vacinologia na biotecnologia - ufpel · 2011. 10. 20. · leptospira noguchii and human and animal...

Vacinologia na Biotecnologia - UFPel

Janeiro 1989

Agosto 1989

Agosto 1989

Abril 1991

Mycobacterium bovis BCG

- Resposta imune humoral e celular;

- Única dose;

- Vacina replicante muito estável;

- Apresenta um baixo custo de produção.

- Vacina largamente utilizada em humanos no mundo todo; - Administrada em qualquer época após o nascimento;

- Efeito imunoestimulante e adjuvante;

Janeiro 1995

Agosto 1996

Agosto 1996

Agosto 1996

Agosto 1996

Agosto 1996

Outubro 1996

02 de agosto de 2001

03 de dezembro de 2001

01 de março de 2003

BCG - PRRS

BCG - Anaplasmose

BCG - Babesiose

BCG - Leptospirose

BCG recombinante...

Porque a vacina interfere com o teste de tuberculina!

Por que não é utilizada em animais?

Um teste capaz de diferenciar animais infectados de animais vacinados (DIVA) permitirá introduzir mudanças na atual legislação e possibilitará o uso de vacina contra TB bovina.

BCG recombinante...

Maior eficácia contra tuberculose bovina do que a cepa convencional

Possibilidade de construção de uma vacina multivalente

Leptospirose

TAMANHO

-0,1 a 0,2 m de diâmetro

-6 a 20 m de comprimento

• Zoonose

• Agente etiológico: Leptospira sp.

• Infecta diversos animais e humanos

• Infecção através de contato direto ou água ou solo contaminado com urina de portadores

• Doença febril aguda

Vacinas

• Células inteiras inativadas (Bacterinas)

• Imunidade pouco duradoura (6 a 12 meses)

• Efeitos colaterais

• Sorovares específicas

• Vacinas recombinantes

Leptospira

interrogans: hardjo,

wolffi, pomona,

icterohaemorrhagiae,

grippotyphosa e

canicola.

L. hardjo;

L. icterohaemorrhagiae;

L. wolffi;

L. bratislava;

L. pomona.

O genoma de L. interrogans

Fonte: Nascimento et al., Braz J Med Biol Res 37(4) 2004 Nascimento et al., J Bacteriol. 2004 Apr;186(7):2164-72.

Gel de poliacrilamida 15%

Purificação das proteínas

ÄKTAPrime

Proteínas purificadas

Resposta Imune Humoral

Resposta Imune Humoral

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 21 42 63 84 105tempo (dias)

Ab

so

rbân

cia

s (

OD

450)

rLIC11058

rLIC10054

rLIC20172

rLIC13059

rLIC11567

rLIC10091

rLIC10009

rLIC13305

Controle -

Resposta imune humoral apresentada pelos animais inoculados com as proteínas

recombinantes e do grupo controle negativo salina/Al(OH)3. A medida das respostas

imunes está expressa em absorbância (OD450).

DESAFIO

Vacinação dos Hamsters

Inoculação de doses letais de

Leptospiras patogênicas

Taxa de

Sobrevivência

2005 Parceria Fiocruz/UFPel – Reunião no Mercosul

2006

Primeira produção científica do laboratório – Canadian Journal of Microbiology

2007 SEIXAS, F. K. ; SILVA, E. F.; HARTWIG, Daiane D ; CERQUEIRA, Gustavo M ; AMARAL, M. ; FAGUNDES,

Michel Q ; DOSSA, Robson G ; DELLAGOSTIN, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing the Lipl32 antigen of Leptospira interrogans protects hamsters from challenge. Vaccine (Guildford), v. 26, p. 88-95, 2007.

SILVA, E. F. ; MEDEIROS, M. A. ; MCBRIDE, Alan J A ; STEVES, G. S. ; RAMOS, J. G. R. ; SANTOS, C. S. ; CRODA, J. ; HOMMA, A. ; DELLAGOSTIN, O. A. ; HAAKE, D. A. ; REIS, Mitermayer G ; KO, Albert I . The terminal portion of leptospiral immunoglobulin-like protein LigA confers protective immunity against lethal infection in the hamster model of leptospirosis. Vaccine (Guildford), v. 25, p. 6277-6286, 2007.

