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Utilidad de la Microscopía Electrónica en el diagnóstico de las enfermedades

neuromusculares Beatriz San Millán Tejado, Carmen Navarro

Servicio de Anatomía Patológica- Neuropatología

Complejo Hospitalario Universitario de Vigo

Invención del Microscopio Electrónico

1931-1933 Max Noll y Ernst Ruska Ernst Ruska Nobel de Física 1986

•1939: Primer TEM comercial

•1960-1970: “The big eye”

•1980: Inmunohistoquímica y biología molecular

Microscopio Electrónico

• Microscopio óptico: 400-700 nm (luz visible)

• Microscopía electrónica: resolución atómica:

~0.1nm

– Imagen elaborada a partir de electrones que atraviesan

la muestra

– Muestra en secciones ultrafinas: 80nm (0.08µ)

– Haz de e muy energético: ~100kV

– Aumentan la imagen hasta 106 veces

Microscopía electrónica

Morfología Histoquímica

Inmunohistoquímica

Western blot

Estudio bioquímico Estudio genético

Tratamiento de muestras para ME

1. Fijación: Glutaraldehido 2,5%. Lavado: tampón cacodilato.

2. Post-fijación: solución de Dalton (Os)

3. Deshidratación

4. Inclusión en resina (Epon)

5. Cortes Ultrafinos 80nm

Ultramicrotomo

Biopsia en fresco

Datos clínicos

Exploraciones complementarias:

Analítica

Imagen

EMG…

Datos histológicos

Examen de cortes semifinos:

Tejido representativo?

Examinar numerosas células

Examinar numerosas áreas

Estudio Ultraestructural

Estructura del músculo esquelético normal

Desmina A Z (α Actinina) I

Miotilina

γ- Filamina

Teletonina

M

Titina

Actina (banda I)

Miosina

Nebulina

Plectina

Tropomiosina-Troponina

Sarcolema

Plasmalema

Lámina basal

SARCÓMERO

Z Z A I I

Lámina densa: 20-30 nm Lám lúcida: 10-15 nm

Sarcoplasma

Retículo Sarcoplásmico

Aparato de Golgi

Mitocondrias

Reacciones patológicas de la membrana Defectos estructurales de la membrana-desintegración

Aumento de vesículas de endocitosis

Proyecciones papilares

Desdoblamiento de la lámina basal

Disferlinopatía

DISTROFINOPATÍAS, SARCOGLICANOPATÍAS …

RUPTURA DE LA MEMBRANA (entrada de fluidos extracelulares ricos en Ca)

LESIONES DELTA: Exceso de Ca intracelular y en mitocondrias: ↓de la síntesis de ATP, ↑degradación proteica, ruptura de FL de membrana

Distrofia muscular de Duchenne

VACUOLAS AUTOFÁGICAS

X-MEA : Miopatía ligada a X con exceso de autofagia

Enfermedad de Danon

Expansiones de GCG en PABP2.

Filamentos rectos no ramificados, entrelazados o en empalizadas 2-3µm

Distrofia óculo-faríngea.

Inclusiones filamentosas

Miositis por cuerpos de Inclusión (IBM)

Inclusiones túbulo-filamentosas

15-18nm

15-20 nm Se acumulan en citoplasma, núcleo o ambos Miositis por cuerpos de Inclusión IBM

Inclusiones túbulo-filamentosas

Inclusiones Túbulo-reticulares

• Agregados reticulares de túbulos de 20-30 nm

• Presentes en células endoteliales:

• Dermatomiositis

• VIH (estadios tardíos)

• LES

Dermatomiositis: Lesión capilar

Miopatía del paciente crítico

(Myosin Heavy-chain depletion syndrome)

MIOPATÍA NEMALÍNICA

Nemalinas: Agregados de filamentos Longitud 1-3 μm Diámetro: 0.3 μm

DesminaA Z (α Actinina)I

Miotilina

γ- Filamina

Teletonina

M

Titina

Actina (banda I)

Miosina

Nebulina

Plectina

Tropomiosina-Troponina

DesminaA Z (α Actinina)I

Miotilina

γ- Filamina

Teletonina

M

Titina

Actina (banda I)

Miosina

Nebulina

Plectina

Tropomiosina-Troponina

Miopatía Nemalínica

Forma severa neonatal de Miopatía Nemalínica: mutaciones en ACTA1 Nemalinas intranucleares

Agregados de tubulos 20-30 nm

Tipos: I (70+40nm int.); II (70-400nm); III (130-400nm +25-40nm int.)

