univerzitet u niŠu prirodno matematiČki fakultet · namirnica od mleka, mesa, povrća i...
Post on 01-Nov-2019
4 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Milica N. Lazarević
REZISTENCIJA BAKTERIJA MLEČNE KISELINE
IZOLOVANIH IZ KAJMAKA NA ANTIBIOTIKE
-MASTER RAD-
Niš, 2015.
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
-MASTER RAD-
REZISTENCIJA BAKTERIJA MLEČNE KISELINE
IZOLOVANIH IZ KAJMAKA NA ANTIBIOTIKE
Kandidat: Milica Lazarević 141
Mentor: Dr Nataša Joković
Niš, 2015.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY WITH ECOLOGY
-MASTER THESIS-
ANTIBIOTIC RESISTANCE OF LACTIC ACID BACTERIA
ISOLATED FROM KAJMAK
Candidate: Milica Lazarević 141
Mentor: PhD Nataša Joković
Niš, 2015.
Biografija kandidata
Ime i prezime: Milica Lazarević
Datum rođenja: 18.09.1991.
Mesto rođenja: Niš
Osnovna škola: „Ivan Goran Kovačić” u Niškoj Banji
(1998 - 2006. god.)
Srednja škola:
Gimnazija „Bora Stanković” u Nišu, društveno-jezički
smer
(2006 – 2010. god.)
Fakultet:
Prirodno matematički fakultet u Nišu, departman za
biologiju i ekologiju
(2010 – 2015. god.)
osnovne akademske studije: smer biologija (2010 – 2013. god.)
master akademske studije: smer biologija (2013 – 2015. god.)
Sažetak:
U ovom radu testirano je 49 izolata bakterija mlečne kiseline (BMK), izolovanih iz
kajmaka, za osetljivost na antibiotike, metodama disk difuzije, mikrodilucije i agar dilucije.
Testirani izolati pripdaju vrstama Lactococcus lactis ssp. lactis (4), Enterococcus faecalis (3),
Enterococcus faecium (15), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (21),
Lactobacillus paracasei (2) i Lactobacillus plantarum (4). Za ispitivanje rezistencije BMK
sojeva na antibiotike disk difuzionom metodom korišćeni su komercijalni diskovi ampicilina,
eritromicina, klindamicina, eritromicina, vankomicina, tetraciklina i hloramfenikola. Za
mikrodilucionu metodu i agar dilucionu metodu korišćeni su rastvori antibiotika u prahu i to
eritromicina, gentamicina, ciprofloksacina i doksiciklina.
Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da su svi testirani izolati, koji
pripadaju vrstama Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp.
mesenteroides, Lb. paracasei i Lb. plantarum osetljivi na ampicilin, eritromicin, tetraciklin,
doksiciklin i hloramfenikol, dok je većina izolata osetljiva na antibiotike gentamicin,
klindamicin, vankomicin i ciprofloksacin. Rezistencija na gentamicin prisutna je kod ukupno
pet izolata, po jednog izolata vrste Lc. lactis ssp. lactis, E. faecium i Lb. paracasei i kod dva
izolata vrste E. faecalis. Rezistencija na klindamicin takođe je prisutna kod pet izolata i to
jednog Lc. lactis ssp. lactis i E. faecalis izolata i tri E. faecium izolata. Dva izolata vrste Lb.
plantarum bila su rezistentna na vankomicin, dok je rezistencija na ciprofloksacin prisutna
kod jednog izolata vrste L. mesenteroides. Rezultati za rezistentnost na antibiotike veoma
variraju između različitih metoda koje su korišćene u ovom radu.
Ključne reči: bakterije mlečne kiseline, rezistencija, antibiotici
Abstract:
The aim of this study was to evaluate the susceptibility for 49 isolates of lactic acid
bacteria (LAB) isolated from kajmak, belonging to the species Lactococcus lactis ssp. lactis
(4), Enterococcus faecalis (3), Enterococcus faecium (15), Leuconostoc mesenteroides ssp.
mesenteroides (21), Lactobacillus paracasei (2) and Lactobacillus plantarum (4), to seven
antibiotics (ampicillin, erythromycin, clindamycin, erythromycin, vancomycin, tetracycline and
chloramphenicol) with disk diffusion method. Additionally, four antibiotics (erythromycin,
gentamicin, ciprofloxacin and doxycycline) were used for susceptibility testing with
microdilution and agar dilution method.
According to the results, all tested isolates belonging to species Lc. lactis ssp. lactis,
E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei and Lb.
plantarum were susceptible to ampicillin, erythromycin, tetracycline, doxycycline and
chloramphenicol, while most of isolates were susceptible to gentamicin, clindamycin,
vancomycin and ciprofloxacin. Five gentamicin-resistant isolates were detected (one Lc. lactis
ssp. lactis, E. faecium, Lb. paracasei and two E. faecalis isolates). Five clindamycin -resistant
isolates were also detected (one Lc. lactis ssp. lactis and E. faecalis and three E. faecium
isolates). Two Lb. plantarum isolates were resistant to vancomycin and one L. mesenteroides
isolate was resistant to ciprofloxacin. The results of susceptibility testing showed variation
between those three methods.
Key words: lactic acid bacteria, resistance, antibiotics
Sadržaj 1. Uvod ............................................................................................................................................................. 1
1.1. Bakterije mlečne kiseline.................................................................................................................. 2
1.1.1. Rod Lactococcus ................................................................................................................ 4
1.1.2. Rod Enterococcus .............................................................................................................. 4
1.1.3. Rod Leuconostoc ............................................................................................................... 5
1.1.4. Rod Lactobacillus ............................................................................................................... 5
1.2. Antibiotici ............................................................................................................................................ 7
1.2.1. Mehanizmi delovanja antibiotika ..................................................................................... 7
1.3. Rezistencija na antibiotike ............................................................................................................... 9
1.3.1. Mehanizmi rezistencije na antibiotike ........................................................................... 10
1.3.2. Mehanizmi horizontalnog transfera gena ..................................................................... 11
1.3.3. Rezistencija na antibiotike bakterija mlečne kiseline.................................................. 12
2. Ciljevi istraživanja ................................................................................................................................. 16
3. Materijal i metode ................................................................................................................................. 17
3.1. Materijal ............................................................................................................................................ 17
3.1.1. Bakterijski sojevi .............................................................................................................. 17
3.1.2. Bakterijske suspenzije ..................................................................................................... 17
3.1.3. Antibiotici .......................................................................................................................... 17
3.2. Metode .............................................................................................................................................. 18
3.2.1. Metoda disk difuzije......................................................................................................... 18
3.2.2. Mikrodiluciona metoda .................................................................................................... 18
3.2.3. Agar diluciona metoda .................................................................................................... 19
4. Rezultati .................................................................................................................................................... 20
4.1. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactococcus.............................................................. 21
4.2. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Enterococcus ........................................................... 23
4.3. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Leuconostoc ............................................................. 27
4.4. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactobacillus ............................................................ 31
4.5. Ukupna rezistencija BMK izolata određena metodom disk difuzije .......................................... 34
4.6. Upoređivanje rezultata dobijenih različitim metodama određivanja rezistencije na
antibiotike ......................................................................................................................................... 36
5. Diskusija ................................................................................................................................................... 41
6. Zaključak .................................................................................................................................................. 45
7. Literatura .................................................................................................................................................. 46
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
1
1. Uvod
Bakterije mlečne kiseline (BMK) predstavljaju taksonomski raznovrsnu grupu
bakterija, koja obuhvata veliki broj rodova i vrsta. Zajednička karakteristika ovih bakterija
jeste sposobnost sinteze mlečne kiseline, kao krajnjeg produkta metabolizma. Značaj BMK
ogleda se u viševekovnoj upotrebi pri tradicionalnoj i industrijskoj proizvodnji fermentisanih
namirnica od mleka, mesa, povrća i žitarica. Ove bakterije prirodno nastanjuju pomenute
namirnice ili se u njih namerno dodaju, u vidu starter kulture. Pored toga, bakterije mlečne
kiseline se mogu naći i na brojnim drugim staništima, poput gastrointestinalnog i
urogenitalnog trakta čoveka i životinja.
Veliki broj BMK ima GRAS status (Generally Recognized As Safe), a mnoge od njih
svrstavaju se u grupu probiotika, zbog pozitivnog efekta na zdravstveno stanje čoveka.
Međutim, tokom poslednjih dekada, javila se zabrinutost da bakterije mlečne kiseline, koje se
u velikom broju unose u gastrointestinalni trakt, predstavljaju rezervoar gena za rezistenciju
na antibiotike. Geni se horizontalnim putem mogu preneti potencijalno pategenim i
patogenim bakterijama. Kada takve bakterije steknu rezistenciju na antibiotike, bolesti koje
one prouzrokuju ne mogu biti uspešno lečene datim antibiotikom. Ovo uzrokuje brojne
probleme, počevši od otežanog i veoma dugog lečenja, preko povećane stope morbiditeta i
mortaliteta, što na kraju ima negativan efekat na društvo, privredu, ekonomiju i td. Zbog
toga je potrebno ispitati rezistenciju na antibiotike onih sojeva koji se, putem hrane, direktno
unose u organizam čoveka.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
2
1.1. Bakterije mlečne kiseline
Bakterije mlečne kiseline (BMK) predstavljaju heterogenu grupu Gram-pozitivnih koka
i bacila, sa niskim sadržajem GC parova u genomu. Ne sintetišu enzim katalazu i nemaju
elektron- transportni sistem i citohrome, tako da se svrstavaju u grupu mikroaerofilnih i
fakultativno anaerobnih bakterija. BMK ne formiraju spore i nepokretne su. Grupa BMK
obuhvata oko 20 rodova, u okviru razdela Firmicutes. Iz praktičnih razloga, pojedini rodovi se
izdvajaju kao najvažniji predstavnici ove grupe i to su rodovi Aerococcus, Carnobacterium,
Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,
Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus i Weissella (Korhonen, 2010).
Na osnovu krajnjih produkata katabolizma glukoze, mogu se podeliti u dve grupe:
homofermentativne i heterofermentativne BMK (Korhonen, 2010). Kod homofementativnih
BMK, koje glukozu katabolišu glikolitičkim putem i mlečnom fermentacijom, krajni produkti su
dva mola laktata (mlečne kiseline) i ATP molekula. Kod heterofermentativnih BMK glukoza se
razlaže 6-fosfoglukonat/fosfoketolaznim (6-PG/PK) putem, pa su krajnji produkti po jedan
mol laktata, etanola i ATP (Slika 1).
Slika 1. Uopšteni put katalize glukoze kod
A: homofermentativnih BMK i B: heterofermentativnih BMK (Korhonen, 2010)
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
3
BMK su u prirodi široko rasprostranjene i mogu se naći na staništima koja su bogata,
pre svega, ugljenim hidratima i proteinima. BMK imaju veoma složene nutritivne zahteve, pa
pored ugljenih hidrata i proteina, za njihov rast neophodno je i prisustvo brojnih
aminokiselina, derivata nukleinskih kiselina, soli, vitamin (riboflavina, pantotenske i folne
kiseline, biotina i tiamina) (Tannock, 2004). Ovako kompleksni nutritivni zahtevi rezultat su
nedostatka određenih gena, specifičnih regulatornih mehanizama ili kompletnih biosintetskih
puteva. Sa druge strane, BMK se mogu naći u okviru brojnih i veoma različitih ekoloških niša,
zbog velike sposobnosti prilagođavanja (Tannock, 2004). Predstavljaju epifitnu floru biljaka,
sastavni su deo gastrointestinalnog i urogenitalnog trakta sisara, a prisutne su i u
namirnicama poput mleka, mesa, povrća i žitarica.
Vekovima unazad, širom sveta, BMK se upotrebljavaju za proizvodnju tradicionalnih i
industrijskih fermentisanih namirnica i napitaka. Do fermentacije može doći spontano, usled
prirodnog prisustva BMK, ili nakon namernog dodavanja BMK u namirnice, u vidu starter-
kultura. BMK produkuju antimikrobne supstance i upravo ta njihova osobina čini ih pogodnim
za konzerviranje hrane. Mali organski molekuli, koji su rezultat procesa fermentacije,
pokazuju antimikrobni efekat. Rezultat fermentacije šećera su organske kiseline (mlečna,
sirćetna i propionska kiselina) i one predstavljaju primarne metabolite. Ove kiseline dovode
do snižavanja pH vrednosti sredine. U takvim uslovima može da raste veoma mali broj
bakterija, pa ovo predstavlja primarnu inhibitornu aktivnost BMK. Pored primarnih
metabolita, BMK sintetišu i mnoga neorganska jedinjenja i sekundarne metabolite, koji
takođe imaju antimikrobno dejstvo. Tako, ugljen dioksid (CO2), koji nastaje u metabolizmu
heterofermentativnih BMK, stvara anaerobne uslove i inhibira rast aerobnih
mikroorganizama. Vodonik peroksid (H2O2) se nagomilava usled nedostatka enzima katalaze i
zbog jakog oksidativnog efekta na bakterijske ćelije, dovodi do destrukcije osnovnih ćelijskih
struktura. Diacetil, koji nastaje kao krajnji proizvod metabolizma citrata, pored
karakteristične arome koju daje fermentisanim proizvodima, ima i antimikrobnu aktivnost.
Etanol, koji nastaje kao produkt katabolizma ugljenih hidrata kod heterofermentativnih
bakterija, takođe ima inhibitorni efekat, koji je zasnovan na destrukciji ćelijskih membrane.
Sekundarni metaboliti, bakteriocini, se sintetišu u stacionarnoj fazi rasta i predstavljaju male
peptide i proteine, sa relativno uskim opsegom antimikrobne aktivnosti, koji je ograničen na
srodne sojeve i omogućava soju koji ih proizvodi kompetitivnu prednost. Bakteriocini BMK
podeljeni su u tri klase, a neki od karakterističnih predstavnika su nizin, pediocin i helveticin.
Zbog veoma duge istorije korišćenja, mnoge BMK su stekle GRAS-status, a neke od
njih spadaju i u grupu probiotika, zbog pozitivnog delovanja na zdravlje ljudi i životinja.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
4
Rodovi Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc i Lactobacillus su najznačajniji u industriji
mlečnih proizvoda.
1.1.1. Rod Lactococcus
Laktokoke su mezofilne homofermentativne BMK, kod kojih je L(+) oblik mlečne
kiseline glavni produkt metabolizma glukoze i mogu se naći u različitim ekološkim nišama,
poput kože životinja, površine biljaka, sirovog mleka, sireva i drugih mlečnih proizvoda.
Predstavljaju deo starter kultura za proizvodnju fermentisanih mlečnih proizvoda. Osnovna
uloga laktokoka je acidifikacija sredine, odnosno sinteza mlečne kiseline i smanjenje pH
početnog supstrata, što obezbeđuje antimikrobne uslove, zatim hidroliza proteina i sinteza
jedinjenja koja utiču na oraganoleptičke karakteristike proizvoda. Ćelije mogu biti
pojedinačne, u paru ili kraćim lancima (ćelije mogu biti izdužene u pravcu prostiranja lanca).
Rod Lactococcus obuhvata pet vrsta: Lactococcus garvieae, Lactococcus piscium,
Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis i Lactococcus lactis.
Vrsta Lactococcus lactis je karakterističan predstavnik ovog roda i predstavlja vrstu
koja je najčešće izolavana iz mleka i mlečnih proizvoda, i to podvrste Lc. lactis ssp. lactis i Lc.
lactis ssp. cremoris, a postoji i treća podvrsta, Lc. lactis ssp. hordniae. U okviru podvrste Lc.
lactis ssp. lactis nalazi se biovarijetet Lc. lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis, koji ima
sposobnost metabolizma citrata i proizvodnje aromatičnih jedinjenja. Metabolizam citrata je
kodiran genima na plazmidima, pa je ova osobina nestabilna. Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis
ssp. lactis biovar. diacetylactis i Lc. lactis ssp. cremoris ulaze u sastav starter kultura za
proizvodnju mnogih mlečnih proizvoda.
1.1.2. Rod Enterococcus
Enterokoke su termofilne homofermentativne BMK, koje fermentacijom glukoze daju
samo L(+) oblik mlečne kiseline. Ćelije su okrugle, najčešće u parovima (diplokoke) ili kraćim
lancima. Mogu se naći u veoma različitim nišama, zbog toga što imaju sposobnost da prežive
u nepovoljnim uslovima, poput ekstremnih temperatura (5-65 °C), u baznim i u kiselim
sredinama (pH od 4,5 do 10,0), sredinama sa visokom koncentracijom NaCl (Fisher i Phillips,
2009). Izoluju se iz hrane, vode, zemlje, sa biljaka, a Enterococcus faecalis i Enterococcus
faecium predstavljaju normalnu mikrofloru gastrointestinalnog trakta čoveka i drugih sisara.
