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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA
VILMA MENEZES DE JESUS PRADO
Desenvolvimento de método por CLAE-DAD para discriminação de chás de genótipos de Lippia gracilis Schauer através de cromatogramas fingerprint combinados com análises quimiométricas
São Cristóvão – Sergipe
Fevereiro/2012
VILMA MENEZES DE JESUS PRADO
Desenvolvimento de método por CLAE-DAD para discriminação de chás de genótipos de Lippia gracilis Schauer através de cromatogramas fingerprint combinados com análises quimiométricas
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal de Sergipe, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Química.
Orientadora: Profª. Drª. Valéria Regina de Souza Moraes
São Cristóvão
2012
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTR AL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
P896d
Prado, Vilma Menezes de Jesus
Desenvolvimento de método por CLEA-DAD para discriminação de chás de genótipos de Lippia gracilis Schauer através de cromatogramas fingerprint combinados com análises quimimétricas / Vilma Menezes de Jesus Prado;
Orientadora: Valéria Regina de Souza Moraes. – São Cristóvão, 2012.
91 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Sergipe, 2012.
1. Lippia gracilis. 2. Chá. 3. Quimiometria. 4. Cromatografia líquida. l. Moraes, Valéria Regina de Souza, orient. lI. Título.
CDU 543.544:582.929.3
ii
À Deus, por ter me dado forças nas horas mais difíceis, ajudando-me a não desistir.
Aos meus pais Antônio Evangelista de Jesus e Vivalda Maria Menezes de Jesus por trabalharem sacrificando
seus sonhos em favor dos meus. Por tudo, sou infinitivamente grata.
As minhas queridas irmãs, Ana Maria, Aline e Beatriz, Pela força, compreensão e constante torcida.
Ao meu esposo Eguinaldo, pelo carinho, força e paciência.
À toda a minha família, pela força, apoio e incentivo.
Dedico
iii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Sergipe (UFS) através do Programa de Pós-Graduação
em Química (NPGQ) e do Departamento de Química (DQI) pela oportunidade de
realizar este trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela
concessão da bolsa de estudos.
À Prof.ª Dr.ª Valéria Regina de Souza Moraes, pela orientação, dedicação e amizade,
além da sua compreensão durante o decorrer deste trabalho.
Ao Prof.º Dr. Paulo César de Lima Nogueira pela colaboração no desenvolvimento
deste trabalho.
Ao Prof.º Dr. Sandro Navickiene pelas valiosas contribuições para o melhoramento
do meu trabalho, pelos ensinamentos, e pela disponibilização de equipamentos e
materiais do seu laboratório para execução deste trabalho.
Ao Prof.º Dr. Emmanoel Vilaça Costa pela contribuição na realização deste trabalho.
Ao Prof.º Dr. Arie Fitzgerald Blank pelo fornecimento das folhas da espécie Lippia
gracilis Schauer.
Ao Prof.º Dr. Edenir Rodrigues Pereira-Filho, do Departamento de Química da
UFSCar, pelas análises quimiométricas contidas neste trabalho.
À Prof.ª Dr.ª Lúcia Regina Rocha Martins pelas discussões e contribuições no início
deste trabalho.
Ao Prof.º Dr. Charles dos Santos Estevam pela colaboração e pela realização do teste
de atividade antioxidante; e aos seus alunos André Luiz Lima Menezes dos Santos
iv
(Farmácia), Rodolfo Alves Moreira (Farmácia) e Sabrina Zelice da Cruz de Moraes
(Biologia) agradeço pela grande ajuda no desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus amigos do LABORGANICS, em especial Alan pela ajuda no HPLC, a
Aline, Marília e Susy pela ajuda na preparação dos chás e contribuição para o
desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus amigos Érica, Pedro Ernesto, Cristiane e Silvânio pelas conversas,
companheirismo e incentivo.
Aos amigos e funcionários do Departamento de Química (DQI), que direta ou
indiretamente, contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
v
CURRICULUM VITAE 1. DADOS PESSOAIS Nome: Vilma Menezes de Jesus Prado Nome em citações bibliográficas: Prado, V. M. J. Naturalidade: Itabaiana –SE Data de Nascimento: 30/06/1982 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO Nível Superior: Química Licenciatura, Universidade Federal de Sergipe, UFS. Ano de Conclusão: 2008 3. ÁREA DE ATUAÇÃO Química Orgânica, Química de Produtos Naturais 4. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
1- COSTA, S. S. L.; PITANGA, A. F.; PRADO, V. M. J.; NASCIMENTO, C. C.
Química e agricultura. Contextualizando o ensino de ligações químicas. In: Colóquio
Internacional "Educação e Contemporaniedade", 2007, São Cristóvão. I Colóquio
Internacional "Educação e Contemporaniedade", 2007.
2- COSTA, S. S. L.; PITANGA, A. F.; PRADO, V. M. J.; NASCIMENTO, C. C. ;
PORFIRIO, L. O. Solo e agricultura como tema para discussão dos conceitos de ligações
químicas 2007 (Resumo Publicado em anais de Congresso).
3- PRADO, V. M. J.; MORAES, V. R. S.; NOGUEIRA, P. C. L. Determinação de um
método por CLAE-DAD para obtenção de cromatogramas fingerprint de chás de
vi
diferentes genótipos de Lippia gracilis Schauer. 7º Encontro de Pós-Graduação da UFS,
2011, São Cristóvão- SE.
4- PRADO, V. M. J.; MORAES, V. R. S.; NOGUEIRA, P. C. L.; MARTINS, L. R. R.;
BLANK, A. F. A LC–DAD fingerprint method for infusions of Lippia gracilis Schauer
genotypes. 3rd Brazilian Conference on Natural Products, 2011, Ouro Preto-MG.
vii
RESUMO
Para avaliar os efeitos do meio ambiente no conteúdo de metabólitos secundários em genótipos de Lippia gracilis Schauer, um método por cromatografia líquida de alta eficiência com detector por arranjo de diodos (CLAE-DAD) foi desenvolvido para obter os perfis cromatográficos (fingerprint) de chás das folhas secas de sete genótipos desta espécie provenientes de duas localizações (Sergipe e Bahia) e coletadas em diferentes estações do ano: verão (com e sem irrigação) e inverno. Para comparar os cromatogramas fingerprints foi aplicado ferramentas quimiométricas de análise exploratória (ACP). Os resultados destas análises mostraram que os genótipos 108 e 202 coletados no verão e cultivados sem irrigação são significativamente diferentes dos demais genótipos da mesma coleta. Além disso, sabendo que esta espécie possui grande resistência à seca e a altas temperaturas, pode-se propor que os genótipos 107, 108 e 110 apresentaram maior resistência ao stress hídrico, pois não foi observada diferenciação entre as amostras coletadas no verão cultivadas com e sem irrigação. Os chás das amostras de L. gracilis foram também submetidos ao teste de atividade antioxidante pelo método DPPH (2,2 difenil-1-picril hidrazil). As amostras do genótipo 201, verão com irrigação e verão sem irrigação [(201 vc e 201 vs); 30 µg/mL; 60 min)] consumiram mais de 90% do radical DPPH, apresentando uma resposta similar ao controle positivo ácido gálico (92,06%, 30 µg/mL, 60 min). Palavras-chave: Lippia gracilis; chás; CLAE-DAD, quimiometria, antioxidante.
viii
ABSTRACT
To evaluate the effects of the environmental on the content of secondary metabolites in the genotypes of Lippia gracilis Schauer, a high-performance liquid chromatographic-photodiode array detection (HPLC-DAD) method was developed to obtain the chemical profiles (fingerprints) of infusions from leaves of seven genotypes of L. gracilis originated from two locations (Sergipe and Bahia state) and collected in different seasons: summer (with and without irrigation) and winter. In order to compare the fingerprints chromatograms, it was applied chemometric tools for exploratory analysis (PCA). The results of these analyses showed that 108 and 202 genotypes collected in summer and grown without irrigation are significantly different from other genotypes under the same conditions. Moreover, knowing that this species is drought-resistant and can withstand high temperatures, we can propose that the 107, 108 and 110 genotypes are more resistant to drought conditions because there were no differences between samples collected in summer and grown with or without irrigation. All samples was submitted to antioxidant activity by DPPH method (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). The samples of 201 genotype collected in summer with and without irrigation, 201vc and 201vs (30 µg/mL; 60 min), respectively, exhibited more than 90% DPPH scavenging activities, displaying similar response to the positive control, gallic acid (92.06%, 30 µg/mL, 60 min). Keywords: Lippia gracilis; infusions; LC-DAD, chemometry, antioxidant.
ix
SUMÁRIO
Resumo....................................................................................................... vii
Abstract...................................................................................................... viii
Lista de Figuras.......................................................................................... xi
Lista de Tabelas.......................................................................................... xiii
Lista de Abreviaturas, Siglas e Acrônimos................................................ xiv
CAPÍTULO 1
1. Introdução......................................................................................................... 02
1.1 Importância das Plantas Medicinais.................................................... 02
1.2 Perfil Cromatográfico.......................................................................... 05
1.3 Quimiometria....................................................................................... 06
1.4 Atividade Antioxidante........................................................................ 09
CAPÍTULO 2
2. Revisão da Literatura........................................................................................ 14
2.1 Família Verbenaceae............................................................................ 14
2.2 Gênero Lippia....................................................................................... 14
2.3 Espécie Lippia gracilis Schauer........................................................... 25
2.3.1 Classificação Taxonômica ................................................................... 26
CAPÍTULO 3
3. Objetivos........................................................................................................... 29
3.1 Objetivo Geral...................................................................................... 29
3.2 Objetivos Específicos........................................................................... 29
CAPÍTULO 4
4. Procedimento Experimental.............................................................................. 31
4.1 Material botânico: coleta e armazenamento......................................... 31
4.2 Equipamentos, Materiais e Reagentes.................................................. 32
4.3 Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência............................. 33
4.4 Preparação dos chás.............................................................................. 33
4.5 Condições cromatográficas de análise dos extratos aquosos
liofilizados de Lippia gracilis...............................................................
33
x
4.6 Análise quimiométrica.......................................................................... 34
4.7 Avaliação da atividade antioxidante..................................................... 34
4.7.1 Avaliação quantitativa da atividade antioxidante................................. 34
4.7.1.1 Curva de calibração do DPPH.............................................................. 35
4.7.1.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras............................... 35
4.7.2 Análise estatística................................................................................. 36
CAPÍTULO 5
5. Resultados e Discussão..................................................................................... 38
5.1 Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de Lippia gracilis........ 38
5.2 Otimização das condições cromatográficas de análise por CLAE-
DAD dos extratos aquosos liofilizados de Lippia gracilis..................
39
5.3 Aplicação da condição cromatográfica na análise de diferentes
genótipos de Lippia gracilis................................................................
48
5.4 Análise quimiométrica.......................................................................... 56
5.5 Atividade antioxidante: Teste do DPPH............................................... 62
CAPÍTULO 6
6. Conclusões........................................................................................................ 68
CAPÍTULO 7
7. Referências....................................................................................................... 70
xi
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Exemplo hipotético de gráfico de scores, com projeção de
amostras em um espaço tridimensional PC1 x PC2 x PC3............... 08
Figura 02. Foto da espécie L. gracilis................................................................ 25
Figura 03. Folhas secas dos sete genótipos de L. gracilis dos três cultivos
(inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação)......................
32
Figura 04.
Cromatogramas do extrato aquoso liofilizado do genótipo 108
(inverno) de L. gracilis obtidos segundo as condições apresentadas
na Tabela 4........................................................................................
41
Figure 05. Cromatogramas obtidos pelas condições de análise testadas
apresentadas na Tabela 5................................................................... 46
Figure 06.
Análise Cromatográfica (λ = 254 nm) do extrato aquoso das folhas
secas do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis obtido com a
condição 20 (Tabela 5). Espectros de absorção no UV das bandas
cromatográficas assinaladas com os números de 1 a
5.........................................................................................................
47
Figure 07. Cromatograma 3D obtido por CLAE-DAD do extrato aquoso do
genótipo 108 (inverno) de L. gracilis................................................ 48
Figura 08.
Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos das
21 amostras obtidas de L. gracilis [sete genótipos (106-110, 201 e
202) das três coletas: inverno, verão com irrigação e verão sem
irrigação]...........................................................................................
50
Figure 09.
Comparação dos cromatogramas fingerprints (λ= 254 nm) dos sete
genótipos entre os três tipos de coletas: inverno, verão com
irrigação e verão sem irrigação.........................................................
51
Figura 10. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos
sete genótipos (inverno) de L. gracilis em quadruplicata................. 53
xii
Figura 11.
Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos
sete genótipos (verão com irrigação) de L. gracilis em
quadruplicata.....................................................................................
54
Figura 12.
Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos
sete genótipos (verão sem irrigação) de L. gracilis em
quadruplicata.....................................................................................
55
Figura 13.
Parte do cromatograma (λ= 254 nm) dos extratos aquosos de L.
gracilis: a) antes do alinhamento, b) após alinhamento utilizando
o algaritmo “Correlation Optimised Warping”
(COW)...............................................................................................
57
Figura 14. Gráfico de pré-processamento centrado na média............................ 58
Figura 15. Variância explicada (%) para cada componente principal
(CP’s)................................................................................................
59
Figura 16. Gráfico de escores (CP1 versus CP2)............................................... 59
Figura 17. Gráfico de loadings dos extratos aquosos liofilizados de L.
gracilis..............................................................................................
61
Figura 18.
Cinética comportamental dos extratos aquosos liofilizados de L.
gracilis (30 µg/mL) e ácido gálico (30 µg/mL), frente ao radical
livre DPPH (40 µg/mL).....................................................................
66
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Classificação taxonômica da espécie L. gracilis.............................. 27
Tabela 02. Dados dos genótipos da espécie L. gracilis..................................... 31
Tabela 03. Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis........... 38
Tabela 04. Variações analíticas de gradiente exploratório para otimização das
condições cromatográficas de separação da amostra 108 inv..........
40
Tabela 05.
Condições cromatográficas de análise para obtenção do perfil
cromatográfico, utilizando uma vazão de 1 mL/min e volume de
injeção de 25 µL...............................................................................
43
Tabela 06. Variância percentual das componentes principais calculadas para
os dados da matriz original centrados na média............................... 58
Tabela 07. Atividade antioxidante dos extratos aquosos liofilizados de L.
gracilis através da redução do radical livre DPPH.......................... 64
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS SIGLAS E ACRÔNIMOS
AAH Análise de Agrupamentos Hierárquica ACN Acetonitrila ACP Análise dos Componentes Principais ANOVA Análise de Variância CG Cromatografia Gasosa CG-EM Cromatógrafo a gás acoplado a Espectrômetro de Massas CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLAE–DAD Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detector de arranjo de diodos CI 50 Concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo máximo COW Correlation Optimised Warping CP Componente Principal ∆∆∆∆%B/min Variação do solvente B por tempo (inclinação do gradiente) Gen no. inv Genótipo coletado no inverno Gen no. vc Genótipo coletado no verão com irrigação Gen no. vs Genótipo coletado no verão sem irrigação IAA Índice de Atividade Antioxidante IP Percentual antioxidante MeOH Metanol RMN Ressonância Magnética Nuclear tR Tempo de retenção UV Ultravioleta V inj Volume de injeção
- 2 -
1 INTRODUÇÃO
1.1 Importância das plantas medicinais
O uso de plantas medicinais com o intuito de tratar doenças desempenha um
importante papel na saúde mundial. Apesar dos grandes avanços observados na
Medicina nas últimas décadas, elas continuam sendo bastante utilizadas. Estima-se
que cerca de 25 a 30% de todos os fármacos avaliados como agentes terapêuticos são
derivados de produtos naturais (SOUSA et al., 2008).
A procura pelo alívio e cura de doenças através da ingestão de preparados de
ervas talvez tenha sido uma das primeiras formas de utilização das plantas
medicinais. No Brasil o uso de plantas medicinais foi disseminado principalmente
pela cultura indígena. A crescente busca da população por estas plantas incentivou os
pesquisadores e a indústria farmacêutica a investirem mais nas pesquisas de novos
fármacos (YUNES & CALIXTO, 2001; VIEGAS et al., 2006; SOUSA et al., 2008).
