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Dialogues entre les voies de signalisation de l’AMPc et celles de l’IL-1 dans la régulation de l’expression de l’IL-6 et rôle de l’IL-6 dans les thyrocytes et dans les
cardiomyocytes de rats
Dialogues entre les voies de signalisation de l’AMPc et celles de l’IL-1 dans la régulation de l’expression de l’IL-6 et rôle de l’IL-6 dans les thyrocytes et dans les
cardiomyocytes de rats
UNIVERSITE PARIS XIFACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD
cardiomyocytes de ratscardiomyocytes de rats
Nicolas Szabo-FresnaisNicolas Szabo-Fresnais
14 octobre 200914 octobre 2009INSERM U486 INSERM U769
L’interleukine-6 (IL-6)
� Cytokine pro-inflammatoire
� Clonage du gène humain de l’IL-6 en 1986 (Hirano et coll.)� participe à la réponse immunologique: B cell stimulatory factor-2
� Membre des cytokines de la famille IL-6 qui contient:- LIF (leukaemia inhibitory factor) - LIF (leukaemia inhibitory factor) - IL-11- CT-1 (cardiotrophin 1),- CLC (cardiotrophin-like-cytokine)- OSM (oncostatin M)- CNTF (ciliary neurotrophic factor)
� Homologie séquence: Homme Rat: 68% (ARNm) et 58% (protéine).
� Synthèse dépendante d’autres cytokines (IL-1, TNFαααα, IFNγγγγ).
Effets cellulaires de l’IL-6
Effet Local Effet immun
IL-6IL-6
Lymphocytes T - Prolifération (IL-2)
Lymphocytes B- Cytokines- Différenciation
Macrophages- Cytokines- Prostaglandines
Fibroblastes- Collagénases
Cellules endothéliales- Molécules d’adhésion
Effet systémique
IL-6IL-6
Cerveau(Fièvre)
Hypophyse(ACTH)
Foie(protéines de la phase aigüe)
Effet métabolique
Foie(production glucose)
tissu adipeux(lipolyse)
Adénome folliculaire
Maladie de BasedowThyroïdite de Hashimoto
Carcinome papillaire
L’IL-6 dans les tissus pathologiques thyroïdiens et cardiaques humains
�Tissus thyroïdiens
Carcinome papillaire
Infarctus du myocardeIschémie
Kayser et coll (1995) AutoimmunityKaneko et coll (1997) Res Commun Mol Pathol PharmacolPlenz et coll (2002) JACCGabrielsen et coll (2007) JMCC
�Tissus cardiaques
IFNγγγγ
TSH
IL-6
Les cellules thyroïdiennes et les cardiomyocytesproduisent de l’Interleukine-6
LPS
Ancey et coll., Cytokine (2002)Gwechenberger et coll. Circulation (1990)Briest et coll. Eur J Physiol (2003)
Cardiomyocyte IL-6
Weetman et coll., J Endocrinol (1990)Diamant et coll., Autoimmunity (1991)Kennedy et coll., J Endocrinol (1992)Iwamoto et coll., Cytokine (1991)
ThyrocyteTNFαααα
IL-1
IL-6TNFαααα
IL-1
TSH IL-6
Effet synergique de l’AMPc sur la production de l’IL-6 stimulée par l’IL-1: un nouveau mode de régulation?
StimulationIL-6
??TSH IL-6++
(AMPc)
Iwamoto et coll., Cytokine (1991)
Thyrocyte
IL-1
Stimulationββββ-adrénergique Cardiomyocyte IL-6
??
??
IL-1
La voie de l’AMPc
membranebasale
membraneapicale
dans le thyrocyte dans le cardiomyocyte
NoradrénalineAdrénaline
ISO
TSHColloïde
GsAC
AMPc
Gs
AC
FSKdifférenciation
fonction
proliférationRTSH
AC
AMPc
Rββββ−−−−Ad
contraction
relaxation métabolisme
ISOFSK
Gs
T3,T4
Dérégulation de la voie de l’AMPc
Thyroïde:Production d’AMPc en continu par:. TSAb (maladie de Basedow). Mutations du RTSH. Mutations de Gs. Mutations de Gs
�Hyperthyroïdie
Cœur:Activation chronique des récepteurs β-ad:. Remodelage cardiaque
�insuffisance cardiaque rôle des cytokines pro-inflammatoires?