U okviru roda Enterococcus nalaze se 32 vrste, od kojih su neke oportunistički
patogeni čoveka. Postoje neslaganja o ulozi vrsta E. faecalis i E. faecium, koje su prisutne u
fermentisanim proizvodima. Sa jedne strane, smatra se da njihovo prisustvo doprinosi
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
5
senzornim svojstvima proizvoda, zahvaljujući proteolitičkoj aktivnosti i produkciji jedinjenja
koja utiču na aromu. Sa druge strane, prisustvo ovih vrsta smatra se posledicom loših
higijenskih uslova tokom proizvodnje. Kod pojedinih sojeva enterokoka uočena je rezistencija
na antibiotike, kao i virulentni faktori (uglavnom kod kliničkih izolata), zbog čega upotreba
enterokoka kao komercijalnih startera ili probiotika, mora biti zanovana na detaljno
proučenim sojevima.
1.1.3. Rod Leuconostoc
Predstavnici roda Leuconostoc su heterofermentativne BMK, koje tokom katabolizma
glukoze, pored D(-) oblika mlečne kiseline, produkuju etanol i CO2. To su mezofilne bakterije,
kokoidnog oblika. U prirodi, vrste roda Leuconostoc mogu se naći kao epifitna flora biljaka,
ali i u drugim ekološkim nišama. Imaju značajnu ulogu u različitim procesima fermentacije
hrane, pa se pored mlečnih i biljnih fermentisanih proizvoda, mogu naći i u fermentisanim
mesnim proizvodima (kobasicama) i proizvodima od žitarica. Mogu biti prirodno prisutne u
supstratu ili se dodaju kao pomoćne starter kulture, zbog specifične arome i teksture finalnog
proizvoda, usled sinteze diacetila, acetata i dekstrana (Campedelli i sar., 2015).
Rod Leuconostoc obuhvata 11 vrsta i tri podvrste Leuconostoc mesenteroides- L.
mesenteroides ssp. mesenteroides, L. mesenteroides ssp. cremoris i L. mesenteroides ssp.
dextranicum (Säde, 2011). Ove podvrste su veoma značajne za industriju, kao starter
kulture. L. mesenteroides ssp. mesenteroides se koristi za prizvodnju dekstrana, koji se
upotrebljava za povećanje volumena krvne plazme, kao zamena za terapiju heparinom i u
kozmetici (Bhavani i Nisha, 2010). Vrste roda Leuconostoc mogu izazvati kvarenje
fermentisanih proizvoda (najčešće zamrznutih mesnatih proizvoda), u vidu prisustva
dekstranske sluzi (Säde, 2011).
1.1.4. Rod Lactobacillus
Rod Lactobacillus predstavlja veoma heterogenu grupu Gram-pozitivnih bacila, sa GC
sadržajem koji varira od 33% do 55% (Bernardeau i sar., 2008). Uključuje vrste sa različitim
fenotipskim, fiziološkim i biohemijskim svojstvima. Oblik ćelija varira od skoro kokoidnih
formi, koje često formiraju kratke ili dugačke lance, do veoma izduženih i tankih štapićastih
ćelija. Pripadnici ovog roda se mogu naći na najrazličitijim staništima bogatim ugljenim
hidratima, poput sluzokože čoveka i drugih sisara (u usnoj duplji, gastrointestinalnom i
urogenitalnom traktu), na biljkama i materijalima biljnog porekla, u đubrivu, veštačkim
ekosistemima poput kanalizacije... Pojedini predstavnici mogu biti uzročnici kvarenja voća,
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
6
ribe, mesa i mesnih prerađevina, mleka i fermentisanih napitaka, poput vina i piva. Međutim,
laktobacili se već godinama koriste za proizvodnju fermentisanih proizvoda od povrća, mesa,
a posebno za dobijanje različitih mlečnih proizvoda. Laktobacili su acidotolerantni i acidofilni.
Tokom rasta smanjuju pH supstrata na 4,0, što ima antimikrobni efekat. U supstratu se
nalaze prirodno ili se dodaju kao starter i pomoćne kulture, kako zbog produkcije mlečne
kiseline, tako i zbog njihove proteolitičke i dipeptidazne aktivnosti, ali i zbog sposobnosti
sinteze aromatičnih jedinjenja poput diacetila i acetaldehida. Određeni sojevi laktobacila
imaju izražena probiotska svojstva, poput očuvanja lokalne mikroflore, antimikrobnog dejstva
na patogene organizme i modulacije imunog odgovora. Sa razvojem različitih tehnika, znanja
o ovom rodu rastu, što omogućava sve uspešniju kontrolu produkcije i povećava opseg
primene pri proizvodnji fermentisanih i probiotskih proizvoda (Bernardeau i sar., 2008).
Lactobacillus predstavlja rod sa najvećim brojem vrsta, u okviru grupe BMK, sa čak
215 vrsta i 29 podvrsta (http://www.bacterio.net/lactobacillus.html oktobar, 2015), koje su
svrstane u tri grupe:
1) obligatni homofementativni laktobacili koji fermentišu samo heksoze do
mlečne kiseline, ne fermentišu pentoze i glukonat (najvažniji predstavnici su Lactobacillus
delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus i Lactobacillus acidophilus, koji ulaze u
sastav starter kultura za prizvodnju jogurta, sireva i kao probitska vrsta, za proizvodnju
napitaka i probiotskih preparata);
2) fakultativni heterofermentativni laktobacili koji fermentišu heksoze do
mlečne kiseline i pentoze do mlečne ili sirćetne kiseline; produkuju gas pri fermentaciji
glukonata, ali ne i iz glukoze (najznačajniji predstavnici ove grupe su Lactobacillus paracasei,
Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus
i Lactobacillus sakei, koriste se kao starter kulture za različite vrste sireva i kao probiotici u
fermentisanoj hrani ili preparatima, zatim kao starter kulture za kobasice i druge proizvode
od mesa);
3) obligatni heterofermentativni laktobacili koji fermentišu heksoze do
mlečne kiseline, sirćetne kiseline i/ili etanola i CO2 (Lactobacillus sanfranciscensis,
Lactobacillus kefiri i Lactobacillus reuteri su najvažniji predstavnici koji se koriste kao starter
kultura za proizvodnju kiselog testa, za proizvodnju alkoholnog mlečnog napitka kefira i u
proizvodnji komercijalnih probiotika).
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
7
1.2. Antibiotici
Antibiotici su organska jedinjenja koja sintetišu bakterije (Escherichia coli, Bacillus
subtilis, Streptomyces griseus, Streptomyces erythreus i td.), plesni (Penicillium
chrysogenum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus clavatus i td.) ili alge (Chlorella
vulgaris) u vidu sekundarnih metabolita. Oni na druge mikroorganizme deluju tako što
inhibiraju rast i razmnožavanje (bakteriostatici) ili uzrokuju njihovu smrt (baktericidi)
(Varagić, 2012). Aleksandar Fleming je 1929. godine utvrdio da metabolitički produkt plesni
Penicillium notatum inhibira rast bakterije Staphylococcus aureus. Nakon njegovog otkrića,
počinje era antibiotika. Do danas je izolovano i opisano nekoliko hiljada antibiotika (Mihajilov-
Krstev, 2008). Hemijskim modifikacijama molekula prirodnih antibiotika, dobijaju se
polusintetski derivati, koji često pokazuju širi spektar antimikrobnog dejstva.
Antibiotici su svrstani u grupe (familije), a kao najbitnije grupe izdvajaju se β-
laktamski, aminoglikozidni antibiotici, glikopeptidi, hloramfenikoli, tetraciklini, streptogramini,
makrolidi, linkozamidi, sulfonamidi i kvinoloni (Korhonen, 2010).
1.2.1. Mehanizmi delovanja antibiotika
Razlikujemo četiri osnovna mehanizma delovanja antibiotika:
1) inhibicija sinteze ćelijskog zida,
2) promena permeabilnosti plazmaleme ili aktivnog transporta kroz membranu,
3) inhibicija sinteze proteina, na nivou transkripcije ili translacije i
4) inhibicija sinteze nukleinskih kiselina.
Inhibicija sinteze ćelijskog zida ili povreda ćelijskog zida uzrokuje smrt ćelije.
Ovim mehanizmom delovanja odlikuju se β-laktamski antibiotici (penicilini, cefalosporini,
monobaktami i karbapemi), glikopeptidi (vankomicin, teikoplanin i avoparicin), bacitracin,
cikloserin i fosfomicini (Mujezinović, 2011). Čak 70% svih antibakterijskih lekova čine β-
laktamski antibiotici, koji sadrže četvoročlani β-laktamski prsten (Petrović, 2007). Molekuli
ovih antibiotika se vezuju za specifične receptore na bakterijskim ćelijama- PBP receptore
(Penicilin Binding Protein). Efekat koji na ćeliju ima antibiotik zavisi od toga za koji se tip PBP
vezao molekul. Ovi receptori kodirani su genima na hromozomu. Nakon vezivanja antibiotika
za receptor, dolazi do inhibiranja reakcije transpeptidacije, zbog čega se zaustavlja sinteza
peptidoglikana koji predstavlja osnovnu komponentu ćelijskog zida. Dalje dolazi do
uklanjanja/inaktivacije jednog od inhibitora autolize, što pokreće proces lize ćelije i rezultira
njenom smrću (Varagić, 2012). Vankomicin i bacitracin inhibiraju rane faze sinteze ćelijskog
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
8
zida unutar ćelije. Cikloserin predstavlja strukturni analog D-alanina i njegovo dejstvo je
zasnovano na kompetitivnoj inhibiciji enzima alanin-racemaze i alanin sintetaze (Mujezinović,
2011). Fosfomicini inhibiraju piruvil–transferazu koja učestvuje u prvoj etapi sinteze ćelijskog
zida.
Promena permeabilnosti plazmaleme ili aktivnog transporta kroz
membranu predstavlja mehanizam kojim deluju polimiksini. Ovi antibiotici menjaju osnovne
funkcije ćelijske membrane, tako što remete njen integritet, pa dolazi do nekontrolisane
razmene jona i makromolekula ćelije sa okolinom ili je razmena u potpunosti zaustavljena.
Ovo izaziva teška oštećenja, ali i smrt ćelije. Deluju na one Gram-negativne bakterije koje u
membrani imaju više fosfatidil-etanolamina (Varagić, 2012).
Inhibicija sinteze proteina, na nivou transkripcije ili translacije je mehanizam
karakterističan za aminoglikozide, tetracikline, hloramfenikol, makrolide (eritromicin,
klaritromicin, telitromicin, azitromicin…) i linkozamide (klindamicin i linkomicin). Inhibicija je
zasnovana na interakciji sa subjedinicama bakterijskih ribozoma, 30S ili 50S. Najbitniji
predstavnici aminoglikozidnih antibiotika su gentamicin, streptomicin, amikacin, tobramicin,
netilmicin i neomicin. Ovi antibiotici se vezuju za specifične receptore na 30S subjedinici i
tako blokiraju aktivnost inicijalnog kompleksa. Informacija sa iRNK se zbog toga pogrešno
prevodi, pa se neodgovarajuća amino kiselina uvodi u peptid. Dolazi do cepanja polizoma na
monozome, usled čega dolazi do smrti ćelije (Varagić, 2012). Tetraciklini (doksiciklin,
hlortetraciklin, oksitetraciklin, minociklin) se takođe vezuju za 30S subjedinicu ribozoma i
tako sprečavaju uvođenje novih amino kiselina u rastući peptidni lanac. Hloramfenikol se
vezuje za 50S subjedinicu, inhibira peptidil-transferazu, što sprečava vezivanje novih amino
kiselina. Makrolidi se vezuju za 50S subjedinicu i ometaju stvaranje inicijalnih kompleksa jer
ometaju reakcije aminoacil translokacije. Linkozamidi su veoma slični makrolidima, kako po
mehanizmu delovanja, tako i po antimikrobnom spektru (Varagić, 2012).
Inhibicija sinteze nukleinskih kiselina karakteristična je za sledeće grupe
antibiotika: hinolone, fluorohinolone, rifampicin, sulfonamide, trimetoprim. Hinoloni
(nalidiksinska i pipemidinska kiselina) i fluorohinoloni (ofloksacin, pefloksacin, norfloksacin i
ciprofloksacin) inhibiraju sintezu nuklinskih kiselina tako što blokiraju DNK-girazu. Rifampicin
se vezuje za DNK zavisnu RNK polimerazu i inhibira sintezu ribonukleinske kiseline.
Sulfonamidi i trimetoprim indirektno inhibiraju sintezu nukleinskih kiselina, preko inhibicije
metabolizma folne kiseline. Sulfonamidi (sulfafurazol, sulfaguanidin, sulfazosulfapiridin) su
strukturni analozi para-amino-benzoeve kiseline (PABA), koju mikroorganizmi koriste u sintezi
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
9
folne kiseline. Kada se molekul sulfonamida veže za pteridin, umesto PABA, inhibira se
funkcija enzima dihidropteroat-sintetaze i stvaraju se nefunkcionalni analozi folne kiseline
(Varagić, 2012). Trimetoprim inhibira sintezu purina i DNK preko inhibicije enzima
dihidrofolat-reduktaze.
1.3. Rezistencija na antibiotike
Bakterije mogu biti osetljive na prisustvo antibiotika ili otporne (rezistentne).
Rezistencija bakterija može biti prirodna (konstitutivna) ili stečena (indukovana).
Konstitutivna rezistencija predstavlja taksonomsku karakteristiku određene vrste i ona se
javlja kod svih predstavnika, bez obzira da li su bakterije bile u kontaktu sa antibiotikom na
koji su rezistentne. Indikuvana rezistencija se uočava tek nakon kontakta sa
antibiotikom, odnosno predstavlja adaptaciju na novonastale, nepovoljne uslove spoljašnje
sredine. Ako u heterogenoj kulturi, inače osetljive vrste, određeni broj jedinki pokazuje
rezistenciju na prisutni antibiotik, u pitanju je indukovana rezistencija. Usled prisustva
antibiotika, osetljive jedinke će biti ubijene ili će se zaustaviti njihov rast, dok će rezistentne
jedinke nastaviti da se dele i postati dominantne.
Indukovana rezistencija može imati fenotipsku ili genetičku osnovu. Kod fenotipske
rezistencije, prisustvo antibiotika izaziva promenu metaboličkih i strukturnih svojstava, u
okviru datog genotipa. Na primer, neke bakterije mogu da pređu u L-oblik (protoplast),
odnosno da izgube ćelijski zid, i tako postaju otporne na delovanje antibiotika poput
penicilina (Varagić, 2012). Genotipska rezistencija je rezultat promena genetičkog
materijala, usled mutacija ili rekombinacija. Mutacije mogu biti spontane ili indukovane
prisustvom antibiotika. U prirodnim populacijama, usled spontanih mutacija, na svakih 105
deoba, nađe se jedna antibiotik-rezistentna jedinaka (Mihajilov-Krstev, 2008). Rekombinacije
se kod bakterija dešavaju na tri načina: konjugacijom, transdukcijom i transformacijom, koje
su opisane u poglavlju Mehanizmi horizontalnog transfera gena.
Geni za rezistenciju na antibiotike se nalaze na bakterijskom hromozomu
(hromozomska rezistencija) ili na plazmidima i transpozonima (ekstrahromozomska
rezistencija). Plazmidi predstavljaju ekstrahromozomalnu, cirkularnu DNK bakterija, koja se
replikuje nezavisno od hromozomske DNK. Broj plazmida u jednoj ćeliji varira i može ih biti
od jednog do nekoliko hiljada. Plazmidi koji nose gene za rezistenciju na jedan ili više
antibiotika nazivaju se R-faktori (resistance factors). Transpozoni su kratke DNK sekvence
koje nose do nekoliko gena i koje imaju sposobnost promene mesta u genomu, zahvaljujući
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
10
„lepljivim krajevima“. Transpozoni se mogu ugraditi u plazmide ali i u hromozomsku DNK i
često nose gene za rezistenciju na antibiotike.
1.3.1. Mehanizmi rezistencije na antibiotike
Postoji nekoliko mehanizama rezistencije na antibiotike, pre svega, odsustvo
bakterijskih struktura na koje deluju antibiotici, a zatim i:
1) enzimska destrukcija ili inaktivacija antibiotika,
2) promena permeabilnosti,
3) promena u strukturi mesta vezivanja antibiotika,
4) promena metaboličkih puteva i
5) razvoj alternativnog enzima (Varagić, 2012).
