zpráva o průběhu exkurze

KFY/BFEX1

Zpráva o průběhu exkurze

Datum: 1.12. 2006Jméno: Ladislav ŠigutObor: BiofyzikaOstravská univerzita v Ostravě

Laborex, s.r.o.

Kontaktní údaje:

Pohraniční 641/106703 00  Ostrava-Moravská Ostrava Telefon: +420 596 614 601Fax: +420 596 614 600E-mail: laborex@iol.cz

Úvod:

Laborex, s.r.o. je specializovaná diagnostická laboratoř pro vyšetřování biologického materiálu pro humánní a veterinární účely. Vzhledem k velkému množství typů vzorků je komplex rozdělen na jednotlivá oddělení (ovšem neoficiálně) se specializovanými přístroji a personálem. Nejdříve jsme si vyslechli prezentaci pracovníků v oddělení analýzy srážlivé krve.

Oddělení analýzy srážlivé krve

Běžná praxe tady probíhá přibližně takto. Po svezení vzorků s žádankami se tyto na příjmu roztřídí. Podle typu materiálu a tudíž i přístrojů potřebných k jejich diagnostikaci se vzorky přiřadí jednotlivým oddělením. Zde také pracovníci označují vzorky na základě žádanek kódy, které obsahují všechny potřebné informace týkající se analýzy.

Na žádankách by měly být tyto informace:

jméno a příjmení pacienta rodné číslo pacienta, popř. náhradní rodné číslo odebíraný materiál požadované vyšetření další požadavky stanovené příslušnou laboratoří jsou specifikovány na žádance dodatečné údaje pro některá vyšetření: hmotnost, výška pacienta a množství sbírané

moči, délka těhotenství datum vystavení žádanky , čas odběru při statimovém nebo vitálním vyšetření diagnóza způsob platby (pojišťovna, samoplátce atd.) razítko příslušného zdravotnického zařízení a jmenovka lékaře/ pro ambulantní lékaře

VFN- nákladové středisko oddělení /ambulance/ a číslo lékaře, přidělené ve VFN

čitelné jméno lékaře veškeré odchylky od běžných postupů se na žádance vyznačují textem, například

„obtížný odběr“, léky, které pacient užívá atd. (1)

Údaje z žádanek a kódů se přepisují do Laboratorního informačního a řídícího systému (LIRS), který zajišťuje automatizaci laboratorního provozu s využitím výpočetní techniky. Systém LIRS tedy zprostředkovává příjem a evidenci požadavků na vyšetření, tvorbu pracovních listů, komunikaci s analyzátory, kontrolu a výdej výsledků, údržbu databáze, archivaci kompletních žádanek, vyúčtování laboratorních výkonů, statistiku laboratoře a lokální i síťové zpracování dat. Dále umožňuje on-line přenos informací mezi lékařem a laboratoří, využití možností a služeb celosvětové počítačové sítě internet při práci v laboratoři a napojení laboratorního bloku na rozsáhlejších nemocniční informační systémy. Na systém jsou na základě kompatibility k jednotlivým analyzátorům implementovány programy pro vyhodnocování naměřených dat a sledování parametrů lokální kontroly kvality.

Na konkrétním oddělení se provádí řada kvalitativních i kvantitativních vyšetření na vzorcích moči a srážlivé krve, např. vyšetření na obsah iontů prvků (např. Fe, K, Na), cholesterol, jaterní testy, vyšetření erytrocytů v moči a další.

Separace (oddělení krevních elementů):

Pro oddělení krevních elementů od séra (plazmy) je vhodná centrifugace při 1000 – 1500 g (gnásobek gravitačního zrychlení) po dobu 10 minut při pokojové teplotě (v běžných centrifugách s průměrem rotoru cca 20 cm centrifugujeme při otáčkách 2800/min.). Delší doba centrifugace nebo zvýšení počtu otáček vede často k částečné či úplné hemolýze. Plazma nebo sérum by měly být odděleny od buněk co možná nejdříve, ale zcela určitě do 2 hodin od odběru (pro stanovení K , NSE do 1 hodiny). Krev pro stanovení tepelně nestálých analytů (PTH, osteokalcin, natriuretické peptidy a další) má být centrifugována v chlazené centrifuze.