Objectifs généraux
� Dérégulation de la voie de l’AMPc et dialogue avec les cytokines pro-inflammatoires
���� réponse cellulaire (production d’IL-6)
� Rôle de l’IL-6 dans le remodelage cardiaque���� hypertrophie
Lignée cellulaire de thyrocytes de rats: les cellules FRTL-5
. Cellules non-transformées, non-polarisées
. Expriment des marqueurs de différenciation
du thyrocyte (Tg, NIS, TPO)
. Croissance cellulaire dépendante
Modèles cellulaires
de la TSH et de l’IGF-1/insuline
Cultures primaires de cardiomyocytes ventriculaires de rats adultes
. Cellules hautement différenciées
. Répondent aux catécholamines
Plan de l’exposé
1) Dialogues entre les voies de signalisation de l’IL-1 et celles de l’AMPc dans la production de l’IL-6
2) Mécanismes de régulations de la synergie au niveau de la stabilité de l’ARNm et au niveau transcriptionnel
3) Voies de signalisation activées par l’IL-6 et par le mécanisme de « trans-signaling » dans les cardiomyocytes
4) « Trans-signaling » et induction de marqueurs de l’hypertrophie cardiaque
5) Conclusions-Perspectives
Plan de l’exposé
1) Dialogues entre les voies de signalisation de l’IL-1 et celles de l’AMPc dans la production de l’IL-6
2) Mécanismes de régulations de la synergie au niveau de la stabilité de l’ARNm et au niveau transcriptionnel
3) Voies de signalisation activées par l’IL-6 et par le mécanisme de « trans-signaling » dans les cardiomyocytes
4) « Trans-signaling » et induction de marqueurs de l’hypertrophie cardiaque
5) Conclusions-Perspectives
Dosage ELISA
6
8
6 sécrétée (ng/ml) IL-1+FSK
Cellules FRTL-5
6
6 sécrétée (ng/ml)
Cardiomyocytes
16h de stimulation
Effet d’agents qui stimulent la production de l’AMPc sur la sécrétion d’IL-6 induite par l’IL-1
30201000
2
4
6
IL-6 sécrétée (ng/ml)
Temps (h)
FSK
IL-1
0
2
4
6
0 ISO IL-1 IL-1+ISO
IL-6 sécrétée (ng/ml)
Northern blot
321,510,5
+--++++--++++--++++--+++
+--+++
--
IL-1:FSK:
Temps (h): 0
Cellules FRTL-5
6 / ARNm CyA 16
stimulation:4h
RT-PCRq
Cardiomyocytes
Effet de la production d’AMPc sur l’expression de l’ARNm de l’IL-6 stimulée par l’IL-1
0 1 2 3
ARNm IL-6/
ARNm GAPDH
Temps (h)
40
80
120
0
IL-1+FSKIL-1FSK
ARNmIL-6
- + + - + + - + + - + +- + +-FSK:
ARNm IL-6 / ARNm CyA
(fois d’induction)
0
4
8
12
0 ISO IL-1IL-1+ISO
2
3
#
#
ns
6 sécrétée (ng/ml)
2
3
# #
# ## #
6 sécrétée (ng/ml)
Dosage ELISA
Rôle de la voie Gs/AMPc dans l’effet synergique IL-1/ISO sur la sécrétion de l’IL-6
Cardiomyocytes
0
1
#
IL-6 sécrétée (ng/ml)
CT: toxine cholérique (stimule Gs)PTX: toxine pertussique (inhibe Gi)
0
1
IL-6 sécrétée (ng/ml)
ddFSK: analogue inactif de la FSK IBMX: inhibiteur non-spécifique
des phosphodiéstérases
PTX
Les cibles de l’AMPc
PKA
MB-AMPc
N6- Monobutyryl-AMPc
Me-AMPc
8-CPT-2'-O-Me-cAMP
CPT-AMPc8-Chlorophenylthio-AMPc
ATP AMPc
AC
R R
C C
phosphorylation protéines
R
C C
R
PKA
Rp-cAMPS
H-89
Epac