Enzimska destrukcija ili inaktivacija antibiotika. Neke bakterije se odlikuju
sposobnošću da sintetišu jedan ili više enzima, koji vrše razaranje ili inaktivaciju molekula
antibiotika. Najčešće bakterije produkuju enzime β-laktamaze, koje otvaraju β-laktamski
prsten antibiotika. Postoji oko 60 različitih β-laktamaza i većina je kodirana genima na
plazmidima. Neke Gram negativne bakterije produkuju više različitih enzima koji vrše
adenilaciju, fosforilaciji ili acetilaciju molekula aminoglikozida, dok neke produkuju
hloramfenikol-acetiltransferazu, koja razara molekul hloramfenikola (Varagić, 2012).
Promena permeabilnosti ćelijskih omotača, dovodi do smanjenog ili potpuno
zaustavljenog ulaska molekula antibiotika u bakterijske ćelije. Ovo je mehanizam rezistencije
na one antibiotike koji se akumuliraju unutar ćelije, poput tetraciklina, polimiksina,
fluorohinolonima i penicilinima, posebno kod Gram-negativnih bakterija.
Promena u strukturi mesta vezivanja antibiotika odnosi se na receptore i
specifične proteine na subjedinicama ribozoma za koje se vezuju antibiotici. Usled ovih
promena afinitet molekula antibiotika za dato mesto je značajno smanjen, a samim tim i
delovanje antibiotika. Može doći i do gubitka određenih struktura, poput gubitka PBP, za koje
se vezuju penicilini i cefalosporini. Promenama na subjedinicama ribozoma, bakterija postaje
rezistentna na antibiotike iz grupe tetraciklina, aminoglikozida i makrolida (Varagić, 2012).
Promena metaboličkih puteva se odnosi na sposobnost bakterija da razviju
alternativni metabolički put i na taj način zaobiđu delovanje antibiotika. Ovakva rezistencija
sreće se prema sulfonamidima, jer bakterije prestaju da koriste PABA i da sintetišu folnu
kiselinu, već je usvajaju iz spoljašnje sredine.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
11
Razvoj alternativnog enzima koji obavlja istu funkciju kao i primarni enzim, pri
čemu molekuli antibiotika imaju manji afinitet ka tom alternativnom enzimu, što sprečava
delovanje datog antibiotika. Određene bakterije pokazuju rezistenciju prema hinolonima i
fluorohinolonima, koji se vezuju za DNK girazu, tako što dolazi do izmene domena proteina
za koju se oni inače vezuju. Takođe, ovaj mehanizam prisutan je i kod bakterija rezistentnih
na sulfonamide i trimetoprim jer dolazi do smanjenja afiniteta između dihidropteorat-
sintetaze, odnosno dihidrofolat-reduktaze, i molekula antibiotika.
1.3.2. Mehanizmi horizontalnog transfera gena
Genetske rekombinacije se kod bakterija dešavaju kada nasledni materijal jedinke,
označene kao donor, pređe u drugu jedinku, označenu kao recipijent. Na osnovu načina
transfera, razlikujemo tri mehanizma, odnosno tri tipa rekombinacija i to su konjugacija,
transformacija i transdukcija. Transfer gena se može odvijati u različitim sredinama, poput
vode, zemljišta, digestivnog trakta ljudi i životinja, pa i u hrani. Učestalost i intenzitet
transfera zavisi od prisustva mobilnih genetskih struktura (plazmida, transpozona),
karakteristika ćelija donora i recipijenta, kao i od sredine u kojoj se transfer odigrava.
Konjugacija se vrši direktnim kontaktom između dve žive bakterije, preko
proteinskih nastavaka, konjugativnih pila, čije je formiranje determinisano genima na F
faktoru (Fertility factor), koji može biti slobodan, u vidu plazmida, ili može se ugraditi u
glavni hromozom (Najman, 2002). S obzirom da se veliki broj gena za rezistenciju nalazi na
mobilnim genskim elementima, konjugacija se smatra najvažnijim mehaizmom horizontalnog
transfera gena. Međutim, postoje određena ograničenja. Prvo, sredina u kojoj se nalaze
bakterije mora da dozvoli kontakt između ćelija. Zatim, bakterije moraju da poseduju
određenu mobilnost, bila ona karakteristika date vrste ili rezultat spoljašnjih faktora. Dalje,
ukoliko dođe do transfera nekih ključnih gena, koji se mogu nalaziti na plazmidima, ćelija
donor može umreti. Takođe, da bi se transpozonski elementi, nakon konjugacije, mogli
integrisati u bakterijski hromozom, ćelija recipijent mora da poseduje dovoljno veliki
kapacitet za njihovu ugradnju (Verraes i sar., 2013). Pored ovog uobičajenog načina
konjugacije, kod nekih Gram-pozitivnih bakterija postoje i alternativni načini da se obezbedi
kontakt između ćelija. Na primer, kod enterokoka može doći do transfera plazmida koji je
indukovan prisustvom feromona (Clewell, 1993).
Transformacija je proces tokom kojeg fragmenti gole DNK, iz spoljašnje sredine,
bivaju usvojeni od strane bakterijske ćelije. Ovaj proces podrazumeva nekoliko koraka. Prvo,
DNK fragment mora da dospe u spoljašnju sredinu, bilo usled smrti i lize bakterisjke ćelije ili
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
12
aktivnim izbacivanjem, što se dešava kod nekih bakterija, u određenom trenutku tokom
životnog ciklusa. Zatim se mali, dvolančani fragment nukleinske kiseline mora vezati za
receptore kompetentne bakterije, nakon čega se aktivnim transportom unosi u ćeliju. Tokom
transporta dolazi do hidrolize jednog lanca, pa u ćeliju dospeva jednolančani DNK fragment.
Ovaj fragment se nakon toga pripaja uz homologi deo bakterijskog hromozoma, formirajući
heterodupleks. Ovo hibridno stanje se može promeniti u normalno mehanizmima reparacije.
U slučaju da se to ne desi, deoba rezultira različitim bakterijskim ćelijama, jedna sa
nerekombinovanim a druga sa rekombinovanim hromozom (Najman, 2002). Da bi došlo do
uspešne transformacije, različiti uslovi moraju biti ispunjeni. Na primer, u digestivnom traktu
čoveka i životinja, slobodna DNK je izložena delovanju različiti enzima i želudačne kiseline.
Ako slobodna DNK i u takvim uslovima ostane neoštećena i ako se unese u bakterijsku ćeliju,
mora da postoji homologi region na hromozomu domaćina. Upravo je odsustvo homologih
sekvenci ili replikacionog početka, najveća prepreka za uspešnost transformacije (Verraes i
sar., 2013).
Transdukcija je proces rekombinacije posredovan bakteriofagama kao vektorima.
Razlikujemo dva tipa transdukcije, generalizovanu i specijalizovanu. Generalizovana
transdukcija je proces kojim se bilo koji segment bakterijskog hromozoma može preneti.
Vektori su bakteriofagi koji ulaze u litički ciklus, čiji se genom ne ugrađuje u genom
domaćina, već formira samoreplikujuće elemente, i koji tokom pakovanja genetskog
materijala u kapsid, greškom upakuju i fragment DNK domaćina. Takav bakteriofag dospeva
do sledećeg domaćina, nakon čega dolazi do rekombinacije između homologih sekvenci.
Kako kapsid faga može da primi samo određenu količinu DNK, to znači da nedostaje neki deo
genoma faga. Zbog toga, najčešće, ovakvi fagi ne izazivaju smrt bakterijske ćelije.
Specijalizovana transdukcija je posredovana lizogenim bakteriofagama, koji se ugrađuju u
hromozom domaćina i to uvek na isto mesto. Zbog toga se, kada se greškom povuče DNK
bakterijskog domaćina, uvek povuku isti geni, pa se zbog toga ovaj tip označava kao
specijalizovana transdukcija (Najman, 2002). Kako se bakteriofagi vezuju za tačno određene
receptore na bakterijskim ćelijama, transdukcija se generalno dešava između blisko srodnih
sojeva i vrsta (Verraes i sar., 2013).
1.3.3. Rezistencija na antibiotike bakterija mlečne kiseline
BMK se u velikom broju unose u gastrointestinalni trakt jer se nalaze u brojnim
namirnicama, pre svega u fermentisanim proizvodima od svežeg mleka i mesa i predstavljaju
rezultat prirodnog procesa proizvodnje (Bulajić i sar., 2008). Komensalne bakterije, kakve su
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
13
BMK, mogu biti rezervoar gena za rezistenciju i veoma su bitne za razumevanje načina
održavanja i širenja ovih gena. Pri tome, važno je razlikovati urođenu od stečene rezistencije.
Kako se urođena rezistencija prenosi vertikalno, deobom, i ne može se preneti horizontalnim
putem, ovakva rezistencija ne može biti preneta na patogene bakterije i ne predstavlja
pretnju. Nasuprot tome, stečena rezistencija se može preneti horizontalno. Dokazano je da
se transfer gena intenzivno odvija in vivo u gastrointestinalnom traktu, između komensalnih i
patogenih bakterija. Identični geni izolovani su iz različitih bakterijskih vrsta koje potiču iz
različitih domaćina i sredina (Mathur i Singh, 2005). Konjugativna razmena gena za
rezistenciju veoma je česta kod enterokoka, koje su dobri recipijenti i donori konjugativnih
plazmida i transpozona, i dešava se u okviru roda, ali i sa drugim Gram-pozitivnim
(laktokokama, Bacillus subtilis, predstavnicima rodova Staphylococcus i Listeria), ali i sa
nekim Gram-negativnim bakterijama (Mathur i Singh, 2005). Kod ostalih BMK ova pojava nije
toliko česta. Iako su geni za rezistenciju nastali mnogo pre početka upotrebe antibiotika,
najverovatnije sa ciljem da se bakterije koje produkuju takva antimikrobna jedinjenja zaštite,
istraživanjima je utvrđeno da rezistencija ipak nije bila toliko rasprostranjena kao danas
(Cherkashin i sar., 2013). Kako stoji u revijalnom radu objavljenom od strane Mathura-a i
Sinhg-a (2008), ne postoje granice između patogenih (streptokoka), potencijalno patogenih
(enterokoka) i komensalnih BMK, u odnosu na sposobnost preuzimanja i sticanja
determinanti rezistencije na antimikrobne lekove. Oni dalje navode da postojeći podaci da su
identični geni za rezistenciju na tetraciklin (tet (M)), eritromicin (ermAM), hloramfenikol
(cat), streptomicin (str), streptogramin (sat) pronađeni u sve tri grupe BMK. Ovo podržava
pretpostavku da BMK, kao i sve ostale bakterije, u ekosistemima opterećinim antibioticima
(kakav je i gastrointestinalni trakt ljudi i životinja), učestvuju u komunikaciji i razmenjuju
gene za rezistenciju, kako između vrsta, tako i između rodova.
Iako najveći broj podataka postoji za BMK koje su potencijalni patogeni, sve više
istraživača bavi se problemom pojave i mogućnosti širenja rezistencije i kod ostalih
predstavnika BMK. Neophodno je da se starter i probiotski sojevi BMK ispituju na sposobnost
prenosive rezistencije na antimikrobne lekove, pored potrebe da se kompletno fiziološki i
tehnološki okarakterišu (Bulajić i sar., 2008). U velikom broju slučajeva, kod bakterija roda
Enterococcus uočeni su geni za rezistenciju na vankomicin, mada je registrovano i prisustvo
gena za rezistenciju na tetraciklin, eritromicin, gentamicin i hloramfenikol (Mathur i Singh,
2005). Kod nekih vrsta iz rodova Enterococcus, Lactococcus i Lactobacillus, izolovanih iz
mlečnih proizvoda, detektovano je prisustvo plazmida koji nose rezistenciju na više
antibiotika (multirezistencija). Među vrstama iz roda Lactobacillus uočena je visoka učestalost
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
14
rezistencije na tetraciklin i eritromicin (Mathur i Singh, 2005). Istraživanje sprovedeno od
strane Bulajić i Mijačević (2011), vršeno je sa ciljem da se detektuju BMK rezistetentne na
antibiotike, i to iz rodova Lactococcus, Lactobacillus i Enterococcus, izolovanih iz različitih
linija proizvodnje autohtonog somborskog sira, tradicionalno proizvedenog bez dodatka
starter kulture. Rezultati su pokazali prisustvo rezistentnih bakterija, koje su bile u manjini u
odnosu na osetljive.
Što se tiče roda Enterococcus, najveća pažnja posvećena je vrstama E. faecalis i E.
faecium i to kliničkim izolatima i izolatima poreklom iz ljudskog gastrointestinalnog trakta koji
se odlikuju neobično visokom stopom urođene tolerancije na niske koncentracije nekoliko
grupa antibiotika, poput aminoglikozida, treću generaciju cefalosporina i hinolona (Serror i
Ogieri, 2008). Kod ovakvih izolata uočena je i stečena rezistencija na brojne antibiotike, a
posebno na glikopeptide, poput vankomicina, kao i na sinergističko delovanje β-laktama i
aminoglikozida (Serror i Ogieri, 2008). Što se tiče enterokoka izolovanih iz hrane, takođe je
uočeno povećanje rezistencije na različite antibiotike, uključujući vankomicin, gentamicin i
streptogramine (Huys i sar., 2004). Enterokoke se odlikuju urođenom rezistencijom na
cefalosporine i na male koncentracije aminoglikozida i klindamicina (Mathur i Singh, 2005).
Veliki broj istraživanja govori i o čestoj pojavi stečene rezistencije na tetraciklin, kao i da je
rezistencija kod izolata enterokoka iz evropskih sireva, kodirana skoro istim tet genima (
tet(M), tet(L), tet(S)), koji su prethodno identifikovani kod kliničkih i veterinarskih izolata
(Huys i sar., 2004). Iako je sve češća pojava detekcije rezistentnih enterokoka izolovanih iz
hrane, mali je broj onih koje su rezistentne na klinički važne antibiotike, poput ampicilina,
penicila, gentamicina i vankomicina (Ogier i Serror, 2008).
Rod Lactococcus, odnosno vrsta Lc. lactis pokazuje osetljivost na amikacin, ampicilin,
prvu generaciju cefalosporina, hloramfenikol, eritromicin, gentamicin, penicilin, tetraciklin i
vankomicin, nešto manja osetljivost uočena je prema karbenicilinu, ciprofloksacinu,
dikloksacilinu i norfloksacinu, dok je ova vrsta urođeno rezistentna na kolistin, fosfomicin,
pipemidinsku kiselinu i rifamicin (Mathur i Singh, 2005). Većina laktokoka odlikuje se
urođenom rezistencijom i prema metronidazolu, trimetoprimu, cefoksitinu i aminoglikozidima,
gentamicinu i kanamicinu (Devirgiliis i sar., 2013).
Neki laktobacili se odlikuju visokom urođenom rezistencijom na bacitracin, cefoksitin,
ciprofloksacin, kanamicin, streptomicin, trimetoprim, vankomicin i dr. (Mathur i Singh, 2005).
S obzirom na heterogenost ovog roda, logično je da postoje značajne razlike, čak i u okviru
jedne vrste. Generalno, iako je stečena rezistencija uočena u okviru roda, i to rezistencija na
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
15
tetraciklin (tet(M) geni) i eritromici (erm(B) geni), većina laktobacila izolavana iz
fermentisanih proizvoda, osetljiva je na ove antibiotike (Devirgiliis i sar., 2013).
Predstavnici roda Leuconostoc pokazuju visok stepen urođene rezistencije na
vankomicin (Ogier i sar., 2008). Campedelli i saradnici (2015), su sekvencirali genom tri
podvrste L. mesenteroides, izolovane iz italijanskih mekih sireva. Njihove preliminarne analize
pokazale su prisustvo erm(B) i tet(S) gena, koji kodiraju rezistenciju na eritromicin i
tetraciklin i sugerisali da su neophodna dalja istraživanja ove atipične rezistencije, da bi se
moglo govoriti o njenom poreklu.
Kako je ranije napomenuto, neophodno je razlikovati urođenu od stečene rezistencije.
Zbog toga se prvo primenjuju fenotipske metode za određivanje ostljivosti/rezistencije, poput
disk-difuzije, E- testa, mikrodilucione i agar dilucione metode. Kada neki od proučavanih
sojeva pokaže rezistenciju na određeni antibiotik, pristupa se daljoj analizi genotipskim
metodama (lančana reakcija polimerizacije (PCR), southern-blot hibridizacija, DNK mikročip
hibridizacija i td.) (Korhonen, 2010).