Předčasné oddělení séra od krevních elementů (dříve než za cca 20 – 30 minut) však může vést k dodatečné tvorbě fibrinu a dochází tak k pocentrifugační koagulaci. Z tohoto pohledu je plazma jako biologický materiál pro další analýzy vhodnější – krev je možné ihned centrifugovat popř. poslat do laboratoře potrubní poštou, hrozí menší nebezpečí hemolýzy, plazma více prezentuje systém in vivo. (1)

Na tomto oddělení se využívá biochemických analyzátorů k vyhodnocování vzorků řadou dílčích metod. Pro každou z nich je typické použití specifických aditiv přidávaných do vzorku, tzv. reagencií a kalibračních křivek, podle kterých přístroje vyhodnocují provedené měření. Prezentovány nám byly tyto metody:

spektrofotometrické měření: nahrazuje se zde optická soustava oka přístrojem měřícím absorbci světla procházejícího vzorkem

ampérometrické stanovení elektrodové oxidace peroxidu vodíku na platinové elektrodě (Clarkova elektroda): využívá se u vyšetření glukózy

měření vodivosti: vyšetření urey měření pomocí iontově selektivních elektrod: využívá se při kvantitativním

vyšetření iontů

Další informace:

Pro manipulaci se čtyřmi vzorky se využívá tzv. racků, které se vkládají do přístroje na určitém místě.

Vzhledem k tomu, že všechny zařízení jsou plně automatizované, tzn. měří zcela objektivně, na personálu spočívají přibližně tyto funkce: výměna racků se vzorky, kalibrace přístrojů a kontrola výsledků, popřípadě opětovné měření vzorku, jehož výsledky se silně vychylují od průměru.

Absolutní chyba povolená pro daná měření je 10% a vyplývá z nehomogenní povahy koloidních roztoků.

Všechna měření musí být provedena tentýž den, kdy byl proveden odběr vzorku. V opačném případě jsou vzorky zamítnuty.

Odběrové zkumavky a další potřeby lékařům zajišťuje laboratoř.

Oddělení analýzy moči a imunochemické analýzy

Vyšetření se provádí chemicky a ze sedimentu. Přístroje k tomu určené jsou na světové úrovni, laboratoř jich začala využívat jako druhá v České republice. Předtím bylo možné provádět pouze sedimentaci.

K vyšetření je potřeba 10 ml vzorek středního proudu první ranní moče po důkladné hygieně genitálu (moč se přes noc bez příjmu tekutin koncentruje a odlišnosti od průměru jsou lépe pozorovatelné).

Měření je opět zcela automatizováno, vzorek se pouze nakape na podložku a reaguje s indikátorem, který vyhodnocuje přístroj. Získávají se tak hodnoty pH, bílkovin a bilirubinu.Při sedimentačním vyšetření je vzorek digitálně překapáván a výsledky měření jsou porovnávány podle softwarového nastavení.

Imunochemická analýza probíhá na bázi nefelometrie (zabývá se měřením intenzity difúzně rozptýleného světla na dispergovaných částicích). Hledané částice jsou imunoglobuliny, jejichž koncentrace se při infikaci organismu antigeny zvyšuje.

Centrifugovaná krev uložená do racků se ukládá do přístroje, který ji vyhodnocuje v počítači. Zařízení je prakticky bezúdržbové.

V této části laboratoře se také provádí měření glykovaného hemoglobinu. Je žádáno lékaři u diabetiků. Výsledek měření ukazuje stupeň glykémie, který popisuje hospodaření s cukrem za dva měsíce. Toto je možné díky erytrocytům, které uchovávají informace o hospodaření s cukrem. Při měření se využívá metodiky kapalinové chromatografie za použití ředících roztoků.

Oddělení analýzy nesrážlivé krve

Zde se vyhodnocují krevní obrazy a diferenciály pomocí imperačních a optických metod. Provádějí se zde kalkulační vyšetření, fotometrická, optická měření a sedimentace za použití stabilizačních roztoků bránících fyziologickým změnám a rozpadu krvinek.

Díky vyšetření na leukocyty může lékař určit diagnózu. Využívají se zde pětipopulační přístroje, tzn. že měří hladiny pěti typů leukocytů

(např. leukocyty, bazofyly, neutrofyly, eozinofyly). Zařízení jsou opět plně automatizovaná a přes hlavní počítač napojená na laboratorní systém. Díky této technologii jsou schopni určit sto vzorků za hodinu, zatímco starým způsobem pouze dva, takže je možné zpracování všech vzorků do dopoledne během jediného dne.