As observações populares sobre o uso de plantas medicinais e a sua eficácia
contribuem de forma relevante para a divulgação das “virtudes terapêuticas” dos
vegetais, considerando os efeitos benéficos à saúde. Muitas vezes, o conhecimento
sobre plantas medicinais simboliza o único recurso terapêutico de muitas
comunidades e grupos étnicos (MACIEL et al., 2002).
As pesquisas químicas e farmacêuticas ao longo das últimas décadas
possibilitaram o alívio para males que ainda assolam a humanidade, tais como:
tuberculose, sífilis, câncer e hanseníase, bem como para as endemias do mundo
moderno, como depressão, cardiopatias e síndrome da imunodeficiência adquirida
(SIDA) (MELO et al., 2007; MENDES et al., 2010).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), 65 a 80% da população
mundial, especialmente em países em desenvolvimento, utilizam as terapias
alternativas como principal forma de tratamento e as plantas medicinais como os
principais medicamentos. Vale ressaltar que no Brasil o uso de plantas medicinais é
promovido pelo difícil acesso da população à assistência médica e farmacêutica, e
pelo custo dos medicamentos industrializados (SILVEIRA et al., 2008).
- 3 -
Se a população dos países em desenvolvimento utiliza as plantas medicinais
por tradição e ausência de alternativas econômicas viáveis, nos países mais
desenvolvidos observa-se um maior uso de fitomedicamentos influenciado pelos
modismos no consumo de produtos naturais (VEIGA, 2008).
Um dos fatores mais preocupantes do consumo de fitomedicamentos é a
automedicação, a qual está associada à falta de informações adequadas sobre as
propriedades das plantas medicinais (principalmente das exóticas), ao seu consumo
concomitante com medicamentos tradicionais (alopáticos) e à perda do conhecimento
sobre os possíveis efeitos medicinais e tóxicos das plantas (VEIGA, 2008).
No Brasil, o principal órgão responsável pela regulamentação de plantas
medicinais e seus derivados é a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), autarquia do Ministério da Saúde, cuja função é proteger e promover a
saúde da população garantindo a segurança sanitária de produtos e serviços
(CARVALHO et al., 2008).
Fitoterápico, de acordo com a legislação sanitária brasileira, “é o
medicamento obtido exclusivamente de matérias-primas vegetais, o qual é
caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela
reprodutibilidade e constância de sua qualidade”. O setor de fitoterápicos movimenta
globalmente US$ 21,7 bilhões por ano. No Brasil, não existem dados oficiais
atualizados, porém, estima-se que esse mercado gire em torno de US$ 160 milhões
por ano (CARVALHO et al., 2008).
Segundo Barbosa et al. (2006a) a qualidade dos fitoterápicos depende de uma
série de fatores, que tem início na identificação correta da espécie e continua no
plantio, na colheita e no beneficiamento. Diversos fatores influenciam a qualidade
final do produto, tais como: variações climáticas, solo, época de colheita,
características genéticas da planta, condições de secagem e tempo de
armazenamento. Recomenda-se que as plantas sejam comercializadas, consumidas
ou secadas imediatamente após a colheita, de forma a minimizar as perdas das
substâncias ativas. Além disso, altos teores de água nas partes vegetais permitem a
ação enzimática, favorecendo o desenvolvimento de microorganismos, podendo
comprometer as qualidades terapêuticas.
- 4 -
A expansão da fitoterapia pode ser atribuída a diversos fatores, tais como:
efeitos adversos dos fármacos sintéticos, preferência dos consumidores por
tratamentos “naturais”, validação científica das propriedades farmacológicas de
espécies vegetais, desenvolvimento de métodos analíticos colocados à disposição do
controle de qualidade, e um melhor conhecimento químico, farmacológico e clínico
dos fármacos vegetais e seus derivados (MELO et al., 2007).
Os chás têm atraído muita atenção nos últimos anos devido a sua capacidade
antioxidante e seu crescimento na dieta de milhares de pessoas em todo o mundo. Os
chás ingeridos na forma de infusão contribuem para a extração dos compostos
fenólicos, considerados benéficos à saúde. Vários estudos relatam a presença de
antioxidantes em chás, mas a metodologia utiliza extratos obtidos por solventes
orgânicos das folhas secas. Assim como os chás, várias espécies de condimentos têm
despertado o interesse quanto à avaliação do potencial antioxidante devido ao seu
uso comum na culinária brasileira (MORAIS et al., 2009).
O chá obtido por infusão é a forma mais popular de uso, seguido do chá
obtido pela decocção. No entanto, com a utilização crescente do forno de microondas
para preparar chá, uma investigação sobre os extratos obtidos com essa técnica é
necessário (LACERDA et al., 2000).
O chá verde, preparado por infusão de folhas secas de Camellia sinensis, é
um produto bastante apreciado devido ao seu aroma atraente e sabor característico,
bem como pelos seus efeitos benéficos à saúde, o que gera um aumento do interesse
em seu real potencial (LACERDA et al., 2000; KOMES et al., 2010). Os polifenóis
presentes no chá verde previnem a coagulação sanguínea e os níveis de colesterol,
reduzindo, assim, o risco de desenvolver doenças cardiovasculares (VINSON et al.,
1995 apud SHIKANGA et al., 2010).
Nos chás preto e mate, são encontrados as metilxantinas (cafeína e
teobromina), substâncias que agem sobre o sistema nervoso central, produzindo
vários fenômenos psíquicos, como o aumento da capacidade de percepção. O chá
preto apresenta ainda propriedades bactericidas, principalmente contra bactérias do
trato bucal (LACERDA et al., 2000).
Com relação ao gênero Lippia, infusões de Lippia javanica (Burm f.) Spreng.
e Lippia scaberrima Sond. são usadas na África do Sul para fins medicinais e ambas
- 5 -
são comercializadas como chás naturais sem cafeína. Já as infusões de Lippia
rehmannii H. Pearson não são geralmente usadas, possivelmente devido à presença
dos compostos hepatotóxicos icterogenina e ácidos rehmannicos. Apesar de haver o
registro do uso de infusões de algumas espécies de Lippia para fins medicinais,
trabalhos científicos sobre as atividades de seus extratos polares são escassos
(MUCHUWETI et al., 2006; MUJOVO et al., 2008; SHIKANGA et al., 2010).
1.2 Perfil cromatográfico
Considerando o crescente uso de ervas medicinais pela população mundial,
torna-se necessário o desenvolvimento de métodos analíticos que garantam também a
autenticidade da matéria-prima vegetal (MARTINS et al., 2007).
A análise do perfil cromatográfico (ou fingerprint cromatográfico) representa
uma possibilidade para avaliação da qualidade das ervas medicinais, na qual são
utilizadas técnicas de separação, como eletroforese capilar (EC), cromatografia
gasosa (CG), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), entre outras, para a
obtenção de padrões específicos que permitam o reconhecimento dos vários
componentes químicos presentes na amostra vegetal. Todo perfil cromatográfico
pode ser usado para determinar não só a ausência ou presença de marcadores
desejados, mas o conjunto completo de relações de todos os analitos detectáveis.
Além disso, com a ajuda de técnicas combinadas, tais como: CG-EM, CLAE-DAD,
CLAE-EM-EM e CLAE-RMN, auxiliadas por métodos de resolução em
quimiometria e técnicas de elucidação estrutural, é possível uma análise qualitativa e
quantitativa dos principais compostos detectados no fingerprint cromatográfico,
permitindo avaliar a autenticidade das plantas utilizadas com finalidade medicinal
(LIANG et al., 2010).
As técnicas de separação reduzem a complexidade da amostra,
“amplificando” a informação no domínio do tempo, por isso se tornam
particulamente valiosas para análises de fingerprint. No entanto, em amostras
biológicas é comum encontrar compostos polares, juntamente com apolares,
ionizáveis e não ionizáveis. Assim sendo, torna-se trabalhoso o desenvolvimento de
- 6 -
um método de análise que permita a detecção de todos esses compostos em uma
única corrida cromatográfica (CHEN et al., 2010).
Considerada uma das mais adequadas abordagens para a avaliação da
qualidade das ervas medicinais, a técnica de fingerprint cromatográfico fornece o
perfil de uma amostra extraída. Assim, métodos para análise dessas “impressões
digitais” químicas (fingerprint) têm sido desenvolvidos para avaliar a qualidade das
ervas comercializadas. A cromatografia líquida tem sido aceita pela OMS para a
avaliação da qualidade de medicamentos fitoterápicos (ZHOU et al., 2008; HOAI et
al., 2009).
Uma outra aplicação da análise de um perfil cromatográfico diz respeito ao
estabelecimento de parâmetros químicos que possibilitem avaliar, entre outras coisas,
a diferenciação entre espécies botanicamente semelhantes, os efeitos da
sazonalidade, a diferenciação de amostras por espécie ou origem geográfica e a
influência de diferentes condições de cultivo (MARTINS et al., 2011).
Sabendo que o conteúdo de metabólitos secundários em uma planta é afetado
pela sua relação com o meio ambiente, tais como: sazonalidade, temperatura,
disponibilidade hídrica, exposição à radiação ultravioleta, altitude, composição
atmosférica, solo, entre outras; e que esta variação pode afetar seus efeitos
terapêuticos, torna-se necessário, para uma caracterização completa da planta
estudada, uma análise total dos seus constituintes químicos (HAN et al., 2006;
GOBBO-NETO e LOPES, 2007; WANG et al., 2009; CHEN et al., 2009; ZHOU et
al., 2009; GARZA-JUÁREZ et al., 2011; LIU et al., 2011).
1.3 Quimiometria
A quimiometria pode ser definida como a utilização de métodos matemáticos
e estatísticos para o tratamento de dados químicos, de forma a extrair uma maior
quantidade de informações e melhores resultados analíticos. Ela iniciou formalmente
no Brasil na primeira metade da década de 70, mas só se firmou definitivamente
quando o computador se tornou mais acessível em laboratórios de química. Assim, a
quimiometria foi dividida em diversas frentes de pesquisa e aplicação: planejamento
- 7 -
e otimização de experimentos; reconhecimento de padrões e classificação de dados;
calibração multivariada e métodos de inteligência artificial (NETO et al., 2006;
VALDERRAMA, 2008).
O reconhecimento de padrões, que é uma das principais vertentes do uso da
estatística multivariada em química analítica, viabiliza a obtenção de mais
informações quando comparado com os procedimentos univariados que são
usualmente adotados. Os métodos de reconhecimento de padrões (RP) podem ser
aplicados com diferentes finalidades, entre elas a análise exploratória de dados, a
classificação de amostras e a resolução de curvas (CORREIA et al., 2007; NETO et
al., 2006).
Os métodos de análise exploratória mais usados são a Análise de
Componentes Principais (ACP) e a Análise de Agrupamentos Hierárquicos (AAH),
que permitem a visualização gráfica do conjunto de dados, mesmo quando o número
de amostras e variáveis é elevado. O uso desses algoritmos tem como principal
objetivo aumentar a compreensão do conjunto de dados, examinando a presença ou a
ausência de agrupamentos naturais entre as amostras. Ambos são classificados como
exploratórios ou não supervisionados, visto que nenhuma informação com relação à
identidade das amostras é levada em consideração (CORREIA et al., 2007; MATOS
et al. 2003).
A Análise de Componentes Principais (ACP) consiste numa transformação da
matriz de dados com o objetivo de representar as variações presentes em muitas
variáveis, através de um número menor de “fatores”. Constrói-se um novo sistema de
eixos (denominados rotineiramente de fatores, componentes principais, variáveis
latentes ou ainda autovetores) para representar as amostras, no qual a natureza
multivariada dos dados pode ser visualizada em poucas dimensões. Estas novas
variáveis são obtidas em ordem decrescente de quantidade de informação estatística
que descrevem, ou seja, a primeira componente principal aponta a direção de maior
variação dos dados, a segunda, que é ortogonal à primeira, aponta outra direção que
descreve a maior variação restante dos dados e assim por diante. Usando a notação
matricial, as componentes principais são obtidas por meio de transformações lineares
conforme a equação:
- 8 -
X P = T
em que X é a matriz original dos dados, T é a matriz de scores (Figura 1) que
contém as coordenadas das amostras no novo sistema de eixos e P é a matriz dos
loadings, onde os elementos de cada coluna correspondem aos coeficientes das
combinações lineares das variáveis originais (MORGANO et al., 1999).
A utilização da ACP visa reduzir a dimensionalidade do conjunto de dados
original, preservando a maior quantidade de informação (variância) possível. Essa
redução é obtida por meio do estabelecimento de novas variáveis ortogonais entre si,
denominadas componentes principais (CPs). Desta forma, as principais vantagens da
ACP estão na simplificação, modelamento, detecção de amostras anômalas,
classificação e previsão.
Figura 1. Exemplo hipotético de gráfico de scores, com projeção de amostras em um espaço tridimensional PC1 x PC2 x PC3. Fonte: VALDERRAMA, 2008
Tanto a ACP quanto a AAH permitem a interpretação multivariada de
conjuntos de dados grandes e complexos por meio de gráficos bi ou tridimensionais.
Estes gráficos apresentam informações que expressam as inter-relações que podem
existir entre as variáveis, facilitando a interpretação multivariada do comportamento
das amostras (MORGANO et al., 1999; MATOS et al. 2003; CORREIA et al.,
2007).
Diversos trabalhos na literatura mencionam o uso de análises quimiométricas,
especialmente ACP e AAH, com o objetivo de extrair informações dos
- 9 -
cromatogramas fingerprint de amostras vegetais. Estes estudos descrevem, por
exemplo, a discriminação de ervas medicinais para avaliação de sua qualidade e
investigação da variação nos componentes químicos entre espécies vegetais coletadas
em diferentes localizações, usando ou não marcadores químicos nesta avaliação
(YANG et al., 2007; ZHOU et al., 2009; CHEN et al., 2009; WANG et al., 2009;
LIANG et al., 2010; ZHAO et al., 2011; LIU et al., 2011).
Chen et al. (2008) utilizaram cromatogramas fingerprint de extratos
metanólicos de Ganoderma lucidum, obtidos por CLAE-DAD, que combinados às
análises quimiométricas permitiram classificar e agrupar os cogumelos de acordo
com sua província de origem.
No trabalho desenvolvido por Peng et al. (2011), análises quimiométricas,
incluindo AS (Análise por similaridade), AAH e ACP, mostraram-se apropriadas
para a classificação de cromatogramas fingerprint na diferenciação da espécie
Artemisia selengensis Turcz coletadas em cinco diferentes províncias da China.
1.4 Atividade antioxidante
Compostos oxidantes são produzidos pelo metabolismo normal do corpo e, se
não controlados, podem provocar danos extensivos. O estresse oxidativo corresponde
a um desequilíbrio entre a taxa de produção de agentes oxidantes e sua degradação.
O estresse oxidativo tem sido associado ao desenvolvimento de muitas doenças
crônicas e degenerativas, incluindo câncer, doenças cardíacas, Alzheimer, bem como
está envolvido no processo de envelhecimento. Esse estresse ocorre quando a
produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) está acelerada ou quando os
mecanismos envolvidos na neutralização de ERO’s encontram-se deteriorados.
Predisposição genética, fatores ambientais como radiação UV e propriedades
intrínsecas específicas de grupos celulares podem exacerbar o dano oxidativo ou
diminuir a capacidade das células de degradar estes agentes agressores (ROESLER et
al., 2007; VICENTINO et al., 2007).
As ERO são produzidas nas mitocôndrias, como subprodutos do metabolismo
normal durante a produção de energia. Elas exercem ações na tradução, na
- 10 -
transcrição gênica e na regulação da atividade da guanilato ciclase nas células
(VICENTINO et al., 2007).
As espécies reativas de oxigênio, tais como: radical hidroxila (•OH), ânion
radical superóxido (O2•–) e hidroperoxila (ROO•) causam danos ao DNA ou podem
oxidar lipídios e proteínas. Além disso, atacam as cadeias de ácidos graxos
poliinsaturados dos fosfolipídios e do colesterol, abstraindo um hidrogênio do grupo
metileno bis-alílico, iniciando um processo de peroxidação lipídica nas membranas
celulares (ANDRADE et al., 2007; SOUSA et al., 2007).
A peroxidação lipídica é a principal conseqüência do estresse oxidativo,
resultando na danificação das membranas causada pela oxidação, acarretando em
aumento da fluidez da membrana, comprometimento da sua integridade e inativação
da interação entre membrana/receptor e membrana/enzima (VICENTINO et al.,
2007).