Kada su fenotipske metode u pitanju, postoje brojni činioci koji utiču na konačne
rezultate. U istraživanju sprovedenom od strane Huys-a i saradnika (2002), navodi se da na
rezultate utiče sastav hranljive podloge, poput varijacija u sadržaju katjona ili koncentracije
sastojaka kao što su tiamin i folna kiselina. Veličina inokuluma, temperatura i period
inkubacije, takođe, mogu uticati na dobijene rezultate za rezistenciju na antibiotike.
Određene komponente hranljivih podloga mogu uticati na aktivnost antibiotika, na primer,
MRS podloga može inhibirati pojedine antibiotike, poput imipenema (Bulajić i sar., 2008).
Takođe, pojedini testovi nisu pouzdani za određivanje niskih nivoa rezistencije, poput disk
difuzionog testa za određivanje niskog nivoa rezistencije na vankomicin kod enterokoka
(Swenson i sar., 1992). Ako se u obzir uzme i činjenica da rezultati dobijeni različitim
metodama ne mogu biti upoređivani međusobno i da zbog velike heterogenosti BMK u okviru
rodova, pa čak i vrsta, ne postoje tačno definisane granične vrednosti za većinu antibiotika,
neophodno je da se u budućnosti utvrde kriterijumi i postave tačno određene vrednosti
minimalnih inhibitornih koncentracija, čime će se sprečiti dalje usložnjavanje ovog problema i
uniformisati interpretacija dobijenih rezultata.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
16
2. Ciljevi istraživanja
Imajući u vidu značaj BMK u proizvodnji fermentisanih proizvoda, dokaze o
postojanju horizontalnog transfera gena između bakterija i sve učestalije pojave rezistencije
na antibiotike, ciljevi ovog rada su:
1) Ispitivanje rezistencije BMK, izolovanih iz kajmaka, na različite vrste antibiotika;
2) Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIK) antibiotika za različite vrste
BMK;
3) Upoređivanje rezultata dobijenih različitim metodama određivanja rezistencije na
antibiotike.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
17
3. Materijal i metode
3.1. Materijal
3.1.1. Bakterijski sojevi
U ovom radu korišćeni su sojevi BMK izolovani iz kajmaka (49), koji su identifikovani
do nivoa vrste Lactococcus lactis ssp. lactis (4), Enterococcus faecalis (3), Enterococcus
faecium (15), Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (21), Lactobacillus paracasei
(2) i Lactobacillus plantarum (4) (Joković, 2010). Sojevi su aktivirani iz stokova čuvanih na -
20°C dvostrukim presejavanjem na odgovarajuću hranljivu podlogu.
Sojevi koji pripadaju laktokokama i enterokokama, gajeni su na čvrstoj M17 hranljivoj
podlozi (Merck, Nemačka), sa dodatkom 5% glukoze. Sojevi leukonostoka i laktobacila gajeni
su na čvrstoj MRS hranljivoj podlozi (Torlak, Srbija). Kao radne kulture datih bakterijskih
sojeva, za ispitivanje rezistencije na antibiotike upotrebljavane su prekonoćne kulture,
zasejane na odgovarajuće podloge. Sve Petri ploče inkubirane su na 30°C.
3.1.2. Bakterijske suspenzije
Suspenzije ćelija, gustine 0,5 McF, pravljene su u fiziološkom rastvoru (0,85% NaCl),
od prekonoćnih kultura izolata. Gustina suspenzije merena je dezintometrom (D-1, Biosan).
3.1.3. Antibiotici
Za ispitivanje rezistencije BMK sojeva na antibiotike disk difuzionom metodom
korišćeni su komercijalni diskovi proizvođača Bioanalyse (Turska). Količine antibiotika na
diskovima bile su sledeće: ampicilin 10 μg, gentamicin 10 μg, klindamicin 2 μg, eritromicin 15
μg, vankomicin 30 μg, tetraciklin 30 μg i hloramfenikol 30 μg.
Za mikrodilucionu metodu i agar dilucionu metodu korišćeni su antibiotici u prahu
proizvođača Sigma-Aldrich (SAD). Početni rastvori antibiotika bili su u koncentracijama 200
μg/ml eritromicina, 400 μg/ml gentamicina, 400 μg/ml ciprofloksacina i 400 μg/ml
doksiciklina.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
18
3.2. Metode
3.2.1. Metoda disk difuzije
Hranljive podloge (M17 i MRS) razlivene su u Petri ploče, koje su nakon provere
sterilnosti (24h, na temperaturi od 37°C) zasejavane čistim ćelijskim suspenzijama gustine
0,5 McF, sterilnim pamučnim štapićem. Nakon zasejavanja, ploče su ostavljene dvadesetak
minuta na sobnoj temperaturi, a zatim su antibiogram diskovi postavljani sterilnom pincetom
na površinu zasejanih hranljivih podloga. Petri ploče su inkubirane 24 časa, na 30°C, nakon
čega su lenjirom očitavane zone inhibicije. S obzirom da se koncentracija antibiotika
smanjuje sa udaljavanjem od ivica antibiogram diska, to znači da će bakterije koje su
osetljive (S) i na male koncentracije antibiotika imati veću zonu inhibicije. Kod bakterija koje
su rezistentne (R) na dati antibiotik nema zone inhibicije.
3.2.2. Mikrodiluciona metoda
Mikrodilucionom metodom određuju se minimalne inhibitorne koncentracije (MIK)
antibiotika. MIK predstavlja onu koncentraciju antibiotika koja zaustavlja vidljiv rast
mikroorganizma nakon prekonoćne inkubacije (za anaerobne mikroorganizme neophodna je
duža inkubacija) (Andrews, 2001).
U ovom radu korišćene su mikrotitar ploče sa 96 bunarčića (8 redova i 12 kolona). U
prvu kolonu naliveno je 180 μl M17 ili MRS bujona i 20 μl antibiotika (početnog rastvora),
dok je u preostale kolone naliveno po 100 μl bujona. Nakon toga su pravljena razređenja
antibiotika, prebacivanjem po 100 μl iz prve u drugu kolonu, zatim iz druge u treću, sve do
poslednje kolone, iz koje je nakon prebacivanja iz jedanaeste kolone, izbačeno 100 μl
rastvora. Tako su u bunarčićima dobijene opadajuće koncentracije antibiotika koje su
predstavljene u Tabeli 1.
Tabela 1. Opadajuće koncentracije antibiotika u mikrotitar ploči
Antibiotik 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Eritromicin 20
μg/ml
10
μg/ml
5
μg/ml
2,5
μg/ml
1,25
μg/ml
0,625
μg/ml
0,313
μg/ml
0,156
μg/ml
0,078
μg/ml
0,039
μg/ml
0,0195
μg/ml
0,0098
μg/ml
Gentamicin Doksiciklin
Ciprofloksacin
40
μg/ml
20
μg/ml
10
μg/ml
5
μg/ml
2,5
μg/ml
1,25
μg/ml
0,625
μg/ml
0,313
μg/ml
0,156
μg/ml
0,078
μg/ml
0,039
μg/ml
0,0195
μg/ml
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
19
Ovako pripremljeni bunarčići inokulirani su sa po 2 μl čiste bakterijske suspenzije (0,5
McF). Mikrotitar ploče su inkubirane 48h, na 30°C, nakon čega su MIK vrednosti očitavane su
golim okom, na prirodnom svetlu. Vrednost MIK antibiotika predstavlja koncentracija
antibiotika na kojoj nema vidljivog rasta bakterija.
3.2.3. Agar diluciona metoda
Ova metoda zasnovana je na zasejavanju bakterijskih sojeva na čvrste podloge sa
različitim koncentracijama antibiotika. Nakon pripreme M17 i MRS čvrste hranljive podloge,
po 9 ml vruće podloge prebačeno je u epruvete i sterilisano u autoklavu. Nakon delimičnog
hlađenja hranljivih podloga, u epruvete je dodat 1 ml antibiotika, koncentracije 10 puta veće
od željene, nakon čega je epruveta dugo vorteksovana, a onda razlivena u Petri ploču.
Nakon hlađenja podloge, po 20 μl čiste ćelijske suspenzije (0,5 McF), tehnikom kapljice,
naneto je na podlogu. Podloge su inkubirane 48h, na 30°C, nakon čega su brojane kolonije.
Konačne koncentracije antibiotika u podlogama prikazane su u Tabeli 2.
Tabela 2. Koncentracije antibiotika u čvrstim hranljivim podlogama
Antibiotik Koncentracija (μg/ml)
Eritromicin 1,25 0,02 0,01
Gentamicin 40 0,31 0,16
Doksiciklin 1,25 0,04 0,02
Ciprofloksacin 40 0,31 0,16
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
20
4. Rezultati
Antibiotici se duže od pola veka upotrebljavaju za lečenje bakterijskih infekcija.
Međutim, zbog nepravilne upotrebe antibiotika u lečenju infekcija, bakterije su postale
rezistentne na delovanje mnogih antibiotika. Rezistencija je kod bakterija prirodna pojava i
kada predstavlja karakteristiku vrste, odnosno kada je urođena, ne postoji opasnost da će se
horizontalnim putem preneti na druge vrste bakterija. Do horizontalnog transfera gena za
rezistenciju na antibiotike dolazi u sredinama opterećenim antibioticama, u kojima, zbog
selektivnog pritiska, osetljive bakterije umiru ili je njihov rast zaustavljen, a rezistentne
bakterije postaju dominantne.
Kako se lanac ishrane smatra jednim od glavnih puteva širenja rezistencije na
antibiotike (Ammor i sar., 2008), u ovom radu je fenotipskim metodama proučavana
osetljivost na antibiotike BMK izolovanih iz kajmaka. BMK mogu predstavljati rezervoar gena
za rezistenciju jer stupaju u interakcije sa potencijalno patogenim i patogenim bakterijama u
fermentisanoj hrani i gastrointestinalnom traktu.
Za ispitivanje osetljivosti metodom disk difuzije korišćeni su antibiotici koji
inhibiraju sintezu ćelijskog zida i proteina. Kao inhibitori sinteze ćelijskog zida korišćeni su
ampicilin (β-laktamski antibiotik), koji se vezuje za PBP i inhibira reakciju transpeptidacije i
sintezu peptidoglikana i vankomicin (glikopeptid), koji inhibira ranu fazu sinteze ćelijskog
zida. Gentamicin (aminoglikozid) koji se vezuje za specifične receptore na 30S subjedinici,
blokira aktivnost inicijalnog kompleksa i dovodi do pogrešnog prevođenja genetskog koda sa
iRNK, dok tetraciklin (tetraciklini) sprečava uvođenje novih amino kiselina u rastući
polipeptidni lanac, vezujući se za 30S subjedinicu ribozoma. Klindamicin (linkozamid) koji se,
kao i eritromicin (makrolid), vezuje za 50S subjedinicu, ometa reakciju amino-acil
translokacije i hloramfenikol, koji inhibira peptidil-transferazu u 50S subjedinici, korišćeni su
kao inhibitori sinteze proteina.
Za ispitivanje osetljivosti metodama mikrodilucije i agar dilucije upotrebljeni su
eritromicin (makrolid), gentamicin (aminoglikozid) i doksiciklin (tetraciklini) koji ima isti
mehanizam delovanja kao i tetraciklin, kao inhibitori sinteze proteina, kao i ciprofloksacin
(fluorohinolon), koji inhibira sintezu nukleinskih kiselina tako što blokira DNK-girazu.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
21
4.1. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactococcus
Rod Lactococcus obuhvata pet vrsta, pri čemu se vrsta Lc. lactis najčešće izoluje iz
fermentisanih mlečnih proizvoda. U ovom radu, osetljivost na antibiotike ispitivana je za četiri
izolata vrste Lc. lactis ssp. lactis metodom disk difuzije, dva izolata metodom mikrodilucije i
jednog izolata metodom agar dilucije.
Metodom disk difuzije merene su zone inhibicije oko diskova sa različitim
antibioticima. Na osnovu izmerenih zona inhibicije (Tabela 3), određene su srednje vrednosti
zona inhibicije i standardne devijacije (SD), prikazane na Slici 2.
Slika 2. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast Lc. lactis ssp. lactis
izolata ± standardna devijacija
Na osnovu prikazanih rezultata, može se zaključiti da su testirani izolati osetljivi na
sve upotrebljene antibiotike, sa izuzetkom izolata MK2-9a, koji je pokazao rezistenciju na
gentamicin i klindamicin (Tabela 3). Laktokoke su pokazale najveću osetljivost na tetraciklin,
sa srednjom vrednošću zone inhibicije od 37,5 mm i relativno malom standardnom
devijacijom od 1,91 mm (Slika 2). Visok stepen osetljivosti laktokoke su imale na
hloramfenikol (33,5 mm), ampicilin (30,75 mm), klindamicin (29 mm) i eritromicin (28 mm),
dok je srednja vrednost zone inhibicije oko diskova sa vankomicinom bila nešto manja (23,5
mm). Svi izolati iz grupe MK1 (MK1-8a, MK1-9a i MK1-12a), osetljivi su na gentamicin, koji je
30,75
17,33
29,00 28,00 23,50
37,50 33,50
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Ampicilin 10μg
Gentamicin 10μg
Klindamicin 2μg
Eritromicin 15μg
Vankomicin 30μg
Tetraciklin 30μg
Hloramfenikol 30μg
Zona inhib
icije (
mm
)
Antibiotik
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
22
na diskovima bio u količini od 10 μg (Tabela 3). Zone inhibicije oko diskova sa gentamicinom
bile su relativno male (17,33 mm), u odnosu na zone inhibicije ampicilina (30,75 mm), čija je
koncentracija jednaka koncentraciji gentamicina (Slika 2). Vrednosti standardnih devijacija za
eritromicin i ampicilin su velike jer su zone inhibicije rasta izolata MK2-9a mnogo manje u
odnosu na zone inhibicije rasta preostala tri izolata iz grupe MK1, za oba antibiotika (Tabela
3).
Tabela 3. Zone inhibicije rasta Lc. lactis ssp. lactis izolata u prisustvu antibiotika izražene u mm
Redni broj izolata
Antibiotik
AM 10μg CN 10μg DA 2μg E 15μg VA 30μg TE 30μg C 30μg
MK1-8a 31 17 30 28 24 36 34
MK1-9a 36 18 30 34 28 36 38
MK1-12a 32 17 27 32 24 38 32
MK2-9a 24 R R 18 18 40 30
AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-
hloramfenikol; R- rezistentno
Metodom mikrodilucije određene su vrednosti MIK za dva izolata vrste Lc. lactis
ssp. lactis (MK1-9a i MK2-9a) za antibiotike koji inhibiraju sintezu proteina (eritromicin,
gentamicin i doksiciklin) i za ciprofloksacin koji inhibira sintezu nukleinskih kiselina. Rezultati
su prikazani u Tabeli 4.
Izolat MK1-9a nije pokazao rast u prisustvu eritromicina, ciprofloksacina i doksiciklina
u korišćenim koncentracijama, što ukazuje na visok stepen osetljivosti na date antibiotike.
MIK vrednost za gentamicin je bila 0,313 μg/ml (Tabela 4).
Tabela 4. MIK vrednosti antibiotika za izolate Lc. lactis ssp. lactis
Antibiotik (μg/ml)
Oznaka izolata Eritromicin Gentamicin Ciprofloksacin Doksiciklin
MK1-9a < 0,0098 0,313 < 0,0195 < 0,0195
MK2-9a 0,156 > 40 1,25 < 0,0195
Izolat MK2-9a osetljiv je na doksiciklin, koji inhibira sintezu proteina. Dobijene MIK
vrednosti za ovaj izolat su 0,156 μg/ml za eritromicin, 1,25 μg/ml za ciprofloksacin, dok je u
prisustvu gentamicina uočen rast u svih 12 bunarčića mikrotitar ploče, što se poklapa sa
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
23
rezultatima dobijenim disk difuzijom, gde je ovaj izolat pokazao rezistenciju na gentamicin
(Tabela 3).
Metodom agar dilucije testirana je osetljivost jednog izolata Lc. lactis spp. lactis
(MK1-9a) na iste antibiotike upotrebljene u mikrodilucionoj metodi. Dobijeni rezultati
predstavljeni su u Tabeli 5.