Další informace:

Nejrychleji z měřených částic se rozpadají leukocyty.Na krevní obraz nemá vliv, jestli se provádí na lačno.Odběr je nutno provést po naznačenou rysku na zkumavce, do které se okamžitě po

odběru aplikuje protisrážlivý roztok. Dodržení správného objemu odebrané krve je potřeba proto, aby nedošlo k sražení vzorku nebo přílišnému naředění protisrážlivým roztokem.

Mikrohematokryt se odebírá z kapilár, krev se centrifuguje a zjišťuje se poměr krvinek a plazmy. Vyšetření se provádí u pacientů s anémií a při zjišťování stavu glukózy u pacienta.

Oddělení bakteriologie

Na tomto oddělení se využívá především kultivačních metod na tekutých a pevných kultivačních půdách v petriho miskách. Složení kultivačních půd vyhovující ke kultivaci většiny bakterií je obohacený agar s krví. Musí se zajistit převoz živých mikrobů. V praxi se většinou využívá tzv. selektivních půd, pomocí nichž se patogen určuje, protože různé kmeny bakterií potřebují ke kultivaci různé typy agarů. Agary jsou vybírány takovým způsobem, že po jejich úspěšné aplikaci je vždy patrná barevná změna kolonií. Po kultivaci daného vzorku se zjišťuje počet kolonií mikroba na objemové množství vzorku.

Příklady typů vzorků:

výtěry z dýchacích cest stěry z jazyka, úst atd. (častý výskyt betahemolytických koků) stolice poševní sekrety

Pokud se vzorek špatně kultivuje, je možné jeho prokázání antigenem přímo v původním prostředí (meningitida).

K identifikaci se využívá biochemických metod na základě zpracování substrátu. Jako indikátor může sloužit například pH při použití určitých speciálních půd (tzv. kombinovaných) se zabarvením nebo přítomnost typických metabolitů pro určité kmeny bakterií, např. sirovodík u salmonely. Mezi selektivní diagnostické půdy patří například auxacolor identifikátory. Typický je například porfirinový test, kdy dochází k zrůžovění substrátu.

Pro stanovení typu mikroba je nutné znát morfologii kolonií, tvar mikroba a jeho kultivaci.

Oddělení Imunochemické analýzy

Využívá se zde imunochemických vyšetřovacích metod, tzn. že v přístrojích dochází k imunologickým a chemickým reakcím. Během měření přístroje pracují na základě fotometrických principů.

Celá metodika je založená na tom, že všechny organizmy s vyvinutou imunologickou regulační soustavou okamžitě mobilizují protilátky, pokud se do vnitřního prostředí organizmu dostane jakákoliv cizorodá látka (antigen). V případě, že se již organismus s antigenem setkal, jsou na povrchu protilátek receptory pro vazbu antigenu.

Všechny antigeny používané při vyšetřeních jsou získávány ze zvířat. Protilátky syntetizované člověkem se nacházejí v krevním séru, ze kterého se však neextrahují.

Pro imunochemickou analýzu se využívá dvou typů přístrojů: otevřené a uzavřené. Pro uzavřené přístroje je vypracována specifická metodika, kterou není možné měnit. Firma vyrábějící tento přístroj zajišťuje tedy i reagencie potřebné pro analýzu.

Metodika měření s otevřeným systémem:

Do jamečky se umístí analyt (protilátka v krevním séru), který se zde naváže na antigen. Všechny ostatní látky obsažené v analytu (sérum aj.) se pak odstraní tzv. vymývacím roztokem. Následně se do analytu přidává konjugát, který se naváže na komplex antigen, protilátka. Konjugát obsahuje enzym. Po přidání substrátu specifického pro konkrétní enzym dochází k reakci, která změní vlastnosti substrátu, např. obarvení nebo chemiluminiscenci. V laboratoři se využívají substráty měnící své chemiluminiscenční vlastnosti, přičemž míra intenzity chemiluminiscence se vyhodnocuje fotometrií po aplikaci kalibrační křivky vhodné k měřenému vzorku.

Metodika měření s uzavřeným systémem:

Princip měření je přibližně stejný jako u otevřených systémů. Místo jameček se však používají mikročástice (mikropartikuly) jejichž kulovitý tvar mnohonásobně zvyšuje reakční plochu. Proto jsou tato měření mnohem přesnější.

Provádějí se zde vyšetření infekčních onemocnění, hladiny hormonů, nosičů hormonů, vitamínů atd.