FERNANDES, Claudia P H; SEIXAS, Fabiana K; COUTINHO, Mariana L; VASCONCELLOS, Flavia A; SEYFFERT, Nubia; BROD, Claudiomar S; MCBRIDE, Alan J A; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, Jose A G Monoclonal antibodies against LipL32, the major outer membrane protein of pathogenic leptospira: production, characterization and testing in diagnostic applications. Hybridoma (Larchmont), v. 21, p. 35-41, 2007.

SILVA, Everton F; BROD, Claudiomar S; CERQUEIRA, Gustavo M; BOURSCHEIDT, Debora; SEYFFERT, Núbia; QUEIROZ; SANTOS, Cleiton S; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A. . Isolation of Leptospira noguchii from sheep. Veterinary Microbiology (Amsterdam), v. 121, p. 144-149, 2007.

SEIXAS, Fabiana K; FERNANDES, Claudia P H; HARTWIG, Daiane D; CONCEIÇÃO, Fabricio R; ALEIXO, José A G; DELLAGOSTIN, O. A. . Evaluation of different ways of presenting LipL32 to the immune system with the aim of developing a recombinant vaccine against leptospirosis. Canadian Journal of Microbiology, v. 54, p. 472-479, 2007.

2008

SILVA, E. F.; SANTOS, C. S.; ATHANAZIO, Daniel A; SEYSSERT, N.; SEIXAS, F. K.; CERQUEIRA, Gustavo M; FAGUNDES, Michel Q; BROD, Claudiomar S; REIS, Mitermayer G; DELLAGOSTIN, O. A.; KO, Albert I . Characterization of virulence of Leptospira isolates in a hamster model. Vaccine (Guildford), v. 26, p. 3892-3896, 2008.

FERNANDES, Claudia P H; SEIXAS, F. K.; COUTINHO, Mariana L; VASCONCELLOS, Flavia A; MOREIRA, Angela N; CONCEIÇÃO, F. R.; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, José A G . An immunomagnetic separation-PCR method for detection of pathogenic leptospira in biological fluids. Hybridoma (Larchmont), v. 27, p. 1-6, 2008.

MIRAGLIA, F.; MORENO, A. M.; PAIXAO, R.; LIUSON, E.; MORAIS, Z. M.; MAIORKA, P.; SEIXAS, F. K.; DELLAGOSTIN, O. A.; VASCONCELLOS, S. A. Isolation and characterization of Leptospira interrogans from pigs slaughtered in São Paulo State, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 39, p. 501-507, 2008.

2009 MCBRIDE, Alan J A; CERQUEIRA, Gustavo M; SUCHARD, M. A.; MOREIRA, A. N.; REIS,

Mitermayer G; HAAKE, D. A.; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A. . Genetic diversity of the Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp.. Infection, Genetics and Evolution, v. 9, p. 196-205, 2009.

SILVA, E. F.; CERQUEIRA, Gustavo M; SEYFFERT, Núbia; SEIXAS, F. K.; HARTWIG, Daiane D; ATHANAZIO, Daniel A; PINTO, Luciano S; QUEIROZ; KO, Albert I; BROD, Claudiomar S; DELLAGOSTIN, O. A. . Leptospira noguchii and Human and Animal Leptospirosis, Southern Brazil. Emerging Infectious Diseases, v. 15, p. 621-623, 2009.

Murray, G. L.; Morel, V.; Cerqueira, G. M.; CRODA, J.; Srikram, A.; Henry, R.; Ko, A. I.; DELLAGOSTIN, O. A.; Bulach, D. M.; Sermswan, R.; Adler, B.; Picardeau, M. . Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infection and Immunity, v. 77, p. 810-816, 2009.

CERQUEIRA, Gustavo M; MCBRIDE, Alan J A; Picardeau, M.; RIBEIRO, Samuel G; MOREIRA, A. N.; Morel, V.; REIS, Mitermayer G; KO, Albert I; DELLAGOSTIN, O. A. . Distribution of the Leptospiral immunoglobulin-like (Lig) genes in pathogenic Leptospira spp. and application of ligB to typing leptospiral isolates. Journal of Medical Microbiology, v. 58, p. 1173-1181, 2009.