Tabela 5. Rast izolata MK1-9a Lc. lactis ssp. lactis na čvrstoj podlozi sa antibiotikom
Antibiotik (μg/ml)
Eritromicin Gentamicin Doksiciklin Ciprofloksacin
Oznaka izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40
MK1-9a + - - - - - + - - + + -
+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta)
Izolat MK1-9a nije pokazao rast na podlogama sa gentamicinom, dok je na
podlogama sa eritromicinom i doksicilinom imao rast samo kada je korišćena najmanja
koncentracija antibiotika (0,01 odnosno 0, 02 μg/ml). Na podlozi sa ciprofloksacinom koji
inhibira sintezu nukleinskih kiselina vezivanjem za DNK girazu, izolat MK1-9a pokazao je rast
na koncentraciji od 0,31 μg/ml.
4.2. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Enterococcus
Enterokoke se odlikuju sposobnošću da prežive u nepovoljnim uslovima, pa se
zahvaljujući tome mogu izolovati sa najrazličitijih staništa, a skoro uvek su prisutne u
fermentisaim proizvodima. Kako je poznato da je konjugativna razmena gena veoma česta
pojava kod enterokoka (Mathur i Sinhg, 2005) i da su pojedini predstavnici ovog roda
oportunistički patogeni, neophodno je detaljno proučavanje rezistencije onih sojeva koji se
unose u organizam.
U ovom radu, petnaest izolata vrste E. faecium i tri izolata vrste E. faecalis je
testirano za osteljivost na antibiotike metodom disk difuzije, četiri izolata vrste E. faecium i
dva izolata vrste E. faecalis metodom mikrodilucije i četiri izolata vrste E. faecium i jedan
izolat vrste E. faecalis metodom agar dilucije.
Ispitivanjem osetljivosti enterokoka metodom disk difuzije, dobijeni su rezultati
koji su prikazani na Slici 3 i u Tabeli 6. Na osnovu prikazanih srednjih vrednosti zona
inhibicija rasta testiranih izolata, uočava se da su enterokoke osetljive na antibiotike koji
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
24
31,1
4
14,3
1
28,1
8
26,5
7
25,1
4
31,9
3
33,5
7
29,3
3
17,0
0
31,5
0
24,3
3
21,3
3
20,3
3
32,0
0
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Ampicilin 10μg
Gentamicin 10μg
Klindamicin 2μg
Eritromicin 15μg
Vankomicin 30μg
Tetraciklin 30μg
Hloramfenikol 30μg
Zona inhib
icije (
mm
)
Antibiotik
E. faecium E. faecalis
inhibiraju sintezu ćelijskog zida (ampicilin i vankomicin), kao i na one koji inhibiraju sintezu
proteina, sa izuzetkom pojedinačnih izolata koji pokazuju rezistenciju prema određenim
antibioticima.
Slika 3. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast E. faecium
i E. faecalis izolata ± standardna devijacija
Izolati JK1-7a vrste E. faecium i DK2-1 vrste E. faecalis pokazuju rezistenciju na
gentamicin i klindamicin, izolati MK2-5a i MK3-7 vrste E. faecium pokazuju rezistenciju na
klindamicin (Tabela 6), dok je izolat MK3-12 vrste E. faecalis rezistentan na gentamicin
(Tabela 6). Najveća osetljivost enterokoka uočena je na hloramfenikol (33,57 mm vrste E.
faecium i 32 mm vrste E. faecalis), a zatim na ampicilin (31,14 mm vrste E. faecium i 29,33
mm vrste E. faecalis). Značajna razlika između srednjih vrednosti zone inhibicije tetraciklina
je uočena između izolata vrste E. faecium (31,93 mm) i izolata vrtse E. faecalis (20,33 mm).
Velika standardna devijacija za ovaj antibiotik, za izolate obe vrste, govori i o velikom
variranju veličine zona inhibicija u okviru vrste. Enterokoke su bile osetljive i na klindamicin
(28,18 mm vrste E. faecium i 31,5 mm vrste E. faecalis), eritromicin (26,57 mm vrste E.
faecium i 24,33 mm vrste E. faecalis) i vankomicin (25,14 mm vrste E. faecium i 21,33 mm
vrste E. faecalis). Relativno male zone inhibicije karakteristične su za gentamicin (14,31 mm
vrste E. faecium i 17 mm vrste E. faecalis).
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
25
Tabela 6. Zone inhibicije rasta E. faecalis i E. faecium izolata u prisustvu antibiotika izražene u mm
Vrsta
Antibiotik
Oznaka
izolata
AM
10μg
CN
10μg
DA
2μg
E
15μg
VA
30μg
TE
30μg
C
30μg
E.
faecalis
DK1-6 32 17 34 30 26 14 38
DK2-1 28 R R 23 19 34 30
MK3-12 28 R 29 20 19 13 28
E.
faecium
JK1-7a 28 R R 18 20 32 32
DK1-2a 30 16 33 34 24 15 35
DK1-10 32 15 35 31 25 17 34
DK1-26 37 16 40 33 29 40 40
DK2-8a 28 15 26 22 25 36 32
DK2-3 34 15 34 32 25 15 34
DK2-11 30 15 32 32 25 36 32
MK1-4a 30 17 11 32 28 38 33
MK2-5a 28 10 R 29 22 34 32
MK2-8 34 12 30 14 27 40 34
MK3-7 32 12 R 34 26 36 34
MK3-6a 24 16 36 20 26 36 34
MK3-15 * * * * * * *
JK1-26 36 14 9 12 28 42 36
JK1-9 33 13 24 29 22 30 28
AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-hloramfenikol; R- rezistentno; * - preklopljene zone inhibicije
Metodom mikrodilucije određene su vrednost MIK za četiri E. faecalis izolata i dva
E. faecalis izolata, za antibiotike iz grupe makrolida (eritromicin), aminoglikozida
(gentamicin), tetraciklina (doksiciklin) i fluorohinolona (ciprofloksacin). Dobijeni rezultati
predstavljeni su u Tabeli 7.
Izolati E. faecalis imaju iste MIK vrednosti za eritromicin (0,156 μg/ml), gentamicin
(10 μg/ml) i ciprofloksacin (1,25 μg/ml). MIK vrednost doksiciklina za izolat DK2-1 je 0,039
μg/ml, a za izolat MK3-12 MIK vrednost iznosi 1,25 μg/ml.
Kada su u pitanju izolati E. faecium, dobijene MIK vrednosti za eritromicina variraju
(0,0195 μg/ml do 0,313 μg/ml), dok jedan soj nije pokazao rast, što govori o visokom nivou
osetljivosti na ovaj antibiotik iz grupe makrolida (Tabela 7). MIK vrednosti gentamicina
takođe variraju i relativno su visoke, od 10 μg/ml do 40 μg/ml (Tabela 7). Dobijene MIK
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
26
vrednosti za ciprofloksacin su u opsegu od 0,313 μg/ml do 5 μg/ml (Tabela 7). Što se
doksiciklina tiče, izolati MK1-4a i MK3-7 nisu pokazali rast, a za preostala dva izolata
vrednosti MIK doksiciklina su 0,313 μg/ml i 0,156 μg/ml (Tabela 7).
Tabela 7. MIK vrednosti antibiotika za izolate roda Enterococcus
Vrsta
Antibiotik (μg/ml)
Oznaka izolata Eritromicin Gentamicin Ciprofloksacin Doksiciklin
E. faecalis
DK2-1 0,156 10 1,25 0,039
MK3-12 0,156 10 1,25 1,25
E. faecium
JK1-7a 0,313 40 1,25 0,313
MK1-4a < 0,0098 10 1,25 < 0,0195
MK2-5a 0,0195 20 0,313 0,156
MK3-7 0,039 40 5 < 0,0195
Agar dilucionom metodom testirana je osetljivost jednog izolat E. faecalis i četiri
izolata E. faecium, na antibiotike za koje je u mikrodilucionoj metodi određivana MIK
vrednost. Dobijeni rezultati predstavljeni su u Tabeli 8.
Izolat MK3-12 E. faecalis pokazao je rast na svim podlogama sa gentamicinom, što
govori da je rezistentan na ovaj antibiotik (Tabela 8). Na preostala tri antibiotika ovaj izolat
je osetljiv, a rasta je bilo na podlogama sa najmanjim i srednjim koncentracijama
eritromicina (0,01 i 0,02 μg/ml) i doksiciklina (0,02 i 0,04 μg/ml ) i na podlozi sa najmanjom
koncentracijom ciprofloksacina (0,16 μg/ml ). Na podlogama sa najvećim koncentracijama
ovih antibiotika nije bilo rasta (Tabela 8).
Što se tiče E. faecium izolata, jedino je izolat MK3-7 pokazao rast na podlozi sa
najvećom koncentracijom ciprofloksacina od 40 μg/ml (Tabela 8), što može ukazati na
rezistenciju na ovaj antibiotik koji sprečava sintezu nukleinskih kiselina. Preostali izolati
porasli su na podlogama sa najmanjom i srednjom koncentracijom (0,16 i 0,31 μg/ml) ovog
antibiotika iz grupe fluorohinolona. Izolati MK1-4a, MK2-5a i MK3-7 nisu porasli ni na jednoj
podlozi sa gentamicinom, dok je izolat JK1-7a imao rast na podlogama sa najmanjom (0,16
μg/ml) i srednjom (0,31 μg/ml) koncentracijom ovog antibiotika. Na podlogama sa
eritromicinom sva četiri izolata porasla su u prisustvu najmanje koncentracije (0,01 μg/ml), a
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
27
tri izolata rasla su i na podlogama sa srednjom koncentracijom (0,02 μg/ml). Što se tiče
podloga sa doksiciklina, isti je slučaj kao i sa eritromicinom. Svi izolati porasli su na
najmanjoj koncentraciji od 0,02 μg/ml, a tri izolata porasla su i na srednjoj koncentraciji
(0,04 μg/ml). Na podlogama sa maksimalnim koncentracijama antibiotika ovi izolati nisu imali
rast (Tabela 8).
Tabela 8. Rast izolata roda Enterococcus na čvrstoj podlozi sa antibiotikom
Vrs
ta
Antibiotik (μg/ml)
Eritromicin Gentamicin Doksiciklin Ciprofloksacin
Oznaka
izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40
E.
fae
ca
lis
MK3-12 + + - + 53 13 + + - + - -
E.
fae
ciu
m
JK1-7a + + - + 37 - + - - + ± -
MK1-4a + - - - - - + + - + + -
MK2-5a + ± - - - - + + - + + -
MK3-7 + + - - - - + 70 - + + +
+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta); ± (umeren rast)
4.3. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Leuconostoc
Najčešće prirodno stanište predstavnika roda Leuconostoc su biljke, odakle dospevaju
na druga staništa, pa i u mleko, gde tokom fermentacije imaju važnu ulogu. Za razliku od
većine BMK koje produkuju L(+) oblik mlečne kiseline, leukonostoci produkuju D(-) oblik.
Neki predstavnici ovog roda smatraju se oportunističkim patogenima, iako su takvi slučajevi
veoma retki (Ogier i sar., 2008). Kako se L. mesenteroides često izoluje iz mlečnih proizvoda,
neophodno je ispitivanje rezistencije na antibiotike. U ovom radu je 21 izolat vrste L.
mesenteroides ssp. mesenteroides ispitivan za osetljivost na antibiotike metodom disk
difuzije, tri izolata metodom mikrodilucije i tri izolata metodom agar dilucije.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
28
Za ispitivanje osetljivosti 21 izolata L. mesenteroides ssp. mesenteroides, metodom
disk difuzije, korišćeni su antibiotici koji inhibiraju sintezu ćelijskog zida iz grupe β-
laktamskih antibiotika i glikopeptida, kao i antibiotici koji inhibiraju sintezu proteina iz grupa
aminoglikozida, linkozamida, makrolida, tetraciklina i hloramfenikol. Dobijeni rezultati
prikazani su na Slici 4 i u Tabeli 9.
Slika 4. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast L. mesenteroides ssp. mesenteroides izolata ± standardna devijacija
Svi izolati su rezistentni na vankomicin. Ova rezistencija je urođena i predstavlja
karakteristiku roda Leuconostoc (Ogier i sar., 2008). Na osnovu srednjih vrednosti prikazanih
na Slici 4, može se zaključiti da su svi testirani izolati, u manjoj ili većoj meri, osetljivi na
upotrebljene antibiotike. Najveću osetljivost izolati pokazuju prema tetraciklinu (33,95 mm),
klindamicinu (33,2 mm) i hloramfenikolu (31,86 mm), a zatim i na ampicilin (28,9 mm) i
eritromicin (27,35 mm). Relativno niska osetljivost može se uočiti za antibiotik iz grupe
aminoglikozida, gentamicin, sa srednjom vrednošću zona inhibicije od 20 mm. Najveća
standardna devijacija uočava se za eritromicin i ona iznosi 5,48 mm (Slika 4), jer postoje
relativno velika variranja u veličinama zone inhibicije rasta između izolata (Tabela 9).
28,90
20,00
33,20
27,35
33,95 31,86
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
Ampicilin
10μg
Gentamicin
10μg
Klindamicin
2μg
Eritromicin
15μg
Tetraciklin
30μg
Hloramfenikol
30μg
Zona inhib
icije (
mm
)
Antibiotik
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
29
Tabela 9. Zone inhibicije rasta L. mesenteroides ssp. mesenteroides izolata u prisustvu
antibiotika izražene u mm
Antibiotik
Oznaka izolata
AM
10μg
CN
10μg
DA
2μg
E
15μg
VA
30μg
TE
30μg
C
30μg
DK1-13a 32 21 40 38 R 33 24
DK1-44 28 19 36 27 R 43 36
DK1-27 32 19 28 26 R 31 29
DK1-38 28 16 34 16 R 40 34
DK2-22 30 28 38 34 R 30 32
DK2-32 27 20 30 26 R 32 26
DK2-20a 30 21 34 18 R 32 36
MK1-27 27 20 28 28 R 32 34
MK1-15a 24 18 29 25 R 30 30
MK1-41 24 17 26 24 R 28 25
MK1-18a 28 18 36 30 R 36 36
MK2-48 30 22 36 32 R 36 27
MK2-32 28 21 35 32 R 34 32
MK2-30 28 22 32 30 R 36 34
MK2-25 32 24 38 34 R 36 36
MK2-39 34 16 36 30 R 36 34
MK2-35 * 14 * * R * 38
MK3-9a 26 15 28 24 R 28 26
MK3-20a 32 20 28 26 R 34 28
JK1-47 28 19 32 27 R 32 32
JK1-34 30 30 40 20 R 40 40
AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-hloramfenikol; R- rezistentno; * - preklopljene zone inhibicije
Metodom mikrodilucije određene su vrednosti MIK za tri izolata L. mesenteroides
ssp. mesenteroides. Antibiotici za koje su određivane vrednosti MIK i dobijeni rezultati
prikazani su u Tabeli 10.
Izolat DK2-32 nije pokazao rast u prisustvu ni jednog od upotrebljenih antibiotika, u
datim koncentracijama, što ukazuje na visok stepen osetljivosti. S obzirom da je u svih 12
bunarčića bilo vidljivog rasta izolata DK1-44, može se pretpostaviti da je MIK vrednost
ciprofloksacina veća od 40 μg/ml ili da je ovaj izolat rezistentan na ciprofloksacin. MIK
vrednosti između izolata DK1-44 i MK1-18a za gentamicin se značajno razlikuju (5 i 0,625
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
30
μg/ml), dok razlika između MIK vrednosti eritromicina (0,625 i 0,0195 μg/ml) i doksiciklina
(0,313 i 0,078 μg/ml) postoji, ali nije tako velika kao u slučaju gentamicina (Tabela 10).
Tabela 10. MIK vrednosti antibiotika za izolate L. mesenteroides ssp. mesenteroides
Antibiotik (μg/ml)
Oznaka izolata Eritromicin Gentamicin Ciprofloksacin Doksiciklin
DK1-44 0,625 5 >40 0,078
DK2-32 < 0,0098 < 0,0195 < 0,0195 < 0,0195
MK1-18a 0,0195 0,625 0,625 0,313
Agar dilucionom metodom testirana je osetljivost tri izolata L. mesenteroides ssp.
mesenteroides na antibiotike koji inhibiraju sintezu proteina (eritromicin, gentamicin i
doksiciklin) i nukleinskih kiselina (ciprofloksacin). Dobijeni rezultati predstavljeni su u Tabeli
11. Izolat DK1-44 pokazao je umeren rast na podlozi sa najvećom koncentracijom
ciprofloksacina (40 μg/ml), što se poklapa sa rezultatima dobijenim u mikrodilucionoj metodi.
