xrcc1, un élément clef de la réparation des lésions de ladn couplée à la réplication thèse...
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XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de
l’ADN couplée à la réplication
Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I
Nicolas Lévy22 novembre 2007
Dessin de N.Bouvier pour G.Almouzni
Thèse réalisée au sein du département Intégrité Du Génome de l’ UMR 7175, ESBS,
sous la direction de Josiane et Gilbert de Murcia
Modification de base:Désamination spontanée,
Alkylation, Oxydation
Cassuresimple-brin
(SSB)
Siteabasique
Cassuredouble-brin
(DSB)
Dimère dethymine
G
T
Nucléotidesmésappariés
Réactions spontannéesAgents alkylants
Radicaux oxygénésRayons X
Rayons XRadiomimétiques
Rayons UV Erreurs dela réplication
BER SSBR
DSBR:NHEJ
HRNER MMR
Les différents types de lésions de l’ADN
Adapté de D.M.Wilson III et al., Encyclopedia of Respiratory Medicine, Ed. Elsevier, 2005
5'5'
P OH
5'5'
P OH
-Rays, ROS...
• Recrutement de XRCC1 assemblage du complexe de réparation Lig3Lig3
XRCC1XRCC1
• Traitement des extrémités de la lésion Lig3Lig3
POH
PNKPNK
XRCCXRCC1
• Remplissage de la brèche
PNKPNK
Lig3Lig3
PARP-2PARP-2PolßPolß
XRCC1XRCC1
PARP-1PARP-1
FEN1FEN1
Adapté de Whitehouse et al. (2001) Cell 104, 107-117
• Ligation des extrémités de la lésion
PolßPolß
XRCC1XRCC1
Lig3Lig3
PARP-1PARP-1 PARP-2PARP-2
Réparation des cassures simple-brin de l’ADN (SSBR)
• Reconnaissance de la base endommagéeAPE1
XRCC1XRCC1
• Reconnaissance de la cassure simple-brin (SSB)
P OH
PARP-1PARP-1
LA famille PARP
Schreiber et al., Nature Reviews, 2006
La réaction de poly(ADP-ribosyl)ation
Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006
Poly(ADP-ribose)(PAR)
PARP-1
ADN
Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006
Les rôles de la poly(ADP-ribosyl)ation
PARylation des histones
X-ray Repair Cross Complementing group 1, XRCC1
Protéine sans activité enzymatique : rôle de plateforme d’interaction et d’organisationDeux domaines homologues à l’extrémité C-terminale de BRCA1 (BRCT)Recrutée en quelques secondes au niveau des coupures de l’ADN sur le PAR synthétisé par PARP-1
Anti-PAR Anti-XRCC1 DAPI + merge
Recrutement de XRCC1 au niveau des lésions de l’ADN
Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR)
Cassures double-brin de l’ADN (DSB):Hautement toxiques pour la cellule : pertes de fragments de chromosomes, translocations... Directes (rayonnements ionisants, drogues radiomimétiques)Indirectes (réplication d’un ADN endommagé)
Deux voies de réparation des DSB:Recombinaison homologue (RH) : phases S tardive et G2 du cycle cellulaireRecombinaison non homologue (NHEJ) : tout au long du cycle cellulaire
Rothkam et al., Mol. Cel. Biol., 2003
Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR) par NHEJ
• Reconnaissance du DSB par Ku70/Ku80, sous-unités de DNA-PK
• Fixation de DNA-PKcs, assemblage de l’holoenzyme DNA-PK
• Alignement des deux extrémités de la lésion
• Ligation finale des deux extrémités de la cassure double-brin
Helleday et al., DNA Repair, 2007
DNA-PKDNA-PKcs
LigIV/XRCC4/XLF
Ku70/Ku80
Réplication de l’ADN
Duplication fidèle du matériel génétique de la cellule avant sa division
Deux étapes principales : initiation et élongation•Initiation : synthèse d’un oligonucléotide ARN/ADN servant d’amorce aux ADN polymérases réplicatives•Elongation : recrutement de l’anneau de processivité PCNA et des ADN polymérase réplicatives hautement fidèles et processives
Initiation
Elongation
Brin discontinu
Brin continu
Arezi et al., TIBS, 2000
L’ADN primase agit comme frein moléculaire au cours de la réplication de l’ADN (Jong-Bong Lee et al., Nature 439, 621-624)
p58 est la sous-unité régulatrice de l’ADN primase eucaryote
Complexe tetramérique chargé de la synthèse des amorces d’ARN/ADN nécessaires à l’initiation de la réplication et à la synthèse des fragments d’Okazaki•L’ADN primase p48-p58 synthétise la portion ARN des amorces •L’ADN polymérase synthétise la portion ADN des amorces
Le complexe ADN polymérase -primase
Les cellules EM9 déficientes en XRCC1 présentent 12x plus d’échanges de chromatides sœurs (SCE) que les cellules sauvages (Dillehay et al., Mutat. Res., 1983)