Os radicais de carbono formados podem reagir com oxigênio originando
radicais peroxila, que por sua vez podem atacar novas cadeias de ácidos graxos
poliinsaturados, propagando a reação. O resultado deste processo é a oxidação de
várias moléculas de ácidos graxos. Os hidroperóxidos formados na peroxidação
lipídica têm vida curta e, quando reagem com metais, formam aldeídos (isto é,
malonaldeído, acroleína, crotonaldeído) e epóxidos, os quais são reativos e causam
danos ao DNA (SOUSA et al., 2007).
A produção de radicais livres é controlada nos seres vivos por diversos
compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena (por ex. superóxido
dismutase), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras fontes. Quando há
limitação na disponibilidade de antioxidantes, podem ocorrer lesões oxidativas de
caráter cumulativo. Os antioxidantes são capazes de estabilizar ou desativar os
radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas células (SOUSA et al.,
2007).
Antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação, através
de um ou mais mecanismos, tais como inibição de radicais livres e complexação de
metais. Eles podem ser sintéticos ou naturais e, para serem utilizados em alimentos,
devem ser seguros para a saúde. Alguns dos antioxidantes sintéticos mais
importantes são hidroxianisol de butila (BHA) e o hidroxitolueno de butila (BHT) e
- 11 -
entre os naturais destacam-se ácido ascórbico, vitamina E e β-caroteno (DUARTE-
ALMEIDA et al., 2006; ANDRADE et al., 2007).
Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural,
os compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos, sobretudo por
inibirem a peroxidação lipídica e a lipooxigenase in vitro. A atividade antioxidante
de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e
estrutura química (SOUSA et al., 2007).
No grande grupo dos compostos fenólicos, os flavonóides e os ácidos
fenólicos, são os que mais se destacam e são considerados os antioxidantes fenólicos
mais comuns de fontes naturais. Estas substâncias apresentam-se amplamente dis-
tribuídas no reino vegetal sendo, desta maneira, encontradas em todas as frutas e
outros vegetais (BROINIZI et al., 2007).
Diversas técnicas têm sido utilizadas para determinar a atividade antioxidante
in vitro, de forma a permitir uma rápida seleção de substâncias ou misturas
potencialmente interessantes na prevenção de doenças crônico-degenerativas. Dentre
estes métodos destacam-se o sistema de co-oxidação do β-caroteno/ácido linoléico e
o método de sequestro de radicais livres, DPPH• -2,2-difenil-1-picril hidrazil.
NO2
NO2O2N
N*N
DPPH
O método de oxidação do β-caroteno/ácido linoléico avalia a atividade de
inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoléico. O
método está fundamentado em medidas espectrofotométricas da descoloração
(oxidação) do β-caroteno, induzida pelos produtos de degradação oxidativa do ácido
linoléico (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).
Por sua vez, o método de radicais livres está baseado no descoramento de
uma solução composta por radicais estáveis DPPH•, de cor violeta, quando da adição
de substâncias que podem ceder um átomo de hidrogênio. O radical estável DPPH
tem sido amplamente utilizado para avaliar a capacidade de antioxidantes naturais
- 12 -
em sequestrar radicais livres. Entretanto, o primeiro método determina a atividade de
uma amostra ou composto de proteger um substrato lipídico da oxidação, enquanto
que o método de inibição de radicais DPPH• baseia-se na transferência de elétrons de
um composto antioxidante para um oxidante. Estas metodologias utilizam
quantidades significativas de reagentes, padrões e amostras, e apresentam limitações
em relação ao número de análises simultâneas que podem ser realizadas (DUARTE-
ALMEIDA et al., 2006; ROESLER et al., 2007).
Assim, neste estudo foi desenvolvido um método por CLAE-DAD para
obtenção de cromatogramas fingerprint, associado à análise quimiométrica para
investigar e demonstrar a variação dos componentes químicos entre os extratos
aquosos liofilizados das folhas de sete genótipos de L. gracilis provenientes de
diferentes locais (Sergipe e Bahia), estações do ano (verão e inverno) e diferentes
formas de cultivo (verão com e sem irrigação) e avaliar a atividade antioxidante dos
amostras dos extratos aquosos liofilizados.
- 14 -
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Família Verbenaceae
A família Verbenaceae J. St.-Hil ocorre em praticamente todos os
ecossistemas terrestres, compreendendo cerca de 100 gêneros e 2600 espécies
distribuídas em regiões tropicais e subtropicais principalmente nas zonas temperadas
do hemisfério sul (CAVALCANTI et al., 2010).
2.2 Gênero Lippia
O gênero Lippia inclui cerca de 200 espécies de ervas, arbustos e árvores
pequenas. Espécies deste gênero estão distribuídas por todos os países da América do
Sul e Central e pela África tropical e são comumente empregadas no tratamento de
doenças respiratórias, segundo alguns autores, devido ao fato de serem ricas em óleo
essencial (PASCUAL et al., 2001; MENDES et al., 2010).
Algumas espécies de Lippia demonstraram atividade antiviral, antimalárica e
citostática. Além disso, as folhas da maioria destas espécies são utilizadas como
tempero para as preparações alimentícias. Vale ressaltar a importância da espécie
Lippia dulcis Trev., no qual seu principal componente é mais de 1000 vezes mais
doce que a sacarose (PASCUAL et al., 2001).
A Lippia citriodora H.B.K. é explorada comercialmente na Europa para
produção de óleo essencial, conhecido como óleo de verbena, amplamente utilizado
em perfumaria. Além desta espécie, Lippia alba (Mill.) N.E. Br. também já foi
avaliada quanto ao seu potencial aromático, apresentando resultados interessantes em
termos do composto linalol, presente em elevadas concentrações no óleo essencial
(50,0-79,2%). O óleo essencial de L. alba também demonstrou potencial antioxidante
semelhante ao efeito da vitamina E (ROSSATO et al., 2006).
O gênero Lippia parece apresentar um perfil constante de composição
química, atividades farmacológicas e usos populares. No Brasil, o gênero está
- 15 -
representado por cerca de 120 espécies, com sua fragrância, em geral, forte e
agradável. Algumas espécies do gênero Lippia são caracterizadas pela presença de
óleos essenciais com atividade antimicrobiana com altos efeitos sobre vários
microorganismos devido à presença de monoterpenos fenólicos, timol e carvacrol.
Os componentes que foram encontrados com maior freqüência em óleos essenciais
de Lippia são: limoneno (1), β-cariofileno (2), γ- terpineno (3), p-cimeno (4), linalol
(5), timol (6), α-pineno (7) e cânfora (8) (MENDES et al., 2010; NETO et al., 2010).
H
H
(1) (2) (3) (4)
H3C CH3
OHH3C
OH
O
(5) (6) (7) (8)
Segundo Olivier et al. (2010) alguns iridóides glicosilados foram isolados a
partir do extrato metanólico de L. javanica e, consequentemente, foram consideradas
como marcadores quimiotaxonômicos para o gênero Lippia.
No trabalho desenvolvido por Shikanga et al. (2010) foi observada alta
atividade antioxidante dos chás de L. javanica e L. wilmsii, a qual foi atribuída ao
elevado nível de verbascosídeo (9) presente principalmente quando comparada a
baixa atividade antioxidante observada em L. scaberrima e L. rehmannii, que
apresentam menor quantidade deste metabólito.
- 16 -
HO
HOO
O
O
OOH
OH
O OH
OHCH3
HOHO
OH
(9)
A maioria dos estudos químicos de L. alba estão relacionados com a
composição do óleo essencial e pelo menos três quimiotipos têm sido propostos com
base na composição química volátil de suas folhas. Na parte aérea, foi encontrada a
presença de flavonóides, iridóides e feniletanóides glicosilados (FARIAS et al.,
2010).
Farias et al. (2010) isolaram duas novas saponinas, a lippiasaponina I (10) e
lippiasaponina II (11) das folhas de L. alba, conhecida popularmente como
“cidreira”. O chá das folhas de L. alba é amplamente utilizado como calmante na
medicina popular em todas as regiões do Brasil (TELES et al., 2012).
OH
HOH2C
O
O
OOHO
HOHO OH
OOH
O
HO
O
OHHO
OH3CO
OHHOO
O
OHHO
HOH3C
(10)
- 17 -
O
HO
O
OH
OH
HOH2C
O
O
OOHO
HOHO OH
O
OHHO
OH3CO
OHHOO
O
OHHO
HOH3C
(11)
As folhas e flores de L. sidoides Cham. constituem a parte medicinal desta
planta. Seu óleo essencial possui elevado valor comercial, tendo o timol (6) e o
carvacrol como constituintes principais, os quais apresentam propriedades
antisséptica, antimicrobiana, antifúngica, antioxidante, antiinflamatória e larvicida. O
chá desta espécie é também usado no tratamento de doenças da pele (ALMEIDA et
al., 2010).
Almeida et al. (2010) apresentam em seu trabalho o resultado obtido do
estudo fitoquímico do extrato etanólico dos talos, das raízes e das folhas da espécie
L. sidoides, descrevendo o isolamento e a identificação da naftoquinona
tecomaquinona (12), 4’,5,7-tri-hidroxiflavanona (13, naringenina), 3’,4’,5,7-tetra-
hidroxiflavanona (14) e 4’,5,7-tri-hidroxi-6-metoxiflavona (15), e da mistura de di-
hidrochalconas 2’-O-b-D-glicopiranosil-3,4,4’,6’-tetra-hidroxi-di-hidrochalcona (16)
e 2’-O-b-D-glicopiranosil-4,4’,6’-tri-hidroxi-di-hidrochalcona (17), além do β-
sitosterol e do carvacrol.
- 18 -
O
O
O
O
R2
OH
O
OOH
R1
HO
(14)2,3-di-hidro,R1= H,R2=OH
(13) 2,3-di-hidro, R1= R2= H
(15) 2,3, R1= OMe, R2= H A
(12)
OR1O
R1O
R1O
OR1
OR1
OO
R1O
R
OR1
(16) R=OH, R1=H
(17) R= R1= H
Hegde et al. (2004) isolaram e identificaram três novos compostos, 18, 19 e
20 do extrato metanólico aquoso de L. alva. Estes compostos mostraram ser
inibidores do receptor de quimiocinas CCR5, um dos principais co-receptores do
vírus tipo 1 da imunodeficiência humana (HIV-1), sendo importante na transmissão
viral.
OO
OH
H CH3
O
O
OH
H
H
OR
(18) R= CH3
(19) R= H
OCH3
CH3
O
O
OH
H HOO
OH
H
(20)
Das folhas de L. graveolens H.B.K., conhecida popularmente como orégano,
foram isolados e identificados do extrato metanólico 7 iridóides, o ácido
carioptosídico (21), lipiosídeo I (22), lipiosídeo II (23), loganina (24), ácido
loganínico (25), ácido 8-epi-loganínico (26) e carioptosídeo (27); e 3 secoiridóides
- 19 -
glicosilados, a secologanina (28), secoxiloganina (29) e dimetilsecologanosídeo (30)
(RASTRELLI et al., 1998).
O
COOH
O
HO
HOO
HOOH
OH
OR
(21)
(22)
R=H
R=
(23) R=
C
O
CH CH OH
OH
OH
CHCH
O
C
O
COOCH3
HO
O Glicose
O
COOH
HO
O Glicose
O
COOH
HO
O Glicose
O
COOCH3
HO
O GlicoseHO
(24) (25) (26) (27)
O
COOCH3
O Glicose
CHO
O
COOCH3
O Glicose
COOH
O
COOCH3
O Glicose
COOCH3
(28) (29) (30)
Costa et al. (2002) relataram o isolamento de vários constituintes químicos do
extrato etanólico das cascas e talos de L. sidoides, sendo eles: o acetato do ácido
oleanólico (31), metil-3,4-diidroxibenzoato (32), lapachenol (33), tecomaquinona
(12), tectoquinona (34), tectol (35), tectol acetilato (36), quercetina (37), luteolina
(38), glucoluteolina (39), lippisidoquinona (40), taxifolina (41) e isolariciresinol (42).
- 20 -
OCH3
O
HO
HO
OCH3
O
(31) (32) (33)
O
O
CH3
O
OH
OH
O
O
OAc
OAc
O
(34) (35) (36)
O
OH
OH
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
OH
C6H12O6O
O
(37) (38) (39)
O
OH
HO
OO
H
O
OH
OH
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
CH3O
OCH3
OH
(40) (41) (42)
Ono et al. (2005) isolaram do extrato metanólico das partes aéreas L. dulcis
Trev. dois novos sesquiterpenos, a lippidulcina A (43) e epilippidulcina A (44);
- 21 -
juntamente com cinco flavonóides, a cirsimaritina (45), salvigenina (46), eupatorina
(47), 5-hidroxi-6,7,3’,4’-metoxi flavona (48) e 5,3’-hidroxi-6,7,4’,5’-metoxi flavona
(49); três feniletanóides glicosilados, o decaffeoylverbascosídeo (50), acteosídeo (9)
e isoacteosídeo (51); e dois iridóides glicosilados, a 8-epiloganina (52) e lamiídeo
(53).
O OHOH
H
βO OH
OH
H
α
O
OOH
H3CO
H3CO
OH
(43) (44) (45)
O
OOH
H3CO
H3CO
OCH3
O
OOH
H3CO
H3CO
OCH3
OH
(46) (47)
O
OOH
H3CO
H3CO
OCH3
OCH3
O
OOH
H3CO
H3CO
OCH3
OCH3
OH
(48) (49)
O
OHOHHO
CH3
O
OH
OH
HO
OOH
OH
O
O
OHOHHO
CH3
OH
OH
OO
O
OH
HO
O
O
HO
HO
(50) (51)
- 22 -
HO
O
HO
HO
OH
O
COOCH3H
HO
HO
H
HO
O
HO
HO
OH
O
COOCH3OH
HO
HO
HO
(52) (53)
A flavona salvigenina (46) também já havia sido isolada por Kanko et al.
(2004) do extrato etanólico das folhas secas de L. multiflora Moldenke. Os
feniletanóides glicosilados acteosídeo (9) e isoacteosídeo (51) também já haviam
sido isolados por Abe et al. (2002) do extrato metanólico das partes aéreas de L.
dulcis e L. canescens Kunth., enquanto que o decaffeoylverbascosídeo (50) também
foi isolado das folhas frescas de L. alba por Barbosa et al. (2006).
Do óleo essencial das folhas frescas de L. alba, além do
decaffeoylverbascosídeo (50), foram isolados também o isonuomiosídeo (54) e a
shanzhida (55) (BARBOSA et al., 2006).
H
OH
H
OH
OH
O
HO
HO O
H
OHO
O
H
OH
O
OH
OH
O
H
OHO
OHOH
H
HO
O
HO H
HO
CO2CH3
O
(54) (55)
Do extrato etanólico das folhas secas de L. multiflora, Kanko et al. (2004)
isolaram a salvigenina (46), o ácido ursólico (56) e o n-tritriacontano (57).
H3C CH3
HO
CH3 CH3 COOH
H3C
CH3
(56) (57)
CH3 - (CH2)31 - CH3
- 23 -
Do caule de L. graveolens foi isolado uma nova flavanona, a (-)(2S)
5,6,7,3’,5’-pentahidroxiflavanona-7-O-β-D-glicopiranosídeo (58), apresentando
atividades antiinflamatória e citotóxica relativamente baixas (GUËRECA et al.,
2010).
O
HO
O
OH O
OH
OH
O
HO OH
OH
HO
(58)
Em seu trabalho, Olivier et al. (2010) citaram o isolamento a partir do extrato
metanólico das partes aéreas de L. javanica dos iridóides glicosilados, verbascosídeo
(9) e isoverbascosídeo (51).
Do extrato metanólico das partes aéreas de L. dulcis e L. canescens, Abe et
al. (2002) isolaram três flavonóides: 6-hidroxiluteolina (59), eupafolina (60) e
desmetoxicentaureidina (61); três sesquiterpenos do tipo bisabolano, (+)-
hernandulcina (62), (-)-epihernandulcina (63) e (1)-anymol (64); quatro
feniletanóides glicosilados, acteosídeo (9), isoacteosídeo (51), martynosídeo (65) e
diacetylmartynosídeo (66). Os flavonóides eupafolina (60) e a
desmetoxicentaureidina (61) mostraram forte atividade inibitória contra o
crescimento de células de carcinoma de útero humano.