Preostala dva izolata porasla su na podlogama sa koncentracijom od 0,31 μg/ml
ciprofloksacina. Sva tri izolata leukonostoka rasla su na podlogama sa najmanjom i srednjom
koncentracijom eritromicina (0,01 i 0,02 μg/ml) i doksiciklina (0,02 i 0,04 μg/ml). Izolati
DK1-44 i DK2-32 nisu porasli ni na jednoj podlozi sa gentamicinom, dok je izolat MK1-18a
pokazao rast na podlozi sa najmanjom koncentracijom ovog antibiotika, koja iznosi 0,16
μg/ml. Na podlogama sa maksimalnim koncentracijama eritromicina, gentamicina i
doksiciklina nije bilo rasta ni jednog izolata leukonostoka (Tabela 11).
Tabela 11. Rast izolata L. mesenteroides ssp. mesenteroides na čvrstoj podlozi sa antibiotikom
Antibiotik (μg/ml)
Eritromicin Gentamicin Doksiciklin Ciprofloksacin
Oznaka izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40
DK1-44 + + - - - - + + - + + ±
DK2-32 + + - - - - + + - + + -
MK1-18a + + - + - - + + - + + -
+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta); ± (umeren rast)
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
31
31,0
0
13,0
0
35,0
0
26,0
0
51,0
0
44,0
0
35,0
0
13,7
5
31,0
0
32,2
5
29,5
0
29,2
5
35,5
0
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
Ampicilin 10μg
Gentamicin 10μg
Klindamicin 2μg
Eritromicin 15μg
Vankomicin 30μg
Tetraciklin 30μg
Hloramfenikol 30μg
Zona inhib
icije (
mm
)
Antibiotik
Lb. paracasei Lb. plantarum
4.4. Rezistencija na antibiotike izolata iz roda Lactobacillus
Rod Lactobacillus je veoma heterogen i njegovi predstavnici dele se u tri grupe:
obligatni homofermentativni laktobacili, obligatni i fakultativni heterofermentativni laktobacili.
Kao rezultat ove heterogenosti, predstavnici roda mogu se naći na najrazličitijim staništima.
Prisustvo laktobacila tokom fermentacije mleka vrlo je bitno, kako zbog produkcije mlečne
kiseline, tako i zbog produkcije jedinjenja koja utiču na organoleptičke karakteristike krajnjeg
proizvoda. Kako se u velikom broju unose u organizam, a pri tome neki od laktobacila
spadaju u grupu probiotika, neophodna je detaljna analiza i proučavanje njihove rezistencije
na antibiotike. U ovom radu, osetljivost na antibiotike ispitivana je za izolate iz grupe
fakultativnih heterofermentativnih laktobacila, odnosno za dva izolata vrste Lb. paracasei i
četiri izolata vrste Lb. plantarum metodom disk difuzije, dva izolata vrste Lb. paracasei i tri
izolata vrste Lb. plantarum metodom mikrodilucije i dva izolata vrste Lb. paracasei i tri izolata
vrste Lb. plantarum metodom agar dilucije.
Rezultati dobijeni metodom disk difuzije prikazani su na Slici 5 i u Tabeli 13. Izolati
Lb. paracasei rezistentni su na vankomicin (Tabela 13), što je karakteristika vrste. Izolat
MK3-24 vrste Lb. paracasei pokazuje rezistenciju i na gentamicin (Tabela 13).
Slika 5. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast Lb. paracasei i Lb. plantarum izolata ± standardna devijacija
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
32
Rezistencija na vankomicin uočena je i kod dva izolata vrste Lb. plantarum i to MK3-
22 i JK1-40 (Tabela 13), dok je za preostale izolate ove vrste srednja vrednost inhibicije rasta
u prisustvu vankomicina 29,5 mm (Slika 5). Na osnovu srednjih vrednosti zona inhibicija
rasta, predstavljenih na Slici 5, uočavaju se određena variranja u osetljivosti između izolata
ove dve vrste. Izolati vrste Lb. paracasei pokazuju mnogo veću osetljivost na tetraciklin (51
mm) u odnosu na izolate vrste Lb. plantarum (29,25 mm). Nešto manja razlika, takođe u
većoj osetljivosti za Lb. paracasei izolate, uočava se za hloramfenikol (44 mm) i klindamicin
(35 mm). Sa druge strane, Lb. plantarum izolati pokazuju nešto veću osetljivost na ampicilin
(35 mm) i eritromicin (32,25 mm) u odnosu na Lb. paracasei izolate (Slika 5). Osetljivost
izolata obe vrste na gentamicin je relativno mala, sa srednjim vrednostima zone inhibicije
rasta od 13 mm za izolate vrste Lb. paracasei i 13,75 mm za izolate vrste Lb. plantarum.
Tabela 13. Zone inhibicije rasta Lb. paracasei i Lb. plantarum izolata u prisustvu antibiotika
izražene u mm
Vrsta
Antibiotik
Oznaka
izolata
AM
10μg
CN
10μg
DA
2μg
E
15μg
VA
30μg
TE
30μg
C
30μg
Lb.
paracasei
DK2-5a 30 13 30 20 R 60 48
MK3-24 32 R 40 32 R 42 40
Lb.
plantarum
MK3-22 36 16 12 32 R 25 32
JK1-15a 32 12 30 31 27 18 40
JK1-29 38 11 46 36 32 36 36
JK1-40 34 16 36 30 R 38 34
AM-ampicilin, CN- gentamicin, DA- klindamicin, E- eritromicin, VA- vankomicin, TE- tetraciklin, C-
hloramfenikol; R- rezistentno
MIK vrednosti antibiotika koji inhibiraju sintezu proteina (eritromicin, gentamicin i
doksiciklin) i sintezu nukleinskih kiselina (ciprofloksacin), određene su za dva izolata Lb.
paracasei i tri izolata Lb. plantarum, metodom mikrodilucije. Dobijeni rezultati
predstavljeni su u Tabeli 14.
Izolati Lb. paracasei nisu rasli u prisustvu gentamicina, iako je jedan od njih (MK3-24)
u metodi disk difuzije pokazao rezistenciju na gentamicin (Tabela 13). MIK vrednosti za
preostale antibiotike, za izolate Lb. paracasei, su 0,078 μg/ml i 1,25 μg/ml za eritromicin, 20
μg/ml i 40 μg/ml za ciprofloksacin i 0,78 μg/ml i 0,156 μg/ml za doksiciklin. Izolat MK3-22
koji pripada vrsti Lb. plantarum nije pokazao rast u prisustvu ni jednog od upotrebljenih
antibiotika, što govori o visokom stepenu osetljivosti. MIK vrednosti za preostala dva Lb.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
33
plantarum izolata, za eritromicin su 0,156 μg/ml i 1,25 μg/ml, za gentamicin 10 μg/ml i 20
μg/ml, zatim za ciprofloksacin 20 μg/ml i za doksiciklin 0,156 μg/ml.
Tabela 14. MIK vrednosti antibiotika za izolate roda Lactobacillus
Vrsta
Antibiotik (μg/ml)
Oznaka izolata Eritromicin Gentamicin Ciprofloksacin Doksiciklin
Lb. paracasei
DK2-5a 1,25 < 0,0195 40 0,156
MK3-24 0,078 < 0,0195 20 0,078
Lb. plantarum
MK3-22 < 0,0098 < 0,0195 < 0,0195 < 0,0195
JK1-15a 0,156 20 20 0,156
JK1-40 1,25 10 20 0,156
Zasejavanjem dva izolata vrste Lb. paracasei i tri izolata vrste Lb. plantarum, na
čvrste podloge sa različitim koncentracijama eritromicina, gentamicina, doksiciklina i
ciprofloksacina, testirana je njihova osetljivost. Rezultati dobijeni ovom agar dilucionom
metodom prikazani su u Tabeli 15.
Tabela 15. Rast izolata Lb. paracasei i Lb. plantarum na čvrstoj podlozi sa antibiotikom
Vrsta
Antibiotik (μg/ml)
Eritromicin Gentamicin Doksiciklin Ciprofloksacin
Oznaka
izolata 0,01 0,02 1,25 0,16 0,31 40 0,02 0,04 1,25 0,16 0,31 40
Lb.
paracasei
DK2-5a + - - - - - + + - + + -
MK3-24 - - - - - - + + - + + -
Lb.
plantarum
MK3-22 - - - - - - - - - - - -
JK1-15a + - - - - - + + - + + -
JK1-40 + + - + - - + + - + + -
+ (previše za brojanje; kada broj kolonija prelazi 300); - (nema rasta)
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
34
Kada su u pitanju izolati vrste Lb. paracasei, rast je izostao na svim podlogama sa
gentamicinom. Zanimljivo je da izolat MK3-24 opet nije pokazao rast u prisustvu
gentamicina, čak ni na podlozi sa najnižom koncentracijom (Tabela 15), s obzirom da je u
disk difuzionoj metodi pokazao rezistenciju. Ovaj izolat nije pokazao rast ni na podlogama sa
eritromicinom, dok je DK2-5a porastao na podlozi sa najmanjom koncentracijom ovog
makrolidnog antibiotika (0,01 μg/ml). Oba izolata porasla su na podlogama sa najmanjom i
srednjom koncentracijom doksiciklina (0,02 i 0,04 μg/ml) i ciprofloksacina (0,16 i 0,31
μg/ml). Ni na jednoj podlozi sa maksimalnom koncentracijom ova četiri antibiotika nije bilo
rasta. Izolat vrste Lb. plantarum MK3-22 je i u ovoj metodi pokazao visok stepen osetljivosti
na antibiotike koji inhibiraju sintezu proteina i nukleinskih kiselina, jer nije bilo rasta ni na
jednoj podlozi, čak ni sa najnižim koncentracijama (Tabela 15). Na podlozi sa najmanjom
koncentracijom eritromicina (0,01 μg/ml) rasla su preostala dva izolata, pri čemu je izolat
JK1-40 porastao i na podlozi sa 0,02 μg/ml. Rast izolata JK1-15a izostao je sa svih podloga
sa gentamicinom, dok je izolat JK1-40 pokazao rast na podlozi sa 0,16 μg/ml gentamicina.
Oba izolata porasla su na podlogama sa najmanjom i srednjom koncentracijom doksiciklina
(0,02 i 0,04 μg/ml) i ciprofloksacina (0,16 i 0,31 μg/ml). Nije bilo rasta ni jednog Lb.
plantarum izolata na podlogama sa maksimalnim koncentracijama upotrebljenih antibiotika
(Tabela 15).
4.5. Ukupna rezistencija BMK izolata određena metodom disk
difuzije
Generalno gledano, na osnovu rezultata dobijenih disk difuzijom, možemo zaključiti
da je svih 49 izolata osetljivo na ampicilin, koji inhibira sintezu ćelijskog zida i na eritromicin,
tetraciklin i hloramfenikol, koji inhibiraju sintezu proteina. 89,8% izolata osetljivo je na
gentamicin, na koji se javlja rezistencija kod 5 izolata. Takođe, 89,8% izolata osetljivo je na
klindamicin. Kako su predstavnici roda Leuconostoc (Ogier i sar., 2008) i Lb. paracasei
(Delgado i sar., 2005) urođeno rezistentni na vankomicin, ovi izolati su izuzeti iz ukupne
rezistencije na vankomicin. Od preostalih 26 izolata, rezistencija na vankomicin se javlja kod
2 izolata Lb. plantarum, što znači da je 92,3% izolata osetljivo na vankomicin.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
35
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
Ampicilin 10μg
Gentamicin 10μg
Klindamicin 2μg
Eritromicin 15μg
Vankomicin 30μg
Tetraciklin 30μg
Hloramfenikol 30μg
Zona inhib
icije (
mm
)
Antibiotik
Lc. lactis E. faecium E. faecalis L. mesenteroides Lb. plantarum Lb. paracasei
Na Slici 6 prikazane su srednje vrednosti zona inhibicije rasta svih testiranih izolata u
okviru vrsta. Jasno se uočava da su izolati vrste Lb. paracasei pokazali najveću osetljivost na
tetraciklin, a zatim na hloramfenikol i klindamicin. Izolati Lb. plantarum pokazuju najveću
osetljivost na ampicilin, eritromicin i vankomicin. U odnosu na ostale izolate, izolati L.
mesenteroides najosetljiviji su na gentamicin.
Slika 6. Srednje vrednosti zona inhibicija pri delovanju različitih antibiotika na rast izolata laktokoka, enterokoka, leukonostoka i laktobacila
Kada se srednje vrednosti zona inhibicija enterokoka i laktokoka uporede, uočava se
da su vrednosti relativno ujednačene i da srednje vrednosti ne pokazuju značajna variranja
između ova dva roda, osim u slučaju tetraciklina i to između Lc. lactis i E. faecalis (Slika 6).
Poređenjem prosečnih vrednosti zona inhibicija rasta između izolata leukonostoka,
laktokoka i enterokoka (Slika 6), uočavaju se manje više ujednačene vrednosti, gde je
najveća razlika u rezistenciji na vankomicin kod leukonostoka. Izolati leukonostoka pokazuju
znatno veću osetljivost na tetraciklin u odnosu na E. faecalis izolate, malo veću osetljivost na
gentamicin i klindamicin u odnosu na sve laktokoke i enterokoke, dok je osetljivost
leukonostoka nešto manja na ampicilin (Slika 6).
U odnosu na laktokoke, enterokoke i leukonostoke, laktobacili, a posebno izolati vrste
Lb. paracasei, pokazuju najveću osetljivost na tetraciklin i hloramfenikol, dok je osetljivost na
ampicilin najveća kod Lb. plantarum izolata (Slika 6). Generalno, osetljivost na gentamicin
najmanja je kod Lb. paracasei izolata (Slika 6).
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
36
30,57
17,28
31,40 27,34
24,74
32,91 33,10
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
Ampicilin 10 μg
Gentamicin 10 μg
Klindamicin 2 μg
Eritromicin 15 μg
Vankomicin 30 μg
Tetraciklin 30 μg
Hloramfenikol 30 μg
Zona inhib
icije (
mm
)
Antibiotik
Na osnovi izmerenih zona inhibicije svih testiranih izolata određene su srednje
vrednosti i standardne devijacije. Rezultati su prikazani na Slici 7. Na osnovu srednjih
vrednosti zona inhibicije, može se zaključiti da su testirani izolati BMK najosetljiviji na
hloramfenikol (33,1 mm) i tetraciklin (32,91 mm), mada je i osetljivost na klindamicin prilično
velika (31,4 mm), s obzirom da je koncentracija ovog antibiotika bila 2 μg. Izolati BMK
osetljivi su i na ampicilin (30,57 mm), eritromicin (27,34 mm) i na vankomicin (24,74 mm).
Ubedljivo najmanju osetljivost izolati BMK pokazuju na gentamicin (17,28 mm).
Slika 7. Srednje vrednosti zona inhibicije svih testiranih izolata ± standardna devijacija
Najveća standardna devijacija može se uočiti za tetraciklin, jer postoje velika variranja
između veličine zone inhibicije, pa je tako najmanja zona inhibicije rasta 13 mm (Tabela 6), a
najveća 60 mm (Tabela 13). Isti je slučaj i sa klindamicinom i eritromicinom. Standardne
devijacije za ostale antibiotike su relativno ujednačene i nisu veće od 4,5 mm (Slika 7).
4.6. Upoređivanje rezultata dobijenih različitim metodama
određivanja rezistencije na antibiotike
Kako je ranije napomenuto, postoje brojni činioci koji utiču na krajnje rezultate, pri
testiranju osetljivosti bakterija na antibiotike, različitim fenotipskim metodama. Od sastava
hranljive podloge i njene pH vrednosti, preko dužine inkubacije i tempreture na kojoj se vrši,
pa do veličine inokuluma, ali i brojnih drugih faktora (Huys i sar., 2002). Pored toga,
rezultate dobijene različitim metodama veoma je teško upoređivati.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
37
U ovom radu primenjene su tri fenotipske metode za testiranje osetljivosti BMK
izolovanih iz kajmaka (metoda disk difuzije, mikrodiluciona i agar diluciona metoda). Jedino
su gentamicin i eritromicin, antibiotici koji zaustavljaju sintezu proteina, upotrebljeni u okviru
sve tri metode. U nastavku su prikazane zbirne tabele dobijenih rezultata za izolate koji su
testirani za osetljivost na ove antibiotike, kroz sve tri metode.
Na osnovu rezultata prikazanih u Tabeli 16, možemo zaključiti da je izolat MK1-9a
osetljiv na gentamicin. Kako je MIK gentamicina 0,313 μg/ml, a nije bilo rasta ni na jednoj
podlozi sa gentamicinom, pa ni na 0,16 μg/ml, možemo pretpostaviti da se minimalna
baktericidna koncentracija (MBK) nalazi negde između ove dve koncentracije. Što se tiče
eritromicina, koji takođe zaustavlja sintezu proteina, pojava da na podlozi sa znatno manjom
koncentracijom antibiotika, u odnosu na određenu MIK vrednost, nema rasta, može se
objasniti visokim stepenom osetljivosti izolata MK1-9a na eritromicin, ali nije isključena
mogućnost da je ova razlika rezultat različitih metoda.