Osobně mě toto oddělení nejvíce zaujalo. Dozvěděl jsem se zde, že vyšetření infekčních onemocnění mohou být měřena kvalitativně, ale dokonce i kvantitativně. Smysl kvantitativního měření spočívá ve velikosti reakce organizmu na daný antigen a spolu s informací o kvalitě protilátek může lékař zcela jistě posoudit, zda pacient nemoc prodělal před dlouhou dobou, teprve nedávno nebo s nemocí stále bojuje a s jakou intenzitou, což nemusí být na pacientovi ihned patrné.

Oddělení imunoradiometrických a radioimunoanalytických metod

Analýzy pomocí radioaktivního izotopu 125I. Nejpodstatnější součástí přístroje je tzv. gamačítač, který měří intenzitu záření objemového množství analytu.

Imunoradiometrická analýza (IRMA):

Jde o nekompetitivní imunoanalytickou metodu stanovení analytů pomocí dvojice protilátek, jedna z protilátek je značena radioizotopem.

Stanovovaná látka (například antigen - Ag) reaguje s nadbytkem vazebného činidla označeného radioindikátorem (specifická protilátka - Ab*). Průběh reakce lze zjednodušeně popsat: 

Ag   +   2Ab*          Ag-Ab*   +   Ab*

Ke kvantifikaci slouží označená protilátka. Množství komplexu [Ag-Ab*] je úměrné množství stanoveného antigenu, tedy se vzrůstající koncentrací stanovované látky vzrůstá také odezva (pokud je měřena vázaná frakce indikátoru), tj. radioaktivita vytvořeného komplexu.

V praxi není obvykle používán výše popsaný jednoduchý princip nekompetitivní reakce. Častější modifikací je tzv. "two-site" IRMA, také označovaná jako sendvičová IRMA. Do reakce se stanovovaným antigenem vstupují v nadbytku dvě specifické protilátky jako vazebné regens. Každá z nich je namířena proti jiné antigenní determinantě antigenu, přičemž jen jedna je vhodným způsobem označena a slouží tak jako indikátor průběhu reakce. První protilátka bez indikátoru Ab1 bývá označována také jako "vychytávací" ("capture antibody"), druhá - Ab2* - jako protilátka signální.

U IRMA metod se výrazným způsobem uplatnily tzv. specifické monoklonální protilátky. Schematicky je pak možno princip této metody popsat následujícím způsobem: 

2Ab1   +   Ag       +   2Ab2*          Ab1-Ag-Ab2*  +   Ab1   +   Ab2* Pro vyhodnocení výtěžku reakce je třeba separovat vázanou frakci indikátoru, tedy komplex [Ab1-Ag-Ab2*], od frakce volné, tj. nezreagované značené protilátky Ab2*. Neznačená protilátka bývá většinou zakotvena na stěnu reakční zkumavky, nebo na jinou pevnou fázi (partikule, kuličky,…). Tím zůstává rovněž celý komplex přichycen k pevné fázi, což podstatným způsobem usnadňuje separační krok. Nevyužitý nadbytek protilátky je z reakční směsi odstraněn obvykle pouhým odsátím nebo dekantací a propláchnutím vhodným promývacím pufrem.

Množství vzniklého značeného komplexu [Ab1-Ag-Ab2*] je i v tomto případě úměrné množství určovaného antigenu. Kvantitativní hodnocení se provádí pomocí analýzy sady vzorků se známou koncentrací analytu (kalibrátorů). Z kalibrační křivky, kterou je závislost změřené radioaktivity (osa y) jako funkce koncentrace stanovovaného antigenu (osa x), je potom odečtena koncentrace analyzovaného vzorku. Kalibrační křivka má tvar stoupající závislosti, v určitém rozsahu koncentrací má více či méně lineární charakter.

Praktické provedení IRMA metod může být realizováno jako "jednokrokové", kdy jsou obě protilátky přidávány do reakční směsi současně, nebo "dvoukrokové" (sekvenční), kdy jsou přidávány postupně. V prvním případě bývá pracovní rozsah metody (rozsah koncentrací kalibrační křivky) zásadně omezen možným vlivem tzv. "Hook efektu".