O
OH
OH
OH
HO
O
HO
O
OH
OH
OH
HO
O
CH3O
O
OH
OCH3
OH
HO
O
CH3O
(59) (60) (61)
- 24 -
RO OH
HO
CH3O
O
O
O
OH
OHO
O
OCH3
OH
O
OHOH
CH3
HO
(62) R= β-H (65) (63) R= α-H (64) R= β-H, 1- deoxo
HO
CH3O
O
O
O
OH
OHO
O
OCH3
OH
O
OCOCH3CH3OCO
CH3
HO
(66)
Maldonado et al. (2010) isolaram das partes aéreas de L. mexicana Grieve
três novos triterpenos: lippiolídeo (67), ácido lippiolidólico (68) e ácido lippiólico
(69).
O O
H
O
HOH
H
H
HO
O O
O
H
H
H
H
HO
O
H
H
H
H
OHβ
(67) (68) (69)
Rimpler et al. (1986) isolaram do extrato etanólico das folhas e raízes de L.
javanica e L. turbinata Griseb. iridóides glicosilados: thevesídeo de sódio (70) e
theviridosídeo (71).
- 25 -
OHO
OH
CH2OHOH
O
COONa
HOH2C
OH
HO
OHO
OH
CH2OHOH
O
COOCH3
HOH2C
OH
HO
(70) (71)
2.3 Espécie Lippia gracilis Schauer
Lippia gracilis Schauer é uma planta típica do nordeste brasileiro, encontrada
nos estados da Bahia, Sergipe e Piauí. No sertão nordestino, encontra-se a uma
altitude de 450 m, sendo popularmente conhecida como cidreira da serra. No
Agreste, encontra-se a uma altitude de 960 m, sendo conhecida popularmente como
alecrim-da-chapada ou alecrim-de-tabuleiro (MENDES et al., 2010; NEVES et al.,
2008)
A estrutura vegetativa podeser descrita como um arbusto ramificado com
folhas aromáticas e altura variando de 1,2 a 3,0 m (Figura 2). A planta possui grande
resistência à seca e altas temperaturas somente perdendo as folhas após um longo
período de estiagem (OLIVEIRA et al., 2008).
Figura 2. Foto da espécie L. gracilis Foto: Silvana V. F. Gomes
As folhas de L. gracilis são utilizadas para infecções de garganta, doenças
cutâneas, úlceras, afecções na vagina, acne, caspa, queimaduras, feridas, sinusite,
- 26 -
bronquite, congestão nasal, dor de cabeça, icterícia e paralisia pelas comunidades
tradicionais da Caatinga, região semi-árida do nordeste brasileiro. Há registros
também de seu uso externo para tratar doenças da pele, queimaduras, feridas e
úlceras. O óleo essencial da espécie apresenta atividade antimicrobiana e contém
como componentes principais os seguintes compostos: carvacrol, o-cimeno, γ-
terpineno (3) e β-cariofileno (2) (GOMES et al., 2010; MENDES et al., 2010;
MENDES et al., 2010; GUILHON et al., 2011).
NETO et al. (2010) demostraram em estudo in vitro, que a solução a 5% (v/v)
do óleo essencial das folhas de L. gracilis apresentou atividade antibacteriana para
Staphylococcus aureus isolado de úlcera infectada de paciente diabético.
GUILHON et al. (2011) avaliaram a possível participação dos opióides,
colinérgicos, e sistemas de óxido nítrico no efeito antinociceptivo do óleo essencial
de Lippia gracilis, e mostraram como resultado que o mesmo produz um efeito
antinociceptivo que poderia ser potencialmente mediado por receptores colinérgicos
via óxido nítrico. Os dados também sugerem que a atividade anti-inflamatória
causada pela exposição do óleo essencial ocorre através da inibição do óxido nítrico
e da produção de PGE2.
2.3.1 Classificação taxonômica
A espécie L. gracilis apresenta a seguinte classificação taxonômica mostrada
na Tabela 1.
- 27 -
Tabela 1. Classificação taxonômica da espécie L. gracilis
CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA REFERÊNCIA
CLASSE Equisetopsida a
SUBCLASSE Magnoliidae a
SUPERORDEM Asteranae a
ORDEM Lamiales a, b
FAMÍLIA Verbenaceae a, c
SUBFAMÍLIA Euverbeneae d
GÊNERO Lippia a, c
ESPÉCIE gracilis a, c
Fonte: a www.tropicos.org, bBARBOSA et al., (2006), cMENDES et al., (2010), d http://florabrasiliensis.cria.org.br/search?taxon_id= 16380.
- 29 -
3. OBJETIVOS
3.1. Geral
� Investigar diferenças químicas em amostras de genótipos de Lippia gracilis a
partir de perfil cromatográfico por CLAE-DAD associados à análise
quimiométrica e avaliar a atividade antioxidante da espécie.
3.2. Específicos
� Estabelecer o perfil cromatográfico por CLAE-DAD dos chás das folhas de sete
genótipos de Lippia gracilis Schauer provenientes de diferentes locais (Sergipe e
Bahia), estações (verão e inverno) e formas de cultivo (verão com e sem
irrigação);
� Submeter os cromatogramas fingerprint às análises quimiométricas;
� Submeter os extratos aquosos lifilizados a ensaios de atividade antioxidante;
� Verificar a relação entre a atividade antioxidante e as análises cromatográficas e
quimiométricas realizadas;
� Investigar a influência da irrigação e época de coleta sobre o perfil
cromatográfico e a atividade antioxidante;
- 31 -
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1 Material botânico: coleta e armazenamento
Amostras de sete genótipos (106-110, 201 e 202) de L. gracilis foram
coletados nos municípios de Tomar do Geru (Estado de Sergipe) e Rio Real (Estado
da Bahia), sendo posteriormente cultivados no Campus Experimental da
Universidade Federal de Sergipe, sob a supervisão do Prof. Dr. Arie Fitzgerald Blank
do Laboratório de Culturas de Tecidos Vegetais e Melhoramento Vegetal do
Departamento de Engenharia Agronômica (DEA).
As folhas dos sete genótipos de L. gracilis foram coletadas no dia 21 de julho
de 2009 (Inverno) e no dia 26 de janeiro de 2010 (verão com e sem irrigação) no
Campus Experimental da Universidade Federal de Sergipe (UFS). A Tabela 2
mostra informações sobre estes genótipos, os quais tiveram suas exsicatas
depositadas no Herbário da UFS.
Tabela 2. Dados dos genótipos da espécie L. gracilis
Código Local de origem Dados geográficos No Voucher
Herbário UFS
LGRA-106 Tomar do Geru – SE 11° 19' 16,7'' S; 37° 55' 09,2'' W
14733
LGRA-107 Tomar do Geru – SE 11° 19' 20,1" S; 37° 55' 13,5" W
14737
LGRA-108 Tomar do Geru – SE 11° 19' 22,4" S; 37° 55' 12,6" W
14734
LGRA-109 Tomar do Geru – SE 11° 19' 20,7" S; 37° 55' 16,9" W
14735
LGRA-110 Tomar do Geru – SE 11° 19' 21,1" S; 37° 55' 14,9" W
14732
LGRA-201 Rio Real – BA 11° 23' 38,7" S; 38° 00' 54,1" W
14736
LGRA-202 Rio Real – BA 11° 23' 45,3" S; 38° 00' 51,3" W
14731
Após a coleta, a secagem das folhas foi feita por 5 dias em estufa de
circulação forçada a 40°C e acondicionadas em um frasco de vidro com tampa
rosqueável (Figura 3).
- 32 -
Figura 3. Folhas secas dos sete genótipos de L. gracilis dos três cultivos (inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação). Foto: Vilma M. J. Prado
4.2 Equipamentos, Materiais e Reagentes
� Estufa - modelo Marconi ML35 de circulação forçada.
� Balança analítica - modelo APX-200 da marca Denver Instrumet
Company.
� Microondas - modelo ME28S da marca Electrolux.
� Freezer - modelo FFE24 da marca Electrolux.
� Liofilizador - modelo L101 da marca Líotop.
� Membrana filtrante - marca MFS de nylon de 47 mm (diâmetro da
membrana) e 0,45 µm (diâmetro do poro).
� Solventes - acetonitrila (Tedia, Fairfield, OH, USA) e metanol (Tedia,
Fairfield, OH, USA) de pureza analítica e grau CLAE. Ácido fórmico
88% (v/v) (JT. Baker, Philipsburg, PA, EUA) de grau analítico. 2,2-
difenil-1-picril hidrazila (DPPH) Sigma de grau analítico. Metanol
(Impex, Labimpex, Brasil) grau analítico. Ácido gálico (Merck,
Brasil).
� Água deionizada - MILLI-Q (Millipore, São Paulo, SP, Brasil).
� Colunas Cromatográficas: coluna C18 LUNA® (5 µm, 25,0 x 0,46 cm,
Phenomenex) acoplada a uma coluna guarda e coluna hexil-fenil
LUNA® (10 µm, 15,0 x 0,46 cm, Phenomenex).
� Espectrofotômetro UV-VIS, bioespectro modelo SP-22.
- 33 -
4.3 Sistema de cromatografia líquida de alta eficiência
Cromatógrafo a líquido da marca SHIMADZU (Quioto, Japão), modelo
Prominence, composto de duas bombas LC-6A, degaseificador DGU-20A3, auto
injetor SIL-10A, detector UV com arranjo de diodos SPD-M20Avp conectado a uma
interface CBM 20A. O equipamento foi gerenciado pelo software LC Solution.
Aparelho pertencente ao Departamento de Química da UFS.
4.4 Preparação dos Chás
O Chá de cada genótipo de L. gracilis (106-110, 201 e 202- dos três cultivos:
inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação) foi obtido pelo método de
infusão, adicionando-se a 200 mL de água destilada a uma temperatura de 94°C 2 g
das folhas. Em seguida, o chá foi deixado em repouso por 10 minutos, procedendo-
se, logo após, uma filtração e congelamento, para serem posteriormente liofilizados
por 24 hs (cada 100 mL de chá) sob as seguintes condições: temperatura -54°C e
pressão 79 µHg.
4.5 Condições cromatográficas de análise dos extratos aquosos liofilizados de L.
gracilis
Para as análises por cromatografia líquida de alta eficiência, 15 mg de cada
um dos extratos aquosos liofilizados foram dissolvidos em 1 mL da solução aquosa
de ácido fórmico 0,5% (v/v), obtendo uma solução com concentração de 15 mg/mL.
Foi utilizada uma coluna de fase estacionária C18 LUNA ® (5 µm, 25,0 x 0,46 cm,
Phenomenex) acoplada a uma coluna guarda de mesma fase e acompanhamento da
eluição por DAD em λ= 254 nm.
As amostras foram analisadas utilizando um sistema de eluição gradiente em
modo reverso, com fase móvel constituída por MeOH (B) e solução de ácido fórmico
0,5% (v/v) (A), com a seguinte inclinação: 5% a 28% (B) em 14 min, 28% a 35% (B)
- 34 -
em 28 min, 35% a 46% (B) em 33 min, 46% a 80% (B) em 20 min, 80% a 100% (B)
em 15 min e mantida isocrático em 100% (B) por 15 min. Ao término da corrida
cromatográfica foi feito um gradiente de volta de 100% a 5% em 35 min e o tempo
de espera para o recondicionamento da coluna foi de 75 min. A vazão da fase móvel
foi de 1 mL/min e em cada análise foram injetados 25 µL da solução, sendo que cada
uma das 21 amostras foi analisada em quadruplicata.
4.6 Análise quimiométrica
As análises quimiométricas foram realizadas pelo Prof. Dr. Edenir Rodrigues
Pereira Filho, da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), empregando o
software PIROUETTE®, versão 4.0 (Informetrix). Antes, porém, foi necessário o
pré-tratamento (alinhamento dos picos) utilizando o algoritmo “Correlation
Optimised Warping” (COW) (SKOV, et al., 2006) e pré-processamento dos dados
originais que foram centrados na média.
4.7 Avaliação da atividade antioxidante
4.7.1 Avaliação quantitativa da atividade antioxidante
A avaliação quantitativa da atividade antioxidante foi feita seguindo a
metodologia descrita na literatura, com pequenas modificações, monitorando-se o
consumo do radical livre DPPH pelas amostras, através da medida do decréscimo da
absorbância de soluções de diferentes concentrações (BRAND-WILLIAMS et al.,
1995). Este ensaio quantitativo foi realizado em espectrofotômetro UV-Vis com
comprimento de onda 515 nm, utilizando como controle positivo o ácido gálico.
- 35 -
4.7.1.1 Curva de calibração do DPPH
Inicialmente preparou-se 75 mL de solução estoque de DPPH em metanol, na
concentração de 40 µg/mL, que foi mantida sob refrigeração e protegida da luz.
Foram feitas diluições para obtenção das concentrações finais de 5, 10, 15, 20, 25 e
30 µg/mL. A curva de calibração foi construída a partir dos valores da absorbância a
515 nm com todas as soluções medidas em cubetas de vidro, com percurso óptico de
1 cm e tendo como “branco” o metanol. As medidas de absorbância foram efetuadas
em triplicata e em intervalos de 1 min entre cada leitura.
4.7.1.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras
As soluções dos extratos aquosos liofilizados de todas as amostras de L.
gracilis foram diluídas nas concentrações de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 µg/mL. As
medidas das absorbâncias das misturas foram feitas a 515 nm, no 1º, 5º, 10º min e a
cada 10 min até completar 60 min (SOUSA, et al., 2007). A mistura de metanol e
amostra foi utilizada como branco. A partir da equação da curva de calibração e dos
valores de absorbância no tempo de 60 min para cada concentração testada, foram
determinados os percentuais de DPPH remanescentes, calculados de acordo com
Brand-Williams et al. (1995), conforme a equação:
%DPPHREM = [DPPH]T/[DPPH]T0 x100
onde [DPPH]T corresponde à concentração de DPPH no meio reacional, após
a reação com a amostra e [DPPH]T0 é a concentração inicial de DPPH. A quantidade
de antioxidante necessária para decrescer a concentração inicial de DPPH em 50%
(IC50) foi calculada plotando-se o %DPPHREM no tempo de 60 min em oposição às
concentrações das amostras. Os resultados foram expressos em µg/mL ± desvio
padrão. Quanto maior o consumo de DPPH por amostra, menor será o seu CI50 e
maior será sua atividade antioxidante.
As absorbâncias nas concentrações testadas (30 µg/mL) no tempo de 60 min
foram convertidas em percentual de inibição (IP).
- 36 -
A atividade antioxidante foi também expressa pelo índice de atividade
antioxidante (IAA), calculado de acordo com Scherer e Godoy (2009), conforme a
equação: IAA = %DPPHREM (Final) (µg/mL)/IC50 (µg/mL). Deste modo, o IAA foi
calculado considerando a massa de DPPH e a massa das amostras testadas na reação,
resultando uma constante para cada amostra, independente das concentrações do
DPPH e amostras usadas. A atividade antioxidante é considerada insatisfatória
quando o valor do IAA for inferior a 0,5; moderada quando o IAA estiver entre 0,5 e
1,0; forte quando o IAA estiver entre 1,0 e 2,0; e muito forte quando o valor do IAA
for superior a 2,0.
4.7.2 Análise estatística
Os resultados da atividade antioxidante estão apresentados como média ±
desvio padrão da média (triplicata). A avaliação estatística dos dados foi realizada
usando a análise de variância (ANOVA) para múltiplas comparações, seguida do
teste de Tukey. Valores de p menores que 0,05 foram considerados significativos.
O ensaio de atividade antioxidante foi realizado no Laboratório de
Bioquímica e Produtos Naturais do Departamento de Fisiologia DFS/UFS em
colaboração com o Professor Dr. Charles dos Santos Estevam.
- 38 -
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis
A Tabela 3 apresenta as massas obtidas dos extratos aquosos liofilizados dos
sete genótipos de L. gracilis nos três cultivos (inverno, verão com irrigação e verão
sem irrigação).