Tabela 16. Rezistencija MK1-9a izolata Lc. lactis ssp. lactis testiranog u sve tri metode
Gentamicin Eritromicin
Oznaka
izolata
Disk difuzija
(10 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
Disk difuzija
(15 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
MK1-9a 18 mm 0,313 μg/ml > 40
μg/ml 34 mm 0,156 μg/ml
> 0,01
μg/ml
U Tabeli 17 prikazani su rezultati za sve izolate enterokoka koji su testirani u sve tri
metode. Na osnovu rezultata možemo zaključiti da je izolat MK3-12 vrste E. faecalis
rezistentan na gentamicin, jer se rezultati poklapaju za sve tri metode. Kada je eritromicin u
pitanju, izolat MK3-12 je osetljiv, i možemo pretpostaviti da se vrednost MBK eritromicina
nalazi između 0,156 μg/ml i 1,25 μg/ml.
Što se tiče E. faecium izolata, zanimljiva je pojava da je izolat JK1-7a, koji je pokazao
rezistenciju na gentamicin i u disk difuzionoj i u mikrodilucionoj metodi, nije pokazao rast na
podlozi sa 40 μg/ml gentamicina. Ovaj izolat je osetljiv na eritromicin, koji, kao i gentamicin,
zaustavlja sintezu proteina. S obzirom da se rezultati dobijeni disk difuzijom i mikrodilucijom
poklapaju za preostala tri izolata vrste E. faecium i potrvrđuju relativno nizak nivo osetljivosti
na gentamicin, čudno je što ni na podlogama sa najmanjom koncentracijom gentamicina
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
38
(0,16 μg/ml) nije bilo rasta (Tabela 17). Osetljivost svih E. faecalis izolata na eritromicin je
znatno veća u odnosu na gentamicin, što se može zaključiti i na osnovu veličine zona
inhicicije rasta i određenih vrednosti MIK.
Tabela 17. Rezistencija izolata enterokoka testiranih u sve tri metode
Gentamicin Eritromicin
Vrsta
Oznaka
izolata
Disk
difuzija
(10 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
Disk
difuzija
(15 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
E.
faecalis MK3-12 R 10 μg/ml
40
μg/ml 20 mm
0,156 μg/ml
>0,02
μg/ml
E.
faecium
JK1-7a R 40 μg/ml >0,31
μg/ml 18 mm 0,313 μg/ml
>0,02
μg/ml
MK1-4a 17 mm 10 μg/ml >40
μg/ml 32 mm
< 0,0098
μg/ml
>0,01
μg/ml
MK2-5a 10 mm 20 μg/ml >40
μg/ml 29 mm 0,0195 μg/ml
>0,02
μg/ml
MK3-7 12 mm 40 μg/ml >40
μg/ml 34 mm 0,039 μg/ml
>0,02
μg/ml
U Tabeli 18 predstavljeni su rezultati za sve izolate leukonostoka koji su testirani u
sve tri metode. Kada se ovako uporede rezultati, uočava se da vrednosti dobijene u različitim
metodama dosta variraju, iako se generalno može reći da su testirani izolati osetljivi na
gentamicin i eritromicin. Na primer, vrednost MIK gentamicina je znatno veća od
koncentracije u čvrstoj podlozi na kojoj nije bilo rasta (Tabela 18), dok je ta razlika za izolat
MK1-18a znatno manja. Što se tiče eritromicina, sva tri izolata se mogu smatrati osetljivim,
jer se rezultati sve tri metode podudaraju.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
39
Tabela 18. Rezistencija izolata leukonostoka testiranih u sve tri metode
Gentamicin Eritromicin
Oznaka
izolata
Disk difuzija
(10 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
Disk difuzija
(15 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
DK1-44 19 mm 5 μg/ml >40
μg/ml 27 mm 0,625 μg/ml
>0,02
μg/ml
DK2-32 20 mm < 0,0195
μg/ml
>40
μg/ml 26 mm
< 0,0098
μg/ml
>0,02
μg/ml
MK1-18a 18 mm 0,625 μg/ml >0,16
μg/ml 30 mm 0,0195 μg/ml
>0,02
μg/ml
U Tabeli 19 predstavljeni su rezultati za izolate laktobacila koji su testirani u sve tri
metode. Kao što je već istaknuto, izolat MK3-24 vrste Lb. paracasei pokazao je rezistenciju
na gentamicin u disk difuziji, dok je u mikrodilucionoj i agar dilucionoj metodi pokazao
osetljivost na ovaj antibiotik i nije pokazao rast u njegovom prisustvu. Kada se rezultati
ovako uporede, mogu se uočiti određena variranja između metoda, konkretno, kod izolata
JK1-15a i JK1-40 Lb. plantarum, vrednosti MIK gentamicina su 20 μg/ml i 10 μg/ml, što su
znatno veće koncentracije u odnosu na koncentracije gentamicina u čvrstim podlogama (0,16
i 0,31 μg/ml) na kojima ovi izolati nisu rasli. Ovo je slučaj i sa eritromicinom i izolatima Lb.
paracasei i izolatom JK1-15a Lb. plantarum, s tim da razlike u koncentracijama nisu ni
približno velike kao kod gentamicina.
Tabela 19. Rezistencija izolata laktobacila testiranih u sve tri metode
Gentamicin Eritromicin
Vrsta
Oznaka
izolata
Disk
difuzija
(10 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
Disk
difuzija
(15 μg)
Mikrodilucija
(MIK)
Agar
dilucija
Lb.
paracasei DK2-5a 13 mm
< 0,0195
μg/ml
>40
μg/ml 20 mm
1,25 μg/ml >0,01
μg/ml
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
40
Nastavak Tabela 19. Rezistencija izolata laktobacila testiranih u sve tri metode
Gentamicin Eritromicin
Vrsta
Oznaka
izolata
Disk
difuzija
(10 μg)
Mikrodilucij
a (MIK)
Agar
dilucija
Disk
difuzija
(15 μg)
Mikrodilucij
a (MIK)
Agar
dilucija
Lb.
paracasei MK3-24 R
< 0,0195
μg/ml >40 μg/ml 32 mm
0,078 μg/ml
>1,25
μg/ml
Lb.
plantarum
MK3-22 16 mm < 0,0195
μg/ml >40 μg/ml 32 mm
< 0,0098
μg/ml
>1,25
μg/ml
JK1-15a 12 mm 20 μg/ml >40 μg/ml 31 mm 0,156
μg/ml
>0,01
μg/ml
JK1-40 16 mm 10 μg/ml >0,16
μg/ml 30 mm 1,25 μg/ml
>0,02
μg/ml
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
41
5. Diskusija
Sve češća pojava bakterija rezistentnih na antibiotike predstavlja globalni problem,
koji pored medicine i veterine, pogađa i proizvodnju hrane (Dušková i Karpíšková, 2013).
Kako je proizvodnja novih antibiotika poslednjih godina značajno smanjena, a sve je više
multirezistentnih bakterija, smatra se da je kraj ere antibiotika sve bliži (Huddleston, 2014).
S obzirom da gastrointestinalni trakt ljudi predstavlja sredinu koja obezbeđuje neke od
osnovnih uslova za horizontalni transfer gena (veliki broj bakterija koje međusobno
interaguju i prisustvo antibiotika), trebalo bi sprečiti unošenje u organizam onih bakterija
koje poseduju gene za rezistenciju na antibiotike na mobilnim genetskih elementima, koji se
mogu naći i kod BMK.
U ovom radu, kao i u istraživanju sprovedenom od strane Bulajić i Mijačević (2011),
rezistentnih izolata ima mnogo manje u odnosu na osetljive, naročito ukoliko u obzir ne
uzimamo izolate sa urođenim rezistencijama, koje ne predstavljaju potencijalnu pretnju.
Rezistencija laktokoka na gentamicin varira i bilo je slučajeva detekcije genatamicin–
rezistentnih sojeva (Hummel i sar., 2007; Bulajić i Mijačević, 2011). Vrsta Lc. lactis se
generalno smatra osetljivom na gentamicin (Mathur i Singh, 2005), a uzmajući u obzir i to da
je većina analiziranih izolata u ovom istraživanju pokazala osetljivost na ovaj antibiotik,
neophodno je dalje proučvanje izolata MK2-9a, kod kojeg je detektovana rezistencija na
gentamicin (MIK>40 μg/ml). Iako multirezistencija nije uočena kod izolata ove vrste (Florez i
sar., 2005), isti izolat MK2-9a pokazuje rezistenciju i na klindamicin, za razliku od preostala
tri izolata koja su osetljiva, te je dalja analiza ovog izolata neophodna, kako bi se utvrdilo
poreklo rezistencije. Što se tiče preostalih antibiotika (ampicilin, eritromicin, vankomicin,
tetraciklin, doksiciklin, hloramfenikol i ciprofloksacin), svi izolati Lc. lactis u ovom radu
pokazali su osetljivost. U revijalnom radu objavljenom od strane Devirgiliis i saradnika
(2013), navodi se da su svi izolati vrste Lc. lactis, iz tradicionalnih fermentisanih namirnica iz
Indije, osetljivi na antibiotike iz grupe linkozamida, aminoglikozida, β-laktama, cefalosporina,
hloramfenikola, makrolida i tetraciklina. Takođe, svi izolati Lc. lactis iz fermentisanih
namirnica iz Merilenda (SAD), osetljivi su na klindamicin, gentamicin, ampicilin, eritromicin,
tetraciklin, vankomicin i ciprofloksacin (Devirgiliis i sar., 2013). Iako su ovi izolati u većini
slučajeva osetljivi na navedene antibiotike, postoje i izolati koji pokazuju rezistenciju na neke
od njih. Na primer, u istraživanju sprovedenom od strane Bulajić i Mijačević (2011), od
ukupno 82 izolata, 22 pokazalo je rezistenciju na vankomicin, 64 izolata rezistentno je na
tetraciklin i 25 na eritromicin. Svih 17 izolata, kod kojih je detektovana rezistencija na
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
42
eritromicin, pripadaju vrsti Lc. lactis (Devirgiliis i sar., 2010). Hummel i saradnici (2007)
pokazali su da su sojevi roda Lactococcus, iz starter kultura za jogurt i sireve, osetljivi na
eritromicin, ampicilin i tetraciklin, a rezistentni na ciprofloksacin i gentamicin. Rezistencija
laktokoka na vankomicin i hloramfenikol nije uočena, dok su neki izolati pokazali rezistenciju
na tetraciklin (Florez i sar., 2005; Ammor i sar., 2008). Na plazmidu jednog izolata Lc. lactis
detektovan je gen tet(M) (Ammor i sar., 2008).
Što se enterokoka tiče, pojava multirezistentnih izolata (JK1-7a vrste E. faecium i
DK2-1 vrtse E. faecalis) i to na gentamicin i klindamicin, nije karakteristična samo za ovaj
rad, jer je i ranije detektovano prisustvo takvih izolata. Na primer, u istraživanju Florez i
saradnika (2005), takođe je prijavljeno da se dva izolata E. faecium odlikuju
multirezistentnošću i to na čak pet antibiotika (klindamicin, tetraciklin, eritromicin,
vankomicin i hloramfenikol). Rezistencija na jedan antibiotik detektovana je kod izolata MK2-
5a i MK3-7 vrtse E. faecium na klindamicin i MK3-12 vrste E. faecalis na gentamicin. S
obzirom da je uočena pojava gentamicin-rezistentnih enterokoka (Huys i sar., 2004; Bulajić i
Mijačević, 2011), ne čudi što su takvi izolati detektovani i u ovom istraživanju, mada je
većina izolata (83,3%) osetljiva na ovaj antibiotik. Svi enterokokalni izolati u ovom radu
pokazali su osetljivost na tetraciklin i vankomicin, iako je pojava rezistencije na ove
antibiotike pokazana u nekoliko istraživanja. Prema Teuberu i saradnicima (1999), učestalost
detekcije vankomicin-rezistentnih enerokoka je niska i iznosi oko 4%. Samo jedan, od
petnaest izolata, pokazao je rezistenciju na vankomicin (Bulajić i Mijačević, 2011). Franz i
saradnici (2001) testirali su 47 sojeva E. faecalis, izolovanih uglavnom iz sireva, i svi su bili
osetljivi na vankomicin. Ni u istraživanju sprovedenom od strane Florez i saradnika (2005)
nije uočena rezistencija na vankomicin. Nasuprot tome, prilikom testiranja osetljivosti izolata
enterokoka iz belih turskih sireva, Citak i saradnici (2004), prijavili su da je 96,8% izolata E.
faecalis i 76% E. faecium rezistentno na vankomicin. Što se tiče tetraciklina, devet od
petnaest testiranih izolata, iz somborskog sira, bilo je rezistentno na ovaj antibiotik koji
inhibira sintezu proteina (Bulajić i Mijačević, 2011). Kod sojeva rezistentnih na tetraciklin,
najčešće se uočava tet(M) gen (Teuber i sar., 1999). Eritromicin-rezistentne enterokoke u
ovom istraživanju nisu detektovane, iako je u par drugih istraživanja ovakva rezistencija
detektovana (Teuber i sar., 1999; Florez i sar., 2005; Bulajić i Mijačević, 2011). Svi izolati
testirani u ovom radu osetljivi su i na ampicilin i na hloramfenikol. Jasno je da rezistencija
enterokoka veoma varira i često je soj- i region-zavisna, ili je to variranje rezultat različitih
metoda izolovanja (Ogier i Serror, 2008). Generalno, iako su antibiotik-rezistentne
enterokoke izolovane iz hrane, mali je udeo onih koje su rezistentne na klinički važne
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
43
antibiotike, poput vankomicina, ampicilina, penicilina, gentamicina i td. (Ogier i Serror,
2008).
Već je navedeno da za rod Leuconostoc karakteristična urođena rezistencija na
vankomicin, zbog prisustva D-Ala-D-Lac u peptidoglikanu, umesto D-Ala- D-Ala, za koji se
molekul vankomicina vezuje, i tako sprečava sintezu ćelijskog zida (Ogier i sar., 2008). Osim
izolata DK1-44, koji je pokazao rezistenciju na ciprofloksacin (MIK>40 μg/ml), ostali izolati su
osetljivi na upotrebljene antibiotike iz grupe β-laktama, glikopeptida, aminoglikozida,
linkozamida, makrolida, tetraciklina, hloramfenikola i fluorohinolona. Za 72,2% izolata
leukonostoka, vrednost MIK ciprofloksacina je ≥4 μg/ml (Zarazaga i sar., 1999). Generalno,
predstavnici ovog roda veoma retko pokazuju rezistenciju na antibiotike od kliničkog značaja
(Ogier i sar., 2008). U istraživanju sprovedenom od strane Swensona i saradnika (1999), svi
izolati leukonostoka pokazali su osetljivost na eritromicin i gentamicin, 98% izolata bilo je
osetljivo na hloramfenikol, 77% na tetraciklin, 24% na ciprofloksacin i svega 2% na
ampicilin. Vrednosti MIK za eritromicin, dobijene u ovom istraživanju su u opsegu od
≤0,0098 μg/ml do 0,625 μg/ml, koji je nešto širi u odnosu na rezultate dobijene u
istraživanju sprovedenom od strane Zarazaga i saradnika (1999), koji je od 0,03 μg/ml do
0,5 μg/ml. Svi izolati leukonostoka osetljivi su na hloramfenikol, eritromicin, bacitracin i
penicillin, a rezistentni na sulfatiazol i trimetoprim (Holt i sar., 2001).