Nepřímá „two-site“ IRMA je další modifikací a zdokonalením základní metody IRMA. Používá stejného principu jako „two-site“ IRMA, avšak jako indikátor zde není použita protilátka Ab2, ale pro detekci je do systému přidána třetí protilátka (Ab3*), která je vhodně označena. Závěrečnou fázi metody lze schématicky znázornit jako:  Ab1-Ag-Ab2   +    Ab3*           [Ab1-Ag-Ab2]-Ab3* +   Ab3* (2)

Radioimunoanalytická metoda (RIA):

Radioimunoanalytické stanovení látky je vysoce citlivá kvantitativní (detekční limit bývá v pg) imunochemická metoda stanovení využívající schopnosti rozpoznání molekuly hledané látky protilátkou s velmi vysokou specifitou. Princip metody spočívá v kompetici přirozené formy antigenu a radioaktivně značeného antigenu ve vazbě na protilátku. Za předpokladu konstantního množství protilátky a radioaktivně značeného antigenu a přebytku přirozené formy antigenu, dochází za specifických podmínek k vytěsňování radioligandu z vazby s protilátkou (3). Výsledky měření se odečtou z kalibrační křivky, kde se hodnotí poměry vzniklých komplexů.

Hodnotí se zde například koncentrace c-peptidu v krvi, který souvisí s diabetií (uvolňuje se při vzniku inzulínu, koncentrace samotného inzulínu se však nezjišťuje, protože jeho poločas rozpadu je asi 5 minut).

Další zde prováděná vyšetření jsou např. stanovení koncentrace testosteronu a těhotenský screening.

Těhotenský screening je založen na faktu, že se při těhotenství vylučuje do krve charakteristická bílkovina a při extrémním snížení její koncentrace vzniká nebezpečí projevení Downova syndromu u plodu. Vyšetření se provádí během prvního simestru, tj. 10.-13. týden těhotenství a druhého simestru, tj. 14.-16. (popř. 17.) týden těhotenství a je při něm potřeba znát i další informace o matce. Touto metodou se nedá určit, zda plod bude postižen Downovým syndromem, vyšetření určuje pouze míru rizika. Pro konečnou diagnostikaci je potřeba projít genetickým vyšetřením na chromozómovou aberaci, konkrétně trizómii na 21. chromozómu, popř. ultrazvukovým vyšetřením. Riziko postižení plodu Downovým syndromem se zvyšuje se vzrůstajícím věkem ženy. V průměru je riziko výskytu postižení přibližně 1:800, avšak u matek s věkem nad 35 let již 1:300. Během letošního roku bylo zaznamenáno 13 případů narození dítěte s tímto postižením, přitom 10 z nich se narodilo matkám starších 35 let.

Podobným způsobem se provádí i vyšetření na Adwardsův syndrom, ale jeho výskyt je méně častý. Jedná se o trizomii 18. chromozómu.

Závěr:

Fascinovala mě profesionalita pracovníků na jednotlivých odděleních a zároveň vysoká míra automatizace celého diagnostického procesu. Přístroje vykonávají zdánlivě jednoduchou metodiku měření, při které je ovšem dáván důraz především na přesnost. Logický smysl a řád veškerým těmto měřením však dává teprve školený personál, který přístroje kalibruje, takže může přístroj po dokončení měření vzorku přiřadit konkrétní hodnotu a rozměr na základě kalibrační křivky.

Z účasti na cvičeních základů laboratorní techniky jsem si odnesl zkušenost, že veškerá měření jsou přesná v úměrné míře s mírou zapojení smyslových orgánů člověka. Proto mě ohromil pohled do profesionální laboratoře, kde mě fascinovala profesionalita pracovníků na jednotlivých odděleních a zároveň vysoká míra automatizace celého diagnostického procesu čímž jsou všechny tyto zkreslení téměř úplně odbourány.

Vzhledem k tomu, že nám byly informace sdělovány ústní formou a ne vždy jsem všemu porozuměl, použil jsem internetu k doplnění některých chybějících informací a náležitě se k těmto zdrojům odkazuji.

Literatura:

(1) ÚKBLD a 1. LF UK: Preanalytická příručka klinických laboratoří ÚKBLD [online].last revision 1st December 2006.<http://ukb.lf1.cuni.cz/dokumenty/preanalytika.pdf>.

(2) Bartoš, V.: Preanalytická Imunoradiometrická analýza (IRMA) [online].last revision 1st December 2006.<http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/CD/hypertext/AJBAV.htm>.

(3) Klemš, M., Balla, J., Flores-Solís, J., Procházka, S.: Stanovení kyseliny abscisové RIA metodou [online].last revision 1st December 2006.<http://old.mendelu.cz/~kucera/mendel/MENDEL97/KLEM_BAL.DOC>.