La mutation du domaine BRCT1 entraîne une diminution de la survie des cellules après traitement au MMS (Taylor et al., Mol. Cell. Biol., 2002)
La mutation du domaine BRCT1 entraîne un défaut de redémarrage de la synthèse d’ADN après traitement au MMS (Kubota et al., Nucl. Acids Res., 2003)
XRCC1 interagit avec l’anneau de processivité PCNA et colocalise avec cette protéine au niveau des foyers de réplication (Fan et al., Nucl. Acids Res., 2004)
Les cellules traitées par ARN interférence dirigé contre XRCC1 s’accumulent en phase S 24h après traitement au MMS (Brem et al., Nucl. Acids Res., 2005)
Un rôle pour XRCC1 dans le coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?
Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli
Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose
Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa
Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés
Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse
p58
DNA-PKcs
GST GST-BRCT1
PARP-1
PCNA
GST-BRCT1
Dimèrede GST
GST
ab
c
de
GS
T-X
RC
C1 1-170
170-428282-428314-428427-633
GST a b c d e WB
XRCC1 et p58 interagissent in vitro
XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase après traitement à l’hydroxyurée
Le domaine BRCT1 de XRCC1 est suffisant pour l’interaction avec p58
Far western blot Anti-XRCC1Amido black
XRCC1 interagit avec la moitié N-terminale de p58
XRCC1
p58 N C1 6 12 G266 509
NLS
-HU +HU
XRCC1 et p58 interagissent in vivo
XRCC1 et p58 colocalisent dans les foyers de réplication des cellules traitées par hydroxyurée
Le poly(ADP-ribose) et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58
Test de mobilité électrophorétique:Le PAR et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58
Le PAR inhibe la liaison de p58 à l’ADN substrat
par sa moitié N-terp58 lie le PAR
Influence du PAR sur l’activité primase
La fixation de PAR par p58 inhibe l’activité primase de p48-p58 in vitro
La liaison du PAR à p58 inhibe fortement l’activité primase du complexe p48-p58
Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent une forte automodification de PARP-1 et une forte hétéromodification de XRCC1 au niveau de son domaine BRCT1
Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux élevés de PAR
DAPI GFP-BRCT1 Anti-PAR Colocalisation
Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux significatifs de PAR nucléaire en absence de traitement, et des niveaux très élevés de PAR après endommagement de l’ADN
2n 4n 2n 4n
XRCC1 est nécessaire à la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé
La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 perturbe fortement la progression des cellules à travers le cycle cellulaire, après traitement au MNU
La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 entraîne une accumulation des cellules en début de phase S : la réplication est inhibée, ralentie
La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 inhibe la progression des fourches de réplication sur un ADN
endommagé
Xenopus laevis:
- Allotétraploïde- 36 chromosomes- 20-22°c température optimale de croissance- ♀ 11cm / ♂ 6cm- œufs 1,2-1,3 mm Ø- 1000 à 6000 œufs/ponte- temps de génération >2 ans
Microinjection,Extraits d’œufs ,
Réplication in vitro
Le modèle Xenopus laevis
Extraits d’oeufs de xénope
ADN matrice
Formation d’une Membrane nucléaire
Cycle unique et complet de réplication de l’ADN
Système acellulaire :
Immunodeplétion (anticorps anti-XRCC1)
Utilisation d’inhibiteurs PARP/PARG
Addition de protéines recombinantes (BRCT1 / BRCT2)
Traitement de la chromatine par des agents génotoxiques
-Analyse des cinétiques de réplication-Analyse des protéines (WB, IF)-Analyse de la taille des ADN synthétisés
Réplication de l’ADN dans les extraits d’œufs de xénope
XRCC1 est une protéine fortement conservée au cours de l’évolution
~ 80% d’homologie de séquence entre la protéine humain et celle de xénope> 90% d’identité de séquence au niveau du domaine BRCT1
@XRCC1Pc souris A
Xenop
us e
gg
extra
cts
HeLa
cells
@PARP1Pc souris EGT69
Xenop
us e
gg
extra
cts
HeLa
cells
X.l. XRCC1 BRCT1 ralentit la réplication des ADN endommagés
Analyse des cinétiques de réplication de l’ADN
L’addition de GST-BRCT1 recombinant dans les extraits d’œufs de xénope freine la réplication des ADN endommagés