Tabela 3. Rendimento dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis
Genótipo
Massa (mg) (Coleta inverno)
Massa (mg) (Coleta verão com irrigação)
Massa (mg) (Coleta verão sem irrigação)
106 347,4 422,8 501,7 107 352,6 355,1 482,2 108 313,4 349,1 516,6 109 394,4 425,8 515,6 110 333,3 468,3 527,9 201 469,5 410,7 589,8 202 504,4 411,4 467,0
Na Tabela 3 é interessante observar um rendimento maior dos extratos
aquosos dos genótipos coletados no inverno proveniente da Bahia (201 e 202) em
relação aos demais da mesma coleta. Além disso, os extratos aquosos dos genótipos
coletados no verão e cultivados sem irrigação apresentaram, em sua maioria, massas
superiores aos seus respectivos de outras coletas.
A variação no conteúdo de metabólitos secundários presentes em um material
vegetal pode advir de vários fatores, tais como: sazonalidade, temperatura, altitude,
disponibilidade hídrica, radiação ultravioleta, composição atmosférica e invasão por
patógenos (GOBBO N. E LOPES, 2007). Desta forma, pode-se supor que a variação
no rendimento dos extratos aquosos liofilizados entre as amostras ocorreu devido ao
fato de serem genótipos provenientes de duas localidades diferentes, de terem sido
coletadas em diferentes estações do ano (inverno e verão) e de apresentarem
diferentes formas de cultivo (verão com e sem irrigação).
- 39 -
5.2 Otimização das condições cromatográficas de análise por CLAE-DAD dos
extratos aquosos liofilizados de L. gracilis
Segundo Snyder (1997), ao iniciar a análise de uma amostra desconhecida é
recomendável realizar uma análise cromatográfica utilizando gradiente exploratório
linear de 5 a 100% de ACN:H2O em 60 min em uma coluna de fase estacionária C18
e uma vazão de 2 mL/min.
A partir desta primeira análise, para posterior otimização das condições
cromatográficas, foram avaliados os seguintes fatores: natureza do modificador
orgânico (acetonitrila ou metanol), fase estacionária (C18 ou hexil-fenil) e vazão da
fase móvel de 1 ou 2 mL/min (Tabela 4). As colunas de fases estacionárias C18 e
hexil-fenil foram escolhidas para a otimização do método analítico por estarem
disponíveis em nosso laboratório. No entanto, a escolha não foi aleatória, pois sabe-
se que para promover a separação dos tipos de compostos provavelmente presentes
em nossas amostras (compostos fenólicos) estas colunas são consideradas adequadas.
A coluna de fase estacionária quimicamente ligada ao grupo octadecilsilano (C18) é
amplamente utilizada quando se deseja avaliar uma amostra vegetal desconhecida.
Por ser apolar, seu modo de separação baseia-se nas interações hidrofóbicas de suas
cadeias hidrocarbônicas com a parte apolar do soluto a ser analisado. Por outro lado,
considerando “seu potencial de seletividade cromatográfica diferenciada”, as colunas
de fase estacionária hexil-fenil têm se popularizado. Seu modo de separação baseia-
se nas interações do tipo π-π, o que as tornam mais seletivas para análises de
amostras contendo compostos aromáticos (MARTINS, 2008; MALDANER et al.,
2010).
- 40 -
Tabela 4. Variações analíticas de gradiente exploratório para otimização das condições cromatográficas de separação da amostra 108 inv
Análise Fase Movél Fase Estacionária
Vazão (mL/min)
1 ACN:H2O C18 2,0 2 MeOH:H2O C18 2,0 3 ACN:H2O Hexil-Fenil 2,0 4 MeOH:H2O Hexil-Fenil 2,0 5 ACN:H2O C18 1,0 6 MeOH:H2O C18 1,0 7 ACN:H2O Hexil-Fenil 1,0 8 MeOH:H2O Hexil-Fenil 1,0
O extrato aquoso do genótipo 108 (coleta de inverno) foi utilizado para estas
otimizações cromatográficas, pois estava disponível uma maior quantidade de suas
folhas.
Para selecionar o comprimento de onda capaz de detectar o maior número de
bandas cromatográficas, foram registrados cromatogramas em 200, 230, 254, 280,
300, 320 e 360 nm. A seleção destes comprimentos de onda foi baseada nos tipos de
compostos provavelmente presentes nos extratos polares desta espécie (vide item 2:
REVISÃO DA LITERATURA), os quais podem apresentar máximos de absorção,
no espectro ultravioleta entre os valores 214 a 380 nm (OLIVIER et al., 2010;
HEGDE et al., 2004). Os cromatogramas oriundos das análises relacionadas na
Tabela 4 encontram-se na Figura 4.
0 10 20 30 40 50 60 70
0
200
400
600
800
1000
1200
360nm 320nm
300nm
280nm
254nm
230nm
200nm
mA
U
Tempo (min)
v
0 10 20 30 40 50 60 700
1000
2000
3000
4000
360nm 320nm 300nm
280nm 254nm
230nm
200nm
mA
U
Tempo (min)
V
1 2
- 41 -
0 10 20 30 40 50 60 700
1000
2000
3000
4000
360nm 320nm 300nm
280nm 254nm
230nm 200nm
mA
U
Tempo (min)
V
0 10 20 30 40 50 60 700
500
1000
1500
2000
360nm 320nm 300nm
280nm 254nm
230nm
200nm
mA
U
Tempo (min)
V
Figura 4. Cromatogramas do extrato aquoso liofilizado do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis obtidos segundo as condições apresentadas na Tabela 4.
Analisando os cromatogramas da Figura 4, é possível propor que o uso da
acetonitrila como modificador orgânico na fase móvel seria o mais adequado para a
análise dos chás, pois, nos cromatogramas gerados pelas condições 1, 5 e 7, foi
0 10 20 30 40 50 60 700
500
1000
1500
2000
360nm 320nm 300nm 280nm 254nm
230nm 200nm
mA
U
Tempo (min)
V
0 10 20 30 40 50 60 700
500
1000
1500
2000
2500
360nm 320nm 300nm 280nm 254nm
230nm
200nm
mA
U
Tempo (min)
V
0 10 20 30 40 50 60 700
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
360nm 320nm 300nm 280nm 254nm
230nm
200nm
mA
U
Tempo (min)
V
0 10 20 30 40 50 60 700
200
400
600
800
1000
1200
1400
360nm 320nm 300nm 280nm
254nm
230nm
200nmm
AU
Tempo (min)
V
3 4
5 6
7
8
- 42 -
possível a detecção de um maior número de bandas cromatográficas com maior
intensidade quando comparados as demais condições. Além disso, utilizando uma
vazão de 1 mL/min para a fase móvel, coluna C18 e acetonitrila como modificador
orgânico (condição 5), pôde-se obter um cromatograma com melhor retenção e
separação entre as bandas cromatográficas quando comparado àqueles obtidos pelas
condições 1 e 7.
Com a condição preliminar selecionada, condição 5, foi possível iniciar o
estudo da influência de parâmetros do gradiente a ser utilizado, tais como as
concentrações inicial e final do modificador orgânico, inclinação (∆%B/min) e tempo
de análise objetivando a separação das bandas cromatográficas.
O levantamento bibliográfico evidenciou ser comum a presença de
flavonóides glicosilados, iridóides glicosilados e diversos outros compostos fenólicos
em extratos e chás de espécies do gênero Lippia (vide item 2. Revisão da literatura).
Sabendo-se que estes compostos em solução aquosa podem estar parcial ou
totalmente ionizados, torna-se importante suprimir esta ionização, ajustando-se o
valor do pH da fase móvel com a adição de ácido fraco (MARTINS, 2008).
Sendo assim, segundo Gomes et al. (2010) também foi testada a mudança da
água pura da fase móvel para uma solução de ácido fórmico (HCOOH) a 0,5% (v/v),
utilizando inicialmente as condições de gradiente exploratório linear [5-100% (B) em
60 min] nas duas colunas disponíveis (C18 e hexil-fenil) em dois modificadores
orgânicos (ACN e MeOH) (condições 5, 7, 9 e 10, Tabela 5). As diferentes
condições testadas estão relacionadas na Tabela 5 e os seus respectivos
cromatogramas apresentados na Figura 5.
- 43 -
Tabela 5. Condições cromatográficas de análise para obtenção do perfil cromatográfico, utilizando vazão de 1 mL/min e volume de injeção de 25 µL.
Análise Eluição Gradiente (B)
Fase Móvel Fase Estacionária
∆∆∆∆%B/ min
λ (nm)
1
1) 5%-40%- 25min; 2) 40%-75%- 35min
ACN:H2O
C18
1) 1,4 2) 1,0
200
2
1) 5%-25% - 5min 2) 25%- 55% - 50min; 3) 55%-75% - 15min
ACN:H2O
C18
1) 4,0 2) 0,6 3) 1,3
200
3 1) 15%-40% - 50min; 2) 40%- 60% - 20min
ACN:H2O
C18
1) 0,5 2) 1,0
200
4
1) 25-45% - 50min; 2) 45%- 75% - 10min
ACN:H2O
C18
1) 0,4 2) 3,0
200
5 5 – 100% - 60 min ACN:HCOOH (0,5%) C18 1,58 254 6 5-65%- 60min ACN:HCOOH (0,5%) C18 1,0 254 7 5 – 100% - 60 min MeOH:HCOOH (0,5%) C18 1,58 254 8
1) 5-30% - 15min; 2) 30-85% - 55min
MeOH:HCOOH (0,5%) C18 1) 1,6 2) 1,0
254
9 5 – 100% - 60 min ACN:HCOOH (0,5%) Hexil-Fenil 1,58 254 10 5 – 100% - 60 min MeOH:HCOOH (0,5%) Hexil-Fenil 1,58 254
11
1) 5%-20% - 10min; 2) 20%-50% - 50min; 3) 50-75% - 10min
ACN:HCOOH (0,5%)
C18
1) 1,5 2) 0,6 3) 2,5
254
12
1) 5%-20% - 6min; 2) 20%-40% - 50min; 3) 40-70% - 15min
ACN:HCOOH (0,5%)
C18
1) 2,5 2) 0,4 3) 2,0
254
13
1) 20%-40% - 50min; 2) 40-70% - 20min
ACN:HCOOH (0,5%)
C18
1) 0,4 2) 1,5
254
14 5%-65% - 60min MeOH:HCOOH (0,5%) C18 1,0 254
15 1) 5%-30% - 10min; 2) 30%-85% - 55min;
MeOH:HCOOH (0,5%)
C18
1) 2,5 2) 1,0
254
16
1) 8%-30% - 10min; 2) 30%-65% - 60min;
3) 65-75% - 5min
MeOH:HCOOH (0,5%)
C18
1) 2,2 2) 0,58 3) 2,0
254
17
1) 8%-30% - 10min; 2) 30%-60% - 65min;
3) 60-75% - 5min
MeOH:HCOOH (0,5%)
C18
1) 2,2 2) 0,46 3) 3,0
254
18
1) 5%-25% - 15min; 2) 25%-45% - 65min; 3) 45-75% - 12min
MeOH:HCOOH (0,5%)
C18
1) 1,33 2) 0,31 3) 2,5
254
19
1) 5%-28% - 13min; 2) 28%-35% - 24min; 3) 35%-46% - 33min 4) 46-75% - 15min
MeOH:HCOOH (0,5%)
C18
1) 1,77 2) 0,29 3) 0,33 4) 1,93
254
20
1) 5%-28% - 14min; 2) 28%-35% - 28min; 3) 35%-46% - 33min 4) 46-80% - 20min 5) 80-100% - 15min
MeOH:HCOOH (0,5%)
C18
1) 1,64 2) 0,25 3) 0,33 4) 1,7 5) 1,33
254
- 44 -
0 10 20 30 40 50 60 70
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80
0
500
1000
1500
2000
2500
mA
U
Abs
orbâ
ncia
Tempo (min)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Tempo (min)
mA
U
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
1000
2000
3000
4000
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80
0
50
100
150
200
250
300
350
Tempo (min)
mA
U
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
100
200
300
400
500
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Tempo (min)
mA
U
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
50
100
150
200
250
mA
U
Tempo (min)
1 2
3 4
5 6
7 8
- 45 -
0 20 40 60 80
0
50
100
150
200
250
300
Tempo (min)
mA
U
0 20 40 60 80
0
50
100
150
200
250
300
mA
U
Tempo (min)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
100
200
300
400
500
600
700
mA
U
Tempo (min)
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
50
100
150
200
250
300
350
Tempo (min)
mA
U
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
100
200
300
400
500
mA
U
Tempo (min)0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
100
200
300
400
500
Tempo (min)
mA
U
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
200
400
600
800
1000
mA
U
Tempo (min)0 20 40 60 80
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Tempo (min)
mA
U
9 10
11 12
13 14
15 16
- 46 -
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
120
140
160
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tempo (min)
mA
U
0 20 40 60 80
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tempo (min)
mA
U
Figura 5. Cromatogramas obtidos pelas condições de análise testadas apresentadas na Tabela 5.
Um cromatograma fingerprint caracteriza-se por apresentar um perfil
cromatográfico, no qual se observa um maior número de bandas possíveis com boa
resolução e simetria e estabilidade da linha de base em um tempo de análise razoável.
O processo de otimização das condições analíticas para obtenção do
cromatograma fingerprint nem sempre é trivial, pois o que se tem neste caso,
geralmente, é um extrato muito complexo, dificultando a separação de todos os
constituintes químicos em uma única corrida (ZHOU et al. 2009). Assim, após várias
etapas de otimização das condições analíticas, o melhor cromatograma fingerprint foi
obtido com a condição 20 (Tabela 5): coluna de fase estacionária C18 LUNA® (5
µm, 25,0 x 0,46 cm, Phenomenex), acoplada a uma coluna guarda; vazão 1 mL/min;
volume de injeção 25 µL; eluição gradiente no modo reverso: 5-28% de MeOH por
14 min (∆%B/min = 1,64); 28-35% de MeOH por 28 min (∆%B/min = 0,25); 35-
46% de MeOH por 33 min (∆%B/min = 0,33); 46-80% de MeOH por 20 min
(∆%B/min = 1,7); 80-100% de MeOH por 15 min (∆%B/min = 1,33); isocrático em
100% de MeOH por 15 min; 100-5% de MeOH por 35 min (retorno do gradiente) e
17 18
19 20
- 47 -
5% de MeOH por 75 min (condicionamento da coluna). A Figura 6 mostra o
cromatograma obtido nesta condição e os espectros de absorção no UV das bandas
assinalas com os números 1 a 5.
0 20 40 60 80 100 120
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
54
3
2
1
mA
U
Tempo (min)
200 250 nm
0
250
500
750
1000mAU
204
234
200 250 nm
0
250
500
750
1000
mAU
204
238
200 250 nm
-50
0
50
100
150
mAU24
2
222
200 250 nm
0
500
1000
1500
mAU
207
267
256
291
200 250 nm
0
500
1000
mAU
206
269
257
Figura 6. Análise Cromatográfica (λ= 254 nm) do extrato aquoso das folhas secas do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis obtido com a condição 20 (Tabela 5). Espectros de absorção no UV das bandas cromatográficas assinaladas com os números de 1 a 5.
1 2 3
5 4
- 48 -
Após estas análises, fez-se a seleção do comprimento de onda apropriado a
ser usado nas análises de todas as demais amostras, de forma a obter a detecção de
um maior número de bandas cromatográficas através da projeção tridimensional
(comprimento de onda x absorbância x tempo de retenção) obtida por CLAE-DAD
do chá do genótipo 108 (inverno) (Figura 7). Assim, o comprimento de onda
selecionado foi 254 nm, o qual abrangeu um maior número de bandas detectáveis.
Figura 7. Cromatograma 3D obtido por CLAE-DAD do extrato aquoso do genótipo 108 (inverno) de L. gracilis.
5.3 Aplicação da condição cromatográfica na análise de diferentes genótipos de
L. gracilis
Após a otimização do gradiente no qual se obteve a melhor condição
cromatográfica para separação dos compostos químicos presentes no extrato aquoso
do genótipo 108 (inverno) (vide item 5.2), foi realizada a análise cromatográfica nas
mesmas condições com os extratos das 21 amostras obtidas de L. gracilis [sete
genótipos (106-110, 201 e 202) das três coletas: inverno, verão com irrigação e verão
sem irrigação]. Os cromatogramas podem ser visualizados na Figura 8.