Kada su laktobacili u pitanju, s obzirom na njihovu heterogenost, nivoi rezistencije na
neki antibiotik mogu varirati čak i u okviru jedne vrste laktobacila (Mathur i Singh, 2005). U
ovom radu detektovani su vankomicin-rezistentni Lb. paracasei izolati, pri čemu se smatra da
je ova rezistencija urođena (Delgado i sar., 2005; Florez i sar., 2005). Rezistencija na
vankomicin detektovana je i kod dva Lb. plantarum izolata. U istraživanju sprovedenom od
strane Cherkashin i saradnika (2013), u kojem su uporedo proučavani izolati laktobacila iz
mlečnih proizvoda industrijske i domaće proizvodnje, uočena je rezistencija na vankomicin i
to kod svih izolata iz domaćih proizvoda i kod 87,5% izolata iz industrijskih proizvoda. Jedan
izolat vrste Lb. paracasei (MK3-24) pokazao je rezistenciju na gentamicin u disk difuzionoj
metodi, dok u mikrodilucionoj i agar dilucionoj metodi nije pokazao rast u prisustvu ovog
antibiotika. Generalno, testirani laktobacili pokazali su nizak nivo osetljivosti prema
gentamicinu. Anaerobni laktobacili odlikuju se urođenom rezistencijom na aminoglikozide, jer
je transport molekula antibiotika iz ove grupe kroz ćelijski membranu povezan sa elektron
transportnim sistemom, koji ne postoji kod anaeroba (Cherkashin i sar., 2013). Laktobacili
izolovani iz starter kultura za jogurt i sireve pokazali su rezistenciju na gentamicin i
ciprofloksacin, dok su na eritromicin, ampicilin i tetraciklin bili osetljivi (Hummel i sar., 2007).
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
44
Na ostale antibiotike (ampicilin, klindamicin, eritromicin, tetraciklin, doksiciklin, hloramfenikol
i ciprofloksacin) laktobacili izolovani iz kajmaka, testirani u ovom radu, nisu pokazali
rezistenciju. Kao što je već navedeno, rezistencija laktobacila veoma varira. Izolati rezistentni
na eritromicin i/ili tetraciklin detektovani su od strane nekoliko istraživača (Swenson i sar.,
1990; Florez i sar., 2005; Ammor i sar., 2008; Bernardeau i sar., 2008; Comunian i sar.,
2010; Bulajić i Mijačević, 2011; Cherkashin i sar., 2013; Devirgiliis i sar., 2013). Svi izolati
laktobacila, u istraživanju Swenson i saradnika (1990), bili su osetljivi na eritromicin,
gentamicin i hloramfenikol. Osetljivost na hloramfenikol takođe varira. Na primer, svi izolati iz
domaćih mlečnih proizvoda osetljivi su na hloramfenikol, dok je 8,3% izolata iz industrijski
proizvedenih namirnica bilo rezistentno (Cherkashin i sar., 2013). U istraživanju Swensona i
saradnika (1990), svi izolati bili su osetljivi na hloramfenikol, a isti je slučaj i sa rezultatima
istraživanja sprovedenim od strane Ammor i saradnika (2008). Rezistencija na hloramfenikol
uočena je u par istraživanja (Florez i sar., 2005; Bernardeau i sar., 2008; Cherkashin i sar.,
2013). Ni jedan od 22 izolata Lb. plantarum nije pokazao rezistenciju na hloramfenikol,
tetraciklin, eritromicin, vankomicin i klindamicin (Devirgiliis i sar., 2013). Rezistencija na
ciprofloksacin nije učestala, iako ima podataka o rezistentnim izolatima (Swenson i sar.,
1990; Cherkashin i sar., 2013).
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
45
6. Zaključak
Na osnovu rezultata predstavljenih u ovom radu mogu se doneti sledeći zaključci:
1) Svi testirani izolati, koji pripadaju vrstama Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium,
L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei i Lb. plantarum su osetljivi na
ampicilin, eritromicin, tetraciklin, doksiciklin i hloramfenikol.
2) Većina izolata osetljiva je na antibiotike gentamicin, klindamicin, vankomicin i
ciprofloksacin.
3) Rezistencija na gentamicin prisutna je kod jednog izolata vrsta Lc. lactis ssp. lactis, E.
faecium i Lb. paracasei i kod dva izolata vrste E. faecalis
4) Rezistencija na klindamicin prisutna je kod pet izolata i to jednog Lc. lactis ssp. lactis i
E. faecalis izolata i tri E. faecium izolata.
5) Rezistencija na vankomicin prisutna je kod dva izolata vrste Lb. plantarum.
6) Rezistencija na ciprofloksacin prisutna je kod jednog izolata vrste L. mesenteroides.
7) Rezultati za rezistentnost na antibiotike veoma variraju između različitih metoda koje
su korišćene u ovom radu.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
46
7. Literatura
Ammor, M. S., Florez, A. B., van Hoek, A. H., de los Reyes-Gavilan, C. G., Aarts, H. J.,
Margolles, A., & Mayo, B., 2008: Molecular characterization of intrinsic and acquired
antibiotic resistance in lactic acid bacteria and bifidobacteria. - Journal of Molecular
Microbiology and Biotechnology 14: 6-15.
Andrews, J. M., 2001: Determination of minimum inhibitory concentrations. - Journal of
antimicrobial Chemotherapy 48 (suppl 1): 5-16.
Bernardeau, M., Vernoux, J. P., Henri-Dubernet, S., & Gueguen, M., 2008: Safety
assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. - International journal
of food microbiology 126: 278-285.
Bhavani, A. L., & Nisha, J., 2010: Dextran—the polysaccharide with versatile uses. - Int J
Pharm Biol Sci 1: 569-573.
Bulajić, S., Mijačević, Z., & Savić-Radovanović, R., 2008: Rezistencija bakterija mlečne
kiseline na antimikrobne lekove. - Veterinarski glasnik 62: 329-340.
Bulajić, S., & Mijačević, Z., 2011: Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria isolated
from Sombor cheese. - Acta veterinaria 61: 247-258.
Campedelli, I., Flórez, A. B., Salvetti, E., Delgado, S., Orrù, L., Cattivelli, L., ... & Mayo, B.,
2015: Draft genome sequence of three antibiotic-resistant Leuconostoc
mesenteroides strains of dairy origin. - Genome announcements 3(5): e01018-15.
Cherkashin, A., Chobert, J. M., Efimochkina, N., Sheveleva, S., & Haertlé, T., 2013: Antibiotic
Resistance of lactic Acid Bacteria Used in Russian Dairy and Probiotic Products. -
European Researcher 44: 654-659.
Çitak, S., Yucel, N., & Orhan, S., 2004: Antibiotic resistance and incidence of Enterococcus
species in Turkish white cheese. - International journal of dairy technology 57(1):
27-31.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
47
Comunian, R., Daga, E., Dupré, I., Paba, A., Devirgiliis, C., Piccioni, V., ... & Giraffa, G.,
2010: Susceptibility to tetracycline and erythromycin of Lactobacillus paracasei strains
isolated from traditional Italian fermented foods. - International journal of food
microbiology 138: 151-156.
Clewell, D. B., 1993: Bacterial sex pheromone-induced plasmid transfer. – Cell 73(1): 9-12.
Delgado, S., Flórez, A. B., & Mayo, B., 2005: Antibiotic susceptibility of Lactobacillus and
Bifidobacterium species from the human gastrointestinal tract. - Current microbiology
50(4): 202-207.
Devirgiliis, C., Barile, S., Caravelli, A., Coppola, D., & Perozzi, G., 2010: Identification of
tetracycline‐and erythromycin‐resistant Gram‐positive cocci within the fermenting
microflora of an Italian dairy food product. - Journal of applied microbiology 109(1):
313-323.
Devirgiliis, C., Zinno, P., & Perozzi, G., 2013: Update on antibiotic resistance in foodborne
Lactobacillus and Lactococcus species. - Frontiers in microbiology 4,
Dušková, M., i Karpíšková, R., 2013: Antimicrobial resistance of lactobacilli isolated from
food. - Czech J Food Sci 31: 27-32.
Fisher, K., & Phillips, C., 2009: The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus. –
Microbiology 155(6): 1749-1757.
Flórez, A. B., Delgado, S., & Mayo, B., 2005: Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria
isolated from a cheese environment. - Canadian journal of microbiology 5: 51-58.
Franz, C. M., Muscholl-Silberhorn, A. B., Yousif, N. M., Vancanneyt, M., Swings, J., &
Holzapfel, W. H., 2001: Incidence of virulence factors and antibiotic resistance among
enterococci isolated from food. - Applied and Environmental Microbiology 67(9):
4385-4389.
Holt, S. M., Al‐Sheikh, H., & Shin, K. J., 2001: Characterization of dextran‐producing
Leuconostoc strains. - Letters in applied microbiology 32(3): 185-189.
Huddleston, J. R., 2014: Horizontal gene transfer in the human gastrointestinal tract:
Potential spread of antibiotic resistance genes. - Infection and drug resistance 7:
167-176.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
48
Hummel, A. S., Hertel, C., Holzapfel, W. H., & Franz, C. M., 2007: Antibiotic resistances of
starter and probiotic strains of lactic acid bacteria. - Applied and environmental
microbiology 73: 730-739.
Huys, G., D'haene, K., & Swings, J., 2002: Influence of the culture medium on antibiotic
susceptibility testing of food‐associated lactic acid bacteria with the agar overlay disc
diffusion method. - Letters in applied microbiology 34(6): 402-406.
Huys, G., D'Haene, K., Collard, J. M., & Swings, J., 2004: Prevalence and molecular
characterization of tetracycline resistance in Enterococcus isolates from food. -
Applied and Environmental Microbiology 70(3): 1555-1562.
Joković, N., 2010: Diverzitet mlečno kiselinskih bakterija izolovanih iz kajmaka, PhD thesis -
Biološki fakultet, Univerzitet u Beogradu.
Korhonen, J., 2010: Antibiotic resistance of Lactic acid bacteria, PhD thesis - Faculty of
Science and Forestry, University of Eastern Finland.
Mathur, S., & Singh, R., 2005: Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria—a review. -
International Journal of Food Microbiology 105(3): 281-295.
Mihajlov-Krstev, T., 2008: Radna sveska iz mikrobiologije. - Univerzitet u Nišu, Prirodno-
matematički fakultet, Odsek za biologiju sa ekologijom, Niš.
Mujezinović, I., 2011: Mechanism of action of antibiotics which inhibit synthesis of bacterial
cell wall. – Veterinaria 60(1-2): 69-77.
Najman, S., 2002: Osnovi molekularne i humane genetike-3. dopunjeno izdanje.- Savez
studenata Medicinskog fakulteta, Niš.
Ogier, J. C., & Serror, P.,2008: Safety assessment of dairy microorganisms: the Enterococcus
genus. - International journal of food microbiology 126(3): 291-301.
Ogier, J. C., Casalta, E., Farrokh, C., & Saïhi, A., 2008: Safety assessment of dairy
microorganisms: The Leuconostoc genus. - International journal of food microbiology
126(3): 286-290.
Petrović, O., Knežević, P., & Simeunović, J., 2007: Mikrobiologija: skripta za studente
biologije. - Daniel Print, Novi Sad.
Master rad
Rezistencija bakterija mlečne kiseline izolovanih iz kajmaka na antibiotike
49
Säde, E., 2011: Leuconostoc spoilage of refrigerated, packaged foods, PhD thesis - Faculty of
Veterinary Medicine, University of Helsinki, Finland.
Swenson, J. M., Facklam, R. R., & Thornsberry, C., 1990: Antimicrobial susceptibility of
vancomycin-resistant Leuconostoc, Pediococcus, and Lactobacillus species. -
Antimicrobial agents and chemotherapy 34(4): 543-549.
Swenson, J. M., Ferraro, M. J., Sahm, D. F., Charache, P., & Tenover, F. C., 1992: New
vancomycin disk diffusion breakpoints for enterococci. - Journal of clinical
microbiology 30(10): 2525-2528.
Tannock, G. W., 2004: A special fondness for lactobacilli. - Applied and environmental
microbiology, 70(6), 3189-3194.
Teuber, M., Meile, L., & Schwarz, F., 1999: Acquired antibiotic resistance in lactic acid
bacteria from food. Antonie van Leeuwenhoek 76(1-4):115-137.
Varagić, V., M., Milošević, P., M. 2012: Farmakologija-23. prerađeno i dopunjeno izdanje. –
Elit Medica, Beograd.
Verraes, C., Van Boxstael, S., Van Meervenne, E., Van Coillie, E., Butaye, P., Catry, B., ...&
Herman, L., 2013: Antimicrobial resistance in the food chain: a review. - International
journal of environmental research and public health 10: 2643-2669.
Zarazaga, M., Sáenz, Y., Portillo, A., Tenorio, C., Ruiz-Larrea, F., Del Campo, R., ... & Torres,
C. 1999: In Vitro Activities of Ketolide HMR3647, Macrolides, and Other Antibiotics
against Lactobacillus, Leuconostoc, and Pediococcus Isolates. - Antimicrobial agents
and chemotherapy 43(12): 3039-3041.
Прилог 5/1
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР: Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Милица Лазаревић
Ментор, МН: Наташа Јоковић Наслов рада, НР: РЕЗИСТЕНЦИЈА БАКТЕРИЈА МЛЕЧНЕ КИСЕЛИНЕ ИЗОЛОВАНИХ ИЗ
КАЈМАКА НА АНТИБИОТИКЕ Језик публикације, ЈП: српски
Језик извода, ЈИ: енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2015.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33. Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога) 49 стр. ; 7 слика, 19 табела
Научна област, НО: биологија
Научна дисциплина, НД: микробиологија хране
Предметна одредница/Кључне речи, ПО: бактерије млечне киселине, резистенција, антибиотици
УДК (637.1 + 547.472.3) : 577.181
Чува се, ЧУ: библиотека
Важна напомена, ВН: Извод, ИЗ: У овом раду тестирано је 49 изолата бактерија млечне киселине (БМК),
изолованих из кајмака, за осетљивост на антибиотике, методама диск дифузије, микродилуције и агар дилуције. На основу добијених резултата може се закључити да су сви тестирани изолати, који припадају врстама Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei и Lb. plantarum осетљиви на ампицилин, еритромицин, тетрациклин, доксициклин и хлорамфеникол, док је већина изолата осетљива на антибиотике гентамицин, клиндамицин, ванкомицин и ципрофлоксацин. Резистенција на гентамицин присутна је код укупно пет изолата, по једног изолата врсте Lc. lactis ssp. lactis, E. faecium, Lb. paracasei и код два изолата врсте E. faecalis. Резистенција на клиндамицин такође је присутна код пет изолата и то једног Lc. lactis ssp. lactis и E. faecalis изолата и три E. faecium изолата. Два изолата врсте Lb. plantarum била су резистентна на ванкомицин, док је резистенција на ципрофлоксацин присутна код једног изолата врсте L. mesenteroides ssp. mesenteroides. Резултати за резистентност на антибиотике веома варирају између различитих метода које су коришћене у овом раду.
Датум прихватања теме, ДП: 07.10.2015.
Датум одбране, ДО:
29.12.2015.
Чланови комисије, КО: Председник: Др Татјана Михајилов-Крстев
Члан: Др Зорица Стојановић-Радић
Члан, ментор: Др Наташа Јоковић
Образац Q4.09.13 - Издање 1
Прилог 5/2
ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO: Identification number, INO:
Document type, DT: monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: university degree thesis
Author, AU: Milica Lazarević
Mentor, MN: Nataša Joković Title, TI: ANTIBIOTIC RESISTANCE OF LACTIC ACID BACTERIA ISOLATED
FROM KAJMAK Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2015.
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes) 49 p. ; 7 pictures, 19 tables
Scientific field, SF: biology
Scientific discipline, SD: food microbiology
Subject/Key words, S/KW: lactic acid bacteria, resistance, antibiotics
UC (637.1 + 547.472.3) : 577.181
Holding data, HD: library Note, N: Abstract, AB: The aim of this study was to evaluate the antibiotic susceptibility for 49 isolates
of lactic acid bacteria (LAB) isolated from kajmak with disk diffusion, microdilution and agar dilution method.
According to the results, all tested isolates belonging to species Lc. lactis ssp. lactis, E. faecalis, E. faecium, L. mesenteroides ssp. mesenteroides, Lb. paracasei and Lb. plantarum were susceptible to ampicillin, erythromycin, tetracycline, doxycycline and chloramphenicol, while most of isolates were
susceptible to gentamicin, clindamycin, vancomycin and ciprofloxacin. Five gentamicin-resistant isolates were detected (one Lc. lactis ssp. lactis, E. faecium, Lb. paracasei and two E. faecalis isolates). Five clindamycin -resistant isolates were also detected (one Lc. lactis ssp. lactis and E. faecalis and three E. faecium isolates). Two Lb. plantarum isolates were resistant to vancomycin and
one L. mesenteroides isolate was resistant to ciprofloxacin. The results of susceptibility testing showed variation between those three methods.
Accepted by the Scientific Board on, ASB: 07.10.2015.
Defended on, DE:
29.12.2015.
Defended Board, DB: President: PhD Tatjana Mihajilov-Krstev
Member: PhD Zorica Stojanović-Radić
Member, Mentor: PhD Nataša Joković
Образац Q4.09.13 - Издање 1
top related