Chromatine non traitée Chromatine traitée MMS
Analyse de la taille des ADN répliqués sur gel alcalin
X.l. XRCC1 BRCT1 bloque l’initiation de la réplication des ADN endommagés
Accumulation de complexes de pré-
initiation
Défaut d’association de PCNA sur la
chromatine
Inhibition de l’initiation de la réplication
L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par XRCC1 BRCT1 est dépendant de sa PARylation
Analyse des cinétiques de réplication de la chromatine endommagée au MMS
+GST-BRCT1
+ GST-BRCT1+ inhibiteur PARP KU0058948
+ GST
L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par le domaine BRCT1 de XRCC1 dépend de sa modification par PARP-1
Modèle : XRCC1 interagit avec p58 pour freiner la réplication des ADN endommagés afin de préserver
l’intégrité du génome
Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1
Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli
Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose
Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa
Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés
Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse
p58
DNA-PKcs
GST GST-BRCT1
PARP-1
PCNA
GST-BRCT1
Dimèrede GST
GST
DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1
Far western blotAnti-XRCC1
XRCC1 interagit avec les 3 sous-unités de DNA-PK
ab
c
de
GS
T-X
RC
C1 1-170170-428282-428314-428427-633
GST a b c d e
DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1
XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK sur son domaine BRCT1 en réponse aux rayons
ionisants
Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vivo par DNA-PK en réponse aux rayonnements ionisants
ab
c
de
GS
T-X
RC
C1 1-170
170-428282-428314-428427-633
GST a b c d e
Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vitro par DNA-PK
XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371
DNA-PK
S371
Un seul motif potentiel de phosphorylation par DNA-PK de type SQ au sein du domaine BRCT1 de XRCC1 : SQ 371/372
La sérine 371 de XRCC1 constitue le site de phosphorylation par DNA-PK
XRCC1 dimérise via son domaine BRCT1 et la phosphorylation de la sérine 371 entraîne la
dissociation du dimère XRCC1
ab
cd
e
GS
T-X
RC
C1 1-170
170-428282-428314-428427-633
XRCC1
Le domaine BRCT1 de XRCC1 est une interface de dimérisation
La phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1
DNA-PK
Le dimère XRCC1 stimule l’activité kinase de DNA-PK in vitro
GSTS15
P
P53
XRCC1 stimule fortement l’activité kinase de DNA-PK
C’est la forme dimère de XRCC1 qui possède cette capacité à stimuler DNA-PK
Le mutant S371L de XRCC1 entraîne la persistance de cassures double-brin de l’ADN
EM9(Déficientes en XRCC1)
EM9XRCC1 wt
EM9 XRCC1S371L
NT
1G
y/1
H
Immunofluorescence: anti-H2AX
Foyers H2AX = sites de cassures double-brin de l’ADN
Le mutant non phosphorylable S371L de XRCC1 entraîne une persistance des DBS alors qu’il est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK
Le dimère XRCC1 est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK, mais sa dissociation est importante pour la suite du mécanisme de réparation des DSB
Modèle : XRCC1 agit comme commutateur entre les voies
de SSBR et DSBR
XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 du complexe ADN polymérase -primase pour
freiner la réplication des ADN endommagés
XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK et stimule l’activité de cette kinase pour favoriser la réparation des DSB générés
lors de la réplication de l’ADN
PARP-1 interagit avec l’ADN polymérase et inhibe son
activité en l’hétéromodifiant (Eki et al., FEBS Letters , 1994;
Simbulan-Rosenthal et al., Biochemistry, 1996; Dantzer et al., Nucl. Acids Res.,
1998)
PARP-1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité kinase
en l’hétéromodifiant (Ruscetti et al., J. Biol. Chem., 1998)
XRCC1 et PARP-1 forment un couple étroitement lié et agissent de façon synergique pour inhiber la réplication des
ADN endommagés et pour organiser la transition entre SSBR et DSBR
XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN
XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
Chimiothérapies, radiothérapies : endommagement de l’ADN de cellules tumorales pour provoquer leur mort.