- 49 -
0 20 40 60 80 100 120
0
100
200
300
400
500
600
mA
UGen 202
Gen 201
Gen 110
Gen 109
Gen 108
Gen 106
Gen 107
Amostras coletadas no Inverno
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
mA
U
Gen 202
Gen 201
Gen 110
Gen 109
Gen 108
Gen 107
Gen 106
mA
U
Tempo (min)
Amostras coletadas no V. COM irrigação
- 50 -
0 20 40 60 80 100 120
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
mA
U
Gen 202
Gen 201
Gen 110
Gen 109
Gen 108
Gen 107
Gen 106
Amostras coletadas no V. SEM irrigaçãom
AU
Tempo (min)
Figura 8. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos das 21 amostras obtidas de L. gracilis [sete genótipos (106-110, 201 e 202) das três coletas: inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação]
Considerando a Figura 8, pode ser observado algumas diferenças entre os
cromatogramas fingerprint dos diferentes genótipos em cada tipo de coleta. Além
disso, também pode-se ver diferenças entre os cromatogramas do mesmo genótipo
nos três tipos de coleta (Figura 9).
- 51 -
0 20 40 60 80 100 120
020406080
100120140160180200220240260280300320340360
106 Vs 106 Vc106 inv
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
100
200
300
400
107 Vs107 Vc
107 inv
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
108 Vs
108 Vc
108 inv
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
100
200
300
400
500
600
109 Vs 109 Vc
109 inv
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
110 Vs
110 Vc 110 inv
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
201 Vs201 Vc
201 inv
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 120
0
100
200
300
400
500
202 Vs 202 Vc
202 inv
mA
U
Tempo (min)
Figura 9. Comparação dos cromatogramas fingerprints (λ= 254 nm) dos sete genótipos entre os três tipos de coletas: inverno, verão com irrigação e verão sem irrigação
- 52 -
Embora não seja o objetivo deste trabalho a validação do método analítico de
separação, sabe-se que uma das formas de melhorar a precisão é aumentar o número
de replicatas (RIBANI et al. 2004). Assim, a repetitividade das análises foi avaliada
pela preparação em quadruplicata de soluções (15 mg/mL) dos extratos aquosos das
21 amostras de L. gracilis (vide item 4.5 Condições cromatográficas de análise dos
chás de L. gracilis).
Nas Figuras 10, 11 e 12 estão apresentados as quadruplicatas dos
cromatogramas fingerprint dos sete genótipos das coletas de inverno (Figura 10),
verão com irrigação (Figura 11) e verão sem irrigação (Figura 12).
- 53 -
0 20 40 60 80 100 1200
20406080
100120140160180200220240260280300320340360
Tempo (min)
mA
U
Tempo (min)
Gen 106inv
0 20 40 60 80 100 1200
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240T em po ( m i n)
mA
U
Tempo (min)
Gen 107inv
0 20 40 60 80 100 1200
20
40
60
80
100
120
140
160
Tempo (min)
mA
U
Tempo (min)
Gen 108inv
0 20 40 60 80 100 1200
100
200
300
400
500
600
Tempo (min)
mA
U
Tempo (min)
Gen 109inv
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
Tempo (min)
mA
U
Tempo (min)
Gen 110inv
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
350
400
Tempo (min)
Tempo (min)
mA
U
Gen 201inv
0 20 40 60 80 100 1200
100
200
300
400
500
Tempo (min)
mA
U
Tempo (min)
Gen 202 inv
Figura 10. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos sete genótipos (inverno) de L. gracilis em quadruplicata.
- 54 -
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
350
400
mA
U
Tempo (min)
Gen 106 V. C/ Irrig
0 20 40 60 80 100 1200
100
200
300
400
500
Gen 107 V. C/ Irrig
mA
U
Tempo (min)
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
mA
U
Tempo (min)
Gen 108 v. c/irrig
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
mA
U
Tempo (min)
Gen 109 v. c/irrig
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
350
400
450
mA
U
Tempo (min)
Gen 110 V. C/irrig
0 20 40 60 80 100 1200
100
200
300
400
500
600
mA
U
tempo (min)
Gen 201 V. C/irrig
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
mA
U
Tempo (min)
Gen 202 V. C/irrig
Figura 11. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos sete genótipos (verão com irrigação) de L. gracilis em quadruplicata.
- 55 -
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
350
400
450
mA
U
Tempo (min)
Gen 106 V.S/ irrig
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
350
400
450
mA
U
Tempo (min)
Gen 107 V. S/ irrig
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
mA
U
Tempo (min)
Gen 108 V. S/ irrig
0 20 40 60 80 100 1200
100
200
300
400
500
600
mA
U
tempo (min)
Gen 109 V. S/ irrig
0 20 40 60 80 100 1200
100
200
300
400
500
mA
U
Tempo (min)
Gen 110 V. S/ irrig.
0 20 40 60 80 100 1200
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
mA
U
Tempo (min)
Gen 201 V. S/ irrig
0 20 40 60 80 100 1200
100
200
300
400
500
Gen 202 V. S/irrig
mA
U
Tempo (min)
Figura 12. Cromatogramas fingerprint (λ= 254 nm) dos extratos aquosos dos sete genótipos (verão sem irrigação) de L. gracilis em quadruplicata.
- 56 -
5.4 Análise quimiométrica
É possível visualizar nas Figuras 8 e 9 algumas diferenças nos
cromatogramas das amostras analisadas, sendo difícil identificá-las e, até mesmo,
quantificá-las apenas por uma análise visual. Neste caso, a aplicação de técnicas
quimiométricas irá fornecer a interpretação dos dados com mais qualidade, pois
possibilitará a classificação e a discriminação entre os cromatogramas fingerprint(
(MOK et al., 2006; LI et al., 2004).
A Análise de Componentes Principais (ACP) é uma ferramenta
quimiométrica útil que permite a compressão dos dados n-dimensionais para um
sistema com, geralmente, duas variáveis, facilitando a visualização dos dados e a
melhor avaliação das correlações entre esses dois fatores. Assim, a ACP transforma
os dados cromatográficos a partir de um espaço n-dimensional variável em
componentes principais (CP), gerando um gráfico de escores que é usado para
classificar as amostras a partir de suas propriedades, podendo revelar um padrão que
pode ser correlacionado com as características gerais das amostras. O gráfico de
loadings, por outro lado, nos fornece informação sobre as variáveis, quantificando a
variação encontrada entre elas (GOMES et al., 2010; CHEN et al., 2009; ZHOU et
al., 2009; YANG et al., 2007).
Os cromatogramas obtidos foram organizados em uma matriz de dados,
contendo 84 linhas (amostras) e 10.314 variáveis (tempos de retenção, 110 min.),
sendo submetidos à Análise de Componentes Principais (ACP), após pré-tratamento
(alinhamento dos picos pela técnica do algoritmo “Correlation Optimised Warping”-
COW) (SKOV et al., 2006) e pré-processamento (centrados na média) dos dados
originais. A Figura 13 mostra uma parte do cromatograma antes (a) e após o
alinhamento (b), evidenciando a grande necessidade de se realizar o alinhamento dos
dados antes da aplicação da análise quimiométrica.
- 57 -
42 45 48
200
400
mA
U
Tempo (min)
42 45 48
200
400
600
mA
U
Tempo (min)
Figura 13. Parte do cromatograma (λ= 254 nm) dos extratos aquosos de L. gracilis: a) antes do alinhamento, b) após alinhamento utilizando o algaritmo “Correlation Optimised Warping” (COW)
Os cromatogramas foram tratados por ferramentas computacionais de análise
multivariada, utilizando-se a Análise por Componentes Principais (ACP) através do
programa computacional PIROUETTE®, versão 4.0 (Informetrix), visando verificar
o comportamento das amostras de L. gracilis.
Antes de empregar a ACP foi necessário um pré-processamento dos dados
originais. Os métodos de pré-processamento mais utilizados consistem basicamente
em centrar na média ou auto-escalar os dados. Neste caso, os dados foram centrados
na média, isto é, foi calculada a média dos valores experimentais para cada variável e
a
b
- 58 -
foi subtraído cada valor experimental do respectivo valor médio, o que está
representado no gráfico dos dados pré-processados na Figura 14.
Figura 14. Gráfico de pré-processamento centrado na média
Na Análise de Componentes Principais foi observado que 83,6% da variância
total dos dados foram explicados nas duas primeiras componentes principais (Tabela
6). A CP1 e CP2 correspondem, respectivamente, a 79,3% e 4,27% da variância dos
dados originais. As demais CP’s (de 3 a 10) não foram consideradas para a
interpretação de tendências dos dados.
Tabela 6. Variância percentual das componentes principais calculadas para os dados da matriz original centrados na média
Componente Principal % de Variância % de Variância Acumulada CP1 79,3 79,3 CP2 4,27 83,6 CP3 3,15 86,7 CP4 2,10 88,8 CP5 1,58 90,4 CP6 1,50 91,9 CP7 1,19 93,1 CP8 1,09 94,2 CP9 0,69 94,9 CP10 0,61 95,5
Na Figura 15 temos o gráfico da variância explicada em cada CP. Pode-se
observar que a variação da variância explicada entre a CP3 até a CP10 é menor do
que 15% do total das CP’s, ou seja, ao se aplicar a ACP, foi possível reduzir a
Pré
- pr o
c es s
a me n
to
Variáveis
- 59 -
dimensão dos dados de 10.314 para 2 (2CP’s). Assim, a CP1 descreve o máximo de
variabilidade das amostras, mais que qualquer uma das variáveis originais, como
apresentado na Tabela 6 e na Figura 15.
Figura 15. Variância explicada (%) para cada componente principal (CP’s)
Na Figura 16 é apresentado o gráfico de escores de CP1 versus CP2, o qual
traz informações sobre as amostras.
Figura 16. Gráfico de escores (CP1 versus CP2)
Componentes Principais
Va r
i ânc
ia E
x plic
a da
(%)
CP1 (79,3%)
CP
2 (4
,27 %
)
- 60 -
No gráfico da Figura 16 vê-se que a CP1 separa as amostras 109inv, 202inv,
201vc, 109vs, 110vc, 201vs e 202vs em valores de escores positivos, das amostras
106inv, 107inv, 108inv, 110inv, 108vc, 202vc e 108vs em valores de escores
negativos; e as amostras 201inv, 106vc, 107vc, 109vc, 106vs e 107vs em valores
próximos de zero. CP2, por sua vez, consegue separar as amostras 108inv, 108vc,
201vc, 202vc, 108vs e 202vs em valores de escores positivos, das amostras 106inv,
107inv, 201inv, 109vc, 110vc, 109vs, 110vs e 201vs em valores de escores
negativos; e as amostras 109inv, 110inv, 202inv, 106vc, 107vc, 106vs e 107vs em
valores próximos de zero. Vale mencionar que as amostras 106vc, 107vc, 106vs e
107vs apresentaram valores próximos de zero tanto no eixo da CP1 como na CP2.
Na Figura 16 pode-se observar a separação de amostras e formação de
alguns grupos. Um grupo foi formado pelas amostras 108inv, 108vc, 108vs e 202vc;
outro grupo é formado por 106vc e 109vc; um terceiro grupo apresenta as amostras
109inv, 202inv e 201vc; um quarto grupo apresenta 107vc, 110vc, 106vs, 107vs,
109vs, 110vs e 201vs; além de um quinto grupo contendo 106inv e 107inv.
É interessante observar que os genótipos 108 e 202 coletadas no verão
cultivadas sem irrigação mostraram ser significativamente diferentes dos demais
genótipos da mesma coleta, pois formaram grupos separados.
Além disso, os genótipos 107, 108 e 110 não se diferenciaram quanto ao tipo
de cultivo (verão com e sem irrigação), sendo que o genótipo 108, ainda não foi
capaz de se diferenciar pela época da coleta (verão e inverno).
A diferenciação entre as amostras pode ser explicada observando o gráfico de
loadings (Figura 17) que demonstra a importância (peso) que cada variável teve na
construção de cada componente principal e, consequentemente, na projeção das
amostras pelos escores.
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Figura 17. Gráfico de loadings dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis
No gráfico de loadings (Figura 17) é possível perceber que na CP1 e CP2
algumas bandas cromatográficas se destacaram com valores de loadings positivos e
outras com valores de loadings negativos. Somente a CP2 apresentou valores de
loadings positivos e negativos, a CP1 só tem valores positivos.
Os loadings da CP1 apresentaram as bandas cromatográficas que contém
maior peso/influência na projeção das amostras, e só contém variáveis com valores
positivos. Sendo assim, as amostras 109inv, 202inv, 201vc, 109vs, 110vs, 201vs e
202vs que apresentaram valores positivos para CP1, estão correlacionadas com
tempos de retenção que apresentam valores positivos na CP1 no gráfico de loadings
(Figura 17). Os tempos de retenção, então, característicos destas amostras
correspondem a 41,8 e 43,8 minutos.
Os loadings da CP2 contêm variáveis com valores positivos e negativos.
Sendo assim, as amostras 106inv, 107inv, 201inv, 109vc, 110vc, 109vs, 110vs e
201vs que apresentaram valores negativos para CP2, estão correlacionadas com
tempos de retenção que apresentam valores negativos na CP2 no gráfico de loadings
(Figura 17). Os tempos de retenção, então, característicos destas amostras
correspondem a 19,3 e 41,8 minutos.
Os valores positivos de escores da CP2 estão relacionados aos tempos de
retenção que apresentaram valores positivos na CP2 no gráfico de loadings (Figura
17). As amostras 108inv, 108vc, 201vc, 202vc, 108vs e 202vs que possuem valores
CP1
CP2 17,0
19,3
41,8
41,8 43,8
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de escores positivos para CP2 apresentaram como tempos de retenção característicos
17,0 minutos.
No gráfico de escores (Figura 16) percebe-se que, excetuando os genótipos
109 e 202, as demais amostras de inverno apresentam valores em CP1 negativos,
tendendo a valores positivos para as amostras coletadas no verão. Estes dados,
combinados com aqueles do gráfico de loadings (Figura 17), permitem-nos propor
que os metabólitos que eluem nos tempos de retenção 41,8 e 43,8 min são mais
característicos das amostras coletadas no verão (amostras 106 a 108; 110 e 201).
Comparando os respectivos espectros UV destas bandas (Figura 6) com os da
literatura e o relato da presença de flavonóides em extrato polar de folhas desta
espécie, sugere-se que estes sejam flavonóides glicosilados, o que corrobora com a
função destes metabólitos como protetores de radiação UV. Além disso, observou-se
também que a irrigação influencia significativamente o perfil cromatográfico nas
amostras 109 e 202, pois reduzem as bandas cromatográficas que definem a CP1
(DUCREY et al., 1995; SISA et al., 2010; GUIMARÃES et al., 2012).
Sabendo-se do interesse farmacológico nesta planta e das inúmeras atividades
biológicas que os flavonóides apresentam, a partir de nossos resultados, deve-se
considerar as condições de cultivo, época de coleta e seleção do melhor genótipo
para sua utilização (YAO et al., 2004; ATMANI et al., 2009; KELLER et al., 2009).
Desta forma, a análise quimiométrica possibilitou uma melhor avaliação das
diferenças e semelhanças entre os cromatogramas fingerprints dos chás das folhas
dos sete genótipos de L. gracilis, permitindo relacioná-las às suas procedências
(Sergipe ou Bahia), estação do ano da coleta (inverno ou verão) e tipo de cultivo
(verão com ou sem irrigação).
5.5 Atividade antioxidante: Teste do DPPH
As análises de atividade antioxidante foram realizadas em triplicata e os
resultados encontram-se na Tabela 7. A equação da curva de calibração do DPPH foi
C = 110,547 – 0,02804A, onde C corresponde à concentração de DPPH no meio
- 63 -
reacional, A é a absorbância medida no comprimento de onda de 515 nm. O
coeficiente de correlação foi de R = 0,9983.
O percentual antioxidante (IP) que reagiu com o genótipo 108inv foi muito
pequeno 0,010% (Tabela 7). Já o IP para os genótipos 106inv, 107inv, 108vc, 109vc,
110inv e 202vc foram de 40,27%, 37,75%, 39,51%, 40,11%, 46,57% e 48,79%,
respectivamente, os quais foram considerados de baixa atividade. Apenas as
amostras do genótipo 201vc e 201vs (30 µg/mL, 60 min) consumiram mais de 90%
do radical DPPH, apresentando uma resposta similar ao controle positivo ácido
gálico (92,06%, 30 µg/mL, 60 min) sendo consideradas com atividade antioxidante.
