar a latência (em segundos) para primeira tosse. No entanto, foi
observado que a dose de 300 mg/kg de LOO modificou a coordenação motora
do animal por uma atividade miorrelaxante devido a uma provável ação do óleo
sobre o sistema nervoso central, relacionada a uma atividade sedativa ou
neurotóxica.
A ação sobre a mobilidade foi confirmada na dose de LOO 300 mg/kg,
através do modelo experimental do rota-rod, enquanto que a atividade
ansiolítica foi confirmada na mesma dose para o modelo do campo aberto,
mostrando que os componentes de LOO promovem atividade miorrelaxante e
ansiolítica/sedativa.
O aperfeiçoamento do protocolo experimental para avaliação da
atividade expectorante utilizando o indicador vermelho de fenol, foi realizado e
validado de forma a utilizar o LOO com os melhores parâmetros analíticos,
sendo possível o prosseguimento dos testes farmacológicos que permitam uma
avaliação precisa e exata do vermelho de fenol no LBA.
125
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145
ANEXO A – Parecer do CEUA/UNIVASF
146
ANEXO B – Atualização do parecer CEUA/UNIVASF
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