Limites : effets secondaires sur les cellules saines de l’organisme, résistance des tumeurs
Inhibition des voies de réparation de l’ADN : potentialisation des traitements anticancéreux
Inhibiteurs PARP : potentialisation des traitements par irradiationeffet important sur les tumeurs liées à BRCA1/2
G. Noël et al., Mol. Cancer Ther., 2006Bryant et al., Nature, 2005
Aptamère (court oligonucléotide à structure tridimensionnelle complexe) :
Forte affinité pour une cible protéique spécifique Inhibition des fonctions de la cible liée
XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses
Inhibition des fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 : perturbation de la prise en charges de lésions au cours de la réplication ainsi que du
NHEJ
Peptide inhibiteur, se liant en dominant négatif au domaine BRCT1 de XRCC1 et empêchant les interactions protéiques normalement
assurées par ce domaine
Accumulation importante de lésions dans l’ADNCiblage spécifique des cellules tumorales en prolifération
A tout le département « Intégrité Du Génome » A tout le département « Intégrité Du Génome » de l’ESBS :de l’ESBS :
http://parplink.u-strasbg.frhttp://parplink.u-strasbg.fr
DEPARTEMENT “INTEGRITE DU GENOME” DE l’UMR 7175DEPARTEMENT “INTEGRITE DU GENOME” DE l’UMR 7175ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG
UNIVERSITE LOUIS PASTEURUNIVERSITE LOUIS PASTEURLRC-CEA n° 39LRC-CEA n° 39
boulevard Sébastien Brant, BP 10413 boulevard Sébastien Brant, BP 10413 F-67412 Illkirch Cedex, FranceF-67412 Illkirch Cedex, FranceUn grand merci :Un grand merci :
Au jury :Au jury :Directeur de thèse : Dr. Gilbert de MurciaDirecteur de thèse : Dr. Gilbert de MurciaRapporteur interne : Pr. Philippe CarbonRapporteur interne : Pr. Philippe CarbonRapporteur externe : Dr. Janet HallRapporteur externe : Dr. Janet HallRapporteur externe : Dr. Pablo RadicellaRapporteur externe : Dr. Pablo RadicellaExaminateur : Dr. Domenico MaioranoExaminateur : Dr. Domenico MaioranoInvitée : Dr. Anne BressonInvitée : Dr. Anne Bresson
Au Dr. Marcel Méchali et à tout le Au Dr. Marcel Méchali et à tout le laboratoire « Surveillance et Stabilité du laboratoire « Surveillance et Stabilité du Génome » de l’Institut de Génétique Génome » de l’Institut de Génétique Humaine de MontpellierHumaine de Montpellier
A Josiane Ménissier de Murcia, Directrice de thèseA Josiane Ménissier de Murcia, Directrice de thèse
Laboratoire derechercheassocié n° 39V
Activité spécifique : Sa = (CPMi x Fd)/(CdATPxV) (cpm/pmol dATP)
Quantité de dATP incorporée : ndATP = (CPM x Fd)/Sa (pmol)
Masse des nucléotides incorporés : m = ndATP x 4 x 0,33 (ngr)
Pourcentage d’ADN répliqué = m / mchromatin
Inhibition de la réplication indépendante des checkpoints
Perspectives
Etude dans un modèle déficient pour XRCC1 (cellules EM9, extraits
d’oeufs de xénope déplétés pour XRCC1…)
Etude de la réplication sur un substrat synthétique avec des lésions
localisées
La réplication de l’ADN est inhibée par l’interaction entre le
domaine BRCT1 (PAR)ylé de XRCC1 et la sous-unité p58 de l’ADN
primase, en réponse au stress génotoxique, afin de maintenir
l’intégrité du génome (évite les collisions entre les fourches de
réplication et les SSB non réparés, susceptibles de générer des
DSB hautement toxiques)
Arrêt de la réplication par inhibition de l’ ADN primase par le ppGpp en
response stress nutritionel (Wang et al. Cell 128, 865-875)
Stabilisation de la machinerie réplicative sur un ADN endommagé
grâce à l’ATP généré lors de la dégradation du PAR (Maruta et al. Biol. Pharm.
Bull. 30, 447-450)
Conclusions
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