Na avaliação da atividade antioxidante, a solução metanólica de DPPH
inicialmente de coloração violeta torna-se amarela. O grau deste descoramento indica
a habilidade do antioxidante em sequestrar radicais livres. Uma forma usual de
expressar os resultados nesse ensaio é calcular a quantidade de antioxidante
necessária para diminuir em 50% a concentração inicial do radical DPPH. Esse
índice denomina-se CI50 e quanto menor o seu valor, maior será a atividade
antioxidante. Dessa forma, como o genótipo 108 inv apresentou um valor de CI50
muito alto, não apresentou atividade antioxidante. Por outro lado, os valores de CI50
para os genótipos 106vs, 107vs, 108vs, 109inv, 110vc, 201vc, 201vs, 202inv e 202vs
foram estatisticamente similares ao apresentado pelo ácido gálico, o controle positivo
(Tabela 7).
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Tabela 7. Atividade antioxidante dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis pela redução do radical livre DPPH
Amostra CI50 (µg/mL) IAA (p/ 30 µg/mL) IP(%)(p/ 30 µg/mL)
Gen 106 inv 43,80±1,74a 0,68 40,27 Gen 106 vc 22,50±1,95b 1,33 62,26 Gen 106 vs 16,28±0,94c 1,84 81,77 Gen 107 inv 44,07±1,81a 0,68 37,75 Gen 107 vc 24,08±2,02b 1,24 60,20 Gen 107 vs 15,16±1,80c 1,97 84,77 Gen 108 inv 141,9±0,88d 0,17 0,010 Gen 108 vc 39,21±1,42a 0,76 39,51 Gen 108 vs 19,79±0,60b 1,51 81,19 Gen 109 inv 14,04±1,91c 2,13 89,34 Gen 109 vc 44,29±1,55a 0,67 40,11 Gen 109 vs 24,48±1,93b 1,22 60,88 Gen 110 inv 36,68±1,68e 0,81 46,57 Gen 110 vc 16,18±1,70c 1,85 78,26 Gen 110 vs 20,03±1,52b 1,49 77,39 Gen 201 inv 20,38±1,97b 1,47 70,39 Gen 201 vc 11,41±1,86c 2,62 94,43 Gen 201 vs 12,51±1,79c 2,39 93,90 Gen 202 inv 13,98±2,01c 1,78 86,56 Gen 202 vc 23,33±1,82b 1,28 48,79 Gen 202 vs 19,32±1,89bc 1,55 73,95 Ácido Gálico 1,05±0,20e 23,08 92,06
Valores (CI50) apresentados na Tabela 7 com letras diferentes são diferentes
estatisticamente; p < 0,05 em relação ao controle positivo ácido gálico.
Os dados encontrados a partir do IAA (Índice de Atividade Antioxidante)
classificaram o genótipo 108inv (0,17) como tendo atividade antioxidante
insatisfatória; os genótipos 106inv (0,68), 107inv (0,68), 108vc (0,76), 109vc (0,67)
e 110inv (0,81) com moderada atividade antioxidante; os genótipos 106vc (1,33),
106vs (1,84), 107 vc (1,24) 107vs (1,97), 108vs (1,51), 109vs (1,22), 110vc (1,85),
110vs (1,49), 201inv (1,47), 202inv (1,78), 202vc (1,28) e 202vs (1,55) com forte
atividade antioxidante e os genótipos 109inv (2,13), 201vc (2,62) e 201vs (2,39) com
atividade antioxidante muito forte, sendo similares ao controle positivo ácido gálico
(23,08), que apresenta atividade antioxidante muito forte (Tabela 7).
É interessante observar que os genótipos coletados no verão e cultivados sem
irrigação apresentaram atividade antioxidante de forte (106 a 110 e 202) a muito
forte (201). Neste caso, pode-se propor que a síntese de metabólitos secundários foi
afetada pelas condições ambientais de stress hídrico. Assim, para que a espécie
sobrevivesse deve ter havido um acúmulo de metabólitos secundários, os quais
- 65 -
podem ter sido os responsáveis pela intensa atividade antioxidante observada nestas
amostras. A partir do conhecimento químico de espécies deste gênero, pode-se ainda
propor que esta intensa atividade antioxidante se deve aos compostos fenólicos
presentes.
Pode-se observar que os genótipos que apresentaram atividade antioxidante
muito forte [109inv (2,13), 201vc (2,62) e 201vs (2,39)], encontraram-se em
grupamentos próximos no gráfico de escores (Figura 16).
Como mostrado na Figura 18, os genótipos da coleta verão sem irrigação
(codificados como “vs irri”) e os genótipos 109inv, 201inv, 202inv, 110vc e 201vc
apresentaram cinética comportamental rápida. O genótipo 108inv praticamente não
reagiu com o DPPH.
0 10 20 30 40 50 60 700
20
40
60
80
100 Gen 106 invGen 107 invGen 108 invGen 109 invGen 110 invGen 201 invGen 202 invÁcido Gálilco
Tempo (min)
DP
PH
rem
(%
)
0 10 20 30 40 50 60 700
20
40
60
80
100 Gen 106 vs irriGen 107 vs irriGen 108 vs irriGen 109 vs irriGen 110 vs irriGen 201 vs irriGen 202 vs irriÁcido Gálilco
Tempo (min)
DPPH
rem
(%
)
- 66 -
0 10 20 30 40 50 60 700
20
40
60
80
100 Gen 106 vc irriGen 107 vc irriGen 108 vc irriGen 109 vc irriGen 110 vc irriGen 201 vc irriGen 202 vc irriÁcido Gálilco
Tempo (min)
DPPH
rem
(%
)
Figura 18. Cinética comportamental dos extratos aquosos liofilizados de L. gracilis (30 µg/mL) e ácido gálico (30 µg/mL), frente ao radical livre DPPH (40 µg/mL).
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6. CONCLUSÕES
Este trabalho descreve o desenvolvimento de um método por CLAE-DAD
para a obtenção de cromatogramas fingerprints, que auxiliados por análise
quimiométrica de ACP, permitiu investigar e demonstrar a variação de componentes
químicos entre os chás de folhas de sete genótipos de L. gracilis procedente de
diferentes locais (Sergipe e Bahia), estações do ano (verão e inverno) e formas de
cultivo (verão com e sem irrigação).
Os resultados permitiram demonstrar que diferentes fatores ambientais, tais
como: sazonalidade e a disponibilidade hídrica podem provocar variação nos
constituintes químicos de uma amostra vegetal, podendo, inclusive afetar suas
propriedades antioxidantes. Além disso, pode-se observar diferenças químicas entre
os genótipos coletados a partir das duas localidades (Sergipe e Bahia).
O método proposto mostrou ser adequado e eficiente para determinar as
diferenças e semelhanças entre as amostras. Assim, é possível propor que os
genótipos 107, 108 e 110 apresentaram maior resistência ao stress hídrico, pois não
foi observada diferenciação entre as amostras coletadas no verão e cultivadas com e
sem irrigação. Além disso, o genótipo 108 apresentou pouca diferenciação entre a
amostra coletada no inverno e as correspondentes coletadas no verão sob as duas
formas de cultivo.
Os resultados obtidos pelo teste de atividade antioxidante mostraram que os
genótipos coletados no verão e cultivados sem irrigação apresentaram atividade
antioxidante entre forte (106 a 110 e 202) e muito forte (201). Esta intensa atividade
pode ter sido ocasionada pelo acúmulo dos compostos fenólicos comumente
encontrados em espécies deste gênero.
As amostras que apresentaram atividade antioxidante muito forte (109inv,
201vc e 201vs) apresentaram comportamento compatível com os resultados
cromatográficos e quimiométricos, comprovando suas similaridades.
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7. REFERÊNCIAS ABE, F.; NAGAO, T.; OKABE, H. Antiproliferative constituents in plants 9.1) aerial parts of Lippia dulcis and Lippia canescens. Biological & Pharmaceutical Bulletin. Vol. 25, n. 7, p. 920-922, 2002. ALMEIDA, M. C. S.; ALVES, L. A.; SOUZA, L. G. DA S.; MACHADO, L. L.; MATOS, M. C.; OLIVEIRA Mª. C. F.; LEMOS T. L. G. Flavonoides e outras substâncias de Lippia sidoides e suas atividades antioxidantes. Química Nova. Vol. 33, n. 9, p.1877-1881, 2010. ANDRADE, C. A.; COSTA, C. K.; BORÁ, K.; MIGUEL, M. D.; MIGUEL, O. G.; KERBER, V. A. Determinação do conteúdo fenólico e avaliação da atividade antioxidante de Acacia podalyriifolia A. Cunn. ex G. Don, Leguminosae-mimosoideae. Revista Brasileira de Farmacognosia. Vol.17, p. 231-235, 2007. ATMANI, D.; CHAHER, N.; ATMANI, D.; BERBOUCHA, M.; DEBBACHE, N.; BOUDOUD, H. Flavonoids in human health: from structure to biological Activity. Current Nutrition e Food Science. Vol. 5, p. 225-237, 2009. BARBOSA, F. F.; BARBOSA, L. C. A.; MELO, E. C.; BOTELHO, F. M.; SANTOS, R. H. S. Influência da temperatura do ar de secagem sobre o teor e a composição química do óleo essencial de Lippia alba (Mill) N. E. BROWN. Química Nova. Vol. 29, n. 6, p. 1221-1225, 2006a. BARBOSA, F. G.; LIMA, M. A. S.; BRAZ-FILHO, R.; SILVEIRA, E. R. Iridoid and phenylethanoid glycosides from Lippia alba. Biochemical Systematics and Ecology. Vol. 34, p. 819-821, 2006. BROINIZI, P. R. B.; ANDRADE-WARTHA, E. R. S.; SILVA, A. M. O.; NOVOA, A. J. V.; TORRES, R. P.; AZEREDO, H. M. C.; ALVES, R. E.; MANCINI-FILHO J. Avaliação da atividade antioxidante dos compostos fenólicos naturalmente presentes em subprodutos do pseudofruto de caju (Anacardium occidentale L.). Ciência e Tecnologia de Alimentos. Campinas. Vol. 27, p. 902-908, 2007. BRAND- WILLIAMS, W.; CUVELIER, M. E.; BERSET, C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-wissenschaft e Technologie. Vol. 28, p. 25-30, 1995. CAVALCANTI, S.C.H.; NICULAU, E. dos S.; BLANK, A.F.; CÂMARA, C.A.G.; ARAÚJO, I.N.; ALVES, P.B. Composition and acaricidal activity of Lippia sidoides essential oil against two-spotted spider mite (Tetranychus urticae Koch). Bioresource Technology. Vol. 101, p. 829-832, 2010. CARVALHO, ANA C. B.; BALBINO, E. E.; MACIEL, A.; PERFEITO, J. P. S. Situação do registro de medicamentos fitoterápicos no Brasil. Brazilian Journal of Pharmacognosy. Vol.18, n.2, p. 314-319, 2008.
- 71 -
CHEN, J.; LU, Y-H.; WEI, D-Z., ZHOU X-L. Establishment of a fingerprint of raspberries by LC. Chromatographia. Vol.70, p. 981-985, 2009. CHEN, Y.; BICKER, W.; WU J.; XIE, M. Y.; LINDNER, W. Ganoderma species discrimination by dual-mode chromatographic fingerprinting: A study on stationary phase effects in hydrophilic interaction chromatography and reduction of sample misclassification rate by additional use of reversed-phase chromatography. Journal of Chromatography A. Vol. 1217, p. 1255-1265, 2010. CHEN, Y.; ZHU, S.; XIE, M.; NIE, S.; LIU, W.; LI, C.; GONG, X.; WANG, Y. Quality control and original discrimination of Ganoderma lucidum based on high performance liquid chromatographic fingerprints and combined chemometrics methods. Analytica Chimica Acta. Vol. 623, p.146–156, 2008. CORREIA, P. R. M.; FERREIRA, M. M. C. Reconhecimento de padrões por métodos não supervisionados: explorando procedimentos quimiométricos para tratamento de dados analíticos. Química Nova. Vol. 30, n. 2, p.481-487, 2007.
COSTA, S. MARIA O.; LEMOS, T. L. G.; PESSOA, O. D. L.; ASSUNÇÃO, J. C. C.; BRAZ-FILHO, R. Constituintes químicos de Lippia sidoides (Cham.) Verbenaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia. Vol.12, p. 66-67, 2002.
DADÉ, M. M.; FIORAVANTI, D. E.; SCHINELLA, G. R.; TOURNIER, H. A. Total antioxidant capacity and polyphenol content of 21 aqueous extracts obtained from native plants of Traslasierra valley (Argentina). Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas. Vol.8, n.6, p.529 – 539, 2009. DUARTE-ALMEIDA, J. M.; SANTOS, R. J.; GENOVESE, M. I.; LAJOLO, F. M. Avaliação da atividade antioxidante utilizando sistema β-caroteno/ácido linoléico e método de seqüestro de radicais DPPH•. Ciência e Tecnologia de Alimentos. Campinas, Vol. 26, p. 446-452, 2006. DUCREY, B.; WOLFENDER, J. L.; MARSTON, A.; HOSTETTMANN, K. Analysis of flavonol glycosides of thirteen epilobium species (Onagraceae) by LC- UV and Thermospray LC-Ms. Phytochemistry. Vol. 38, p. 129-137, 1995. FARIAS, M. R.; PÉRTILE R.; CORREA, M. M.; ALMEIDA, Mª T. R., PALERMO, J. A., SCHENKEL E. P. Triterpenoid Saponins from Lippia alba (Mill.) N. E. Brown. Journal of the Brazilian Chemical Society. Vol. 21, n. 5, p. 927-933, 2010. GARZA-JUARÉZ, A.; SALAZAR-CAVAZOZ, M. L.; SALAZAR-ARANDA, R.; PÉREZ-MESEGUER, J.; TORRES, N.W. Correlation between chromatographic fingerprint and antioxidant activity of Turnera diffusa (Damiana). Planta Medica. Vol. 77, n. 9, p. 958-963, 2011.
- 72 -
GOBBO-NETO, L.; LOPES N. P. Plantas medicinais: fatores de influência no conteúdo de metabólitos secundários. Quimica Nova. Vol. 30, n. 2, p. 374-381, 2007. GOMES, S. V. F.; SANTOS, A. D. C.; MORAES, V. R. S.; MARTINS, L. R. R.; VIANA, M. D.; BLANK, A. F.; FILHO, E. R. P.; CASS, Q.B.; NOGUEIRA, P. C. L.; ALVES,P. B. Differentiation of Lippia gracilis Schauer genotypes by LC fingerprint and chemometrics analyses. Chromatographia. Vol. 72, n. 3-4, p. 275-280, 2010. GUËRECA-GONZÁLEZ, M.C.; HERNÁNDEZ, S. M.; VÁZQUEZ, M. M. Isolation of (-)(2S)-5,6,7,3’,5’-pentahydroxyflavanone-7-O-β-D-glucopyranoside, from Lippia graveolens H.B.K. var. berlandieri Schauer, a new anti-inflammatory and cytotoxic flavanone. Natural Product Research. Vol. 24, n. 16, p. 1528–1536, 2010. GUILHON, C. C.; RAYMUNDO, L. J. R. P.; ALVIANO, D. S.; BLANK, A. F.; BLANK, M. F. A.; MATHEUS, M. E.; CAVALCANTI, S. C. H.; ALVIANO, C. S.; FERNANDES, P. D. Characterisation of the anti-inflammatory and antinociceptive activities and the mechanism of the action of Lippia gracilis essential oil. Journal of Ethnopharmacology. Vol. 135, p. 406–413, 2011.
GUIMARÃES, A. G.; GOMES, S. V. F.; MORAES, V. R. S.; NOGUEIRA, P. C. L.; FERREIRA, A. G.; BLANK, A. F.; SANTOS, A. D. C.; VIANA, M. D.; SILVA, G. H.; QUINTANS JÚNIOR, L. Phytochemical characterization and antinociceptive effect of Lippia gracilis Schauer. Journal of Natural Medicines. No prelo (doi 10.1007/s11418-011-0601-3), 2012.