2010 Cerqueira, G. M.; McBride, A. J. A.; Queiroz, A.; Pinto, L. S.; SILVA, E. F.; HARTSKEERL, R. A.; Ko,

A. I.; DELLAGOSTIN, O. A. . Monitoring Leptospira Strain Collections: The Need for Quality Control. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, v. 82, p. 83-87, 2010.

VASCONCELLOS, Flávia Aleixo; COUTINHO, Mariana L; SILVA, Everton F; FERNANDES, Claudia P H; Monte, Leonardo G.; SEYFFERT, Núbia; DELLAGOSTIN, O. A.; ALEIXO, José A G . Testing different antigen capture ELISA formats for detection of Leptospira spp. in human blood serum. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, v. 104, p. 259-264, 2010.

SEIXAS, F. K.; BORSUK, S.; FAGUNDES, Michel Q; HARTWIG, Daiane D; SILVA, E. F.; CERQUEIRA, Gustavo M; DELLAGOSTIN, O. A. . Stable expression of Leptospira interrogans antigens in auxotrophic Mycobacterium bovis BCG. Biological Research (Print), 2010.

ESLABAO, M. R.; DELLAGOSTIN, O. A.; CERQUEIRA, Gustavo M . LepBank: a Leptospira sequence repository and a portal for phylogenetic studies. Infection, Genetics and Evolution (Print), 2010.

….

VACINA CONTRA

PNEUMONIA

MICOPLÁSMICA SUÍNA

Produção e Avaliação de

Outros Antígenos

Clonagem Direcional

- Seleção de genes de M. hyopneumoniae

- Amplificação por PCR

- Clonagem

pET200D-TOPO

5741 bp

6xHis

EK recognition

Kanamycin

pBR322 Ori

T7 promoter

RBS

T7 termination

pET200D-TOPO

5741 bp

6xHis

EK recognition

Kanamycin

pBR322 Ori

T7 promoter

RBS

T7 termination

NRDF 429 bp

CACC Stop codon

10 PCR A10 PCR A

For

RevFor mut

Rev mut

RevFor

TGG

RevFor

TGG

pET200D-TOPO

5741 bp

6xHis

EK recognition

Kanamycin

pBR322 Ori

T7 promoter

RBS

T7 termination

pET200D-TOPO

5741 bp

6xHis

EK recognition

Kanamycin

pBR322 Ori

T7 promoter

RBS

T7 termination

Mutação sítio dirigida

Bactérias recombinantes

Plasmídio

Transformação em

E. coli

Transformação em cepa de expressão BL21(DE3)

DNA recombinante

Seleção de clones recombinantes

Purificação ÄKTA_Prime Multiplicação

42 kDa Proteína Purificada

Purificação de Proteínas

Expressão

Antigenicidade das proteínas

10 proteínas recombinantes

testadas no ELISA

-10 soros de suínos SPF

- 37 soros de suínos convalescentes

50 ng

1:6000

1:100

SDS-PAGE corado com Commassie Blue, mostrando 9 proteínas recombinantes

purificadas por cromatografia de afinidade ao níquel.

Resultados

Médias calculadas com os soros avaliados em triplicata

Análise estatística - GraphPad Prism 4 (GraphPad Software)

Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o P≤ 0,05

Resultados

*

*

*

* * * * * * *

Projetos em andamento

• Avaliação de antígenos recombinantes de

Mycoplasma hyopneumoniae: desenvolvimento de

vacinas e testes diagnósticos (Edital

CNPq/MAPA/SDA Nº 64/2008)

– Valor: R$ 488.000,00

– Início em fevereiro 2009

• Núcleo de excelência em desenvolvimento de

vacinas veterinárias (PRONEX – FAPERGS/CNPq)

– Valor: R$ 631.000,00

– Início em abril de 2010

• Produção e avaliação de uma vacina recombinante

contra tuberculose bovina e de teste de

diagnóstico diferencial (DIVA) (CNPq e Biotecsur)

– Valor: 350.000,00

– Início em janeiro de 2009

OUTROS PROJETOS...

Parceiros e apoiadores