Rap1GDP
Rap1GTP
Rap GAP
Effets
stimulation 2h
Effet de l’activation des voies de l’AMPc sur la régulation de l’IL-6 par l’IL-1
Cellules FRTL-5
Northern blot
6 sécrétée (ng/ml)
stimulation 16h
Cardiomyocytes
Dosage ELISA
ARNmIL-6
024681012
IL-6 sécrétée (ng/ml)
Effet de l’inhibition de la PKA sur la régulation de l’IL-6 par l’IL-1
Pré-traitement 2hstimulation 2h
Cellules FRTL-5
Northern blot
*
6 sécrétée (ng/ml) 8
Pré-traitement 2hstimulation 16h
Cardiomyocytes
Dosage ELISA
IL-1+FSK0
H89
ARNmIL-6
IL-1+FSK
Rp-cAMPS
*
IL-6 sécrétée (ng/ml)
0
2
4
6
-
Conclusion 1
. La production d’IL-6 par l’IL-1 est augmentée de manière synergique par l’AMPc
. Cet effet synergique implique l’expression de l’ARNm de l’IL-6. Cet effet synergique implique l’expression de l’ARNm de l’IL-6
. L’activation de la voie de signalisation AMPc/PKA participe à cet effet synergique
Plan de l’exposé
1) Dialogues entre les voies de signalisation de l’IL-1 et celles de l’AMPc dans la production de l’IL-6
2) Mécanismes de régulations de la synergie au niveau de la stabilité de l’ARNm et au niveau transcriptionnel
3) Voies de signalisation activées par l’IL-6 et par le mécanisme de « trans-signaling » dans les cardiomyocytes
4) « Trans-signaling » et induction de marqueurs de l’hypertrophie cardiaque
5) Conclusions-Perspectives
60
80
100
120
6 (% contrôle)
*
* ¶FSK
IL-1+FSK
Milieu changéActinomycine D
+/-stimulations
90 min
Etude de la stabilité de l’ARNm de l’IL-6 dans les cellules FRTL-5
0
20
40
60
0 30 60
Temps (min)ARNm IL-6 (% contrôle)
*IL-1+FSK
IL-1Non-stimulé
(100%)30 min 60 min0 min
90 min
*¶Significatif/non-stimuléSignificatif/FSK
�ARN�Northern blot
Promoteur du gène de l’IL-6 et mesure de l’activité transcriptionnelle
Transfection cellulaire transitoire
Cellules FRTL-5
5 ’ 3 ’AP-1 CRE NFkB Luciférase
TATA
-283-1168 -63
C/EBP
(NF-IL6)
Co-transfectionPlasmide rapporteur luciférasePlasmide contrôle β-galactosidase
Transfection cellulaire transitoire
Déprivation
Stimulations
24h
24h
7h
Activités luciférase et ββββ-galactosidase
Activité transcriptionnelle du promoteur de l’IL-6 dans les cellules FRTL-5
20
Activités LUC / ββ ββ-GAL
(fois d’induction)
* **x 2,8synergie
Significatif par rapport IL-1* **/
0
10
0 TSH FSK IL-1 IL-1+
TSH
IL-1+FSK
Activités LUC /
(fois d’induction)
P1168 wt
Activités LUC / ββββ-GAL (fois d’induction)0 5 10 15 20 25 30
P1168 ∆∆∆∆AP-1x 1,3
P1168 mCRE
x 3,1
synergieLUC
LUC
Effet de l’invalidation des sites du promoteur de l’IL-6 sur l’effet synergique IL-1/FSK
P1168 mCREx 1,5
P1168 mC/EBPx 2.4
P1168 mNFκκκκB
x 4.3
LUC
LUC
LUC
IL-1IL-1+FSK
Effet de la synergie sur la liaison des facteurs de transcription sur les sondes AP-1 et CRE
Cellules FRTL-5. stimulation 1h. extraits nucléaires. Incubation sondes
Retard sur gelEMSA
CRE*+/-CRE
CRE
5’…GGACGTCA…3’
AP-1
AP-1*+/-AP-15’…TGAGTCA…3’
non-spé.