HAN, C.; CHEN, J.; CHEN, B.; LEE, F. S-C.; WANG, X. Fingerprint chromatogram analysis of Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax root by high performance liquid chromatography. Journal of Separation Science. Vol. 29, n. 4, p. 2197-2202, 2006. HEGDE, V. R.; PU, H.; PATEL, M.; PRADIP R. DAS, STRIZKI, J.; GULLO, V. P.; CHOU, CHUAN-CHU; BUEVICH, A. V.; CHAN, TZE-MING. Three new compounds from the plant Lippia alva as inhibitors of chemokine receptor 5 (CCR5). Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. Vol. 14, p. 5339–5342, 2004. HOAI, N. N.; DEJAEGHER, B.; TISTAERT, C.; THI HONG, V. N..; RIVIÈRE, C.; CHATAIGNÉ, G.; PHAN VAN, K.; CHAU VAN, M.; QUETIN-LECLERCQ, J.; HEYDEN, Y. V. Development of HPLC fingerprints for Mallotus species extracts and evaluation of the peaks responsible for their antioxidant activity. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Vol. 50, p. 753–763, 2009. KANKO, C. ; KOUKOUA, G.; N’GUESSAN, Y. T.; FOURNIER, J.; PRADÈRE, JEAN-PAUL; TOUPET, L. Contribution à l’étude phytochimique de Lippia multiflora (Verbenaceae). Comptes Rendus Chimie. Vol. 7, p. 1029–1032, 2004.
- 73 -
KELLER, R. B. (Ed.); Flavonoids: biosynthesis, biological effects and dietary sources. Nova Science Publishers. New York. 2009. KOMES, D.; HORZˇIC´ D.; BELŠCˇAK, A.; GANIC´, K. K.; VULIC, I. Green tea preparation and its influence on the content of bioactive compounds. Food Research International. Vol. 43, p.167 -176, 2010. LACERDA, M. E. G.; FILHO, H. C. A.; KAPLAN, M. A. C. Comparative evaluation of methyl xanthine percentages in commercial samples of black tea and mate tea. Brazilian Journal Food Technology. Vol. 3 p. 17-21, 2000. LI, B-Y.; HU, Y.; LIANG, Y-Z.; XIE, P-S.; DU, Y-P. Quality evaluation of fingerprints of herbal medicine with chromatographic data. Analytica Chimica Acta. Vol. 514, p. 69-77, 2004. LIANG, Y.; XIE, P.; CHAU, F. Chromatographic fingerprinting and related chemometric techniques for quality control of traditional chinese medicines. Journal of Separation Science. Vol. 33, p. 410–421, 2010. LIU, X-J.; HU, J.; LI, Z-Y.; QIN, X-M.; ZHANG, L-Z.; GUO, X-Q. Species classification and quality assessment of Chaihu (Radix bupleuri) based on high-performance liquid chromatographic fingerprint and combined chemometrics methods. Archives of Pharmacal Research. Vol. 34, n. 6, p. 961-969, 2011. MACIEL, M. A. M.; PINTO, A. C.; VEIGA, V. F. JR.; GRYNBERG, N. F.; ECHEVARRIA, A. Plantas medicinais: A necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, Vol. 25, n.3, p. 429-438, 2002. MALDANER, L.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F. Fases estacionárias modernas para cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa. Química Nova. Vol. 33, p. 1559-1568, 2010. MALDONADO, E.; DÍAZ-ARUMIR, H.; TOSCANO, R. A.; MARTÍNEZ, M. Lupane triterpenes with a δ-Lactone at ring e, from Lippia mexicana. Journal of Natural Products. Vol. 73, n. 11, p. 1969–1972, 2010. MARTINS, L. R. R.; PEREIRA, E. R. F.; CASS, Q. B. Multivaried analysis of high performance liquid chromatographic profile for discrimination of vegetables species of phyllanthus. Labciencia con Noticias Técnicas del Laboratorio. Vol. 4, pg. 11-13, 2007. MARTINS, L. R. R.; PEREIRA, E. R. F.; CASS, Q. B. Chromatographic profiles of phyllanthus aqueous extracts samples: a proposition of classification using chemometric models. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2011. MARTINS, Lúcia Regina Rocha. Perfil cromatográfico e análise multivariada para o controle de qualidade de amostras comerciais do gênero phyllanthus (quebra-pedra).
- 74 -
São Carlos, 2008. 154p. Tese (Doutorado)- Departamento de Química, Universidade Federal de São Carlos. MATOS, G. D.; PEREIRA-FILHO, E. R.; POPPI, R. J.; ARRUDA M. A. Z. Análise exploratória em química analítica com emprego de quimiometria: PCA e PCA de imagens. Revista Analytica. Nº 06, p. 38- 50, 2003. MELO, J. G. DE; MARTINS, J. D. G. R..; AMORIM E. L. C.; ALBUQUERQUE, U. P. Qualidade de produtos a base de plantas medicinais comercializados no Brasil: castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum L.), capim-limão (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf ) e centela (Centella asiatica (L.) Urban). Acta Botanica Brasilica. Vol. 21 pg. 27-36, 2007. MENDES, S. S.; BOMFIM, R. R.; JESUS, H. C. R.; ALVES, P. B.; BLANK, A. F.; ESTEVAM, C. S.; ANTONIOLLI, A. R.; THOMAZZI, S. M. Evaluation of the analgesic and anti-inflammatory effects of the essential oil of Lippia gracilis leaves. Journal of Ethnopharmacology. Vol. 129, p. 391-397, 2010. MOK, D. K. W.; CHAU, F-T. Chemical information of chinese medicines: A challenge to chemist. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. Vol. 82, p. 210-217, 2006. MORAIS, S. M.; CAVALCANTI, E. S. B.; COSTA, S. M. O.; AGUIAR, L. A. Ação antioxidante de chás e condimentos de grande consumo no Brasil. Brazilian Journal of Pharmacognosy . Vol.19, n.1B, p. 315-320, 2009. MORGANO, M. A.; QUEIROZ, S. C. do N.; FERREIRA, M. M. C. Aplicação da análise exploratória na diferenciação de vegetais. Brazilian Journal of Food Technology. Vol. 2, p. 73-79, 1999. MUCHUWETI, M.; NYAMUKONDA, L.; CHAGONDA, L. S.; NDHLALA, A. R.; MUPURE, C.; BENHURA, M. Total phenolic content and antioxidant activity in selected medicinal plants of Zimbabwe. International Journal of Food Science and Technology. Vol. 41, p. 33–38, 2006. MUJOVO, S. F.; HUSSEIN, A. A.; MEYER, J. J. M.; FOURIE, B.; MUTHIVI, T.; LALL, N. Bioactive compounds from Lippia javanica and Hoslundia opposita. Natural Products Research Part A. Vol. 22, p. 1047–1054, 2008. NETO, B. B.; SCARMINIO, I. S.; BRUNS, R. E. 25 anos de quimiometria no Brasil. Química Nova. Vol. 29, n. 6, p.1401-1406, 2006. NETO, R. M.; MATOS, F. J. A.; ANDRADE, V. S.; MELO, M. C. N.; CARVALHO, C. B. M.; GUIMARÃES, S. B.; PESSOA, O. D. L.; SILVA, S. L.; SILVA, S. F. R.; VASCONCELOS, P. R. L. The essential oil from Lippia gracilis Schauer, Verbenaceae, in diabetic rats. Brazilian Journal of Pharmacognosy. Vol. 20, n. 2, p. 261-266, 2010.
- 75 -
NEVES, I. A.; OLIVEIRA J. C. S.; CAMARA C. A. G.; SCHWARTZ, M. O. E. Chemical composition of the leaf oils of Lippia gracilis Schauer from two localities of Pernambuco. Journal of Essential Oil Research. Vol. 20, p. 157-160, 2008. OLIVEIRA, O. R.; TERAO, D.; CARVALHO, A. C. P. P.; INNECCO, R.; ALBUQUERQUE, C. C. Efeito de óleos essenciais de plantas do gênero Lippia sobre fungos contaminantes encontrados na micropropagação de plantas. Revista Ciência Agronômica de Fortaleza. Vol. 39, n. 01, p. 94-100, 2008. OLIVIER, D.K.; SHIKANGA, E.A.; COMBRINCK, S.; KRAUSE, R.W.M.; REGNIER, T.; DLAMINI, T.P. Phenylethanoid glycosides from Lippia javanica. South African Journal of Botany. Vol. 76, p. 58–63, 2010. ONO, M.; MORINAGA, H.; MASUOKA, C.; IKEDA, T.; OKAWA, M.; KINJO, J.; NOHARA, T. New bisabolane-type sesquiterpenes from the aerial parts of Lippia dulcis. Pharmaceutical Society of Japan. Vol. 53, No. 9, p. 1175-1177, 2005. PASCUAL, M.E.; SLOWING, K.; CARRETERO, E.; MATA, D. S.; VILLAR, A. Lippia: traditional uses, chemistry and pharmacology: a review. Journal of Ethnopharmacology. Vol. 76, p.201–214, 2001. PENG, L.; WANG, Y.; ZHU, H.; CHEN, Q. Fingerprint profile of active components for Artemisia selengensis Turcz by HPLC–PAD combined with chemometrics. Food Chemistry. Vol. 125, p.1064–1071, 2011. RASTRELLI, L.; CACERES, A.; MORALES, C.; SIMONE F. DE; AQUINO, R. Iridoids from Lippia graveolens. Phytochemistry. Vol. 49, n. 6, p. 1829-1832, 1998. RIBANI, M.; BOTTOLI, C.B.G.; COLLINS, C.H.; JARDIM, I.C.S.F.; MELO, L.F.C. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Quimica Nova. Vol. 27, n. 5, p. 771-780, 2004. RIMPLER, H.; SAUERBIER, H. Iridoid glucosides as taxonomic markers in the genera Lantana, Lippia, Aloysia and Phyla. Biochemical Systematics and Ecology. Vol. 14, n. 3, p. 307-310, 1986. ROESLER, R.; MALTA, L. G.; CARRASCO, L. C.; HOLANDA, R. B.; SOUSA, C. A. S.; PASTORE, G. M. Atividade antioxidante de frutas do cerrado. Ciência e Tecnologia de Alimentos. Campinas. Vol. 27, p. 53-60, 2007. ROSSATO, M.; SANTOS, ANA C. A. DOS; SERAFINI, L. A.; AGOSTINI, F.; PANSERA, M. R.; WASUM, R.; BARBIERI, R. L. Avaliação do óleo essencial de Aloysia sellowii (Briquet) Moldenke (Verbenaceae) do sul do Brasil. Química Nova. Vol. 29, n. 2, p. 200-202, 2006. SCHERER, R.; GODOY, H. T. Antioxidant activity index (IAA) by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl method. Food Chemistry. Vol. 112, p. 654-658, 2009.
- 76 -
SHIKANGA, E.A.; COMBRINCK, S.; REGNIER, T. South African Lippia herbal infusions: Total phenolic content, antioxidant and antibacterial activities. South African Journal of Botany. Vol. 76, p. 567–571, 2010. SILVEIRA, P. F.; BANDEIRA, M. A. M.; ARRAIS, P. S. D. Farmacovigilância e reações adversas às plantas medicinais e fitoterápicos: uma realidade. Brazilian Journal of Pharmacognosy. Vol.18, n.4, p. 618-626, 2008. SISA, M.; BONNET, S. L.; FERREIRA, D.; VAN DER WESTHUIZEN, J. H. Photochemistry of flavonoids. Molecules. Vol. 15, p. 5196- 5245, 2010. SKOV, T.; BERG, F. V. D.; TOMASI, G.; BRO, R. Automated alignment of chromatographic data. Journal of Chemometrics. Vol. 20, p. 484-497, 2006. SNYDER, L. R.; KIRKLAND, J. J.; GLAJCH, J. L. Practical HPLC method development, 2. ed. New York, John Wiley and Sons, p. 350-431, 1997. SOUSA, C. M. M.; SILVA, H. R.; VIEIRA-JR., G. M.; AYRES, M. C. C.; COSTA, C. L. S.; ARAÚJO, D. S.; CAVALCANTE, L. C. D.; BARROS, E. D. S.; ARAÚJO, P. B. M.; BRANDÃO, M. S.; CHAVES, M. H. Fenóis totais e atividade antioxidante de cinco plantas medicinais. Química Nova. Vol. 30, n. 2, p. 351-355, 2007. SOUSA, F. C. F.; MELO, C. T. V.; CITÓ, M. C. O.; FÉLIX, F. H. C.; VASCONCELOS, S. M. M.; FONTELES M. M. F.; BARBOSA J. M. FILHO; VIANA G. S. B. Plantas medicinais e seus constituintes bioativos: Uma revisão da bioatividade e potenciais benefícios nos distúrbios da ansiedade em modelos animais. Brazilian Journal of Pharmacognosy. Vol. 18, n.4, p. 642-654, 2008. TELES, S.; PEREIRA, J. A.; SANTOS, C. H. B.; MENEZES, R. V.; MALHEIRO, R.; LUCCHESE, A. M.; SILVA, F. Geographical origin and drying methodology may affect the essential oil of Lippia alba (Mill) N.E. Brown. Industrial Crops and Products. Vol. 37, p. 247-252, 2012. VALDERRAMA, P. Quimiometria. Revista Eletrônica de Ensino de Química. Vol. 1, n. 1, 2008. VEIGA, V. F. JR. Estudo do consumo de plantas medicinais na região centro-norte do estado do Rio de Janeiro: aceitação pelos profissionais de saúde e modo de uso pela população. Brazilian Journal of Pharmacognosy. Vol.18, n.2, p. 308-313, 2008. VICENTINO, A. R. R.; MENEZES, F. S. Atividade antioxidante de tinturas vegetais, vendidas em farmácias com manipulação e indicadas para diversos tipos de doenças pela metodologia do DPPH. Revista Brasileira de Farmacognosia. Vol.17, p. 384-387, 2007. VIEGAS Jr. C.; BOLZANI V. S.; BARREIRO E. J. Os Produtos naturais e a química medicinal moderna. Química Nova. Vol. 29, n.2, p. 326-337, 2006.
- 77 -
ZHAO, C.; CHAN, H-Y.; YUAN, D.; LIANG, Y.; LAU, T-Y.; CHAU, F-T. Rapid simultaneous determination of major isoflavones of Pueraria lobata and discriminative analysis of its geographical origins by principal component analysis. Phytochemical Analysis. Vol. 22, p. 503-508, 2011. ZHOU, J.; ZHANG, T.; WANG, Q.; CHEN, J. Chromatographic fingerprint analysis of varietal differences among three species of baishouwu and simultaneous analysis of three bioactive constituents by use of LC-DAD. Chromatographia. Vol.68, p. 213-218, 2008. ZHOU, X.; ZHANG, Y-S.; ZHAO, Y.; GONG, X-J.; ZHAO, C.; CHEN, H-G. An LC fingerprint study of Poria cocos (Schw.) Wolf. Chromatographia. Vol 69, p. 1282-1288, 2009. YANG, J.; CHEN, L-H.; ZHANG, Q.; LAI, M-X.; WANG, Q. Quality assessment of Cortex cinnamomi by HPLC chemical fingerprint, principle component anaylsis and cluster analysis. Journal of Separation Science. Vol. 30, p.1276-1283, 2007. YAO, L. H.; JIANG, Y. M.; SHI, J.; TOMÁS-BARBERÁN, F. A.; DATTA, N.; SINGANUSONG, R.; CHEN, S. S. Flavonoids in food and their health benefits. Plant Foods for Human Nutrition. Vol. 59, p. 113-122, 2004. YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. Plantas medicinais sob a ótica da química medicinal moderna, Argos, Santa Catarina-SC, p. 318-329, 2001. WANG, Y.; HAN, T.; ZHANG, X-G.; ZHENG, C-J.; RAHMAN, K.; QIN, L. LC fingerprint and hierarchical cluster analysis of Crocus sativus L. from different locations in China. Chromatographia. Vol. 70, p. 143-149, 2009. http://www.tropicos.org/Name/42000290?tab=maps. Acesso 01-02-2011, as 9:30h. http://florabrasiliensis.cria.org.br/search?taxon_id=16380. Acesso 09-03-2011, as 10:15h.
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