AGREGADOS TUBULARES

AGREGADOS TUBULARES

Miopatía por agregados tubulares:

• AD

• AR

Hallazgo inespecífico:

• Miastenia Gravis

• Parálisis periódica

• Miopatías inflamatorias

• Miopatía alcohólica

• Exposición crónica a drogas

• Mialgias-calambres por ejercicio

Miopatías mitocondriales

Proliferación mitocondrial Alteración de crestas mitocondriales

HE TRI SDH COX-SDH

Miopatías mitocondriales

Proliferación mitocondrial Crestas circulares concéntricas

Inclusiones paracristalinas

Glucogenosis II

PAS

X-MEA : Miopatía ligada a X con exceso de autofagia

Angioqueratomas y otras lesiones vasculares

“Cornea verticillata”

HVI

Enfermedad de Fabry

Dolor, diarrea,

náuseas, vómitos

Acroparestesias

SNC:

- AIT

- Infartos

SNP:

- Neuropatía periférica

Fucosidosis

Galactosialidosis

βMannosidosis

• INCLUSIONES LISOSOMALES

(Cuerpos“cebra”, multilaminares, densos)

– Vasos (céls. endoteliales, pericitos, músculo liso)

– Fibroblastos

– Células perineurales

Cuerpos “Cebra”

CEROIDO LIPOFUSCINOSIS NEURONAL (NCL) Herencia AR Depósitos lisosomales de pigmentos lipídicos: PAS+, FA+

INFANTIL

CLN1 (1p32) Depósitos granulares (GRODs)

Déficit de PPT

INFANTIL TARDÍA CLN2 (11) Cuerpos curvilíneos

Subunidad C de ATPsintasa (SMACS)

JUVENIL

CLN3 (16) Del 1Kb (96%)

Cuerpos curvilíneos ,granulares e inclusiones en huella digital

ADULTO ANCL (GRODs, cuerpos curvilíneos

+ huellas digitales)

VARIANTES ….

CEROIDO LIPOFUSCINOSIS NEURONAL (NCL)

Cuerpos curvilineos intralisosomales Inclusiones en huella digital

CEROIDO LIPOFUSCINOSIS NEURONAL (NCL)

Cuerpos curvilineos Inclusiones granulares

Enfermedad de Krabbe: Depósito de galactocerebrosidos: Inclusiones espiculares claras

Leucodistrofia Metacromática Déficit de Arilsulfatasa

Woelcke

PAS Cresil Violeta

•Acúmulo de sulfátidos •Metacromasia •PAS+

Enfermedad de Hurler

CADASIL Cerebral Autosomal Dominant Angiopathy with Subcortical Infarcts and Leucoencephalopathy

« Granular Osmiophilic Material » (GOM)

Microscopía electrónica en Neuropatología

o Muestras de muy pequeño tamaño

o Procesamiento laborioso

o Posibilidad de artefactos, hallazgos

inespecíficos

o Importancia de la correcta manipulación

e interpretación por personal entrenado

o Permite diagnosticar enfermedades

sin hallazgos en MO

o Estudiar la fisiopatología de la

enfermedad y orientar estudio

molecular

o Examinar varios tipos celulares y

estructuras subcelulares

• La ME mejora el rendimiento de las biopsias de musculo y nervio periférico

• Principales aplicaciones de la ME:

– Vacuolas:

• Sin membrana: Miopatías lipídicas, Glucogenosis no lisosomales, vacuolas ribeteadas.

• Con membrana: Enfermedades lisosomales, miopatias vacuolares autofágicas

– Depósitos de material anormal:

• Visibles con MO: Nemalinas, Agregados tubulares…

• No visibles en MO: inclusiones en huella digital, cuerpos curvilíneos, cuerpos “cebra”

– Desorganización miofibrilar: mp del paciente crítico (miosina), mp miofibrilares

– Estudio de tejidos extraneurales (piel) para el dco de enf neuromusculares

• La microscopía electrónica es necesaria para la comprensión de la enfermedad.

Conclusiones

FUCOSIDOSIS

Enfermedades metabólicas

Miopatías Mitocondriales

Miopatías lipídicas, Glucogenosis…

Enf Lisosomales

• Glucogenosis II • Enf de Fabry

Leucodistrofias • LDM (LD Metacromática) • LDK (LD de células de Krabbe)

Ceroidolipofuscinosis Neuronal

Otras

Depósitos lisosomales en: • Músculo esquelético • Vasos (céls. endoteliales, pericitos, músc liso) • Fibroblastos • Células perineurales

Neuropatía Amiloidea Familiar por Transtiretina