CRE*
CRE
non-spé.
AP-1*
AP-1
Fos:Jun: CREB:
Les facteurs de transcription AP-1 et CREB
. Appartiennent à la superfamille des facteurs de transcription b-ZIP (leucine zipper factor). Forment des homo ou des hétérodimères
c-FosFra1Fra2FosB
c-JunJunB JunD
CREBATF1
Stimulation transcription par les hétérodimères Jun-Fos est plus forte que celle des homodimères Jun-Jun.
Expression et activation des facteurs de transcription AP-1 et CREB
FSK IL1IL1+ FSK
0
c-Fos
FosB
Fra-1
Stimulation 1hExtraits nucléairesWestern-blot
Cellules FRTL-5
ATF-1
CREB
Fra-2
c-Jun
JunD
JunBP-Jun Ser63
P-Jun Ser73
P-CREB Ser133
P-ATF-1 Ser63
FSK IL1IL1+ FSK
0
Conclusion 2
. L’AMPc augmente la stabilité de l’ARNm de l’IL-6
. La TSH/ FSK stimule de manière synergique l’activité du promoteurde l’IL-6 induite par l’IL-1
. Les sites AP-1 et CRE sont la cible de l’effet synergique
. L’expression de c-Fos et Fra-2 est stimulée par l’IL-1/FSK demanière synergique
IL-1
CREBATF-1
Pc-FosFra-2
Jun
P
AMPc
c-FosFra-2
Dialogues entre l’IL-1 et l’AMPc dans l’expression synergique de l’IL-6
NFkB
ARNm IL-6
ATF-1Fra-2
AP-1
ARNm IL-6
Fra-2
Plan de l’exposé
1) Dialogues entre les voies de signalisation de l’IL-1 et celles de l’AMPc dans la production de l’IL-6
2) Mécanismes de régulations de la synergie au niveau de la stabilité de l’ARNm et au niveau transcriptionnel
3) Voies de signalisation activées par l’IL-6 et par le mécanisme de « trans-signaling » dans les cardiomyocytes
4) « Trans-signaling » et induction de marqueurs de l’hypertrophie cardiaque
5) Conclusions-Perspectives
cardiomyocyteventriculaire
cellule T cellule B
IL-6
Action paracrine/autocrine de l’IL-6 dans le tissu cardiaque ventriculaire
?
IL-6IL-6
IL-6
fibroblastes cardiaques
activationclassique
IL-6 IL-6
2 types de récepteurs pour l‘IL-6
Trans-signaling
sIL-6R
sIL-6RIL-6 IL-6
sIL-6R
sIL-6R
Métalloprotéase
sIL-6R
sIL-6R
gp130
gp130IL-6R
IL-6R
gp130
gp130
sIL
sIL
Épissage alternatif
Domaine transmembranaire
ARNm IL-6R
Coupure protéolytique
IL-6R
IL-6R
gp130
JAK
gp130
JAKIL-6R
IL-6R
IL-6 IL-6
Voies de signalisation de l’IL-6
gp130
JAK
gp130
JAKIL-6R
IL-6R
IL-6 IL-6
P P
SHP2
STAT3 PP
SHP2
STAT3
STAT3
STAT3 P
P
PI3KAKT
ERK1/2
P P
100 kDaIL-6RARNm
IL-6R
Etude de la phosphorylation des MAP kinases ERK1/2 et de AKT en réponse à l’IL-6
RT-PCR Western-blot
IL-6R
rIL-6
P-ERK1/2Thr202/Tyr204
Total ERK1/2
0 10 15 60Temps (min) 4530
P-AKTSer473
Total AKT
Temps 0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h
rIL-6
30’
Etude de la phosphorylation de STAT3 en réponse à l’IL-6 dans les cardiomyocytes de rats
hIL-6 + hsIL-6R
0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h30’
Trans-signaling
P-STAT3tyr705
Temps
Total STAT3
0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h30’ 0 10’ 20’ 1h 2h 3h 4h 6h30’
Plan de l’exposé
1) Dialogues entre les voies de signalisation de l’IL-1 et celles de l’AMPc dans la production de l’IL-6
2) Mécanismes de régulations de la synergie au niveau de la stabilité de l’ARNm et au niveau transcriptionnel
3) Voies de signalisation activées par l’IL-6 et par le mécanisme de « trans-signaling » dans les cardiomyocytes
4) « Trans-signaling » et induction de marqueurs de l’hypertrophie cardiaque
5) Conclusions-Perspectives
Morphologie des cardiomyocytes dans l’hypertrophie et l’insuffisance cardiaque
Synthèse
Peptides
Hunter and Chien, 1999
Peptides natriurétiques(BNP)Gène précoce(c-Fos)
protéique
• LIF, CT-1/cardiomyocytes, myocarde���� survie, ���� l'hypertrophie cardiaque, ���� régénération myocardeNegoro et coll (2001) Circulation Kodoma et coll (1997) Circ Res
Effets cardiaques des cytokines de la famille IL-6
Kodoma et coll (1997) Circ Res Zou et coll (2003) Circulation
• Souris TG surexpression IL-6 + IL-6R :Hypertrophie ventriculaire chez l'adulteHirota et coll (1995) PNAS
140
160]-Leucine
(% du controle)
**
*
Mesure de la synthèse protéique
stimulation 24h
Cardiomyocytes
100
120
0 PE rIL-6 hIL-6 hIL-6+
hsIL-6R
incorporation [3H]-
(% du controle)
0
**
PE: phényléphrine (agoniste alpha-adrénergique)
600
800
Fos/ ARNm CycA
(% du contrôle)
*
Etude de l’induction de gènes associés au processus hypertrophique
stimulation 1h30
Cardiomyocytes
RT-PCRq
Sécrétion du BNP
(% du contrôle) 400
500
*
stimulation 48h
Dosage ELISA
0
200
400
600
ARNm c-Fos/ ARNm CycA
(% du contrôle)
*
Sécrétion du BNP
(% du contrôle)
0
100
200
300 *
gp130
gp130
IL-6 IL-6
JAK JAK
Conclusion 3
SHP2
IL-6R
IL-6R
• Expression du récepteur de l’IL-6
Cardiomyocytes
sIL-6R
sIL-6R
SHP2
STAT3
• Le trans-signaling de l’IL-6 estindispensable:
Synthèse protéique
Expression de c-Fos
Sécrétion du BNP
���� Dans l’expression des marqueursassociés au processus hypertrophique
PI3KAkt
ERK1/2
SHP2
���� Dans l’activation de STAT3
PI3KAkt
ERK1/2
SHP2
STAT3
STAT3
STAT3
Plan de l’exposé
1) Dialogues entre les voies de signalisation de l’IL-1 et celles de l’AMPc dans la production de l’IL-6
2) Mécanismes de régulations de la synergie au niveau de la stabilité de l’ARNm et au niveau transcriptionnel
3) Voies de signalisation activées par l’IL-6 et par le mécanisme de « trans-signaling » dans les cardiomyocytes
4) « Trans-signaling » et induction de marqueurs de l’hypertrophie cardiaque
5) Conclusions-Perspectives
c-FosFra2
ARNm IL-6
Sécrétion IL-6
stabilité
AMPc
IL-1IL-1+ AMPc/PKA
Conclusion générale
Fra2
CREAP1 NFkB IL-6IL-6
IL-6 hypertrophie
Trans-signaling IL-6
hypertrophie
STAT3
sIL-6R
Perspectives
• Etudier le mécanismes du trans-signaling de l’IL-6 dans les cellulesFRTL-5 puis dans thyrocytes humains.
• Etudier les mécanismes qui conduisent à l’activation spécifique deSTAT3 par trans-signaling
� niveau critique d’activation de la gp130� niveau critique d’activation de la gp130
• Montrer l’implication de STAT3 dans la stimulation de l’hypertrophie cellulaire des cardiomyocytes par l’IL-6
• Mettre en évidence l’effet autocrine IL-1+ISO sur l’hypertrophie� Production du récepteur soluble de rat� Étude sur cellules humaines
Remerciements
Martine Pomérance
Jean-Paul Blondeau
Rodolphe Fischmeister
Aurore Germain
Florence Lefebvre
Rodolphe Fischmeister
Françoise Chantoux
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